JPS63207396A - 腫瘍関連抗原に特異的な抗体およびこれを利用する抗原の測定法 - Google Patents
腫瘍関連抗原に特異的な抗体およびこれを利用する抗原の測定法Info
- Publication number
- JPS63207396A JPS63207396A JP4055187A JP4055187A JPS63207396A JP S63207396 A JPS63207396 A JP S63207396A JP 4055187 A JP4055187 A JP 4055187A JP 4055187 A JP4055187 A JP 4055187A JP S63207396 A JPS63207396 A JP S63207396A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- hybridoma
- monoclonal antibody
- treatment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はｍ瘍関連抗原、該抗原に特異的な抗体、および
該抗体を利用する抗原の測定法に関する。
該抗体を利用する抗原の測定法に関する。
従来、大腸癌の免疫学的あるいは化学的診断法としては
、カルチツエンプリオニツク・アンチダン（ＣＥＡ）Ｃ
Ａ１９−９や組織ゾラスミノーグンアクテペータ（ＴＰ
Ａ）を検出したシ定量する方法が採用されてきた。
、カルチツエンプリオニツク・アンチダン（ＣＥＡ）Ｃ
Ａ１９−９や組織ゾラスミノーグンアクテペータ（ＴＰ
Ａ）を検出したシ定量する方法が採用されてきた。
しかし、いずれのＳ瘍マーカーもスクリーニングや確定
診断に用いるには不十分であった。
診断に用いるには不十分であった。
従って、大腸癌特有の抗原、該抗原に対する抗体を見い
出すことは、大腸癌の診断、ひいては大腸癌の早期治療
上極めて重要である。
出すことは、大腸癌の診断、ひいては大腸癌の早期治療
上極めて重要である。
上記実状に鑑み、本発明者らは大腸癌細胞について種々
研究した結果、細胞融合技術を利用することにより大腸
癌に特有な抗原に特異的なモノクローナル抗体が得られ
、該抗体を利用すれば大腸癌由来の抗原が単離でき、さ
らに該抗原が正確に測定できることを見い出し、本発明
を完成した。
研究した結果、細胞融合技術を利用することにより大腸
癌に特有な抗原に特異的なモノクローナル抗体が得られ
、該抗体を利用すれば大腸癌由来の抗原が単離でき、さ
らに該抗原が正確に測定できることを見い出し、本発明
を完成した。
すなわち、本発明は下記の性質を有するヒト大腸癌由来
の抗原 （１）分子量 約３８，０００〜４２，０００ （Ｓ Ｄ Ｓ−／リア
クリルアミドグル電気泳動法、ウェスタンイムノプロッ
ト分析） （２）抗体との反応性 ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、過ヨウ素酸カ
リウム処理によって抗体との反応性が消失する。
の抗原 （１）分子量 約３８，０００〜４２，０００ （Ｓ Ｄ Ｓ−／リア
クリルアミドグル電気泳動法、ウェスタンイムノプロッ
ト分析） （２）抗体との反応性 ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、過ヨウ素酸カ
リウム処理によって抗体との反応性が消失する。
該抗原に対して特異的であるモノクローナル抗体、およ
び該抗原に特異的な抗体を用いる該抗原の測定法を提供
するものである。
び該抗原に特異的な抗体を用いる該抗原の測定法を提供
するものである。
本発明のモノクローナル抗体は、例えば該モノクローナ
ル抗体産生ノ〜イブリドーマの培養上清、又は該モノク
ローナル抗体産生ノ・イブリドーマを接種した動物の腹
水から単離することができる。
ル抗体産生ノ〜イブリドーマの培養上清、又は該モノク
ローナル抗体産生ノ・イブリドーマを接種した動物の腹
水から単離することができる。
本発明モノクローナル抗体を産生ずるノ１イブリドーマ
は例えば次の如くして製造される。すなわち、■抗原と
して大腸癌細胞を用いて免疫した動物から抗体産生細胞
を調製し、■別に骨髄腫細胞を調製し、■これらの細胞
を融合させ、■得られた融合細胞を選択的に増殖させ、
■該ノ・イブリドーマから抗体産生ノ・イブリドーマを
検索し、次いでクローニングすることにより、目的とす
るモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを得る。
は例えば次の如くして製造される。すなわち、■抗原と
して大腸癌細胞を用いて免疫した動物から抗体産生細胞
を調製し、■別に骨髄腫細胞を調製し、■これらの細胞
を融合させ、■得られた融合細胞を選択的に増殖させ、
■該ノ・イブリドーマから抗体産生ノ・イブリドーマを
検索し、次いでクローニングすることにより、目的とす
るモノクローナル抗体産生ハイプリドーマを得る。
■抗体産生細胞を調製するには、例えばヒト大腸癌細胞
で動物を免疫し、その動物の牌細胞を採取することによ
シ行なわれる。使用される動物としては、マウス・ラッ
ト等が好ましい。
で動物を免疫し、その動物の牌細胞を採取することによ
シ行なわれる。使用される動物としては、マウス・ラッ
ト等が好ましい。
■骨髄ｐｓｍ胞としては、特に限定されないが、例えば
マウス骨髄腫細胞株Ｐ ３ 、Ｘ ６３．Ａｇ８゜６５
３等が好ましい。
マウス骨髄腫細胞株Ｐ ３ 、Ｘ ６３．Ａｇ８゜６５
３等が好ましい。
■細胞融合は、通常ＲＰＭＩ １６４０培地、ＭｇＭ
培地などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合
することによシ行なわれる。融合促進剤としては、平均
分子量Ｌｏｏｏ−＠ｏｏｏの？リエチレングリコールが
使用できる。
培地などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を混合
することによシ行なわれる。融合促進剤としては、平均
分子量Ｌｏｏｏ−＠ｏｏｏの？リエチレングリコールが
使用できる。
／７１１！ｄ＋春鋪カ小、１炉け Ｕム〒慎輛冬田層イ
粁外われる。
粁外われる。
■得られたハイプリドーマから、抗体産生ノ〜イブリド
ーマを検索するには、例えばまずノ・イブリドーマ培養
液を採取し、ヒト大腸癌細胞培養株ＳＷ１１１６等と反
応させ、酵素ラベルした第２抗体との反応性を指標とし
て行ない、次いでさらにヒト由来の種々の抗原との反応
性を検討することにより、行なわれる。得られた抗体産
生ハイプリドーマを限界希釈法等によシクローニングす
ることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生ずる
ハイプリドーマが得られる。
ーマを検索するには、例えばまずノ・イブリドーマ培養
液を採取し、ヒト大腸癌細胞培養株ＳＷ１１１６等と反
応させ、酵素ラベルした第２抗体との反応性を指標とし
て行ない、次いでさらにヒト由来の種々の抗原との反応
性を検討することにより、行なわれる。得られた抗体産
生ハイプリドーマを限界希釈法等によシクローニングす
ることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生ずる
ハイプリドーマが得られる。
斯くして得られたハイプリドーマを利用して、本発明モ
ノクローナル抗体を大量に製造するには、マウス腹腔内
にシリスタン等の鉱物油を投与した後該ハイブリドーマ
を腹腔内投与し、数日後に腹水を採取する。次いでこの
腹水中から通常の抗体分離精製操作に従い、本発明モノ
クローナル抗体を分離すればよい。
ノクローナル抗体を大量に製造するには、マウス腹腔内
にシリスタン等の鉱物油を投与した後該ハイブリドーマ
