JPS63229368A - 抗体を測定するための方法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｒ１及びＲ３が液体相中に存在し、抗体と結
合可能でめジ、Ｒ２が固体相中に存在し、Ｒ工と結合可
能であり及びＲ３は標識を有する３種類の異なる受容体
（Ｒｅｚｅｐｔｏｒ　）　Ｒ１，Ｒ２及びＲ３と一緒に
恒温惺持し、固体相ｔｍ体相から分離し、固体相中の標
識を興Ｊ定することによって抗体を測定する方法に胸す
る。

〔従来の技術〕

抗体は、ＢＩＪンパ球及び鹿漿細胞の通過する抗原との
接触によＶ産出され、この生成ｔＸ起する抗原に釣具的
に対応する蛋白質分子である。

従つｌｉ定の抗原に対する抗体の検出によって、病気の
段階又は自己免疫病の存在を解明することができる。

抗体は免疫学的検定法の原理による方法によって鋭敏に
検出することができる。この場合に梅々の方法が可能で
ある。すなわち例えば抗原全支持体と共有結合させ、測
定すべき抗体を含有する浴液と接触させ、引続きこの抗
体に対応する公矧方法で柳詠付けしておる抗体一般に抗
−１ｇ−抗体と及応させることができる。次いで結合し
た標識の程度から抗体含量の１が推論される。この方法
の欠点は、試相中に含有される判異的ではない抗体の非
釣具性結合によって偽の陽性値が得らｎることである。

史にこの測定は連続する２工程でのみ実施できるにすぎ
ない。抗体の検出及び定量測定用のその他の試験は、測
定すべき抗体に対する抗原を固体用に固定することでお
る。引続き患渚の鹿渭を前身って決めた量の測定すべき
抗体（標識を有する）と−緒に肉加し、引続き固体用と
結合した弾識″ｆ：測定する。この場合にも感度が的に
讐求される競争Ｂ７ｉ験（ｋｏｍｐｅ７１ｔｉｖｅｎ　
Ｔｅ５ｔ　）が問題となる。その他の方法は固体用に抗
−工ｇ−抗体を結合さセ、次いで試験溶液と反応場せる
ことである。引続き測定すべき抗体に釣具的な抗原（こ
ｎＫ律識が結合している）ｋ添加する。この方法の欠点
は固体用の結合力に限界があることである。それは測定
すべき抗体の他に同じ種類のクロプリンのその他の抗体
も結合するからである。

もう１つの変法は、固体相七測定すべき抗体の竹異的な
抗ぶで被覆し、引続さこの固体用を試狛浴液と反応場せ
、その後次の段階で標識全頁する判異的な結合可能な物
質？添加することで必る。このような方法は例えば欧州
物許（ＢＰ−Ａ）第１６８６８９号明細書及び欧州的許
（Ｆ、Ｐ−Ａ）第１６０９００号明細書から公知である
。この方法の欠点は一つに、固体用がその都度的異的な
抗原含有するので、各々の測定用にその他の固体用を使
用せねばならないことである。もう１つの欠点は、抗体
と抗原の反応が多相で行なわｎることである。更にこの
ような方法には常に２つの工程が必云とされる。しかし
この二うな方法は唯一つの洗浄工程が実施用能である分
析装置で行うことはで＠にい。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って本発明の課題は、一段階でかつ１回の洗浄工程で
実施することができ、従つ工自動化が可能である抗体測
定法を開発することであった。更に本発明の課題は、１
つの固体用を多数の瀉なる試験に使用することができる
方法全開発することであった。

〔課題？解決するための手段〕

この課題は、Ｒ１及びＲ３が液体相中に存在し、抗体と
結合用１泪であり、Ｒ２が１１０＝相と結合して存在し
Ｒ１と結合可能であり、Ｒ３が標識を頁する３　ａ類の
異なる受容体Ｒ１、Ｒ２及びＲ３と一緒に恒温保持し、
固体用を液体相から分離し、固体用のｉ　Ｈ＆　’に測
定することによる抗体の測定法によって解決されるが、
こｆｉＶｉＲｌとし′Ｃ測定すべき抗体によってｔｊＰ
！ｊ異市に臆赦さユる物質及び判異的な結合系の反応成
分から成る結合体（ｋｏｎｊｕｇａｔ　）　ｋ使用し、
Ｒ３として測定すべき抗体に工って％異的に臆靴される
物質及び標識から成る結合体を使用し、Ｒ２として釉異
的な結合系のその他の結合成分上使用することに一１徴
とする。

本発明による方法は、２洩類の結合成分（このうちの１
つは測定すべき抗体に喘異的な少なくとも１つの工ぎ）
−ｆｋ有する物質、例えば抗原、抗原フラグメント、抗
−イディオタイプ−抗体又はハプテンと釉異的な結合系
の成分から成る結合体であり、もう一つは測定すべさ抗
体に判異的な少なくとも１つのエビ）−７”ａ−ＩＨす
る物質、例えば抗原、抗原フラグメント、抗−イディオ
タイプ−抗体又はハシテンと偉諌から成る結合体である
）が測定すべ′＠抗体の少なくとも２種類の判異的な結
合′５′Ｊ能なパラトープに関して競合するという原理
に基づく。その際次の反応生成物が生ずる；Ｒ１ともＲ
３とも結合している抗体、Ｒ１とだけ結合している抗体
及びＲ３とだけ結合している抗体。最初の２つの反応生
成物は、萄異的な結合系の反応成分全頁するので、固体
用と結合することができる。Ｒ３とだけ結合している反
応生成物は洗浄除去される。Ｒ１だけが結合している抗
体は柳識を有さないので、測定には関与しない。従って
抗体の濃度仰）定はＲ１及びＲ３が結合し１いる抗体分
子に関してのみ行ｖｆする。従ってその島測定すべき抗
体によって判異的に虻識δｎる物質の量（免疫汐応性で
もある）がＲ１中でＲ３中の免疫及応性物質の旬より多
いか又は同じである場合にＬ）高の感度が得られる。有
利にはＲ１及びＲ５中の免疫反応性物質は比２０〜１：
１で使用される。時に有利には比は５〜１：１で［Ｆ］
る。結合した椋識付けさｆ’１４結合体に関して評価す
ることができ、検量＋ｖＪ！’を用いて試料中の抗体の
濃度を徂１ｊ定することができる。

