JPS63219399A - フエニルアラニン又はフエニルピルビン酸定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体液中のフェニルアラニン又はフェニルピ
ルビン酸の定量用試薬に関するものである。

（従来の技術） 血清中に通常少量存在するフェニルアラニンは。

フェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼ欠損。

ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損等の遺伝性代謝異
常疾患などにおいて、血中に多量貯留され。

一部はフェニルピルビン酸、フェニル乳酸、フェニル酢
酸などに代謝された後、尿中に排出される。

これらフェニルアラニン、フェニルピルビン酸。

フェニル乳酸、フェニル酢酸の蓄積は、フェニルケトン
尿症の症状として知能障害、皮膚・髪の欠乏１強度の湿
疹などを引き起こすことが知られている。

これらの症状は、新生児期初期にフェニルアラニンの代
謝異常を発見し、早期にフェニルアラニン含量の低い食
事に制限するなどの処置によって予防可能であり、新生
児血中あるいは尿中におけるフェニルアラニン、フェニ
ルピルビン酸などの測定は、臨床診断上きわめて重要な
意義を有している。さらにフェニルケトン尿症患者には
、低フェニルアラニン含量の食品が必要とされるが１食
品中のフェニルアラニン含量を知るためにも、フェニル
アラニンの測定は重要な意義を有している。

フェニルアラニン、フェニルピルビン酸の測定には１種
々の誘導物質に変換後、あるいはそのままの状態で高速
液体クロマトグラフィーによって分画定量する方法の他
に、フェニルピルビン酸については、塩化第二鉄反応を
利用した測定用試薬など、またフェニルアラニンの測定
用試薬としては、カベラー・アドラー（Ｋａｐｅｌｌｅ
ｒ−Ａｄｌｅｒ）反応を利用した試薬、あるいはガスリ
（Ｇａｔｈｒｉｅ）の開発した血液濾紙を用いた試薬な
どが一般に用いられている。塩化第二鉄反応を利用した
測定用試薬は、塩化第二鉄を硫酸の存在下において、フ
ェニルピルビン酸とともに緑色に発色させ、比色定量す
るものである。血液濾紙を用いた測定用試薬は、寒天を
加えたドメイン培地にフェニルアラニン要求性である枯
草菌ＡＴＣＣ６６３３芽胞懸濁液とフェニルアラニン拮
抗物質であるβ−２−チェニルアラニンを加えて平板を
作成し、血液濾紙よりくり抜いた円板をその上に並べ、
３７℃で２０時間培養し１円板源紙の周囲に生育した菌
の発育環の状態によりフェニルアラニン含量を求めるも
のである。この場合のフェニルアラニン含量が１〜３ｍ
ｇ／ｄ１以下では。

β−２−チェチルアラニンのもつフェニルアラニンに対
する拮抗作用により菌は発育せず、それ以上のフェニル
アラニンを含有する場合にのみ発育環がみられる。

しかしながら、高速液体クロマトグラフィーを利用する
方法は、除蛋白などの前処理を必要とすること、測定に
長時間を有すること５分析機器が高価であることなどの
欠点を有している。また。

塩化第二鉄反応を利用した測定用試薬、カペラー・アド
ラー反応を利用した測定用試薬、ガスリによる血液濾紙
を用いた測定用試薬は、フェニルアラニンあるいはフェ
ニルピルビン酸以外に多くの物質に対して反応するため
、特異性において重大な欠点があること、定量性がきわ
めて不十分であること、測定に長時間を要すること１強
酸あるいは重金属塩を使用することなど、多くの問題点
を有するため、臨床検査分野等の多数の試料を迅速に測
定することが要求される分野には到底供しえないもので
あった。

これに対し、これらの欠点を克服し簡易にフェニルアラ
ニン、フェニルピルビン酸を定量するために、数種の酵
素法が提案されている。これら酵素法に用いる試薬には
、フェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼを用いる試
薬、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼを用いる
試薬及びフェニルアラニン脱水素酵素と、フェニルアラ
ニンデカルボキシラーゼとを用いる試薬がある。フェニ
ルアラニン４−モノオキシゲナーゼを用いる試薬は、テ
トラヒドロビオプテリンと分子状酸素の存在下でフェニ
ルアラニン４−モノオキシゲナーゼがフェニルアラニン
をチロシンに変換することを利用したものであり、チロ
シンを直接螢光で測定するか、またはニトロソナフトー
ルのエタノール、溶液と濃硝酸を加えて噴霧、風乾後、
１００℃で加熱して赤色に発色させることによって測定
を行うものである。また、フェニルアラニンアンモニア
リアーゼを利用する試薬は、酵素反応によってフェニル
アラニンから遊離したアンモニアを、グルタミン酸脱水
素酵素、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
及び２−オキソグルタル酸を用いて３４０ｎｍにおける
吸光度の減少として測定するか、アンモニア電極によっ
て測定するものである。フェニルアラニンデカルボキシ
ラーゼを用いる試薬は、生成するβ−フェニルエチルア
ミンを有機溶媒抽出した後、螢光測定するものである。

