JPS63212864A - 試料内の細胞の測定方法 - Google Patents

試料内の細胞の測定方法

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JPS63212864A
JPS63212864A JP62186770A JP18677087A JPS63212864A JP S63212864 A JPS63212864 A JP S63212864A JP 62186770 A JP62186770 A JP 62186770A JP 18677087 A JP18677087 A JP 18677087A JP S63212864 A JPS63212864 A JP S63212864A
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urine
sample
solution
iii
cells
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JP62186770A
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ロバート　トロコニス　ベリィ
シャリル　サンフォード　サリバン
リチャード シュミットウ エリック
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は試料中の細胞の測定方法に関する。それは特に
尿路感染症の測定に有用である。
〔従来の技術〕
感染症の迅速且つ有効な診断及び治療のためには病気の
原因である微生物をなるべく迅速に検出することができ
るのが望ましい。尿路感染症は最も普通の細菌感染症に
属し、頻度において呼吸経路感染症に次ぐものである。
その様な尿路感染症（ＵＴＩ）は、通常、有意性細菌板
と称される条件である尿１−当りｉｏｏ、ｏｏｏ以上の
生物体の細菌カウント数を伴うものである。
有意性細菌板の検出のための現在の実験室的方法は、微
生物を含有することが疑われた試料を培養することに基
づいている。しかしながら、これらの方法は時間がかか
り、又、相当な臨床的訓練及び設備を必要とする。
本発明者の実験室における共同研究者は、有意性細菌板
を示す細胞を尿試料から分離することができ、感受性レ
ドックス試薬を用いて検出することができることを見出
した。しかしながら、無菌尿が濾過され、緩衝液で洗浄
された後も、レドックス試薬は尿から残された少量の残
存還元性物質を検出するのに十分感受性であることが判
明した。
この様に、感染を含有しない尿試料が試験された場合に
も存在する外来性還元性物質により相当なバックグラウ
ンド密度が得られる。加えて、バックグラウンド密度は
患者毎に変化した。
尿試料は、少し述べるだけでも、グルタチオン、システ
ィン、尿酸及びアスコルビン酸などの広範囲の滞在的に
干渉性の還元剤を含有する。
板肉の細胞以外の物質の測定においては、還元剤により
引起される。干渉を減少するために試験前に、試料に物
質を添加するのが普通である。米国特許第３．４１１．
８８７号明細書（１９６８年１１月１９日発行）におい
ては試料にイオン化可能な重金属化合物を添加すること
を特徴とする処理が開示されている。被分析物質（例え
ばグルコース）を次いでオキシダーゼ酵素（例えばグル
コースオキシダーゼ）を用いて測定する。特開昭５８−
５５７５７号公報（１９８３年４月２日公開）には試料
に金属キレート化化合物（例えば鉄（ＩＩＩ）−エチレ
ンジアミン四酢酸［鉄（Ｉ［）ＥＤＴＡ］）を添加する
ことを特徴とする尿処理が開示されている。これらの文
献のいづれも有意性細菌尿の測定などの細胞の存在を測
定する問題に関するものではない。両者の場合において
、処理物質は引続く定量化反応がおこる時点において存
在する。
〔発明が解決しようとする問題点〕
細胞の測定において、本発明者は、鉄（ＩＩＩ）Ｅ［ｌ
Ｔ＾を単独で用いる処理は還元性物質によるバックグラ
ウンドの全てを除去するのに十分でないことを発見した
。例えば、無菌尿試料を鉄（ｍ）ＥＤＴＡのみを含有す