を腹腔内投与し、数日後に腹水を採取する。次いでこの
腹水中から通常の抗体分離精製操作に従い、本発明モノ
クローナル抗体を分離すればよい。
得られた本発明のモノクローナル抗体は、ヒト大腸癌に
のみ反応し、胃癌、乳癌、胃悪性リン・９腫等の他の癌
細胞と反応しない。また正常組織、例えば正常大腸粘膜
、正常小腸粘膜、正常胃粘膜等とほとんど反応しない。
のみ反応し、胃癌、乳癌、胃悪性リン・９腫等の他の癌
細胞と反応しない。また正常組織、例えば正常大腸粘膜
、正常小腸粘膜、正常胃粘膜等とほとんど反応しない。
本発明のヒト大腸癌由来の抗原は、例えば上記の如くし
て得られたモノクローナル抗体を利用して製造すること
ができる。すなわち、ヌードマウスにて継代されている
大腸癌を摘出した後、細断、ホモゾネートシ、該ホモジ
ネートの可溶化画分を、モノクローナル抗体を結合した
カラムに通してアフィニティークロマトを行うことによ
シ製造することができる。アフィニティークロマトを行
う前に、正常抗体結合カラムにホモジネート可溶化画分
を通し、非特異的反応物質を除去しておくことが好まし
い。
て得られたモノクローナル抗体を利用して製造すること
ができる。すなわち、ヌードマウスにて継代されている
大腸癌を摘出した後、細断、ホモゾネートシ、該ホモジ
ネートの可溶化画分を、モノクローナル抗体を結合した
カラムに通してアフィニティークロマトを行うことによ
シ製造することができる。アフィニティークロマトを行
う前に、正常抗体結合カラムにホモジネート可溶化画分
を通し、非特異的反応物質を除去しておくことが好まし
い。
得られた抗原は、次の性質を有する。
（１）分子量
約３ａＯＯＯ−４２０００（Ｓ Ｄ Ｓ−／リアクリル
アミドグル電気泳動法、ウェスタンイムノプロット分析
） （２）抗体上の反応性 ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、過ヨウ素酸カ
リウム処理によって抗体との反応性が消失する。
アミドグル電気泳動法、ウェスタンイムノプロット分析
） （２）抗体上の反応性 ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、過ヨウ素酸カ
リウム処理によって抗体との反応性が消失する。
抗体との反応性から、本発明抗原は糖タン、ｅり質であ
シ、抗体の結合部位は糖部分にあると考えられる。
シ、抗体の結合部位は糖部分にあると考えられる。
本発明の抗原に特異的な抗体を利用して、本発明の抗原
を測定するには、自体公知の免疫測定法に従って実施す
ることができる。
を測定するには、自体公知の免疫測定法に従って実施す
ることができる。
本発明の抗原に特異的な抗体としては、？リフローナル
抗体、モノクローナル抗体の両者が挙げられ、それぞれ
単独でも組合せても使用できる。
抗体、モノクローナル抗体の両者が挙げられ、それぞれ
単独でも組合せても使用できる。
免疫測定法の例としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、エンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ）、免疫−螢
光試験、ラテックス凝集試験、血球凝集法等が挙げられ
る。
Ａ）、エンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ）、免疫−螢
光試験、ラテックス凝集試験、血球凝集法等が挙げられ
る。
ＲＩＡにおいては任意の公知の変法を用いることができ
、例えば均一相でのＲＩＡ、固相ＲＩＡ。
、例えば均一相でのＲＩＡ、固相ＲＩＡ。
平均−ＲＩＡ、シングルＲＩＡ、ダブル（サンドインチ
）ＲＩＡを用いて抗原の直接または間接（競合法）測定
を行なうことができる。就中、サンドインチラジオイム
ノアッセイが％に好ましく、この方法においてはモノク
ローナル抗体によシ被覆された担体と試験溶液をインキ
ュベートし、次に１２５工で放射性ラベルされたモノク
ローナル抗体の溶液（この溶解したモノクローナル抗体
は、担体に結合しているモノクローナル抗体が認識する
エピトープとは異なるエピトープを認識する）とインキ
ュベートし、そして担体に結合した放射能を測定するこ
とによシ試験溶液中の抗原量を測定する。用いられる担
体としては、例えば？リスチレン、？リプロピレン、も
しくは？リピニルクロリド製のタイタープレート、もし
くは試験管のプラスチック表面、ガラス製もしくはプラ
スチック製ビーズ、濾紙、又はデキストラン、酢酸セル
ロースモジくハニトロセルロースのシート、するいはこ
れらに類似するものが挙げられる。
）ＲＩＡを用いて抗原の直接または間接（競合法）測定
を行なうことができる。就中、サンドインチラジオイム
ノアッセイが％に好ましく、この方法においてはモノク
ローナル抗体によシ被覆された担体と試験溶液をインキ
ュベートし、次に１２５工で放射性ラベルされたモノク
ローナル抗体の溶液（この溶解したモノクローナル抗体
は、担体に結合しているモノクローナル抗体が認識する
エピトープとは異なるエピトープを認識する）とインキ
ュベートし、そして担体に結合した放射能を測定するこ
とによシ試験溶液中の抗原量を測定する。用いられる担
体としては、例えば？リスチレン、？リプロピレン、も
しくは？リピニルクロリド製のタイタープレート、もし
くは試験管のプラスチック表面、ガラス製もしくはプラ
スチック製ビーズ、濾紙、又はデキストラン、酢酸セル
ロースモジくハニトロセルロースのシート、するいはこ
れらに類似するものが挙げられる。
ＥＩＡにおいては、ＥＬＩＳＡ（エンザイムリンクドイ
ムノゾルベントアツセイ）二抗体サンドイツチ法が好ま
しく、この方法においては、ＲＩＡ試験について前記し
た担体にモノクローナル抗体を被覆し、試験溶液と共に
インキュベートシ、そして次に抗原に反応性を有する酵
素ラベルされた、ｊｅ ＩＪクローナル抗体溶液又は、
担体に結合したモノクローナル抗体が認識するエピトー
プとは異なるエピトープを１！！！！識する酵素ラベル
されたモノクローナル抗体溶液とインキュベートし、結
合した抗原量を酵素−基質反応によシ測定する。
ムノゾルベントアツセイ）二抗体サンドイツチ法が好ま
しく、この方法においては、ＲＩＡ試験について前記し
た担体にモノクローナル抗体を被覆し、試験溶液と共に
インキュベートシ、そして次に抗原に反応性を有する酵
素ラベルされた、ｊｅ ＩＪクローナル抗体溶液又は、
担体に結合したモノクローナル抗体が認識するエピトー
プとは異なるエピトープを１！！！！識する酵素ラベル
されたモノクローナル抗体溶液とインキュベートし、結
合した抗原量を酵素−基質反応によシ測定する。
この発明のＥＩＡにおける好ましい酵素は、ホースラデ
ィッシュノｑ−オキシダーゼやアルカリ性ホスファター
ゼ及びβ−ガラクトシダーゼなどである。
ィッシュノｑ−オキシダーゼやアルカリ性ホスファター
ゼ及びβ−ガラクトシダーゼなどである。
ＲＩＡに比べて、ＥＩＡは、放射能を測定する場合のよ
うな複雑な測定装置を必要とせず、そして放射性物質を
取シ扱う場合に比べて厳重でない安全基準を満たせばよ
いという利点を有する。
うな複雑な測定装置を必要とせず、そして放射性物質を
取シ扱う場合に比べて厳重でない安全基準を満たせばよ
いという利点を有する。
本発明の他の測定法として、例えば、螢光物質トノ抗体
結合体を用いるイムノフルオレッセンス試験、抗体で被
覆されたラテックス粒子もしくは抗原で被覆されたラテ
ックス粒子を用いるラテツクス凝集法、又は抗体で被覆
された赤血球もしくは抗原で被覆された赤血球を使用す
る血球凝集法、等が含まれる。
結合体を用いるイムノフルオレッセンス試験、抗体で被
覆されたラテックス粒子もしくは抗原で被覆されたラテ