またフェニルアラニン脱水素酵素を用いる試薬は、酵素
反応によって生成する酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドによる３４０ｎｍにおける吸光度の増減により
フェニルアラニン又はフェニルピルビン酸の量を求める
ものである。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、非酵素的な方法を克服するために提案さ
れた酵素法に用いる試薬も、フェニルアラニン以外のア
ミノ酸に対しても反応性を有し。

特異性において問題があること、あるいは内因性のチロ
シンや蛋白質、アンモニアなどによって影響をうけるこ
と、酵素が非常に不安定であること。

など欠点のために、臨床検査におけるフヱニルアラニン
、フェニルピルビン酸測定にふされしいものとはなり得
なかった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を解決するために鋭意研究
を重ねた結果、フェニルアラニン又はフェニルピルビン
酸の定量用試薬に、きわめて特異性の高、い耐熱性のフ
ェニルアラニン脱水素酵素を用いると、生体液中のフェ
ニルアラニン又はフェニルピルビン酸を精度よく測定し
うろことを見い出し２本発明を完成するに到った。

すなわち１本発明は、（ａ）耐熱性フェニルアラニン脱
水素酵素及び（ｂｌ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドを含有することを特徴とするフェニルアラニン又
はフェニルピルビン駿足を用試薬を要旨とするものであ
る。

本発明のフェニルアラニン定量用試薬は、耐熱性フェニ
ルアラニン脱水素酵素及び酸化型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド〔以下ＮＡＤ″″と略記する。〕を主
成分とする。またフェニルピルビン酸定量用試薬は、耐
熱性フェニルアラニン脱水素酵素及び還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド〔以下ＮＡＤＨと略記する
。〕を主成分とし、これにアンモニウムイオンを含ませ
ることが望まれる。その他にフェニルアラニン定量用試
薬又はフェニルピルビン酸定量用試薬は１通常、促進剤
、賦活剤などの添加剤なるものを含ませることもできる
。その添加剤としては９例えば塩化カリウム、酢酸ナト
リウムなどの塩類やトリトンＸ−１００などを、また防
腐剤としては１例えばアジ化ナトリウムなどの公知のも
のを支障なく使用することもできる。

本発明に用いられるフェニルアラニン脱水素酵素として
は、基質特異性の厳しい性質を有するものが好ましいが
、耐熱性を有するものであれば。

その給源が特に限定されるものではなく、保存性。

安定性に冨む好熱性の放線菌などの微生物由来のものな
ど２種々の起源のものを使用することができる０例えば
サーモアクチノマイセスに属する細菌、サーモノスボラ
属に属する細菌、ストレプトマイセス属に属する細菌由
来のものが好ましく。

その具体例としてサーモアクチノマイセス・インテルメ
ディウス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｃｅｓ　　ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）ＩＦＯ１４２３０、サーモアクチ
ノマイセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
　　ｃｅｓｖｕｌ　　ａｒｉｓ）ＩＦＯ１２５１６，０
３Ｍ４３１８４、ＤＳＭ　　４３３５４．サーモノスボ
ラゆアルバ（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓ　　ｏｒａａｌｂａ）
ＤＳＭ　　４３３１０．　　ストレプトマイセス・サー
モルーテンス（Ｓｔｒｅ　　ｔｏｍ　　ｃｅｓ　　ｔｈ
ｅｒｍｏｌｕｔｅｎｓ）ＩＦＯ１４２０９が挙げられる
。

本発明のフェニルアラニン定量用試薬の各成分の濃度と
しては、フェニルアラニン脱水素酵素を０．１〜１００
ニー’−７ト／　ｍ　ｌ　、　　Ｎ　Ａ　Ｄ　”を０．
１〜５０ｍＭ、界面活性剤を０．０１〜５％、防腐剤を
０．５〜５０ｍＭとなるように使用すればよ（、フェニ
ルアラニン脱水素酵素を０．５〜５０ユニット／ｍ１．
ＮＡＤ”を０．２〜２０　ｍＭ、塩類を５〜３５０ｍＭ
、界面活性剤を０．０２〜２％、防腐剤を１．０〜３０
ｍＭとなるように使用することが好ましい。また、これ
らの組成物はｐ　Ｈ８，５〜１１゜７に緩衝能を有する
緩衝液に溶解せしめればよい。