る溶液で洗浄した場合には、バックグラウンドは幾分減
少するが、しかし、望ましいものよりは高いバックグラ
ウンド密度が得られた。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明に従えば、試料内の細胞の測定方法であって、そ
の方法が （１）細胞を試料から分離する工程、 （２）分離した細胞を （ａ）鉄（ＩＩＩ）キレート溶液、及び（ｂ）非イオン
性界面活性剤溶液 で洗浄する工程、及び （３）洗浄細胞とレドックス試薬とを接触させて細胞の
存在により検出可能な変化を生成する工程・ を含んでなる方法が提供される。
〔作　用〕
本発明は細胞の検出、特に水性液体中の有意性細菌尿の
検出に関する。その中に細菌が含まれることの疑われた
任意の試料（例えば食物、組織、地下水、冷却水、薬品
、下水など）を試験することができるが、本発明はヒト
及び動物の生物学的流体（例えば尿、髄液、血液など並
びに大便懸濁液）及びヒト及び動物ｔａ織の懸濁液にお
ける細胞検出に特に有用である０本発明を実施するのに
用いられる好ましい生物学的流体はヒトの尿である。
、「細胞」は微生物体（例えば細菌、酵母及び真菌数）
のみならず、レドックス試薬により検出されるその他の
細胞も含めて意味する。
先ず、細胞を生物学的試料から分離する。濾過、遠心分
離或いは沈澱などの任意の方法を使用することができる
。濾過が最も便利であり、従って好ましい、尿の場合に
は、試料から細胞を除去するためには一般的に０．２　
ｔｎａ未満の孔径を有するフィルターを通しての濾過が
十分である。
分離された細胞を、次いで、鉄（■）キレートを含有す
る溶液及び界面活性剤を含有する溶液で洗浄する。
広範囲の鉄（ｍ）キレート類が有用である。このキレー
トは、多くが知られている適当なリガンドと鉄塩とを単
に混合することにより作ることができる。有用な鉄キレ
ートとしては以下のりガントの鉄（ＩＩＩ）キレートが
挙げられる：（ａ）エチレンジニトリロ四酢酸（Ｉ！Ｄ
ＴＡ）、（ｂ）ニトリロ三酢酸、 （Ｃ）ジエチレントリアミン五酢酸、 （ｄ）　　１　、３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパ
ンーＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−四酢酸、 （ｅ）　　１　、２−ジアミノプロパン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’
。
Ｎ′−四酢酸、 Ｃｆ）エチレンジアミン−Ｎ、Ｎ’−二酢酸、（ｇ）イ
ミノニ酢酸、 （ｈ）Ｎ−メチルイミノニ酢酸、 （ｉ）トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ
、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−四酢酸、 （ｊ）　　１　、３−ジアミノプロパン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’
。
Ｎ′−四酢酸、 及びそれらの塩類例えばＮａ或いはに塩。現在好ましい
りガントは（ａ）　、　（ｂ）　、輸）及び（ｈ）であ
る。
鉄（Ｉ［［）キレート溶液に加えて、細胞は又、非イオ
ン性界面活性剤でも洗浄される。鉄（Ｉ［Ｉ）キレート
及び界面活性剤は同−溶液或いは別々の溶液に存在する
ことができる。細胞を試料から濾過により分離した場合
に、鉄（Ｉ［Ｉ）キレート及び界面活性剤は濾過材料中
にあることができ、その場合には洗浄溶液がその場（ｉ
ｎ　５ｉｔｕ）で作成される。
有用な非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔａｎの
商品名（例えばＸ　−１００，１０２，１６５及び３０
５）　テＲｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ
から市販されているオクチルフェノキシポリエトキシエ
タノール頚、ＯｌｉｎＭａｔｈｉｅｓｏｎ　Ｃｏ、から