ックス粒子を用いるラテツクス凝集法、又は抗体で被覆
された赤血球もしくは抗原で被覆された赤血球を使用す
る血球凝集法、等が含まれる。
上記本発明測定法を実施するにあたっては、予め本発明
モノクローナル抗体、本発明抗原その他の附属物を組み
合せてなる試験キットを準備しておくことが好ましい。
モノクローナル抗体、本発明抗原その他の附属物を組み
合せてなる試験キットを準備しておくことが好ましい。
ラジオイムノアッセイのためのこの試験キットは、例え
ば、適当な担体にモノクローナル抗体を結合させた固相
−次抗体 １２１１１で標識されたモノクローナル抗体
（担体に結合したモノクローナル抗体が認識するエピト
ープとは異なるエピトープをｇ繊するモノクローナル抗
体）の場合によっては凍結乾燥された又は濃縮された溶
液、精製抗原の標準液、緩衝液、並びに場合によっては
、非特異的な吸着及び凝集の形成を防止するための洗剤
、ピペット、反応器、等を含む。
ば、適当な担体にモノクローナル抗体を結合させた固相
−次抗体 １２１１１で標識されたモノクローナル抗体
（担体に結合したモノクローナル抗体が認識するエピト
ープとは異なるエピトープをｇ繊するモノクローナル抗
体）の場合によっては凍結乾燥された又は濃縮された溶
液、精製抗原の標準液、緩衝液、並びに場合によっては
、非特異的な吸着及び凝集の形成を防止するための洗剤
、ピペット、反応器、等を含む。
エンザイムイムノアツセイのためのこの試験キットは、
例えば、適当な担体にモノクローナル抗体を結合させた
固相−次抗体、酵素ラベルされたモノクローナル抗体（
担体に結合したモノクローナル抗体が認識するエピトー
プとは異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体
）もしくは、同様に酵素ラベルされた一すクローナル抗
体の場合によっては凍結乾燥された又は濃縮された溶液
、精製抗原の標準液、緩衝液、固体の又は溶解した形の
酵素基質、酵素反応停止剤、並びに場合によっては、非
特異的な吸着及び凝集の形成を防止する丸めの洗剤、ピ
ペット、反応器、等を含む。
例えば、適当な担体にモノクローナル抗体を結合させた
固相−次抗体、酵素ラベルされたモノクローナル抗体（
担体に結合したモノクローナル抗体が認識するエピトー
プとは異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体
）もしくは、同様に酵素ラベルされた一すクローナル抗
体の場合によっては凍結乾燥された又は濃縮された溶液
、精製抗原の標準液、緩衝液、固体の又は溶解した形の
酵素基質、酵素反応停止剤、並びに場合によっては、非
特異的な吸着及び凝集の形成を防止する丸めの洗剤、ピ
ペット、反応器、等を含む。
なお、本発明測定法で使用される？リフローナル抗体は
、本発明抗原で免疫された動物から常法によシ採取する
ことができる。例えば本発明抗原でモルモットを数回免
疫し、該抗原に対する抗体価が最高に達した時採血し血
清を分離する。この血清を５０％飽和硫安で塩析し、リ
ン酸緩衝液で透析した後、セファクリルＳ−２００カラ
ムタ日マドグラフィーを行ない、精製モルモツ）ＩｇＧ
分画を得る。
、本発明抗原で免疫された動物から常法によシ採取する
ことができる。例えば本発明抗原でモルモットを数回免
疫し、該抗原に対する抗体価が最高に達した時採血し血
清を分離する。この血清を５０％飽和硫安で塩析し、リ
ン酸緩衝液で透析した後、セファクリルＳ−２００カラ
ムタ日マドグラフィーを行ない、精製モルモツ）ＩｇＧ
分画を得る。
本発明の抗原、モノクローナル抗体、免疫測定法を利用
してヒトの体液、例えば血液中の抗原量を測定すること
によシ大腸癌の確定診断及び予後判定が可能となる。
してヒトの体液、例えば血液中の抗原量を測定すること
によシ大腸癌の確定診断及び予後判定が可能となる。
次に実施例を挙げて本発明を説明する。但しこれによシ
本発明が限定されるものではない。
本発明が限定されるものではない。
実施例１
モノクローナル抗体の製造：
ＢＡＬＢ／Ｃ％ ｎｕ／ｎｕのヌードマウスの皮下で継
代されているヒト大腸癌（Ｃｏｉ□ｎ６ ）を免疫原
とした。Ｃｏ１ｏｎ ６はＳ状結腸癌の肝転移巣由来で
あシ、組織型は高分化型腺癌である。継代されているＣ
ｏ１ｏｎ ６をヌードマウス皮下より無菌的に摘出し、
ハサミで細切の後メツシュを用いて濾過し、腫瘍細胞１
．５Ｘ１０’個を０．８−のリン酸緩衝液（ＮａＣＬ
： ８． Ｏｆ 、 ＫＣｌ ： ０．２ ｆ 、 Ｎ
ａ＊ＨＰ０４ｅ１２ Ｈ２Ｏ＠ ２．９ ｆ ｔ ＫＨ
！Ｐ Ｏａ ： Ｏ−２ｔ ＊脱イオン水１０００ｄ）
に浮遊させた。これを、８週令の雄性ＢＡＬＢ／Ｃマウ
スの皮下および腹腔内に半量づつ投与した。この免疫操
作を１ｏ日間隔で３回にわたって行ない、最終免疫は上
記浮遊細胞を静脈内注入した。
代されているヒト大腸癌（Ｃｏｉ□ｎ６ ）を免疫原
とした。Ｃｏ１ｏｎ ６はＳ状結腸癌の肝転移巣由来で
あシ、組織型は高分化型腺癌である。継代されているＣ
ｏ１ｏｎ ６をヌードマウス皮下より無菌的に摘出し、
ハサミで細切の後メツシュを用いて濾過し、腫瘍細胞１
．５Ｘ１０’個を０．８−のリン酸緩衝液（ＮａＣＬ
： ８． Ｏｆ 、 ＫＣｌ ： ０．２ ｆ 、 Ｎ
ａ＊ＨＰ０４ｅ１２ Ｈ２Ｏ＠ ２．９ ｆ ｔ ＫＨ
！Ｐ Ｏａ ： Ｏ−２ｔ ＊脱イオン水１０００ｄ）
に浮遊させた。これを、８週令の雄性ＢＡＬＢ／Ｃマウ
スの皮下および腹腔内に半量づつ投与した。この免疫操
作を１ｏ日間隔で３回にわたって行ない、最終免疫は上
記浮遊細胞を静脈内注入した。
Ｃｏ１ｏｎ ６で過免疫したマウスを最終免疫の３日後
に層殺し、牌臓を無菌的に取シ出しく牌被膜を除去して
１ｘ１０８個の°牌細胞を得た。混入した赤血球をトリ
ス・塩化アンモニウム溶液で溶血せしめた後、ＲＰＭｌ
１６４０にて３回洗浄した。
に層殺し、牌臓を無菌的に取シ出しく牌被膜を除去して
１ｘ１０８個の°牌細胞を得た。混入した赤血球をトリ
ス・塩化アンモニウム溶液で溶血せしめた後、ＲＰＭｌ
１６４０にて３回洗浄した。
一方、細胞融合には抗体非産生型のＰ３．Ｘ６３゜Ａｇ
８．６５３ マウス骨髄腫細胞を用いた。Ｐ３．Ｘ６
３、Ａｇ８．６５３はＣｏｒｎｉｎｇ社製の培養フラス
コ（＄２５１００ ）内において、１０チウシ胎児血清
（Ｆｅ２ 、 Ｆｌｏｗ社）を含むＲＰＭＩ １６４
０で培養維持されている。細胞融合には対数増殖期にあ
る細胞を用いた。
８．６５３ マウス骨髄腫細胞を用いた。Ｐ３．Ｘ６
３、Ａｇ８．６５３はＣｏｒｎｉｎｇ社製の培養フラス
コ（＄２５１００ ）内において、１０チウシ胎児血清
（Ｆｅ２ 、 Ｆｌｏｗ社）を含むＲＰＭＩ １６４
０で培養維持されている。細胞融合には対数増殖期にあ
る細胞を用いた。
この骨髄腫細胞をｆベツティングにより培養フラスコよ
シ剥離し、２Ｘ１０７個に調整した後、ＲＰＭＩ １
６４０にて３回洗浄した。洗浄した牌細胞と骨髄腫細胞
をＲＰＭＩ １６４０内で十分に混和し、１２００回
転、１０分間の遠心を行なって培養液を除去した。混合
ペレットに５０％、３５ リエチレン・グリコール（和
光紬薬、 Ｍ、 Ｗ、 １５４０）０．５ｄを徐々に加
え、３７℃で２分間攪拌した。
シ剥離し、２Ｘ１０７個に調整した後、ＲＰＭＩ １
６４０にて３回洗浄した。洗浄した牌細胞と骨髄腫細胞
をＲＰＭＩ １６４０内で十分に混和し、１２００回
転、１０分間の遠心を行なって培養液を除去した。混合
ペレットに５０％、３５ リエチレン・グリコール（和
光紬薬、 Ｍ、 Ｗ、 １５４０）０．５ｄを徐々に加
え、３７℃で２分間攪拌した。
ついで、５分間かけてＲＰＭＩ １６４０をゆつ〈シ
加え１０ｍに希釈した。１０００回転５分間の遠心で、
？リエチレンーグリコールを除去した後、融合ペレット