このような緩衝液としては通常ｐ　Ｈ８，５〜１１．７
のものが使用でき、グルシン−ＫＯＨ，炭酸緩衝液、グ
リシン−ヒドラジン緩衝液などをあげることができる。

その濃度としては３０〜３００ｍＭを有利に使用するこ
とができる。

本発明のフェニルピルビン酸定量用試薬の各成分の濃度
としては、フェニルアラニン脱水素酵素を０．０５〜５
０ユニット／ｍｌ、ＮＡＤＨを０．０５〜１．０　ｍＭ
、塩類を５〜５００ｍＭ、界面活性剤を０．０１〜５％
、防腐剤を０．５〜５０ｍＭとなるように使用すればよ
く５フエニルアラニン脱水素酵素を０．２〜３０ユニッ
ト／ｍｌ、ＮＡＤＨを０、１−０．５　ｍ　Ｍ、塩類を
５〜３５０ｍＭ、界面活性剤を０．０２〜２％、防腐剤
を１．０〜３０ｍＭとなるように使用することが好まし
い。また、これらの組成物はｐＨ８，５〜１０に緩衝能
を有する緩衝液に溶解せしめればよい。このような緩衝
液としては２通常ｐＨ８，５〜１０のものが使用でき。

炭酸緩衝液、塩化アンモニウム−ＫＯＨ緩衝液などをあ
げることができる。Ｂ度としては３０〜３００ｍＭを有
利に使用することができる。

次に本発明のフェニルアラニン定量用試薬の測定原理を
示す。

フェニ３７ラニシａ水素ｓｓ フェニルアラニン　　　十　　ＮＡＤ　　”　　　−−
一−−−−−−−−−−−−−呻フェニルビルビン酸＋
　ＮＡＤＨ＋アンモニウムイオン　　　　　　　（１）
このようにフェニルアラニンは（１１式により生成する
ＮＡＤＨを３４０ｎｍの吸光度の増加として定量するこ
とができる。

また生成するＮＡＤＨをジアホラーゼ、フエナジンメト
サルフエイト、あるいは１−メトキシフェナジンサルフ
エイトの中から選ばれる１種を介して、ジホルマザンに
導く方法を採用することもできる。

次に本発明のフェニルピルビン酸定量用試薬の測定原理
を示す。

フェニルアラニンｍ　水素酵Ｍ フェニルピルビンｆｉ＋ＮＡＤＩ＋＋アン毫ニウムイオ
ンフェニルアラニン　　　十　　ＮＡＤ　　”　　　　
　　　　＋２）このようにフェニルピルビン酸は（２）
式により生成するＮＡＤを３４０ｎｍの吸光度の減少と
して測定することによって求めることができる。

本発明のフェニルアラニン定量用試薬又はフェニルピル
ビン酸定量用試薬を用いて血清や尿などの生体液中のフ
ェニルアラニン又はフェニルピルビン酸を定量するとき
の反応温度としては１通常の酵素反応の２０〜５０℃を
使用すればよい。

（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例１ ペプトン５ｇ／β、グリセリン５ｇ／Ｌ　リン酸−カリ
ウム１ｇ／ｌ、　　リン酸二カリウム２ｇ／２、硫酸マ
グネシウム０．１ｇ・／１．塩化カルシウム０．０５ｇ
／ｉ’、酵母エキス２ｇ／Ｌ肉エキス２　　ｇ／ｌ、　
ビオチン９μｇ／１．チロシン０．４ｇ／ｌ塩化アンモ
ニウム５ｇ／ｆをｐ　Ｈ７，２に調製した培地を用いて
サーモアクチノマイセス・インテルメディウス（Ｔｈｅ
ｒｍｏａｃｔ　ｉｎｏｍＬ△土土　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ
ｕｓ）ＩＦＯ１４２３０を培養し菌体を得た０次にこの
菌体を常法にて破砕後遠心し９次いで硫酸アンモニウム
分画（２５〜６０％）、レフトセファロース４Ｂアフイ
ニイテイクロマトグラフイー（ファルマシア社製）、ス
ラブ調製用電気泳動（７，５％ポリアクリルアミドゲル
、ｐＨ８，９）を経て精製した（比活性１３．８ユニツ
）／＋ｇ蛋白蛋白質重収率３５％次に、このようにして
得られたサーモアクチノマイセス・インテルメディウス
由来のフェニルアラニン脱水素酵素０．６４ユニット／
ｍ１．ＮＡＤ”５．０ｍＭ、グリシン−ヒドラジン緩衝
液（ｐ　Ｈ１０，０）１００ｍＭからなるフェニルアラ
ニン定量用試薬を調製した。さらにこの試薬に１．８ｍ
βを３７℃にて２分間予備加熱し、３４０ｎｍにおける
初期吸光度（Ａｏ）を測定した後、各種濃度のフェニル
アラニン溶液０．２　ｍ　ｌを加え、３７℃で反応を行
わせて吸光度変化を測定し、吸光度が一定の値を示す時
点（約５分以内）での吸光度（Ａ）を求めた。この吸光
度変化ｉｔ　（Ａ−ＡＯ）とフェニルアラニン量との関
係を第１図に示した。