従って１外にも本発明にエフ、抗体？非常に高い正確さ
でかつｆＭ半な方法で測定することが可能である。本発
明による測定力法ζ高い濃度の測定すべきではない抗体
によって生害さｎない。本方法の判別な利点は検：１Ｔ
ｌｃ経通の迅速性と１￥ＩＩＩ潔性である。

本発明による方法は全てのオ」ρの抗体、例えば工ｇＧ
、　　１ｇＭ、　　工ｇＡ、　　工ｇＤ及び工ｇＥ亜ひ
に混合物の測定用に好適である。

受容体及び測定すべき抗体のいずれもが各々そｎＶｃ、
％定の反応成分と判異的にのみ及応しうるので、全ての
受容体及び試料を一緒に恒温保持し、方法を１工程で実
施することができる。

この方法は又恒温保持後に１回の洗浄工程を必要とする
にすぎない。勿晶本発明による方法ｔ２段階で実施する
こともできる。この場合に有第１」には試別を先ず受容
体Ｒ１及びＲ３と恒温作付し、引き続きＲ工、丘３及び
測定すべき抗体から生じた保合体を固体用と、結合した
Ｒ２に添加する。本′３ｔ３明による方法のその他のオ
月点は、方法ｔ１段階で行うことであり、七ｉによって
方法を容易に自動化することができる。

本発明による方法を実施するためＫ　３　Ｓ店の受容体
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３を使用する。受答滓Ｒ工及びＲ３は
各々液体相中に、有利には同じ濃度で存在する。こｎら
は各々測定すべさ抗体に豹異的なエビトーノを刊する物
質から成る。この物質は各々２つの部分から成る結合体
で８９、その際１つの部分は工ぎトープを有し、例えば
抗原、抗原フラグメント、抗−イディオタイプ−抗体又
はノ・ブテンである。受答体Ｒ工及びＲ３中に含Ｍされ
る抗体的異性物質は同一であってもよいし異なるもので
ｂつてもよい。結合体のもう１つの部分はＲ１では鉤異
的な結合系の反応成分である。この場合に鉤異的な結合
系とは相互に崎異的に反応しうる２つの成分でめる。

その際結合力は免役学的反応に基づくものであっても良
いが、その他の４ｅｉ１４的な反応に基づくものであっ
ても良い。

有利には鉤異的な結合系としてはビオチンとアビジン；
ビオチンとストレプトアビジン；ビオチンとアンチビオ
チン；ハプテンと抗ノ）ブテン；抗体の１？ｌＣγ−７
ラグメントとこのＥ’Ｃ−γ−７ラグメントに対する抗
体又は炭化水素とシフチンの組合せ全使用する。その際
この牲異的に結合可能な組の反応成分の１つは受容体Ｒ
１を生成する結合体の部分である。

その他の反応成分は固体相中に存在する受容体Ｒｇであ
る。不溶性の支持体材料に対するＲ２の結合は結合体成
分（液汁１には生物学的結合体系の〕を固体の支持体物
質に固定するための常用の当業者に公知の方法により行
うことができる。共有結合及び吸着性の結合が好適であ
る。

しかし例えばプラスチックに対しては、その場合に高収
率が達成さｎ、操作方法が簡素化されるために、単に吸
着性結合が有利である。固体層とじ又は内表面上Ｒ２で
吸着的に被覆しである試験管又はポリスチレン及び類但
のプラスチック裂の微量滴定プレートが的に好適でるる
。

更に粒状の物質、例えば分子篩材用、ガラス７４％体、
プラスチック管等も好適である。固体層の支持体として
は多孔性の層状支持体、例えは紙が判に好適である。Ｒ
２として固体層に釣具的な結合系の反応成分を固定する
。

受容体Ｒ３は抗原、抗原フラグメント又はノ・ブテンの
他に結合体のその他の部分として標識を有する。標識と
して酵素、発蛍光性、化学発光性又は放射性物質全使用
する。抗原、抗原フラグメント又はノ・ブテンを標識付
けする方法は。

例えばクリ二カーヒミカφアクタ（ａｌｉｎｉｃａＣｂ
ｅｍｉｃａ　Ａｃｔａ　）第８１巻（１９７７年）１〜
４０から当業者に公知であり、本明細書で更に詳説する
必要はない。標識は自体公知の方法で測定することがで
きる。

本発明による方法の有利な態様では、受容体Ｒ１及びＲ
３並びに測定すべき抗体全含有する試料全恒温保持する
。その際Ｒ１及びＲ５は統計学的な確率で測定すべき抗
体のパラトープと反応する。この反応混合物を引続き受
容体Ｒｚｋ有する固体層と接触させる。