に１０％ｒｃｓ含ＲＰＭＩ １６４０を８〇−加え、
９６孔組織培養プレート（Ｃｏ５ｔａｒ社、＄３５９６
）に０．２−づつ分注した。これを、３７℃、５％炭酸
ガス培養器で培養し、翌日よシＨＡ Ｔ ５ｅｌｅｃｔ
ｉｏｎを開始した。すなわち、培養上清の半量をＨＡＴ
培地（１０％ＦＣ８含ＲＰＭ１１６４０、ヒ？キサンチ
ン１．３６ ′ＩＩｇ／ ｄｔ、 アミノゾテリン１
９．１μｔ／ｄｔ、チミジン３８７μｔ／ｄｔ ）で
交換し、以後、５−７日毎に培養上清の半量をＨＡＴ培
地に交換した。融合操作を行なって１８日目と２９日目
に、融合細胞（ハイプリドーマ）のコロニーが認められ
たウェルよシ培養上清を採取し、その抗体活性を酵素抗
体法を用いて検討した。
加え１０ｍに希釈した。１０００回転５分間の遠心で、
？リエチレンーグリコールを除去した後、融合ペレット
に１０％ｒｃｓ含ＲＰＭＩ １６４０を８〇−加え、
９６孔組織培養プレート（Ｃｏ５ｔａｒ社、＄３５９６
）に０．２−づつ分注した。これを、３７℃、５％炭酸
ガス培養器で培養し、翌日よシＨＡ Ｔ ５ｅｌｅｃｔ
ｉｏｎを開始した。すなわち、培養上清の半量をＨＡＴ
培地（１０％ＦＣ８含ＲＰＭ１１６４０、ヒ？キサンチ
ン１．３６ ′ＩＩｇ／ ｄｔ、 アミノゾテリン１
９．１μｔ／ｄｔ、チミジン３８７μｔ／ｄｔ ）で
交換し、以後、５−７日毎に培養上清の半量をＨＡＴ培
地に交換した。融合操作を行なって１８日目と２９日目
に、融合細胞（ハイプリドーマ）のコロニーが認められ
たウェルよシ培養上清を採取し、その抗体活性を酵素抗
体法を用いて検討した。
本発明の抗原を発現しているヒト大腸癌細胞培養株ＳＷ
Ｉ １１６を標的細胞とし、酵素抗体法を用いてハイプ
リドーマ上清中の抗体活性を検討した。１０％ＦＣ８含
ＲＰＭＩ １６４０の培地中で継代されているＳＷＩ
１１６を０．５％トリノシン（Ｓｉｇｍａ社）含ＰＢ
８２ｍ、０．１％ＥＤＴＡ（和光紬薬）含ＰＢＳ２−を
加えて培養フラスコより剥離した。１０００回転５分間
の遠心でトリジシン、ＥＤＴＡを除去した後、ペレット
に培地を加えて１−当たシ２×１０″個に調整した。こ
れをマイクロテストプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、＄３０
３４）に１ウエル当たシ２−３Ｘ１０３個播き、３７℃
、５％炭酸ガス培養器で培養した。２４−４８時間後プ
レートをＰＢＳで洗浄し、各ウェルにノーイブリドーマ
培養上清１５μｔを加え、３７℃で４５分間反応させた
。コントロールとして１０ ％ ＦＣ８含ＲＰＭＩ
１６４０を用いた。反応終了後ＰＢＳにてプレートを３
回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫グ
ロブリンＩｇＧ ＋ ＩｇＡ ＋ＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅ
ｄ社）１０００倍溶液を１ウエル当たシ１５μを加え、
３７℃で４５分間反応させた。ＰＢＳにて充分洗浄の後
、酵素基質としてＡ Ｂ Ｔ Ｓ （２ｓ ”−７ゾノ
ーゾー（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）・２ ＮＨ４３ｆａ液（０，５ｍｙ／ゴ）を１ウエル
当たシ１５μを加え室温に放置し九。２０分後に緑色の
呈色の有無を肉眼的に判定し、コントロールに比べ有意
の呈色があるものを反応陽性とした。抗体活性が認めら
れたハイプリドーマについては、さらに反応特異性を検
討した。
Ｉ １１６を標的細胞とし、酵素抗体法を用いてハイプ
リドーマ上清中の抗体活性を検討した。１０％ＦＣ８含
ＲＰＭＩ １６４０の培地中で継代されているＳＷＩ
１１６を０．５％トリノシン（Ｓｉｇｍａ社）含ＰＢ
８２ｍ、０．１％ＥＤＴＡ（和光紬薬）含ＰＢＳ２−を
加えて培養フラスコより剥離した。１０００回転５分間
の遠心でトリジシン、ＥＤＴＡを除去した後、ペレット
に培地を加えて１−当たシ２×１０″個に調整した。こ
れをマイクロテストプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、＄３０
３４）に１ウエル当たシ２−３Ｘ１０３個播き、３７℃
、５％炭酸ガス培養器で培養した。２４−４８時間後プ
レートをＰＢＳで洗浄し、各ウェルにノーイブリドーマ
培養上清１５μｔを加え、３７℃で４５分間反応させた
。コントロールとして１０ ％ ＦＣ８含ＲＰＭＩ
１６４０を用いた。反応終了後ＰＢＳにてプレートを３
回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫グ
ロブリンＩｇＧ ＋ ＩｇＡ ＋ＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅ
ｄ社）１０００倍溶液を１ウエル当たシ１５μを加え、
３７℃で４５分間反応させた。ＰＢＳにて充分洗浄の後
、酵素基質としてＡ Ｂ Ｔ Ｓ （２ｓ ”−７ゾノ
ーゾー（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸
）・２ ＮＨ４３ｆａ液（０，５ｍｙ／ゴ）を１ウエル
当たシ１５μを加え室温に放置し九。２０分後に緑色の
呈色の有無を肉眼的に判定し、コントロールに比べ有意
の呈色があるものを反応陽性とした。抗体活性が認めら
れたハイプリドーマについては、さらに反応特異性を検
討した。
次にヒト赤血球・リン、Ｑ球との反応性について試験を
行なった。すなわち、Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ各血液型の健常
人１０人より末梢血の提供を受けて、その赤血球・リン
、Ｑ球をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いて分離し
、各型の赤血球同士、リン、Ｑ球同士を同じ比率で混合
した。混合した赤血球をＰＢＳにて希釈し、０．１％（
ｖ／ｖ ）量とし、その１００μｔを塩野義チューブに
入れた。また、リンフ９球もＰＢＳにて希釈し５ Ｘ
１０’個／Ｗｔとし、その１００μｔを塩野義チューブ
に入れ、赤血球と混和した。
行なった。すなわち、Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ各血液型の健常
人１０人より末梢血の提供を受けて、その赤血球・リン
、Ｑ球をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いて分離し
、各型の赤血球同士、リン、Ｑ球同士を同じ比率で混合
した。混合した赤血球をＰＢＳにて希釈し、０．１％（
ｖ／ｖ ）量とし、その１００μｔを塩野義チューブに
入れた。また、リンフ９球もＰＢＳにて希釈し５ Ｘ
１０’個／Ｗｔとし、その１００μｔを塩野義チューブ
に入れ、赤血球と混和した。
このチューブにハイプリドーマ培養上清１００Ｐｔを加
え、４℃で６０分反応させた。この時、陽性コントロー
ルとして、シト由来の全ての細胞と反応する既知のモノ
クローナル抗体Ｊ−２７を用いた。また、陰性コントロ
ールとして１０％ＦＣ８含ＲＰＭＩ １６４０ｔ−用
いた。ＰＢＳにて３回洗浄の後、ウサギ抗マウス免疫グ
ロブリン抗体（Ｄａｋｏ社）１００倍溶液５０ ｐＬと
ウサギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｍｉｌｅｓ社）１００倍溶
液５０ａｔを加え、４℃・で６０分反応させた。ＰＢＳ
で洗浄の後つぎに、１２５Ｉ−プロティンＡ （Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社）を１チユーブ当たり０．０８．３μＣｉ
（約１０万カウントに相当）加え、４℃で６０分反応