このように、第１図から明らかなごとく、低濃度から高
濃度までの広範囲のし一フェニルアラニン量に対して吸
光度変化量が、化学量論的に直線関係を示し、微量のフ
ェニルアラニンを定量することも可能であることがわか
る。

尚、比較のため、ブレビバクテリウム属の細菌（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｓｐ、）ＤＳＭ２４４８か
ら公知文献アチーブス・オブ・マイクロバイオロジー（
Ａｒｃｈｉｖｅｓ　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ）１３７巻、４７頁（１９８４年）に従ってフェニル
アラニン脱水素酵素を精製した。

次にこのようにして得られたプレブバクテリウム属由来
のフェニルアラニン脱水素酵素０．６４ユ−−ット／ｍ
ｌ、ＮＡＤ”　５．０ｍＭ、グリシン−ヒドラジン緩衝
液（ｐＨ１０，０）１００ｍＭからなるフェニルアラニ
ン定量用試薬を調製した。

このフェニルアラニン定量用試薬２．０　ｍ　ｉ　ヲ３
１℃にて２分間予備加熱し、３４０ｎｍにおける初期吸
光度を測定した後、フェニルアラニン又は各種アミノ酸
溶液５０ｍＭをＱ、５ｍｌ加え、３７℃で反応を行わせ
て吸光度変化を測定し、吸光度変化量を求めた。

その結果を、フェニルアラニンの吸光度変化量を１００
とした場合の、各種アミノ酸の吸光度変化量の相対値を
表１に示す。

さらに実施例１で使用したサーモアクチノマイセス・イ
ンテルメディウス由来の酵素を用いたフェニルアラニン
定量用試薬を用いて上記と同様の操作を行い、フェニル
アラニンの吸光度変化量を１００とした場合の他のアミ
ノ酸の吸光度変化量の相対値も第１表に示し、先のブレ
ビバクテリウム属由来の酵素を用いたフェニルアラニン
定量用試薬と比較した。

（以下余白） 第１表 このように、ブレビバクテリウム属由来の酵素を用いた
フェニルアラニン定量用試薬（比較例１）がフェニルア
ラニン以外のアミノ酸に対しても反応するのに対し、サ
ーモアクチノマイセス・インテルメディウス由来の酵素
を用いた試薬（実施例１）はフェニルアラニンを特異的
に定量しうろことがわかる。

実施例２．比較例２ 実施例１で精製したフェニルアラニン脱水素酵素０．３
２　：１−ニー　７ト／ｒｎ１．ＮＡＤＨｏ、３ｍＭ、
塩化アンモニウム１００ｍＭ、炭酸緩衝液（ｐＨ９゜０
）２００ｍＭからなるフェニルピルビンＬｆｆｌｔ用試
薬を調製した。さらにこの試薬１．８　ｍ　Ｉｔを３７
℃にて２分間予備加熱し、３４０ｎｍにおける初期吸光
度（八〇）を測定した後、各種濃度のフェニルピルビン
酸溶液９．２ｍＪ！を加え、３７℃で反応を行わせて吸
光度変化を測定し、吸光度が一定の値を示す時点（約３
分以内）での吸光度（Ａ）を求めた。この吸光度変化量
（ＡＡ（＋）とフェニルピルビン酸との関係を第２図に
示した。

このように、第２図から明らかなごとく、低濃度から高
濃度までの広範囲のフェニルピルビン酸量に対して吸光
度変化量が、化学量論的に直線関係を示し、微量のフェ
ニルピルビン酸を定量することも可能であることがわか
る。