市販されているｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタ
ノール類、Ｔｅｒｇｉｔｏｌの商品名（例えば１５−３
−７及び１５−３−９）でＣ１ｎ１ｏｎ　Ｃａｒｂｉｄ
ｅ　Ｃｏ、から市販されているアルコールのポリエチレ
ングリコールエーテル、Ｔｗｅｅｎの商品名（例えば２
０　、８０）でＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓから市販され
ているポリオキシエチレン化合物及び天然の非イオン性
界面活性剤などが挙げられる。現在好ましい非イオン性
界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−４０５、Ｔｗｅｅｎ　２０及びＴｗｅｅｎ　８０
である。
洗浄溶液中の成分の濃度は重要ではない。典型的には溶
液中の鉄キレートの濃度は少なくとも約０．００１モル
、好ましくは約０．００５〜０．０１モルである。界面
活性剤の濃度は少なくとも約０．０５％、好ましくは約
０．１〜２％である。
広範囲のレドックス試薬を用いることができる。
特に好ましいレドックス試薬は水溶性コバルト（ＩＩＩ
）錯体、水溶性金属化可能色素及び好ましくは電子移動
剤及び炭素源を含んでなるコバルト（Ｉ［［）含有試薬
である。
もう一つの好ましいレドックス試薬はＰＣＴ／ＵＳ８６
／　００２４０号に記載されている。この出願において
は、還元時に検出可能な種を放出するベンゾキノン及び
ナフトキノン化合物が開示される。
もう一つのレドックス試薬は特開昭６１−２３１４４０
号公報に記載されている。この出願においては、鉄（Ｉ
ＩＩ）イオン及び還元時に鉄（ＩＩ）イオンを生成する
鉄（ＤＩ）配位リガンド及び鉄（ＩＩ）イオンと優先的
に配位して着色錯体を形成する第二の鉄（ｎ）イオン配
位リガンドのキレートよりなる組成物が開示されている
。
多くのその他のレドックス試薬が知られており、例えば
米国特許第４．３５１．８９９号明細書に記載されてい
るＮＡＤ、電子キャリヤー及びテトラゾリウム塩を含有
する組成物、米国特許第４．３０３．４０９号明細書に
記載されている多価金属イオンキレート及びその金属イ
オンと反応することのできる指示薬及び緩衝剤を含有す
る組成物、及び米国特許第３．３３１．７５２号、第３
．７１１，２５２号、第４．１０１，３８１号、第４．
１１６．７７４号、第４．２２４．０３４号及び第３．
９５４．４１２号各明細書に記載されているような各種
の還元性化合物を含有する組成物などが挙げられる。
前記の如く、現在好ましいレドックス試薬はコバル）　
（Ｉ［Ｉ）錯体含有試薬である。コバルト（ＩＩＩ）は
典型的には６個の配位数を有する三価金属である。コバ
ルト（ＩＩＩ）に配位する極めて広範囲のリガンドが知
られている。リガンドが負の電荷を有するように選ばれ
るならば、原子価は配位子により満たされることができ
る。反対に、配位子が電気的に中性であるならば、原子
価は非配位対イオンにより満たされなければならず、塩
が形成される。本発明に用いるためには、水溶性錯体が
必要とされる。より水溶性であるコバルト（ＩＩＩ）錯
体塩が好ましい。
Ｃｏ（ＩＩ［）錯体を形成するために有用な中性リガン
ドとしては、アンモニア；エチレンジアミン、プロピレ
ンジアミン、ジエチレントリアミンなどの脂肪族アミン
類；アニリン、２−アミノエチルアニリン、２，２′−
ビスアニリンなどの置換或いは未置換芳香族アミン頻；
ピリジン、２．２′−ビピリジン、２−（アミノメチル
）ピリジン、４．４′−ジメチル−２，２′−ビピリジ
ン、２゜２ｔ４ｒｚ−ターピリジン、モルホリン、ピリ
ミジン、ピリダジン、２，２′〜ビピリラジン、キノリ
ン、イソキノリン、アクリジン、チアゾール、イミダゾ
ール、トリアジン、１．１０−フェナントロリン、５−
ニトロフェナントロリン、２．２’−ビビリミジン、２
．２′−ジイミダゾールなどの置換或いは未置換複素環
式アミン類；及び酸素供与体リガンド例えばＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミドなどのアミド類及び水などが挙げら
れる。対イオンとしては任意のアニオンを用いることが