させた。洗浄の後、チューブの放射活性をガンマ・カウ
ンターで測定した。判定はカウント値が陰性コントロー
ル値の２倍以下を反応陰性とした。
え、４℃で６０分反応させた。この時、陽性コントロー
ルとして、シト由来の全ての細胞と反応する既知のモノ
クローナル抗体Ｊ−２７を用いた。また、陰性コントロ
ールとして１０％ＦＣ８含ＲＰＭＩ １６４０ｔ−用
いた。ＰＢＳにて３回洗浄の後、ウサギ抗マウス免疫グ
ロブリン抗体（Ｄａｋｏ社）１００倍溶液５０ ｐＬと
ウサギ抗マウスＩｇＭ抗体（Ｍｉｌｅｓ社）１００倍溶
液５０ａｔを加え、４℃・で６０分反応させた。ＰＢＳ
で洗浄の後つぎに、１２５Ｉ−プロティンＡ （Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社）を１チユーブ当たり０．０８．３μＣｉ
（約１０万カウントに相当）加え、４℃で６０分反応
させた。洗浄の後、チューブの放射活性をガンマ・カウ
ンターで測定した。判定はカウント値が陰性コントロー
ル値の２倍以下を反応陰性とした。
ヒト赤血球・リンフ９球との反応が陰性であったハイプ
リドーマについてさらに、ヒト線維芽細胞培養株および
ヒト癌細胞培養株との反応性を酵素抗体法を用いて検討
した。ヒト由来の細胞培養株には、ヒト正常線維芽細胞
株ＨＥＬ、およびヒト癌細胞培養株として、大腸癌由来
のＳＷＩ １１６を用いた。これらの培養株細胞３ ％
１０３個をマイクロテストプレートに播き、３７℃、
５チ炭酸ガス培養器内で２４−４８時間培養した。ＰＢ
Ｓでプレートを洗浄後、各ウェルにノ・イブリドーマ培
養上！１５μｔを加え、３７℃で４５分間反応させた。
リドーマについてさらに、ヒト線維芽細胞培養株および
ヒト癌細胞培養株との反応性を酵素抗体法を用いて検討
した。ヒト由来の細胞培養株には、ヒト正常線維芽細胞
株ＨＥＬ、およびヒト癌細胞培養株として、大腸癌由来
のＳＷＩ １１６を用いた。これらの培養株細胞３ ％
１０３個をマイクロテストプレートに播き、３７℃、
５チ炭酸ガス培養器内で２４−４８時間培養した。ＰＢ
Ｓでプレートを洗浄後、各ウェルにノ・イブリドーマ培
養上！１５μｔを加え、３７℃で４５分間反応させた。
ＰＢＳにて３回洗浄の後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ
抗マウスＩｇＧ ＋ ＩｇＡ ＋ ＩｇＭ抗体１０００
倍溶液を１５μを加えさらに、３７℃で４５分間反応さ
せた。ＰＢＳで洗浄の後、基質としてｋＢＴＢ＠液１５
μ液管５μｔ温に放置した。
抗マウスＩｇＧ ＋ ＩｇＡ ＋ ＩｇＭ抗体１０００
倍溶液を１５μを加えさらに、３７℃で４５分間反応さ
せた。ＰＢＳで洗浄の後、基質としてｋＢＴＢ＠液１５
μ液管５μｔ温に放置した。
２０分後に緑色の発色を肉眼的に判定した。濃い緑色を
呈したものを陽性、発色が認められなかったものを陰性
とした。発色が陽性であったＩ〜イブリドーマは、２４
孔組織培養プレートに移し、ＨＴ培地（１０％ＦＣ８含
ＲＰＭＩ １６４０、ヒ？キサンチン１．３６”Ｆ／
ｄＺ１チミゾン３８７μｆ／ｄｔ ）で増殖させ、さら
に１２孔組織培養プレートに移し、１０％ＦＣ８含ＲＰ
ＭＩ １６４０で培養した。次に、限界希釈法にて２
回クローニングした。この際ｆｅｅｄｅｒとして１ウエ
ル当たシ５ Ｘ １０’個のマウス胸腺細胞を用いた。
呈したものを陽性、発色が認められなかったものを陰性
とした。発色が陽性であったＩ〜イブリドーマは、２４
孔組織培養プレートに移し、ＨＴ培地（１０％ＦＣ８含
ＲＰＭＩ １６４０、ヒ？キサンチン１．３６”Ｆ／
ｄＺ１チミゾン３８７μｆ／ｄｔ ）で増殖させ、さら
に１２孔組織培養プレートに移し、１０％ＦＣ８含ＲＰ
ＭＩ １６４０で培養した。次に、限界希釈法にて２
回クローニングした。この際ｆｅｅｄｅｒとして１ウエ
ル当たシ５ Ｘ １０’個のマウス胸腺細胞を用いた。
そして、モノクローナル抗体は、このクローニングされ
たハイプリドーマ培養上清から下記の精製法によシ得る
ことができる。又、大量にモノクローナル抗体を製造す
るには、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにシリスタン０．５ Ｍを
注射後、２−５日後にハイツリドーマ細胞を８ Ｘ １
０’個／マウス腹腔に注入し、８−１０日後に腹水を採
取した。３０匹のマウスから約５９１Ｉ＃ｔの腹水が得
られた。この腹水５９ゴに０、 ＯＩ Ｍリン酸緩衝生
理食塩水ｐＨ７，２を５９−加え、さらに飽和硫安溶液
９２７ｄ加えて１夜４℃に放置し、生じ九沈殿を集めた
。この沈殿を０．０２Ｍ ） リス塩酸緩衝液ｐＨ７，
２に溶解し、同緩衝液で１夜透析し、不溶の沈殿を遠心
分離で除き、上清液２６−を得た。次いであらかじめ０
．０２ Ｍ ）リス塩酸緩衝液で充分平衡化したＤＥＡ
Ｅ−７フイグル・ブルー１００ ｍｌのカラムにこの上
清液２６−を吸着させ０．０２ Ｍ トリス塩酸緩衝液
５００ ａｔと０．１ Ｍ ＮａＣ１，０，０・２ Ｍ
）リス塩酸緩衝液５００ｄでグラジェントで溶出させ
てモノクローナル抗体分画３００−を得た。次いでこの
分画をアミコンＹＭ−１０で限外濾過濃縮後、０．ｏＩ
Ｍ９ｙ酸緩衝生理食塩水ｐＨ７，２に対して２４時間透
析し、純化したモノクローナル抗体溶液５８ｍを得た。
たハイプリドーマ培養上清から下記の精製法によシ得る
ことができる。又、大量にモノクローナル抗体を製造す
るには、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにシリスタン０．５ Ｍを
注射後、２−５日後にハイツリドーマ細胞を８ Ｘ １
０’個／マウス腹腔に注入し、８−１０日後に腹水を採
取した。３０匹のマウスから約５９１Ｉ＃ｔの腹水が得
られた。この腹水５９ゴに０、 ＯＩ Ｍリン酸緩衝生
理食塩水ｐＨ７，２を５９−加え、さらに飽和硫安溶液
９２７ｄ加えて１夜４℃に放置し、生じ九沈殿を集めた
。この沈殿を０．０２Ｍ ） リス塩酸緩衝液ｐＨ７，
２に溶解し、同緩衝液で１夜透析し、不溶の沈殿を遠心
分離で除き、上清液２６−を得た。次いであらかじめ０
．０２ Ｍ ）リス塩酸緩衝液で充分平衡化したＤＥＡ
Ｅ−７フイグル・ブルー１００ ｍｌのカラムにこの上
清液２６−を吸着させ０．０２ Ｍ トリス塩酸緩衝液
５００ ａｔと０．１ Ｍ ＮａＣ１，０，０・２ Ｍ
）リス塩酸緩衝液５００ｄでグラジェントで溶出させ
てモノクローナル抗体分画３００−を得た。次いでこの
分画をアミコンＹＭ−１０で限外濾過濃縮後、０．ｏＩ
Ｍ９ｙ酸緩衝生理食塩水ｐＨ７，２に対して２４時間透
析し、純化したモノクローナル抗体溶液５８ｍを得た。
この溶液のタンノ９り質濃度は５．５１１Ｆ ／−であ
り、モノクローナル抗体はアクリルアミドディスク電気
泳動で単一のバンドを示した。
り、モノクローナル抗体はアクリルアミドディスク電気
泳動で単一のバンドを示した。
実施例２
抗原の精製：
ヌードマウスにて継代されているヒト大腸癌を摘出し、
１０ｍＭ）リス−ＨＣ１ｐＨ８，０，０，１４Ｍ塩化ナ
トリウム、２ｍＭフェニルメチルスル７オニルフルオラ
イドを含む溶液（均一バッファー）中で細断し、ホモジ
ナイザーにてホモジネート化した。以後のステップは全
て４℃で行なった。次にホモジネートに１０ｍＭ）リス
−ＨＣＬ ｐＨ８，０％０、１４ Ｍ塩化ナトリウム、
２ｍＭフェニルメチルスル７オエルフルオライド、１％
ＮＰ−４０ｔ”含む溶液（可溶化バッファー）を等量加
えて可溶化させた。可溶化した溶液を５分間、１０ｏｘ
ｒで遠心分離しポ核ともとの状態の組織を除去した。
１０ｍＭ）リス−ＨＣ１ｐＨ８，０，０，１４Ｍ塩化ナ
トリウム、２ｍＭフェニルメチルスル７オニルフルオラ
イドを含む溶液（均一バッファー）中で細断し、ホモジ