判具的な結合系のＲ０中に含有される反応成分はＲ２と
反応する。恒温少時後に固体層の液体相からの相分離を
例えば吸引４−遍により行うが次いで固体層を洗浄後標
識の測定上行うことかでさ、測定すべき抗体の量の程度
が判明する。

祷鎗付けｔ酵素を用いて行う場合には、憚識酵木の活性
をこのために一般に公知の方法で測定するだけで十分で
ある。憚葦酵索としては特に有利にはペルオキシダーゼ
又にβ−ガラクトシダーゼを使用する、 標識付け？酵素ではなく放射性物質、アイソトープ、発
蛍光性又は化学発光性物質を用いて行う場合にも、当業
者によく矧らｎている方法の１つによジ測定を行う。

方法を遠心５ｆ析器で行う場合には、試料全光ず２種類
の受容体Ｒ１及びＲ３が分離して存在する支持体を用い
て遠心分離するのが有利である。

この場合に受答体Ｒ１及びＲ３は沼解される。

相応する一時的に形成される保持用によって受容体Ｒ工
とＲ３の分離及び試料中に含有さ７Ｌる測定すべき抗体
との七ｎらの錯形成が起る。

次の段階で生成された反応混合物全固体層に移し、そこ
でａ終曲な反応が行わｎる。

同様に受容体Ｒ１及びＲ８及び試刺全カ形底用の保持用
なしに直接受容体Ｒ２’ｆｉ−有する固体層に移すこと
も可能である。受容体Ｒ１とＲ３及び測定すべき抗体と
の間の反応は均一であるので、不均質な界面でのＲ１及
びＲ２の間の反応よりも遥かに迅速に進行する。従って
この反応方法により保持層全周いる反応方法で得らｎる
結果と大差ない結果が得らｎる。

本発明による方法の特に有利な態様では、６イ＊類の受
容体全て及び測定すべ＠抗体全含有する試＊４を恒温保
付する。その際Ｒ１及びＲ３は統耐字的な確率で測定す
べき抗体のパットーデと反応する。Ｒ１中に含有される
肴異的な結合系の反応成分はＲ２と反応する。この場合
にも肋記のようにＲ１、Ｒ３及び測定すべき抗体間の均
一々反応はＲ１とＲ２間の不均一な反応よりも著しく迅
速に行わｎ１従つ工妨害さｎない。恒温保愕後固体相の
液体相からの相分離を例えば吸引ａΦ廻によって行う。

固体相勿洗浄した後次いで一識の捌Ｊ定を行うことがで
き、測定すべき抗体のｊの程度が判る。

その他の態様では、先ず試料全固停相と接触名セ、次い
で受容体Ｒ１及びＲ３から成る反応混合物を重加するこ
ともできる。この方法は、試桐及び試薬全同時には配量
ゐ加することができない自動分析５　（Ａｎａｌｙｓｅ
ｎａｕｔｏｍａｔｅ　）用に肋に有利である。

本発明のその他の目的は抗体測定用の試薬であり、こｎ
は２．」項の異なる同浴件の抗体と結合可能な受容体Ｒ
１及びＲ３（このうちＲ１は判異的な結合系の反応成分
を有し、Ｒ３は梯識を有する）及び更に受容体Ｒ２（こ
ｎは固体相中に存在し受容体Ｒ１と結合可能である）を
含有し、その際不溶性受答体Ｒ２及び司泪性受容悸Ｒ１
が物理的に相互に別々に存在すること七豹徴とする。

受容体Ｒ３はＲ１ともＲ２とも反応しないのでこれを試
薬中に入れることは問題ない。しかし有オリにはＲ１と
Ｒ３！ｌ′ｉ−緒に１つの試薬中に保存する。

その際Ｒ１及びＲ３は一般に液状又は凍結乾燥した試薬
中に含有する。Ｒ２はこむとは別に不溶性の支持体材用
と結合して存在する。

もう１つの態様では受容体Ｒ工及びＲ３が同浴。

性であり、受容体Ｒ２が不溶性であり、Ｒ１と別に固体
の支持体材料に含■されていてもよい。

支持体材料としては、Ｒ２を化学的又は物理的な結合に
よって固定することができる本発明で現わｎる条件下で
不活性の材料が好適である。

このＸｍの材料は当業者に広く卸らｎている。有利には
吸収付か、膨潤性か又は司浴性のフィルム形成住支持体
材料、例えば試験条片用に公卸の支持体材料、例えば紙
又は頌イ以のフリース林旧である。

次に実施例及び図面につき本発明を詳説する。

第１図はＨＤ日−抗体量を増加させた例４による方法の
検量線を表す。第２図はＨＢｓ−抗体粗金冷加させた例
５による方法の検１緋を表丁。

例１ 試薬浴液の製造 （１）　　ＨＢｓＡｇ−マクスーエｇＧ−結合体の製造
（受容体１） １ａ）　ＨＢｓＡｇ（肝炎Ｂ−ａ面−抗ｉｔＸ　）の限
定還元 １０ミリモルの酢酸ナトリウム緩Ｓ剤（ｐＨ４，５）５
ｄ中のＨＢ８ＡｇＣＪ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈ、　１１
　Ｓ。

２２５〜２３０頁（１９８５）によ！ｌ製造〕５ｒｎ９
ｗジチオフレイト５０ミリモルに加え、２５℃で６０分
間僅つ。

１ｂ）反応バッチの脱喝 反るバッチをセファデックスＧ−２５カラム（φ１６ｖ
ｔｘ、光″４４高名１５龜）を用い１０ミリモルの酢酸
ナトリウム緩衝剤ＰＨ４，５中で流速４０ｄ／時でクロ
マトグラフィーにかけ、分別する。２８０ｎｍ　（Ｋ　
Ｏ−＋　）で吸光を有するフラクションをプールし、２
４時間６０ミリモルの燐酸カリクム炒衝剤ｐＨ７，１で
透析する（透析液１１ｘ３）ｃ １ｃ）工ｇＧｃ、マウスー正常−工ｇＧ、　Ｍ−ｎ−１
ｇＧ。