できる。便宜的には塩素、臭素、及びヨウ素などのハロ
ゲンイオンが好ましい、その他の有用な対アニオンとし
ては、例えばアジド、チオシアネート、テトラフルオロ
ボレート、硝酸、過塩素酸、ヘキサフルオロホスフェー
ト、硫酸、炭酸、スルホン酸及びカルボン酸イオンなど
が挙げられる。
アニオン配位子は又コバル）　（ＩＩ［）上の電荷が錯
体が塩であり従って水溶性であるようにリガンドにより
完全に中和されなければコバルト（Ｉ［）と配位しても
よい。有用なアニオン性リガンドとしては塩素、臭素、
ヨウ素或いはフン素などのハロゲン、アジド、チオシア
ネート、亜硝酸、炭酸、カルボン酸、スルホン酸、蓚酸
及び２．４−ペンタンジオン酸イオンが挙げられる。
本発明において有用なレドックス試薬において有用であ
るその他の成分は水溶性の金属化可能な色素である。コ
バルト（ｎ）及びコバルト（ＩＩＩ）イオンと配位する
ことのできる極めて広範囲の色素が有用である。これら
の色素は水溶性でなければならない。下記文献に示され
る特定の色素の多くは水溶性ではないが、しかし、常法
により色素分子中に適当な可溶化基を導入することによ
り容易に水溶性とすることができる。カルボン酸、スル
ホン酸及び硫酸基などの通常の可溶化基が有用である。
好ましい色素は又コバルトに対する三配座りガントであ
る。三配座りガントはより安定な錯体を形成し、従って
より容易にコバル）（ＩＩ）１１体がらりガントを置換
することができる。
これらの標準に留意して、有用な色素及び色素群は米国
特許第４．３９６，５４６号、第４．２７３．７０８号
、第４．２７２．４３４号、第４．０２４．９９３号、
第４．１４７．５４４号及び第４．４１９．４３５号各
明細書に開示されている。
尿試料内の細胞の検出において、レドックス試薬が又疑
われた微生物に対する尿素源を含有するのが好ましい、
疑われるあらゆる細胞に対して便利な炭素源はグルコー
スである。他の成分と同様に、炭素源は尿を濾過するた
めに用いられるフィルター材料或いはコバルト（１）　
レドックス試薬を担持する要素内に含ませることができ
る。
好ましい色素としては下記のものが挙げられる：２−（
（３−メチル−２−ピリジル）アゾツー１−ナフトール
−４−スルホン酸モノアンモニウム塩、 ２−（（５−カルボキシ−２−ピリジル）アゾツー１−
ナフトール−４−スルホン酸ジアンモニウム塩、及び ２−（（３−メチル−５−スルホ−２−ピリジル）アゾ
ツー１−ナフトール−４−スルホン酸ジアンモニウム塩
。
本発明において有用な組成物は、場合により、しかしな
がら好ましくは細胞からコバルト（Ｉ［Ｉ）錯体に電子
を移動することのできる電子移動剤（本発明においてＥ
ＴＡと称される）を包含するのがよい。一般的に、ＥＴ
Ａは還元性物質のそれよりもより正であり、及びコバル
ト（ＩＩＩ）錯体のそれよりも正でない電位を有するの
が望ましい。
本発明の実施において有用であるＥＴＡ化合物としては
、フェナジンメトサルフェート、フェナジンエトサルフ
ェート、及び同様な化合物、及び置換ベンゾキノリン類
及びナフトキノリン類などが挙げられる。必要に応じて
異ったＥＴＡ化合物の組合せを用いることができる。好
ましいＥＴＡ類はトリメチル−１，４−ベンゾキノン、
４．５−ジメトキシ−１，２−ベンゾキノン及び２．３
−ジメトキシー５−メチル−１，４−ベンゾキノンであ
る。
本発明の好ましい実施態様において、被試験尿試料は濾
過される。濾過された細胞は本発明に従って洗浄され、
及びレドックス試薬を次いで添加し、色変化の存在が決
定される。存在する感染の種類を決定することが望まし
い場合には、二つの尿試料を試験することができる。一
つの未処理試料を試験して如何なる種類の細胞の存在或
いは不存在を決定する。第二の試料は先ず、米国特許第
４．５２５，４３５号明細書（１９８５年６月２５日発
行）に記載されるようなアニオン性界面活性剤を用いて
処理する。
試験片がしばしば試験溶液に測定された量の試薬を運ぶ
ための便利な方法として用いられる。試験片を既に被測
定細胞を含有する可能性のある溶液中に入れる。試薬は
試験片から反応溶液を形成するように溶液中に溶解する
。本発明の試験片の好ましい実施態様においては、試薬
は水溶性バインダー中に担持される。試験片が溶液中に
浸漬されると、バインダーが溶解して試薬を放出する。
その理由は未だ判らないが、この放出態様は試薬の新た
に作成された溶液を用いるのに対比して改良された感度
を与える。有用な水溶性重合体としては、ポリ　（Ｎ−
ビニル−２−ピロリドン）単独重合体並びに共重合体〔
例、アクリルアミドとの例えばポリ　（アクリルアミド
−ニーＮ−ビニル−２−ピロリドン）　９０　：　１０
重量比など〕などのＮ−ビニルピロリドン重合体が挙げ
られる。
乾式分析素子に使用される場合に、組成物成分は吸水膨
潤、含浸、被覆或いは他の適用な技術により吸収剤担体
中に導入することができる。有用な吸収剤担体材料は不
溶性であり、水或いは尿或いは血清などの生理学的流体
に曝露された際にそれらの構造的一体性を維持する。有
用な吸収剤担体材料は紙、多孔性粒状構造体、多孔性重
合体、セルロース、木材、ガラス繊維、織布及び不織布
（合成及び非合成）などから調製することができる。有
用な乾式分析素子は組成物の溶液を材料中に吸収膨潤さ
せ乾燥させることにより作られる。
Ｍ二」」 以下の具体例においては、次の材料を用いた。
コバルト（ＩＩＩ）錯体は（２、２’−ビピリジン）ビ
ス（１，２−ジアミノエタン）コバルト（Ｉ［Ｉ）クロ
ライドであった。用いた色素は２−（（５−カルボキシ
−２−ピリジル）アゾ〕−１−ナフトールー４−スルホ
ン酸、ジアンモニウム塩であった。界面活性剤はＳｉｇ
ｍａ　Ｃｂｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（ミズーリー州、セ
ントルイス）から得られた。試料はＭｉｃｒｏＳｅｐＴ
ｌ′Ｉ０．５ｍセルロースアセテートフィルター　（Ｆ
ｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　ニューヨ
ーク州、ロチニスター）を通してミリボヮフィルター装
置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｏ　Ｃｏｒ＋）、　　メリーラン
ド州、ベッドフォード）内において濾過した。Ｐ　３０
０プレフィルタ−はＮｕｃｌｅｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　
（カリフォルニア州、プレザントン）から得られた。ナ
イロン徽多孔膜はＰａ１ｌＣｏｒｐ、　にューヨーク州
、グレンコープ）から得られた。
以下余白 〔実施例〕 コζ：がεｍ：　　　の　′、の小における゛の六ｌｃ
ｄ片のセルロースアセテートフィルター材料（口径０．
５−１ＭｔｃｒｏＳｅｐ）をガラスフリット支持体上に
置き、６００Ｉ１１の尿試料を約１ｋｇ／ｃｎｌの真空
においてフィルターを通して濾過した。
フィルターを次いで５００　ＩＩＩの（ａ）　０．０５
モル濃度のリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）、ｐＨ７，
８、（ｂ）０．０５モル濃度のＫＰＢ　、　ｐＨ７，８
中０．０１モル濃度のＦｅ（Ｉ［Ｉ）　ＥＤＴＡ、　（
ｃ）　０．０５モル濃度のＫＰＢ　、　ｐｉ（７，８中
０．０１モルＦｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ　　Ｘ−１００。
或いは（ｄ）　０．０５モル濃度のＫＰＢ　、　ｐＨ７
，８中１％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００のいづれかで洗
浄し、次いで２−の０．０５モルＫＰＢ　、　ｐＨ６，
８で洗浄した。
フィルター材料をフリット支持体から取出して、１−の
ポリスチレンキュベツト内に入れた。コバルト細胞検出
試薬は２．４−の０．０５Ｍ　ＸＰＢ、　ｐＨ６，８，
０，５艷のコバルト（ＩＩＩ）溶液（水中６　ｍＭ）を
５０４の色素溶液（水中７．５ｍＭ）　、２５　ｐｌの
グルコース溶液（■２０中１０重量％）及び２５μｌの
２，３−ジメトキシ−５−メチル−１，４−ベンゾキノ
ン溶液（メタノール中０．ＯＩＭ）に添加することによ
り調製した。１−の試薬を各キュベツト中に分散した。
これらのキュベツトを３７℃においてインキュベートし
、３０分後２００Ｉの試料を取出し、透明マイクロタイ
タープレート内に入れ、６１０ｎｍにおいて読取った。
表１はプレート培養時に成長を示さなかった６つの尿即
ち無菌尿に存在する干渉を除去する際のＦｅ（ＩＩＩ）
　ＥＤＴＡ及びＦｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ／Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００洗浄の効果を示す。ＫＰＢ洗浄対照例及
びＦｅ（ＩＩＩ）ＥＤＴＡ対照例に対比してＦｅ（ＩＩ
Ｉ）　ＥＤＴＡ／ＴＸ−１００洗浄についてはバックグ
ラウンドに明瞭な減少が存在した。追加の研究において
、顕微鏡検査により尿阻６は処理後の残存高バックグラ
ウンドの原因である尿酸結晶を含有することが示された
。尿隘４における高バックグラウンドは検討されなかっ
た。尿は病院からのものであったので、この尿が高バン
クグラウンドを引起こすその他の干渉物質を含有した可
能性がある。
表−一」− 尿阻１　　　　　　０．４４０　　　　０．２２０　　
　０．１９０尿１１ｍ　２　　　　　　０．４６６　　
　　０．１４３　　　０．１１５尿磁３　　　　　　　
Ｑ、４６０　　　　０．１０３　　　０．０９４尿Ｎ１
１４　　　　　　０．３３１　　　　０．１１９　　　
０．１６６ネ尿陽５　　　　　　０．２５０　　　　０
．１１７　　　０．０９３尿ｌ１ｋＬ６　　　　　　０
．８１０　　　　０．３５７　　　０．５７８　＄６バ
ツクグラウンド　０．０８９ ＊検討されず ＊＊尿酸結晶を含有 ′ＸｊＩＬＪ！ＬＬ：　　　・”にぼ５′のｔ本例はＦ
ｅ（ｍ）　ＢＤＴＡ及びＦｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ／Ｔ
Ｘ−１００洗浄が一つの例即ち全ての洗浄につき減少し
た応答を示したシュードモナス・アエルギノザ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を除いて各
種生物体の細胞応答に有意に影響を及ぼさなかったこと
を例示する。
試験は実施例１と同様に行った。生物体の純粋培養液を
尿試料に添加した。結果を表■に示す。
婁ｍ二」−：コバル　　　　　′− ■ コバル）　（ＩＩＩ）レドックス試薬を下記の如く概略
的に示される被膜内に担持した。
ゾニルＦＳＮ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．２２ポリ　（エチレンテレフタレート） ゾニルＦＳＮ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．２２グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２．２盪−ｊ駐 新鮮な尿試料（５００ｍ”）をＭｉｃｒｏＳｅｐ”フィ
ルターを通して濾過した。一つの尿試料は先ず緩衝液単
独（５００Ｊ１１）で洗浄し、その他のものは先ず緩衝
液（５００ｍ　）中Ｆｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ或いは緩
衝液（５００１１１”）中Ｆ　ｅ　（ｍ　）　ＥＤＴＡ
及び界面活性剤で洗浄した。この初期洗浄に続いて緩衝
液洗浄（５００ＩＪ１）を行った。対照洗浄溶液は尿以
外の全ての適当な成分を含有した。対照洗浄操作は緩衝
液（５００１１り　、対照洗浄溶液（５００Ｉｌｌ）、
及び緩衝液（５００ｍ）であった。これらの対照例は又
追加の緩衝液洗浄（５００！１１）を受取った。
試料を適用及び洗浄後、フィルター膜を１＠１キユベツ
トに移した。暗所において、１−片のコバルト化学被膜
を３７℃において３−のＱ、０５ＭＫＰ緩衝液（ｐＨ７
，０）を含有する管内に入れ、成分を被膜から溶出させ
、１＠ｌの得られた溶液を上記キュベツトに添加して３
０分後３７℃において６１０ｎｍにおける吸光度を対照
例及び試験例について読取った。
表■に示される結果は、Ｆｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ及び
界面活性剤洗浄によりバックグラウンドが減少したこと
を示す。
ｌ−一旦 対照例（緩衝液洗浄した尿）　　　　　　　　　　０．
４６６対照例（ＴＩｋ衝液十Ｆｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ
洗浄した尿）　　　０．１０１３１１衝液、Ｆｅ（Ｉ［
ｌ）　ＨＤＴＡＳＴＸ−１００ｔ’洗浄した尿　　　　
　　　　　　　　　０．０６５４　　緩衝液、Ｆｅ（Ｉ
［［）　ＥＤＴＡ、　ＴＸ−４０５で洗浄した尿　　　
　　　　　　　　　　０．０８４５　　緩衝液、ｐ’ｅ
（Ｉ［［）　ＥＤＴＡ、　Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄した
尿　　　　　　　　　　　　０．０５９０．００５モル
濃度のＦｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ／Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１００洗浄液の存在下或いは不存在下において、コバル
ト（■）レドックス試薬を用いてスクリーニングした病
院尿の比較を表■に示す。
病院尿のスクリーニングにおいては次の操作を用いた。
即ち、ナイロン微多孔膜（０，４５−平均口径）を使捨
て試験装置の試験ウェル中に導入した。
加えて、Ｐ３００プレフィルタ−を使捨て装置内に入れ
、東向の大部分の汚染物質を濾別した。
（１）　Ｆｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ／ＴＸ−１００（０
，１−の０．１％ＴＸ−１００を含有する０、００５モ
ル濃度のＦ　ｅ　（ｍ　）ＥＤＴＡ）を試験ウェルに添
加し、約１．２５ｋｇ／Ｃｌ１ｆ真空で濾過させた。
（２）尿（０，５ａｊ）をウェルに添加し、濾過させた
。
（３）０．５艷の０．１％ＴＸ−１００を含有する０、
００５モル濃度のＦｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡの洗浄溶液
を添加し、濾過させた。
（４）試験ウェルを次いで０．５　ｍＺ及び１．０−の
リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６，８を用いて洗浄した。
（５）コバルト試薬を実施例３〜６において説明した薄
膜要素から、これらの要素の部分（１−）を３ｒｎｌの
０．０５モル濃度のＫＰｉｌ衝液ｐＨ７，０中に溶解す
ることにより再構成し、０．５　＠ｌの溶液をウェル（
排口閉）及び使捨て装置を３５℃で３０分間インキュベ
ートした。
（６）フィルター頂部の０．２−の溶液を取出し、透明
マイクロタイタープレートに移し、６１０ｎｍにおける
光学密度を測定した。
対照側研究のために、工程（１）及び（３）におけるＦ
ｅ（Ｉ［Ｉ）　ＥＤＴＡ／ＴＸ−１００の代りに０．０
５Ｍ　ＫＰＢ。
ｐＨ６，８を用いた。
Ｆｅ（Ｉ［［）　ＥＤＴＡ／ＴＸ−１００洗浄の存在或
いは不存在の両者における幾つかの測定結果をこれらの
測定の平均として表■に示す。これらの溶液研究に加え
て、同一の尿試料を生育プレート上でプレート培養し、
常法により微生物の量及び種類について評価した。プレ
ート培養からの結果を表■に示す。
Ｆｅ（ＩＩＩ）　ＥＤＴＡ／ＴＸ−１００洗浄が未成前
原のバンクグラウンドを有意的に減少させたのは明らか
である。従ってこの洗浄を用いて微生物生育を示す試料
を無菌のものから分離することができる。例えば、対照
洗浄を用いた場合には尿Ａ及びＢにおける生育条件は容
易に区別することができなかった（０００．４８４対０
００．４５８）。本発明の洗浄を用いた場合には、Ｂに
おける生育（０００，４６８）は未成畏服Ａ　（０００
，１７２）に対比して容易に求めることができた。
Ａ　　　　　Ｏ，１７２０，４８４成長なしＢ　　　　
　Ｏ，４６８０，４５８１０’　Ｅ、ｃｏｌｉＣＯ，１
５４０，４４３成長なし Ｄ　　　　　Ｏ，４５７０，４６６１０’　Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓＥ　　　　　Ｏ，４６７０，４８５４，５
ＸＩＯ’　Ｉ！、ｃｏｌｉＦ　　　　　Ｏ，０８４０，
３４６成長なしＧ　　　　　Ｏ，４２９０，４４３１０
’　Ｅ、ｃｏｌｉＨＯ，４４３０，４４７１０’　Ｂａ
ｃｉｌｌｉｌ　　　　　０．４３１　　　　　　０．４
５９　　５　ＸＩＯ’　ＢａｃｉｌｌｉＪ　　　　　Ｏ
，０６３’　　　　０．１９８　　１０’　５ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓＯ分におけるブランクは０．０３１
であった（平均）３０分におけるブランクは０．０４１
であった（平均）８−１に゛　■のＦｅ（ＤＩ）キレ−
トノｉこれらの実施例はバックグラウンドを減少させる
ための追加の鉄（■）キレート洗浄溶液の使用を例示す
る。鉄（ＩＩＩ）キレート溶液は最終Ｆｅ（Ｉ［）濃度
が０．００５Ｍ及びリガンド濃度が０．００５Ｍ　（或
いは表に示される如＜０．ＯＩＭ）となるように蒸留水
中の適当なりガントの溶液に０．０５Ｍ硝酸第二鉄溶液
を添加することにより調製された。ｐＨは０．１Ｍ重炭
酸ナトリウムを添加して６に調整した。これらの溶液を
４日間静置後ＭｉｃｒｏＳｅｐ”　０．５−セルロース
アセテートフィルター及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタ
ー装置を用いて無菌濾過した。
１−作： 新鮮な尿試料（５００ｄ　’）を０．５　ｔｍ　　Ｍｉ
ｃｒｏＳｅｐ　ＴＭイルターを通して濾過し、次いで適
当な鉄（Ｉ［［）キレート洗浄溶液（５００μりで洗浄
し、次いで０．０５Ｍ　ＫＰＢ　（ｐＨ６，８）及び１
％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ　”　１００洗浄溶液（５００ｊ
１１）で洗浄し、最後に５００１１１の緩衝溶液で洗浄
した。尿対照例は５００　Ｊ１！の緩衝液で洗浄し、次
いで５００Ｉの緩衝液及び１％ＴＸ　−１００で洗浄し
た。
これらのフィルター膜を試験管に移し、１滴の緩衝液（
ｐＨ７，０）を添加した。暗所において、上記実施例３
〜６で説明した１ｃｌＩ片のコバルト化学被膜を３−の
０．０５Ｍ１ｌ衝液（ｐＨ７，０）を含有する管内に３
７℃で入れた０次いで、１−の得られた溶液をフィルタ
ー膜を含有する管に添加し、これらの管を３７℃で３０
分間被覆し、インキエベートした。これらの管を渦巻き
攪拌により混合し、６１０ｎｍで読取った０表■に示す
結果は、３０分後の読取りであり、その他の鉄（ＩＩＩ
）キレート類も又バックグラウンドの減少に有効である
ことを示している。
以下余白 表−ｍ−！ バックグラウンド対照例（尿なし）　　　０．０８６尿
対照例（キレート洗浄なし）　　　　　０．２７０８　
　　Ｆｅ（［１）エチレンジニトリロ四酢酸０．１２６
ンーＮ・Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−四畔醒　　　０．１４１〔
発明の効果〕 細胞の決定において、本発明方法は試料中の少量の還元
剤の可能性のある存在による減少したバックグラウンド
を与える。この様に、本発明は相当数の微生物を有する
試料を無菌の試料から分離するために用いることができ
る。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、試料内の細胞の測定方法であって、その方法が、 （１）細胞を試料から分離する工程、 （２）分離した細胞を （ａ）鉄（III）キレート溶液及び （ｂ）非イオン性界面活性剤溶液 で洗浄する工程、並びに （３）洗浄細胞とレドックス試薬とを接触させて、細胞
    の存在により検出可能な変化を生成する工程 を含んでなる、前記の方法。
JP62186770A 1986-07-28 1987-07-28 試料内の細胞の測定方法 Pending JPS63212864A (ja)

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