ナイザーにてホモジネート化した。以後のステップは全
て４℃で行なった。次にホモジネートに１０ｍＭ）リス
−ＨＣＬ ｐＨ８，０％０、１４ Ｍ塩化ナトリウム、
２ｍＭフェニルメチルスル７オエルフルオライド、１％
ＮＰ−４０ｔ”含む溶液（可溶化バッファー）を等量加
えて可溶化させた。可溶化した溶液を５分間、１０ｏｘ
ｒで遠心分離しポ核ともとの状態の組織を除去した。
上澄液を取シ出し、１時間、１３００００Ｘｔで遠心分
離した。この高速遠心分離からの上澄液をとシ、０．４
５μｍのフィルターにて濾過した。セファロース４Ｂ（
ファルマクア社）に正常ＩｇＧ抗体を結合させたカラム
に通して、非特異的反応物質を除去し九。次にセファロ
ース４Ｂ（ファルマシア社）に大腸癌に対して特異的反
応を有するモノクローナル抗体を結合させたカラムに通
してアフィニティークロマトを行なう。可溶化バッファ
ーで洗浄した後、４．５Ｍヨウ化ナトリウム溶液にて溶
出させて７ラクシヨンコレクターにて分取した。各フラ
クションをＥＬ Ｉ ＳＡ （エンザイムリンクドイム
ノソルベントアツセイ）にてモノクローナル抗体との反
応性の有無を測定した。反応陽性の７ラクシヨンを集め
て１０倍に希釈したＰＢＳにて透析を行なった。透析後
、溶液を凍結乾燥させて精製抗原を得た。
離した。この高速遠心分離からの上澄液をとシ、０．４
５μｍのフィルターにて濾過した。セファロース４Ｂ（
ファルマクア社）に正常ＩｇＧ抗体を結合させたカラム
に通して、非特異的反応物質を除去し九。次にセファロ
ース４Ｂ（ファルマシア社）に大腸癌に対して特異的反
応を有するモノクローナル抗体を結合させたカラムに通
してアフィニティークロマトを行なう。可溶化バッファ
ーで洗浄した後、４．５Ｍヨウ化ナトリウム溶液にて溶
出させて７ラクシヨンコレクターにて分取した。各フラ
クションをＥＬ Ｉ ＳＡ （エンザイムリンクドイム
ノソルベントアツセイ）にてモノクローナル抗体との反
応性の有無を測定した。反応陽性の７ラクシヨンを集め
て１０倍に希釈したＰＢＳにて透析を行なった。透析後
、溶液を凍結乾燥させて精製抗原を得た。
実施例３
抗原の生化学的分析：
抗原の分子量を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウェスタンイムノプロット
分析及び免疫染色から求めた。精製抗原をグルサンゾル
バッファー（１％ＳＯ８゜２０％グリセリン、０．００
１％ブロムフェノールブルー、２０ ｍＭ ）リス−Ｈ
ｃｔ Ｉ）Ｈ６，ｓ ）中に溶解し、濃縮グルのついた
ＳＯ８−）リスグリシン系（Ｌａｅｍｍｌｉ法、１９７
０ ）により、３％濃ｉグルをもつ１０％グル上で分離
した。ゲルの一部は８ｉ１ｖｅｒ ５ｔａｉｎ ＫＩＴ
（Ｂｉｏ −Ｒａｄ社）にて銀染色を行ない、他のグ
ルはＴｏｗｂｉｎらの方法（１９７９）に従って、分離
蛋白質をニトロセルロース膜（東洋濾紙のＴＭ−２）に
トランスファーさせた。トランスファーの終わったニト
ロセルロース膜を直ちに３チウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）−ＰＢＳの中に移し、室温下で６０分間ゆっくりと
振盪して、蛋白質と結合していない膜面をＢＳＡでブロ
ックした。次いで、Ｎａｋａｎｅ法（１９７８）にてホ
ースラディッシュノＱ−オキシ〆−ゼを結合させたモノ
クローナル抗体を含む３％ＢＳＡ、５％ヒツゾ血清、Ｐ
ＢＳと室温で１時間ゆつ〈シと振盪しながらインキュベ
ートさせた。抗体による処理が終了後、抗体希釈液を除
き水冷ＰＢＳで十分に洗浄し、５００μｆ／ｍ１ｏ−’
フェニレンシアミン、０．０３％Ｒｈｏｓ 、０．１
Ｍクエン酸塩−リン酸塩バッファーｐＨ５，Ｑで発色さ
せた。
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウェスタンイムノプロット
分析及び免疫染色から求めた。精製抗原をグルサンゾル
バッファー（１％ＳＯ８゜２０％グリセリン、０．００
１％ブロムフェノールブルー、２０ ｍＭ ）リス−Ｈ
ｃｔ Ｉ）Ｈ６，ｓ ）中に溶解し、濃縮グルのついた
ＳＯ８−）リスグリシン系（Ｌａｅｍｍｌｉ法、１９７
０ ）により、３％濃ｉグルをもつ１０％グル上で分離
した。ゲルの一部は８ｉ１ｖｅｒ ５ｔａｉｎ ＫＩＴ
（Ｂｉｏ −Ｒａｄ社）にて銀染色を行ない、他のグ
ルはＴｏｗｂｉｎらの方法（１９７９）に従って、分離
蛋白質をニトロセルロース膜（東洋濾紙のＴＭ−２）に
トランスファーさせた。トランスファーの終わったニト
ロセルロース膜を直ちに３チウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）−ＰＢＳの中に移し、室温下で６０分間ゆっくりと
振盪して、蛋白質と結合していない膜面をＢＳＡでブロ
ックした。次いで、Ｎａｋａｎｅ法（１９７８）にてホ
ースラディッシュノＱ−オキシ〆−ゼを結合させたモノ
クローナル抗体を含む３％ＢＳＡ、５％ヒツゾ血清、Ｐ
ＢＳと室温で１時間ゆつ〈シと振盪しながらインキュベ
ートさせた。抗体による処理が終了後、抗体希釈液を除
き水冷ＰＢＳで十分に洗浄し、５００μｆ／ｍ１ｏ−’
フェニレンシアミン、０．０３％Ｒｈｏｓ 、０．１
Ｍクエン酸塩−リン酸塩バッファーｐＨ５，Ｑで発色さ
せた。
５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンイムノプロット分析か
ら抗原の分子量は約３８，０００〜約４２．０００の範
囲内にあることが決定された。
ら抗原の分子量は約３８，０００〜約４２．０００の範
囲内にあることが決定された。
実施例４
免疫組織化学的測定：
胃癌、大腸癌、乳癌の凍結組織ブロックをクライオスタ
ットにて９ミクロンの厚さに切シ、非固定凍結切片を作
製した。この凍結切片を０．５チ過酸化水素で１０分間
インキュベートさせ、内因性ペルオキシダーゼをブロッ
クした。ＰＢＳで洗浄した後、１０％ウサギ血清を含む
ＰＢＳで１０分間インキュベートさせ、非特異的な二次
抗体の反応部分をブロックした。ＰＢＳで洗浄の後Ａモ
ノクローナル抗体溶液を加えて４５分間インキュベート
させた。更にＰＢＳで洗浄の後、二次抗体としてペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫グｏプリン（ＩｇＧ
ＸＩｇＡ ％ ＩｇＭ ）抗体１００倍希釈溶液を加
えた。４５分後ＰＢＳにて洗浄し、基質としてｄ ｉａ
ｍ １ｎｏｂｅｎｚ ｉｄ ｉｎ溶液（ｄ ｉａｍ １
ｎｏｂｅｎｚ ｉｄ １ｎ１００Ｗ、Ｈｚ（ｈ４０ｐＬ
、ＰＲ８２０ｍ）を加えて５分間インキュベートさせた
。最後に洗浄した後、ヘマトキシリン液で核を染め、脱
水し、包埋した。以上の反応は全て室温下で行なった。
ットにて９ミクロンの厚さに切シ、非固定凍結切片を作
製した。この凍結切片を０．５チ過酸化水素で１０分間
インキュベートさせ、内因性ペルオキシダーゼをブロッ
クした。ＰＢＳで洗浄した後、１０％ウサギ血清を含む
ＰＢＳで１０分間インキュベートさせ、非特異的な二次
抗体の反応部分をブロックした。ＰＢＳで洗浄の後Ａモ
ノクローナル抗体溶液を加えて４５分間インキュベート
させた。更にＰＢＳで洗浄の後、二次抗体としてペルオ
キシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫グｏプリン（ＩｇＧ
ＸＩｇＡ ％ ＩｇＭ ）抗体１００倍希釈溶液を加
えた。４５分後ＰＢＳにて洗浄し、基質としてｄ ｉａ
ｍ １ｎｏｂｅｎｚ ｉｄ ｉｎ溶液（ｄ ｉａｍ １
ｎｏｂｅｎｚ ｉｄ １ｎ１００Ｗ、Ｈｚ（ｈ４０ｐＬ
、ＰＲ８２０ｍ）を加えて５分間インキュベートさせた
。最後に洗浄した後、ヘマトキシリン液で核を染め、脱
水し、包埋した。以上の反応は全て室温下で行なった。