製造元力ルビオヒエム（Ｑａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｇｍｂ
Ｈ、フランクフルト〕〕の変性 ３０ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（ｐ）ｔ　７．１　
）１ｙｌ中のＭ−ｎ工ｇＧ１０１ｎ９の浴液にジメチル
スルホキシド中のマレインアミノへキサノニル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミド−エステル（ＭＨｂ　）（ジメ
チルスルホキシド１ｄ当７７　ＭＨ＆　１４．３〜）の
浴液１０μｌ？添加し、２５℃で１時間反応させる。

１ａ）変性バッチの脱工１ １ｃからのバッチ上セファデックス０２５１０＊ｊ’、
ｒ用い６０ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（ｐ）（７−
１）甲でクロ、１トゲラフイーにかけ、分別する（流速
４０ｒｘｌ／時〕。最高蛋白質含量の蛋白質ピークのフ
ラクションｔプールする。

こＣはマレインアミノヘキサノニル−変告見−ｎ工ｇＧ
抗体？！−含有する。

１ｅ）結合体バッチ ６０ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（−７，１）４　ｗ
ｅ中の１ｂからの還元されたＨＢｓＡｇ　２■に１０ミ
リモルの燐酸カリウム緩衝剤（Ｔｈ−１７，１）Ｌ６ｍ
ｌ中の１ｄにより変性したＭ−ｎ−工ｇＧｉＱｍ９全加
える。混合後２５°０で１時間反応させる。

反応を１ミリモルまでシスティンを添加することによつ
１完了さセ、２５℃で６０分間反応させ、次いでヨード
アセトアミドを５ミリモルまで重加し、２５℃で３０分
間故戊応せる。引α＠１５１ｎ９／’ｊの１度にｅ縮す
る。

１ｆ）結合体バッチのクロマトグラフィーに＝る分離 パンチ’（０，８ｍに１縮した後スーヘｏ　−ｔ’（［
ｊｕｐｅｒｏｓｅ　）　６ｐｒｏｐ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　）　（約８０−〕にのせ、５（−７時の直想的侃
退でクロマトグラフィーにかける（１０ミリモルのＭＩ
ｊＷカリウム様価剤ｐｉ４７．５　；　０．２％蔗糖；
０．１％アジ化物〕。除去したフラクションが好適な主
成物である。

（２）羊−抗一マウス−ＦＯｒ（受容体−２）２ａ）羊
−抗−マクス−Ｂ’ｃｒ−抗ｍ　ｒＲｋ前記のようにし
て精製する： この抗体ン官有する廂清に硫ｔ９アンモニウムな加、８
ｔ″Ｃ１，１３モルにする。沈ｆ、？’に１５ミリモル
の燐酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ１７−ＣＪ　）？官有す
る５０ミリモルの坦化ナトリクムに入才【る。こうして
得ら１する浴液’ｉ　１ＪＫＡｉ−セルロース七通端て
セる。

２ｂ）免疫吸着による精製 ２ａからの羊−抗一マウスーＦＱｒ−試薬をｒＢｓ　Ｈ
；衝剤（へら）墳で仁術した食塩水）　ｐｉ（７−５甲
で２時間かけてセフ　、ｆ−ロシＡ／　（Ｂｅｐｈｅｒ
ｏａｉＡ！　）−結合マウス−ＩｇＧ金経て導入する（
試薬蛋白質５０ｍり当りＭ−工ｇＧ−セフエロシル約１
−）。

結合さハなかった蛋白質を洗浄除去後的異的に結合さハ
た含分を１モルのプローオン酸で沼敞する。生成物を透
析し、凍結乾燥する。

（３１ＨＢｅＡｇ−βＧａ１−結合体（受容体６つ３ａ
％ｂ）　１ａ％　ｂ）と同様にして行うＨＢｅＡｇの限
定過大及び脱地 ６すβ−ガラクトシダーゼ（／’−Ｇａｌ　）の変性３
０ミリモルの病ひカリウム緩衝剤（ｐＨ７，１）１Ｍｔ
中のβＧａ１１０■の浴液に、ビスマレイミド−メチル
−エーテル（ＢＭＭＢ）　５０μで（無水ジメチルスル
小キシドｉ　ａｌ当りＢＭムｉＩｃ　４７　ｒｎ９）　
’ＩＩ”添加し、？ＪＲ合し、１時間室温で反応させる
。

５ｄ）変口さｔまたβＧａｌの脱塩 ６Ｑ）７：）１らの戊応バンチを４℃に作動し、この温
度でセファテックスＧ−２５１０ｍ１’ｉ用い３０ミリ
モルの燐酸カリウム緩衝剤（ｐｉ（７，１）中で流速４
０１１１／時でクロマトグラフィーにかけ、分別する。

最高蛋白質含量を有するフラクションをプールする（蛋
白質濃度６ｍ９７ｒｄ）：β−Ｇ　ａｌ　−ＢＭＭＥ　
。

６り結合体バッチ ６０ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤（ｐ）１７．１，１
４ｄ中の５　ｂ）からの還元さ１１　ｆＣＨＢｓＡｇ　
２　ｒｒｕ；Ｉ　Ｋ同じ緩衝剤１．６ｄ中のβｅａＡ−
Ｂｎｎｘ　１０　ｍ？　’ｒ：、加え、混合後１時間反
応させる。

反応をシステイン１ミリモルまでｋｔｌｓ加することに
よって終了名せる。２５℃で６０分後口−ドアセトアミ
ド５ミリモルまで伶加し、同様に６０分間反応させる。

引続きバッチに１５■／ｌＪＫ濃縮する。

６ｆ）　＆応バッチのクロマトグラフィーによる精製 ３　ｅ）からのバッチｔスペローゼ６ｐｒｏｐ−カラム
８０ｊＩｊに入れ、流速５１／時でクロマトグラフイー
にかける（緩衝剤：１０ミリモルの燐酸カリウム緩衝剤
ｐＨ７，５、ｌ］、２％蔗糖、［１，１％アジ化物）。

最後のフラクションがｆｉｉｌ製された生成物である。

例２ 抗−ＨＢｓの測定 Ａ）基質緩衝剤の製造 ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨｐ）１７．０　７０ミリモル／ｌ
堝化ナトリウム　　１５４ミリモル／ｌ牛鹿渭アルブミ
ン　　　５ｆｉ／１ クロルフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクトシド（西ド
イツ儒許第５３４５７４８号明細書により製造）　　　
　　５ミリモル／ｌトウイーン２０（非イオン性清浄剤
） ２　ｇ／Ｉ Ｂ）試薬支持体の製造 １）試薬支持体１： １ノ当り、燐酸ナトリウムーへ６（６７℃）１００ばリ
モル 増化マグネシウム　２ミリモル、 環化ナトリウム　　９ｇ、 牛匍渭アルブミン　５ｇ、 ＨＢｓＡｇ−ＩｇＧ　（受容体１浴液）　　１０■、Ｈ
ＢｓＡｇ−β−ガラクトシダーゼ−結合体　　２５０Ｕ
（受容体３溶液；活性はオルト−ニトロフェニル−β−
ガラクトシドを用い６７℃で測定する）を含有する溶液
４０μｌ’を市販のポリエステル紙から成るフリースに
滴加する。引続き室温で乾燥する。

２）試薬支持体２： セルロース−フリースにブロムシアン活性化法（西ドイ
ツ肴許公開公報第１７６８５１２号明細′Ｊ４）により
マウス抗体のＦｃ７部に対する羊抗体（受容体２浴液）
全固定するが、その際愼維拐相１ｇ当り抗体１０μｇを
固定する。洗浄により結合されなかった抗体を除去し、
フリース全嘗湛で注意深く乾燥する。

この２種類の試薬支持体１及び２七用いる測定は西ドイ
ツ判ｔｆ（ＤｌｌニーＡＩ）　３４２５００８．５号（
判願昭６０−１４６９４号）明細書に記載されている分
析測定を行うための装置を用いて行う（その第１図参照
）。

こｎは、成形体から成る自動遠心分析装置用の回転装入
構造物ｔ−表し、この成形体は試狛塗布罠（こｎは各々
物足の試薬を含浸させた吸収性の支持体材料を含有する
試薬区分（ＦＪｄ　）と接続している）、少なくとも１
個の混合弁呈及び１個の測定！ＩＷＬ（こｎらは一緒に
装入構造物が回転子上に固定される場合に内径から外径
へ通じる試料液体輸送路を形成する）、更に少なくとも
１個の液体全収容する地の室、及びこの岸から回」定へ
と導く、試料液体輸送路と少なくとも部分的に同じもの
である輸送路を有する。その際試刺収容岸Ｐの試料液体
輸送路は、吸収性材料を充填した緩衝剤七協有する芦ａ
１室Ｃ及び室ａと呈Ｃの間に配置さｎた第１弁室ＶＫＩ
金経て第２弁岸ＶＫ’ｌへ導き、ここから室ｄ及び捕果
室ＡＫｉ経由して測定室にへ導く。

その他のｇ、体を収容する几めにボンメ塞として作られ
た３質室ＰＫ全具備し、この室は配量添加室ＤＫ及び細
管Ｋａｐから成る配量添加装置及びオーバーフロー室υ
Ｋｔ−経由して第２弁室ＶＫ２と接続している。西ドイ
ツ萄肝（ＤＢ−Ａ）１５４２５００ｅ、、５明ａ＊ｏ第
１図は使用すｎる回転装入構造物七略示するものである
。

試薬支持体１を回転装入構造物の区分ｏ（Ｃ載せ、試薬
支持体２は区分ｄに載せる。その際試料４０μ！金上部
開口部から面接区分にピペットで入れる。基質溶液２７
０μｌｔ−岸ＰＫにピペットで入ｎる。次いで高い回転
数と静止状態を父互に変える好適な遠心分離プログラム
によって試η及び基質浴液を分離マトリックス及びキュ
ベツトのカへ搬送する。

その際プログラムが進むにつｎて受容体１及び３は区分
Ｃの試料゛液体によって溶離さハ、次いで均一な混合物
が反応を起す。区分ｄで生成さｎた錯体（受容体１：分
析物（Ａｎａｌｙｔ　）　：受容体３）が受容体２に結
合する。

基質浴液は配量添加箋りにによって少量に分けられ、銘
化さｎなかつ九過剰の結合体を洗浄除去するのて役立つ
。

これらの条件下で下記の結果が得られる：第１表 抗ＨＢｓＡｇ Ｕ／１１）　　０　　　１００　　２８０　　６５０　
　　９５０測定（ｍ（ｍｌすｉ５ｏ＊ｓ　　２６０±１
［］　　４４５±１０　８０５＊１６　１１１１＊２７
１）西ドイツ在パクルーエーリッヒ研究所（Ｐａｕノー
Ｅｈｒｌｉｃｈ−工ｎ５ｔｉｔｕｔ　）の標準化による
単位の定義試刺を各々５画工１［定した。測定は７００
　ｎｍに対して５７６　ｎｍで０．５−の層厚で実施し
、ｄ−ｉ−の層厚に換算した。

例６ 微Ｊ！Ｍ定プレー）　（ＭＴＰｓ）を各凹み当フ、畿覆
緩衝剤（２０ミ！７モルの炭酸塩緩衝剤、−９，６）中
の１０μ９／ｄの磁度の免疫吸着により精製した受容体
２（羊−抗−マウス−Ｆｃｒ−抗体〕の浴液各２５０μ
ｌを用い″Ｃ呈ＷＲＴで一夜被覆する。引続き非判異的
な結合部を後被ｒ！Ｊ緩衝剤（燐酸カリウム５０ミリモ
ル、ＮａＣ１１５［１ミリモル、牛皿渭アルブミン（Ｒ
８Ａ）　１％、トウイーン２０１ｇ／ノ、−７，５）　
３００μｌと一緒に堅温で１時間後恒温保持することに
よって飽和する。凹み当り洗浄緩衝剤（ＨＫＦＥ８１０
０ミリモル、Ｎａ（Ｖ　１５０ミリ七ル、羊−佛準−工
ｇＧ　２．５　／　１％　Ｌ−アスパライン酸マグネシ
ウム０．５ミリモル、トウイーン２９／ｌ。

ｐＨ７，２５）　３００μｌで洗浄後、試別１５０バ及
び洗浄緩衝剤中の例１からの受容体５　（ＨＢ８Ａｇ−
βＧａｄ−結合体、０．１　Ｕ　／　ａｔ、６７℃で０
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いて活性
測定）及び例１からの受容体１（ＨＢｓＡｇ−マウスー
エｇ、ａ−結合体、５μｇ／耐）を含有する試薬浴液５
０μｌｋ添加し、揺動し、引続き６時間恒湿保持する。

引続き凹みｔ吸い出し、洗浄緩衝剤中６００μｌで６回
洗浄する。その後至福で１時間基質浴液（クロルフェノ
ールレッド−β−Ｄ−ガラクトシド５ミリモル、ＨＥＩ
’ＥＳ　７０ミリモル、Ｎａ０Ａ’　１５０ミリモル、
Ｒ８Ａ３，９／Ａ、）ウィーン２０２ｇ／ｌ、ｐＪ（７
−３）　２５０μｌと共に恒温保持し、引続き市販のＭ
ＴＰ−測定装置を用い５７　Ｄ　ｎｍで、６６０ｎｍの
ビクロマト補正（ｂｉｃｂｌｏｎ＋ａｔｉｓｃｈｅＫｏ
ｒｒｅｋｔｕｒ　）　ｆ、用いて測定する。

第２表は代表的な実４＠の結果を表す（各々ｎ−４全用
いる測定）。

第２表 わ’ｉ：　　−ＨＢｓＡｇ　　−じ負度（Ｕ＃　　１）
）　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　２００ｍ
Ｅ（５７０ｎｍ−６５０ｎｍ）　　　　１５８＋／−１
９９１２＋／−５８１）定該は例２参照。

ジ１１４ 曾の被］ ｄ？　ＩＪステロール試験管を４０ミリモルの燐酸ナト
リクム緩衝剤中のアビジン４０μｇ／ｄｋ用いて１８〜
２４時間被覆する。非判異的な結合部を飽′ａｊるため
の後被覆全Ｒ８Ａ　（十崩消アルブミ７　）　０．３％
、ＮａｃｌＯ−９％、蔗糖２％及びポリエーテルグリコ
ール（プルオニツクＬ−６４）　Ｏ，０５％ｋｍ有する
ｍｆｌ、”を用いて行う。

ペルオキシダーゼと結合した肝炎３表面抗原（ＨＢｓＡ
ｇ）の製造： この方法は原理的には、ＨＢｓＡｇ中で注意深く還元す
ることによって！３Ｈ基ｔａ離させ、次いでこの基にマ
レイミドヘキサノニル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミ
ドエステル（ＭＨ８）ｉ用いて３導したオランダガラシ
ーペルオキシダーゼ（ＰＯＬ＋）全結合して、行った。

ＨＢｓＡｇ中ｔ　ａｔ度１　、４　Ｒ９／　！１１及び
ｐＨ４，５でジチオスレイト（シＴＴ）ｉ　Ｑミリモル
の存在で２時間２５゛Ｃで恒温保持し、引続きセファデ
ックス−０２５梢製カラム（ファルマシア）ヲ用い１０
ミリモルの酢酸塩慶衝剤中で脱場し、醋化保護のために
アルゴンでガス処理する。

ＦＯＤを１度１０Ｒ９／　ｘｔｌで３０ミリモルの燐酸
す）　ＩＪクム畿（＃炸＋％…７．１中で２５倍モルの
過剰のＭＨＩＪと一緒に１時間２５°Ｃで恒温保持する
。

遊離ＭＨ８’ｉセファデックスーＣ）２５６体（ｍｅｄ
ｉｕｍ　）カラム（ファルマシア）を用い、燐酸カリウ
ム緩衝剤１０ミリモル、ｐＨ６，１、Ｎａ０１５０ミリ
モル、ＭｇＯ１２１０ミリモル中で分離する。

還元されたＨＢｓＡｇのＰＯＤへの結合ｔ％ＨＢｓＡｇ
１ｍｇ当Ｆ）ＭＨ日誘導体化したＰＯＤ　３■を使用し
て−７及び２５°Ｃで行う。２時間後反応をシステイン
１ミリモルまでを添加することによって終了させる。引
続９８Ｈ基をヨードアセトアミド５ミリモルによって−
７，５で１時間２５℃で誘導体化する。次いでＨＢｓＡ
ｇ−ＰＯＤ−結合体を燐酸ナトリウム緩衝剤１０ミリモ
ル、…７．５、ＮａｐＨ５０ミリモ／Ｌ、中でＡＣＡ　
２２　（ＩＢＦ、　−１ｘルバ、西ドイツ〕でゲル濾過
を用いてｆＲ製する。

ビオチニル化さｎた肝炎Ｂ表面抗原の製造：ビオチン−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル〔バイエル、Ｋ
、Ａ、及びＷｉｌｃｈｅｋ　Ｍ。

（１９８０）　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３４巻、
２６５〜２６７頁〕を用いて蛋白質中のアミノ基に関し
１ビオチニル化する； 更にＨＢ８Ａｇｆ　３０ミリモルの燐酸ナトリウム緩衝
剤ｐ）１７．１中で濃度１〜／−で２５°Ｃで１時１’
ｌＪ）、ＤＭ８０中のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルの６ｍ９１ｘ１ｍ液５０μｌｉｄと一
緒に恒温保持する。遊離ビオチニル化試薬を、燐酸ナト
リウム緩衝剤（ｐＨ７，１）２０ミリモル、ＮａＣＪ　
１５０ミリモル中テＡｃＡ　２２　テ９’ル濾過するこ
とによつ工分離する。

試験の実施： 試料（２００μ１％崩渭又は卯漿）を管中で試薬１００
０μノ中で岸温で４時間恒湛枳持する。試薬は受容体Ｒ
３としてペルオキシダーゼと結合した肝炎３表面抗原（
◇１００ｎ、９／ｍｌ　ＨＢｓＡｇ　）　６０ｍＶ　／
−及び受容体Ｒ１としてビオチニル化さｎた肝炎３表面
抗原１５０ｎ、９／ａ４’ｅポリエーテルグリコール（
ゾルロニツク１’　−６８）　０．５％、牛崩清アルブ
ミン０．２％、酒石酸ナトリウム０．２モルを有する燐
酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ八へ）中に官有する。

恒温保持した後管を６回水道水１．５−で洗浄し、基質
反応させるために２，２′−アジノージβ−エチル−チ
アゾリン−スルホン酸／ジアンモニウムｍ１１Ｌｌ（１
，９ミリモル）全ピペットで添加する。吸光上４０５　
ｎｍで層厚５謳のキュベツト中で徂］定し、１曙のキュ
ベツトに換算スる。

第６表及び第１図は代表的な実験結果である。

第６衣 ｐｆｉＨＥｓ”） Ｕ／ｌ　　　　　Ｏ’ｖ０　　１０　　　５０　　　１
０Ｇ　　　２５０　　　　ｂＬＩｔＪ山１捉値（址）　
８３　１２６　１４５　３２１　５０５　１１１０　１
９５４１）足軽は例２参照 例５ 試験管全ヌトレプトアビシン及びテルモ−ＲＥＩＡで被
シする。

ａ）ｆルモーＲ８Ａ　（牛鹿消アルブミン）の製造；Ｒ
８Ａ−Ｉ　１　ｇ’に５０　ミ’）モｈ／ｌ（７）ｇ！
４Ｍ力ＩＪ　’７ム（ｐＨ７，０）　１００ＫｔＶＣＭ
）ｆｌ＄シ、７０’Ｃに加熱し、４時間軽く攪拌しなが
らこの′Ｗ度で保つ。

溶液を冷却し、濾通し、限外濾過室（除去限界（Ａｕａ
ｓｃｈｌｕＩＩｇｒｅｎｚｅ　）　：　３　Ｄ　０００
ダルトン）中で濃度ＳＣＪｍ９／−に鉤整する。引続′
＠６０倍の容Ｉの２回蒸留した水で透析し、引続き凍結
乾燥する。生成物は分子量約７０１１０００を有する。

ストレプトアビジンに結合する前にテルモ−ＲＢＡを活
性化する。こｎに０．１モル／ｌの燐酸カリウム（ｐｉ
（７，８）２ｄ甲のテルモ−ＲＢＡ　６８■會招解し、
日−アセチルメルカプト琥珀酸アンヒドリ）’　（Ｅ３
ＡＭＢＡ　）　３．８ｍ９（７）ｉ沿ｋ［々に加える。

６時間の反応後、５０ミリモル／）の燐酸カリウム（、
ｐ）１６．５　）　２１で４°Ｃで透析する。

ｂ）テルモ−ＲＢＡに結合したストレプトアビジンの製
造ストレプトアビジンの粘性化：ストレプトアビジン６
０ｒｎＩｊ’ｔ　５０ミリモル／ｌの燐酸カリツム／１
００ミリ ナトリウムの浴液（　−７．０　）　６　ｘｌＶｃ浴解
し、４℃で冷時に保つ。マレインイミドヘキサノニル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＨ１３）６
．１６■ｔジオキサン６２０μＪＫ溶解し、ストレプト
アビジン浴１ｔ＆に混入する。２時間４℃で反応させた
後、５０ミリ七ル／ｌ燐酸力リウム／１０Ｄミリモル／
　ｌ　ｔＭ化ナナトリウム溶液（ｐＨ５）１１で４°Ｃ
で２回透析する。

ストレプトアビジン及びテルモ−Ｒ８Ａがら成る結合体
の製造： ５０ミリモル／ｌの燐酸カリウム−５，０及び１００ミ
リモル／ノの塩化ナトリウム１０ｙに溶解したＭＨ８５
導体化したストレプトアビジン６６ｍ９及び５０ミリモ
ル／１ｍｍカリウム／１００ミリモル／ｌ墳化ナトリク
ムｐＨ６，５５ｄ中の活性化さｎたテルモ−Ｒ８Ａ−８
ＡＭＢＡ　７２　ｍ９を一緒にする。混合後反応ｔＦ、
了させるために１モル／ｌのヒドロキシルアミン（…７
．０　）５０μ！盆溶加する。６時間後災厄主成物をデ
ルクロマトグラフィー（スペローゼ■６、燐酸カリウム
５０ミリモル／！、増化ナトリウム１００ミリモル／ｌ
、ＰＨ７，５）で和製する。分子童白万〜５拘万を有す
る結合体が得らｎる。

各ボ１，７．。−２７」、管又は、−、ア（、□、８ユ
）■（ＢＡＢＦ　ｌｊ造）にストレプトアビジン／チル
そ−Ｒ８Ａｆｆｉ液（テルモ−Ｒ８Ａ　１−当りストレ
プトアビジン１０μｇ）１．５−を充填し、−夜（約２
２時間）放置する。その後小管？完全に臣にし、牛崩清
アルブミン？！−含有する浴液で後被覆する。

次いで例４に記載したように、ペルオキシダーゼと結合
した肝炎３表面抗原を用いてビオチニル化さまた抗原を
製造し、例４に記載したように試験を実施する。結果を
下記の第４表及び第２図に記載する。

第４叡 抗ＨＢθｌ） Ｕ／ｌ　　　　０　　５　１０　５０　１００’５００
１ｊｌｌｊ定有屓Ｉ吐）　　　１４３　　２０９　　２
４２　　７４４　　１ｂＯＬＪ　　　５５４５１）定容
は′ｆＡ２　ｋ６照

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＢｓ−抗体量を増加させた例４による方法の
検Ｊｉｉ線を表し、第２図はＨＢｓ−抗体ｊを増加させ
た例５による方法の検量線を表す。 囚」 ＦＩＧ、１ ｍ１ｌＪ／ｍｌ抗ＨＢｓ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｒ＿１及びＲ＿３が液体相中に存在し、抗体と結合
   可能であり、Ｒ＿２は固体相と結合しており、Ｒ＿１と
   結合可能であり、Ｒ＿３は標識を有する、６種類の異な
   る受容体Ｒ＿１、Ｒ＿２及びＲ＿３と一緒に恒温保持し
   、固体相を液体相から分離して固体相の標識を測定する
   ことによつて抗体を測定する方法において、Ｒ＿１とし
   て測定すべき抗体により特異的に認識される物質及び特
   異的な結合系の反応成分から成る結合体を使用し、Ｒ＿
   ３として測定すべき抗体により特異的に認識される物質
   及び標識から成る結合体を使用し、Ｒ＿２として特異的
   な結合系のその他の反応成分を使用することを特徴とす
   る、抗体を測定する方法。 ２、特異的な結合系としてビオチン／アビジン；ビオチ
   ン／ストレプトアビジン；ビオチン／／アンチビオチン
   ；ハプテン／抗ハプテン；抗体のＦｃｒ−フラグメント
   ／このＦｃｒ−フラグメントに対する抗体；炭化水素／
   レクチンを使用することを特徴とする、請求項１記載の
   方法。 ３、受容体Ｒ＿３が酵素、発蛍光性、化学発光性又は放
   射性の物質で標識付けされていることを特徴とする、請
   求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。 ４、３種類の受容体全てを同時に添加することを特徴と
   する請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。 ５、受容体Ｒ＿１及びＲ＿３を試料と一緒に前以つて恒
   温保持し、引続きＲ＿２と一緒に恒温保持することを特
   徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の方
   法。 ６、Ｒ＿１中の測定すべき抗体により特異的に認識され
   る物質の量がＲ＿３中の測定すべき抗体により特異的に
   認識される物質の量より多いか又はそれと同じであるこ
   とを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項に記
   載の方法。 ７、Ｒ＿１中の測定すべき抗体により特異的に認識され
   る物質の量とＲ＿３中の測定すべき抗体により特異的に
   認識される物質の量の比が ２０〜１：１であることを特徴とする請求項６に記載の
   方法。 ８、比が５〜１：１であることを特徴とする請求項７に
   記載の方法。 ９、抗体と結合可能な２種類の異なる可溶性の受容体Ｒ
   ＿１及びＲ＿３（Ｒ＿１は特異的な結合系の反応成分を
   有し、Ｒ＿３は標識を有する）及び更に固体相に存在し
   受容体Ｒ＿１と結合可能である受容体Ｒ＿２を含有し、
   不溶性の受容体Ｒ＿２及び可溶性の受容体Ｒ＿１は物理
   的に相互に別別に存在することを特徴とする請求項１か
   ら８までのいずれか１項に記載の抗体を測定するための
   試薬。 １０、受容体Ｒ＿２又は受容体Ｒ＿２を物理的に相互に
   別々にその都度支持体材料に含浸させておくことを特徴
   とする請求項９記載の試薬。