尚、比較のため、　比較例１で精製したブレビバクテリ
ウム属由来のフェニルアラニン脱水素酵素０．３２ニー
１−７ト／ｍｊ２．ＮＡＤＨ０，３ｍＭ、塩化アンモニ
ウム１００ｍＭ、炭酸緩衝液（ｐＨ９゜０）２００ｍＭ
からなるフェニルピルビン酸定量用試薬を調製した。さ
らにこの試薬２．　Ｏｍ　ｌを３７℃にて２分間予備加
熱し、３４０ｎｍにおける初期吸光度を測定した後、５
０ｍＭのフェニルピルビン酸又は各種フェニルピルビン
酸類似物溶液Ｑ、　５　ｍ　ｌを加え、３７℃で反応を
行わせ吸光度変化量を求めた。

その結果を、フェニルピルビン酸の吸光度変化量を１０
０とした場合の、他のフェニルピルビン酸類似物の吸光
度変化量の相対値を第２表に示す。

さらに実施例２で使用したサーモアクチノマイセス・イ
ンテルメディウス由来のフェニルピルビン酸定量用試薬
を用いて上記と同じ操作を行い。

フェニルピルビン酸の吸光度変化量を１００とした場合
の他のフェニルピルビン酸類似物の吸光度変化量の相対
値を第２表に示し、先のブレビバクテリウム属由来の酵
素を用いたフェニルアラニン定量用試薬と比較した。

第２表 このように、サーモアクチノマイセス・インテルメディ
ウス由来のフェニルアラニン脱水素酵素を用いたフェニ
ルピルビン酸定量用試薬（実施例２）はフェニルピルビ
ン酸を特異的に定量しうろことがわかる。

実施例３．比較例３ 実施例１で調製したサーモアクチノマイセス・インテル
メディウス由来の酵素を用いたフェニルアラニン定量用
試薬、実施例２で調製したフェニルピルビン酸定量用試
薬、比較例１で調製したブレビバクテリウム属由来の酵
素を用いたフェニルアラニン定量用試薬、比較例２で調
製した同酵素を用いたフェニルピルビン酸定量用試薬の
４種の試薬を、それぞれ３７℃にて保存し、経口的にフ
ェニルアラニンあるいはフェニルピルビンＩＩＩ　２　
ｍＭの溶液を加え、３７℃で反応を行わせて吸光度変化
量を求めることにより、フェニルアラニンあるいはフェ
ニルピルビン酸の検出率を求めた。

この検出率はそれぞれ試薬の調製直後を１００としたと
きの値である。

この結果を第３表に示す。

（以下余白） 第３表 このように、ブレビバクテリウム属由来の酵素を用いた
試薬（比較例１，２）が１日後で使用不可能であるのに
対し、サーモアクチノマイセス・インテルメディウス由
来の酵素を用いた試薬（実施例１，２）は、１０日後で
も検出率はほとんど変化せず、きわめて安定な性質を有
していることがわかる。

（発明の効果） 本発明のフェニルアラニン又はフェニルピルビン酸定量
用試薬は、耐熱性のフェニルアラニン脱水素酵素を用い
た従来にない安定な定量用試薬であって、従来の試薬に
みられた問題点、すなわち測定に長時間要すること、特
異性が不十分であることなどを克服したものであるうえ
に、血中の共存物質の影響を受けず、前処理などの煩雑
な操作を必要とせずに、微量のフェニルアラニン又はフ
ェニルピルビン酸を、化学量論的に精度よく測定するこ
とができる。

このように本発明の試薬は、多数の検体を精度よく迅速
に分析することが要求される臨床検査分野などへ多大な
寄与をなすものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は９本発明のフェニルアラニン定量用試薬の定量
性を示す図であり、縦軸には３４０ｎｍにおける吸光度
変化量を、横軸にはフェニルアラニン量を示している。 第２図は本発明のフェニルピルビン酸定量用試薬の定量
性を示す図であり、縦軸には３４０ｎｍにおける吸光度
変化量を、横軸にはフェニルピルビン酸量を示している
。 特許出願人　ユニ亭力株ｖｃ＊社 ０　　　　０．１　　　０．２　　　０．３フエニルＰ
ウニン（惧Ｍ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）耐熱性フェニルアラニン脱水素酵素及び（
   ｂ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は
   還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含有す
   ることを特徴とするフェニルアラニン又はフェニルピル
   ビン酸定量用試薬。