この切片を、１００倍の倍率で鏡検しｄ ｉａｍｉｎｏ
ｂｅｎｚ １ｄｉｎにて茶褐色に染まった細胞が全体の
１０％以上を占めたものを反応陽性、それ以下を反応陰
性として第１表に示した。
ｂｅｎｚ １ｄｉｎにて茶褐色に染まった細胞が全体の
１０％以上を占めたものを反応陽性、それ以下を反応陰
性として第１表に示した。
以下余白
第１表
実施例５
ＥＩＡによる抗原の定量：
直径６．５ ｙｕｘの？リスチレンゴール（株式会社イ
チゴ）を超音波洗浄し、０．０３％？リエチレ／イミン
溶液に入れて室温で２時間ゆっくりと攪拌した。蒸留水
で洗浄し、次に２％グルタルアルデヒド溶液（２％グル
タルアルデヒド、ｏ、 Ｉ Ｍ炭酸バツ７アーりＨ９，
Ｏ）に入れて３７℃で２時間ゆっくりと攪拌した。０．
１Ｍ炭酸バッファーで洗浄後、モノクローナル抗体溶液
（１００μｆ ／ｍｌモノクローナル抗体、０．１Ｍ炭
酸バッファーｐＨ９，０）に？リスチレン〆−ルを移し
、４℃にて１２時間ゆつくシと攪拌しながらインキュベ
ートさせた。ＰＢＳで３回洗浄して、３％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳの中に移し、モノクローナル
抗体と結合していない？リスチレンゴール表面をブロッ
クした。これを固相−次抗体とした。次に、固相−次抗
体と精製抗原の希釈液及び被検試料（患者血清及び健常
人血清）各３００μｔと室温で１時間インキュベートし
た。同相−次抗体をＰＢＳにて３回洗浄した。精製抗原
で免疫されたモルモットから得られた？リフローナル抗
体に、Ｎａｋａｎｅ法（１９７８）にてホースラディツ
シュ、Ｑ−オキシダーゼを標識した。ホースラディッシ
ュノｑ−オキシダーゼ標識？リクローナル抗体を含む３
％ＢＳＡ。
チゴ）を超音波洗浄し、０．０３％？リエチレ／イミン
溶液に入れて室温で２時間ゆっくりと攪拌した。蒸留水
で洗浄し、次に２％グルタルアルデヒド溶液（２％グル
タルアルデヒド、ｏ、 Ｉ Ｍ炭酸バツ７アーりＨ９，
Ｏ）に入れて３７℃で２時間ゆっくりと攪拌した。０．
１Ｍ炭酸バッファーで洗浄後、モノクローナル抗体溶液
（１００μｆ ／ｍｌモノクローナル抗体、０．１Ｍ炭
酸バッファーｐＨ９，０）に？リスチレン〆−ルを移し
、４℃にて１２時間ゆつくシと攪拌しながらインキュベ
ートさせた。ＰＢＳで３回洗浄して、３％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳの中に移し、モノクローナル
抗体と結合していない？リスチレンゴール表面をブロッ
クした。これを固相−次抗体とした。次に、固相−次抗
体と精製抗原の希釈液及び被検試料（患者血清及び健常
人血清）各３００μｔと室温で１時間インキュベートし
た。同相−次抗体をＰＢＳにて３回洗浄した。精製抗原
で免疫されたモルモットから得られた？リフローナル抗
体に、Ｎａｋａｎｅ法（１９７８）にてホースラディツ
シュ、Ｑ−オキシダーゼを標識した。ホースラディッシ
ュノｑ−オキシダーゼ標識？リクローナル抗体を含む３
％ＢＳＡ。
５チモルモット血清、ＰＢＳと洗浄した固相−次抗体と
を室温で１時間インキュベートした。固相−次抗体をＰ
ＢＳにて３回洗浄し、基質溶液（５００μＰ／ｍ１０−
フェニレンシアミン、０．０３％ＨｘＯｚ 、０．１
Ｍクエン酸塩−リン酸塩バッファー１）Ｈ５，０）７５
０μｔを加えて発色させた。酸素反応は４ Ｎ −Ｈ２
ＳＯ４を２５０μを加えて止め、発色の強さを波長４９
２ ｎｍに於いて分光光度計で測定した。精製抗原溶液
の希釈度と吸光度の値より標準曲線を作成し、第１図に
示した。又、被検試料中の抗原量を発色の強さ、即ち波
長４９２ ｎｍに於ける吸光度の値として第２図に示し
た。
を室温で１時間インキュベートした。固相−次抗体をＰ
ＢＳにて３回洗浄し、基質溶液（５００μＰ／ｍ１０−
フェニレンシアミン、０．０３％ＨｘＯｚ 、０．１
Ｍクエン酸塩−リン酸塩バッファー１）Ｈ５，０）７５
０μｔを加えて発色させた。酸素反応は４ Ｎ −Ｈ２
ＳＯ４を２５０μを加えて止め、発色の強さを波長４９
２ ｎｍに於いて分光光度計で測定した。精製抗原溶液
の希釈度と吸光度の値より標準曲線を作成し、第１図に
示した。又、被検試料中の抗原量を発色の強さ、即ち波
長４９２ ｎｍに於ける吸光度の値として第２図に示し
た。
第１図は実施例５によって得られた精製抗原溶液の希釈
度と吸光度との関係を示す図面で１）、第２図は実施例
５によって得られた健常人血清と大腸癌患者血清の吸光
度をそれぞれ示す図面である。 以上 ４９２ｎｍでの吸光度 第２図 健常人 大腸癌患者 血 清 血清
度と吸光度との関係を示す図面で１）、第２図は実施例
５によって得られた健常人血清と大腸癌患者血清の吸光
度をそれぞれ示す図面である。 以上 ４９２ｎｍでの吸光度 第２図 健常人 大腸癌患者 血 清 血清
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有するヒト大腸癌由来の抗原（１）分
子量 約３８，０００〜４２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法、ウエスタンイムノプロツト分析
） （２）抗体との反応性 ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、 過ヨウ素酸カリウム処理によつて抗体との反応性が消失
する。 ２、下記の性質を有するヒト大腸癌由来の抗原（１）分
子量 約３８，０００〜４２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法、ウエスタンイムノプロツト分析
） （２）抗体との反応性 ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、 過ヨウ素酸カリウム処理によつて抗体との反応性が消失
する。 に対して特異的であるモノクローナル抗体。 ３、下記の性質を有するヒト大腸癌由来の抗原（１）分
子量 約３８，０００〜４２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法、ウエスタンイムノプロツト分析
） （２）抗体との反応性 ノイラミニダーゼ処理、プロナーゼ処理、 過ヨウ素酸カリウム処理によつて抗体との反応性が消失
する。 に対して特異的な抗体を用いる該抗原の測定法。 ４、測定をラジオイムノアツセイによつて行うものであ
る特許請求の範囲第３項記載の測定法。 ５、測定をエンザイムイムノアツセイによつて行うもの
である特許請求の範囲第３項記載の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62040551A JPH0661276B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | 腫瘍関連抗原に特異的な抗体およびこれを利用する抗原の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62040551A JPH0661276B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | 腫瘍関連抗原に特異的な抗体およびこれを利用する抗原の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63207396A true JPS63207396A (ja) | 1988-08-26 |
| JPH0661276B2 JPH0661276B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=12583586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62040551A Expired - Fee Related JPH0661276B2 (ja) | 1987-02-24 | 1987-02-24 | 腫瘍関連抗原に特異的な抗体およびこれを利用する抗原の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0661276B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991006649A1 (en) * | 1989-11-07 | 1991-05-16 | The Green Cross Corporation | Mouse antibody v-region gene fragment and preparation of chimera antibody by using said gene fragment |
| EP1241264A1 (en) * | 1994-12-02 | 2002-09-18 | Chiron Corporation | Monoclonal antibodies to colon cancer antigen |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61282096A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-12-12 | ハイブリテツク・インコ−ポレイテツド | 新規な腫瘍関連抗原 |
-
1987
- 1987-02-24 JP JP62040551A patent/JPH0661276B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61282096A (ja) * | 1985-04-22 | 1986-12-12 | ハイブリテツク・インコ−ポレイテツド | 新規な腫瘍関連抗原 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991006649A1 (en) * | 1989-11-07 | 1991-05-16 | The Green Cross Corporation | Mouse antibody v-region gene fragment and preparation of chimera antibody by using said gene fragment |
| EP1241264A1 (en) * | 1994-12-02 | 2002-09-18 | Chiron Corporation | Monoclonal antibodies to colon cancer antigen |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0661276B2 (ja) | 1994-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4446122A (en) | Purified human prostate antigen | |
| CA1320459C (en) | Anti-human pulmonary carcinoma monoclonal antibody | |
| USRE33405E (en) | Purified human prostate antigen | |
| CA1339095C (en) | Purification of cancer-associated protein and preparation of antibody thereto | |
| US5512657A (en) | Detection of complexes which include basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases | |
| EP0232871A2 (en) | Human monoclonal antibody, hybridoma producing the same and its use | |
| JPS61282096A (ja) | 新規な腫瘍関連抗原 | |
| EP0200464B1 (en) | A tumor associated antigen | |
| AU661653B2 (en) | Monoclonal antibodies against tumor-associated antigens, a process for the preparation thereof and the use thereof | |
| US5338661A (en) | Monoclonal antibody specific for a human tumour-associated antigen | |
| JP2555028B2 (ja) | ヒト非−小細胞肺癌に関するモノクロ−ナル抗体 | |
| CA1165685A (en) | Purified prostatic tissue antigen | |
| JPS63207396A (ja) | 腫瘍関連抗原に特異的な抗体およびこれを利用する抗原の測定法 | |
| JPS63258898A (ja) | ヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼に対するモノクロ−ナル抗体、その製造法、該モノクロ−ナル抗体産生ハイブリド−マおよび該モノクロ−ナル抗体を用いたヒト▲膵▼ホスホリパ−ゼａ▲下２▼の測定方法 | |
| WO1990007116A1 (en) | Detection of basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases | |
| JPS6321562A (ja) | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体ａｍｃ−４６２ | |
| EP0145373A2 (en) | Purification of cancer-associated protein and preparation of antibody thereto | |
| Martin et al. | Characterization of the antigen identified by Po66: A monoclonal antibody raised against a lung squamous cell carcinoma | |
| US5264370A (en) | Detection of basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases | |
| EP0207170A1 (en) | Process for preparing human cancer-specific monoclonal antibody | |
| JP2878317B2 (ja) | ラミニン測定試薬 | |
| JPS6058926A (ja) | 肺小細胞癌細胞と反応するモノクロ−ナル抗体 | |
| JP2018062466A (ja) | 新規甲状腺癌関連抗原に結合する抗体および甲状腺癌診断剤 | |
| EP0242154A2 (en) | A novel tumor-associated antigen | |
| JPS60253871A (ja) | 抗アポａ−１抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |