JPS6323862A - ５−ヒドロキシ−３−インド−ル酢酸の螢光偏光免疫検定法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は流体、特に生物学的流体例えば血清、・血漿又
は尿中０５−ヒドロキシ−３−インドール酢酸（５−Ｈ
ＩＡＡ）の量の測定用の螢光偏光免疫検定の方法及び試
験、及び試薬の製造方法に関する。よ列特には、本発明
は（１）試料中の５−ＨＩＡＡＯ量の測定用の試薬（ト
レーサー及び抗体）、（２）抗体の増加に用いる免疫原
化合物；　（３）　（トレーサー）及び免疫原化合物の
）合成方法；及び（４）測定を実施するための分析方法
に関する。

〈発明の背景技術〉 ５−ＨＩＡＡは神経伝達物質セロトニン（５−ヒドロキ
シ）　ＩＪブタミン）の主要代謝物質である。尿の５−
　ＨＩＡＡレベル（濃度）の測定は身体のセロトニン作
動性の機能不全の便利な指標である。５−ＨＩＡＡの中
程度乃至高度に上昇した濃度は吸収不良症候群及び代謝
及び神経系障害によって特徴付けられる二次症候群、こ
れは極めて重症な右側弁の心臓疾患を起こしかねない、
の両方に付属するものである。

マススペクトロメトリーを伴うガスクロマトグラフィー
、高性能液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセ
イ（放射線免疫検定法）及び比色法が尿中の５−）ＩＩ
ＡＡの測定用に文献中に記載されている。一般に、競合
的結合免疫検定法が化学的方法例えばガスクロマトグラ
フィー及び高圧液体クロマトグラフィー、これは冗長な
試料抽出法と検定時間を必要とする、の好ましい代替法
を提供している。

これは本発明の螢光偏光免疫検定法についても成り立ち
、本発明の方法は免疫検定法の特異性と均質的方法の速
さと使、利さとを結び合わせて、尿中の５−ＨＩＡＡレ
ベルのモニター用の正確で信頼できる方法を提供する。

競合的結合免疫検定法では、（通常゛′配位子（リガン
ド）゛と呼ばれる）測定される生物的物質が標識を付さ
れた試薬（“配位子ｔＩ８ｉ似体（リガンドアナローブ
）゛又は“トレーサー゛）と、配位子及び配位子類似体
に特異性のある抗体上の限られた数の受容体結合サイト
に対して競争する。試料中の配位子の濃度が抗体に結合
する配位子類似体の量をきめる。配位子と配位子類似体
はそれぞれその濃度に比例して抗体に結合するので、結
合する配位子類似体の量は試料中の配位子の濃度に反比
例することになろう。

螢光偏光は地合的結合免疫検定法で生じるトレーサー−
抗体抱合体の月のｉｔ！Ｉｔ宝に利用できる方法の一つ
である。螢光偏光法は、螢−ｙｔ標識を付した化合物は
平面偏光によって励起された時、その回転の速度に逆比
例する偏光度を有する螢光を発するという原理にもとづ
いている。従って、螢光標識を有するトレーサー−抗体
抱合体が平面偏光によって励起された時、発螢光団が、
光が吸収され発光される時間の間、回転を拘束されてい
るために高度に偏光したま＼の光を発する。こｎに反し
て、結合していないトレーサーが平面偏光で励起される
と、その回転は対応するトレーサー−抗体抱合体よシも
遥かに迅速である。その纜果として、結合していないト
レーサー分子から発せられる光は偏光解消している。

螢光偏光免疫検定法の技術は当業者に良く知られている
；しかし現在迄、かかる技術を尿の５−ＨＩＡＡ濃度決
定に使用することは成功を収めるまでに到っていない。

本発明は、便利さが増し、コストが低下し、これ迄さま
ざまの利用可能となっている検定システムにのしか−っ
ていた欠点の無い、尿中の５−ＨＩＡＡの量の高度に正
確な測定の特長を当業界にもたらすものである。

〈発明の構成〉 本発明は５−ＨＩＡＡの螢光偏光免疫検定法、この検定
法で使用するためのトレーサー、免疫原及び抗体；及び
トレーサー、免疫原及び抗体の製造方法に関する。

本発明の第１の態様は新規な構造を有するトレーサー及
び免疫原の新規な発見に関しており、従って本発明の第
１の態様によれば式２に示す構造式； Ｉ 但し　Ｒ１ばＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであるか、あるいはＲ２
と一緒になり４乃至８個の合計炭素原子全有し且つ４個
以下のヘテロ原子を含有する環式基であり；Ｒ２は０Ｈ
ＸＣ１，ＦＸ　Ｂｒ、Ｉ、ＯＣＨ３，０ＲＺＱであるか
、あるいはＲ１又はＲ３と一緒になり４乃至８個の合計
炭°　素原子を有し且つ４個以下のヘテロ原子を含有す
る環式基であり； Ｒ３はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであるか、あるいはＲ２と一緒
になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以下の
ヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ４はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又他の
免疫学的に活性なキャリヤー、又はフルオレセイン又は
フルオレセイン誘導体であυ； ２はＱがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体の場
合にはＣ０ＸＮＨ１ＣＨ２Ｎ′Ｈ又はＣＳであり、そし
てＱがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は
他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合にはＮ、　ＮＨ
１８０２、ＰＯ２、ＰＳＯ又はグルクロニド部分であり
；且つＲば、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）
誘導体又は他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合には
７個以下のヘテロ原子を含有し、そしてＱがフルオレセ
イン又はフルオレセイン誘導体の場合には１０個以下の
ヘテロ原子を含有し、且つ直鎖又は枝分れ鎖に配列され
た０乃至２０個の炭素原子とヘテロ原子の合計を有し、
２個以下の項構造を含有する結合基である； でいずれも表わされるトレーサー及び免疫原が提供され
る。

Ｑがポリ（アミノ酸）、その誘導体又は他の免疫学上活
性なキャリヤーの場合には、この化合物は免疫原として
使用できる。Ｑがフルオレセイン又はその誘導体の場合
には、この化合物はトレーサーとして使用できる。

現在好ましい発明の態様は、トレーサーも免疫原も式３
に示す構造式： 曽 但し、Ｒ２はＨＸＯＨＸＣｌ、Ｆ、Ｂｒ又はＩであり；
Ｒ４はＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｑ及び２は先に定義した通りであり；且つＲ１１Ｑがポ
リ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は他の免疫
学的に活性なキャリヤーの場合に７個以下のヘテロ原子
を含有し、Ｑがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導
体の場合に１０個以下のヘテロ原子を含有し、且つ直鎖
又は枝分れ鎖中に配列されたＯ乃至２０個の炭素原子と
ヘテロ原子の合計を有し、２個以下の環構造を有する結
合基である； によって表わすことができる。

本発明の第２の態様は新規な免疫原によって増加させら
れた抗体に関する。本発明の第２の態様によればＱがポ
リ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は他の免疫
学的に活性なキャリヤーの特許請求の範囲第１項による
化合物に応答して、抗体が製造される。

本発明の第３の態様によれば、（ａ）式２で示された構
造式〔但しＺＱ（＝Ｘ）がＮＨ２、Ｃ０２Ｈ，又はＮ　
Ｈ−ＣＯＣＨ２Ｉであり、そしてＲが直鎖又は枝分れ鎖
中に配列されたＯ乃至２０個の炭素原子とヘテロ原子の
合計を有しておシ、そして２個以下の環構造を有する結
合基である〕で表わされる化合物と、（ｂ）ポ１月アミ
ノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は別の免疫学的に活
性なキャリヤーとをカップリングさせる工程を有するこ
とを特徴とする方法で免疫原が製造される。好ましいボ
′１ノ（アミノ酸）には、テログロブリン及びキーホル
・リンバット（ｋｅｙ　ｈｏｌｅ　　ｌｉｍｐｅｔ（Ｆ
ｉｓｓｓｕｒｅｌｌａの−ｍ）〕ヘモシアニンがある。

本発明の第４の態様によれば、（ａ）式２に示す構造式
〔但しＺＱｆ＝Ｙ）がＣ０２Ｈ，ＮＨ，、ＯＨ，５Ｏ３
Ｈ又はＣ）（Ｏであり、そしてＲが直鎖又は枝分れ鎖中
に配列された０乃至２０個の炭素原子とヘテロ原子の合
計を有しておりそして２個以下の環構造を有する結合基
である〕で表わす；ｉＬル化合物’ｋ、（ｂ）フルオレ
セイン又はフルオレセイン誘導体とカップリングさせる
トレーサーの製造法が提供される。現在好ましいのは４
′−アミノメチルフルオレセインの誘導体である。

本発明の第５の態様は本発明のトレーサー用の新規な安
定化マトリックスに関する。か＼る安定化マトリックス
は１．５乃至３．５の範囲のｐＨを有する有機溶媒、か
＼る有機溶媒中で安定であυ且つ可溶である酸化防止剤
、及び電子伝導性化合物を含む。か＼るマ）　ＩＪラッ
クス一つは有機溶媒としてのＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド、酸化防止剤としてのチオ尿素、及び電子伝導性化
合物としての塩化カリウム／ＭＣＩ　から成る。

本発明の第６の態様は試料バックグラウンド及び交叉反
応代謝物を減少させるための相抽出を利用する新規な試
料の調製方法の使用に関する。

本発明の第７の態様は、本発明の対照及びキヤリプレー
タ（ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ　）用の新規な安定化マトリ
ックスに関する。このマトリックスは正常の場合に生起
する諸成分に加えてＬ−アスコルビン酸とＮ−アセチル
−Ｌ−システィンの配合物を含有しており、マトリック
カ二酸素がパージしてあシ、密封されている、人工の尿
マトリックスから成る。

本発明の第９の態様によれば、５−ＨＩＡＡの濃度の測
定方法が提供される。試料を５−）（ｒＡＡ抗血清、バ
ンクグラウンド消滅剤、及び５−ＨＩＡＡ抗血清の存在
に対して検知可能な螢光偏光応答をすることのできるフ
ルオレセインを含有する５−ＨＩＡＡ誘導体を接触させ
る。平面偏光光を次に溶液中を通過させる螢光偏光応答
を得て、そしてこの応答を試料中の５−ＨＩＡＡの測定
単位（尺度）として検知する。本発明のこの態様の改良
された方法は、マススペクトロメトリーを持つガスクロ
マトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、ラジ
オイムノアッセイ及び比色法の様な先行技術の方法に比
較して、大巾に改善された試料処理速度を可能とする。

本発明のその他の目的及びそれに伴なう利点は式及び実
施例と共に以下の詳細な記載を一読することによって最
も良く理解できる。

く式の簡単な説明〉 以下に示す式中では略号“Ｆｌ”はフルオレセイン部分
を表わし、“ＢＳＡ”はウシ血清アルブミンを表わし、
ＫＬＨ’″はキーホール・リンバットヘモシアニンを表
わし、そして“ＴＧＢ″はテログロブリンを表わすもの
とする。

式１は本発明に従って定量的に測定される代謝物質５−
ＨＩＡＡの構造を示す。

式２は本発明のトレーサー及び免疫原並びにその製造に
使用される反応物についての普遍的構造式である。

式３は現在好ましい種類のトレーサー及び免疫原につい
ての普遍的構造式である。

式４は本発明のトレーサーに包含されるフルオレセイン
部分の交互（互変）構造式及び名称を示す。

式５は、式２がトレーサー用の前駆体を表わしている時
に、フルオレセイン部分を前駆体に結びつけるさまざま
の結合を示す。

式６乃至式９及び式３０は本発明による、トレーサーの
構造のさまざまの例を示す。

式１０．１１及び式２５は本発明による免疫原の例を示
す。

式１２乃至式２４は本発明中で使用されるトレーサー及
び免疫原の形成に用いるハプテン反応物の構造のさまざ
まの例を示す。

■ 式３ ラクトン　　　　　　　　　　　酸 式４ ％式％ −１州−Ｃ８−ＮＨ−Ｆｌ　　−０−Ｃｏ−ＮＨ−Ｆｌ
　　−０−Ｃ８−ＮＨ−Ｆｌ−８ｏ２−ＮＨ−Ｆｌ　　
−０−Ｃｏ−ＮＨ−３Ｏ２−ＮＨＦ１式５ 式７ 式９ 式１０　　　　　　　　式１１ Ｍｅ　　　　Ｍｅ ＼Ｎ′ 式１２　　　　　　　式１３ 式１４　　　　　　　　式１５ 式１６　　　　　　　式、□ 式１８　　　　　　　式１９ 式２０　　　　　　　　　式２１ 式２２　　　　　　　　　式２３ 式２４　　　　　　　　　式２５ Ｉ Ｃ１式２７ 式２６ 式２８　　　　　　　　　式２９ 式３０ 〈発明の詳細な記載〉 本発明はフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体の使
用を伴なう。本明細書中でトレーサーの有用性について
必要とされるフルオレセイン及びフルオレセイン誘導体
の性質はフルオレセイ／の螢光である。フルオレセイ／
は環境の酸濃度（ｐＨ）によって、式３に示す２８の互
変異性型として存在する。開環（酸）型の場合、その形
のフルオレセイン（及びフルオレセイン部分を有する化
合物）が宵い光を吸収し、約４ナノ秒の励起状態寿命後
に緑の螢光を発することのできる様にする、多数の共役
二重結合が存在する。

開環及び開環型が共に存在する場合には、開環及び開環
型の分子の相対濃度はｐＨレベルを調節することによっ
て容易に変えられる。一般に、本発明のトレーサー化合
物は溶液中で、生理学上許容し得る塩例えばナトリウム
、カリウム、アンモニウム塩等として存在し、これが本
発明の分析方法中で使用した時に化合物全開環の、螢光
型に存在させる。存在する特定の塩はｐＨレベルの調節
に使用した緩衝液によって変る。例えば燐酸ナトリウム
緩衝剤の存在下では、本発明の化合物は一般に、ナトリ
ウム塩として開環型で存在する。

ここで使用する用語“フルオレセイン゛は個々の化合物
として、又は巨大分子の一成分として、螢光に関連する
以外は特定の分子について存在する場せ、開環及び閉環
型の両方を包含するものとする。開環型は螢光が起こる
のに必要である。

フルオレセイン分子の炭素原子の缶号付けは、対象とし
ている分子が開環又は閉環型のいずすしかによって変る
。従ってフルオレセイン及びその化合物に関する文献は
炭素原子の番号付けについては一致していない。開環型
では、フェニル環上のラクトンのカルボニルにパラの炭
素は６と付番される。開環型ではフェニル環上のカルボ
ン酸基にパラの炭素は５と付番さね、る（式４参照）。

本開示では、合成に使用される原料が最も普遍的にこの
システムを用いて付番さｔしているので、閉環の付番方
法を採用する。従ってカルボキシル基の反対側のフルオ
レセイン及びその化合物の炭素原子は、不発明の開示の
目的では、°″６゛と付番され抗体と複合体を形成して
いない溶液中のトレーサーは自由回転して、（光の）吸
収と螢光の再発光に要する時間が少ない。その結果、再
発光された光は比較的ランダムに配向しており、抗体と
複合体を形成していないトレーサーの螢光偏光は低く、
ゼロに近い。特定の抗体と複合化して、かくして形成さ
れたトレーサー抗体の複合体は、そのよシ大きなスペー
スのために抗体分子の回転が比較的小さなトレーサー分
子のそれよりもずっと遅く、それで観察される偏光を増
加させると考えられる。従って、抗体サイトに対して配
位子がトレーサーと競合する時は、遊離トレーサーとト
レーサー・抗体複合体の得られた混合物の実測された螢
光の偏光はトレーサーのそれとトレーサー・抗体複合体
のそれの中間の値であると考えられる。試料が高濃度の
配位子を含有する場合には、実測される偏光値は遊離配
位子のそれに近く、即ち低い。試験試料が低濃度の配位
子を含有する場合には、偏光値は結合した配位子のそれ
に近く、即ち高い。免疫検定法の反応混合物を垂直及び
次に水平に偏光した光で逐次的に励起し、そして発光さ
れた光の垂直偏光成分だけを分析し、反応混合物中の螢
光の偏光が正確に測定できる。偏光と測定すべき配位子
の濃度との間の正確な相関々係は、既知濃度のキヤリプ
レータ−の偏光値を測定することによって設定される。

配位子の濃度はこの方法で作成した基準カーブから内挿
できる。

試薬 本発明の免疫原とトレーサーは両方とも式２に示した普
遍的構造式で表わし得る。

目的は抗体の識別サイトへの５−ＨＩＡＡとトレーサー
の間での競合をさせることである。ハプテンとトレーサ
ーの構造を大きく変えることがこの目的を達成させる。

本発明の目的では、“ハプテン゛は、免疫学上活性なキ
ャリヤーに結合するための適切な基を有する５−ＨｒＡ
Ａ置換誘導体から一般に成っている、免疫原の前駆体で
ある。

免疫原の構造 有用な抗体はさまざまの５−）ＩＩＡＡ誘導体から製造
できる。免疫原は１−位置、４−位置、５−位置及び６
−位置が機能化されており、動物中で抗体をつくり出す
ことが出来る化合物からつくられ；か＼る抗体は適切な
トレーサーと複合化した時に本発明による５−ＨＩＡＡ
検定法で有用である。

本発明の免疫原は式２に示す一般構造式を有しており、
そして本発明の好ましい態様では、免疫原は式３に示す
一般構造式から誘導される。免疫原は式２に示す種類の
化合物を、ポリ（アミノ酸）又はポリ（アミノ酸）の誘
導体又は他の免疫学上で活性なキャリヤーとカップリン
グさせることによって製造でき、合成方法及び下記の実
施例中で詳述する。ＴＧＢ及びＫＬＨがこの好ましい態
様のポリ（アミノＩＲ）であるが、アルブミン、血清タ
ンパク質、例えばｉｏプリン、眼レンズタンパク質、リ
ポタンパク質等を含めたさまざまのタンパク質キャリヤ
ーが使用できることを理解されたい。例示的なタンパク
員キャリヤーには、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミ
ン、ウシγ−グロブリン、チロキシン結合グロブリン等
がある。別のものとして、充分な数の利用可能なカルボ
キシレート基例えばアスパルテートを有する合成ポリ（
アミノ酸）が、反応性の官能基を持つ合成又は天然の他
の多くの高分子物質と同様に、使用できる。更に、免疫
学的キャリヤーとして使用できる炭水化物、酵母、多糖
類及びその他の物質がノ・ブテンと複合して免疫原をつ
くυ出すことができる。

本発明のトレーサーの構造での可能な変更は、そのノ・
ブテンの構造での可能な変更よりも更に太きいう本発明
のトレーサーは式２に示す一般構造式を有する。発明の
好ましい態様では、トレーサーは式３に示す構造式を有
する。

トレーサーは式５に示すように、例えばアミド、アミジ
ノ、トリアジニルアミノ、カルバミド、チオカルバミド
、カルバモイル、チオカルバモイル又はスルホニルカル
バモイル基によって、フルオレセイン誘導体に結合した
５−ＨＩＡＡ誘導体である。適切なフルオレセイン誘導
体を、アミン、カルボン酸、スルホン酸、メルカプト、
ヒドロキシ、イミデート、ヒドラジド、イソシアネート
、チオインシアネート、クロロフォメート、クロロチオ
フォメート、カルボン酸りロラライド、クロロスルホニ
ルカルバモイル等の基を有する５−ＨＩＡＡ訪導体と結
合させて製造され、これは合成法及び実施例に関連して
後述する。

例として示すが、以下のフルオレセイン誘導体のいずれ
も使用できる： Ｆ　ｌ　−ＣＨ，−ＮＨ２アミノメチルフルオレセイン
Ｆｌ−ＮＨ２フルオレセインアミン Ｆ　ｌ　−ＣＯｚＨＱ−ヨードアセトアミドフルオレセ
インＦｌ−ＮＨＣＯＣＨ２Ｉ　　Ｑ　−ブロモアセトア
ミドフルオレセイン抗体 本発明の抗体は上述の免疫原へのウサギ中で応答を引出
すことによって製造された。免疫原は肖業者周知の方法
で、動物中に投与するか又は一連の接種で免疫担当細胞
のインビトロ培養に投与する。ウサギがここに詳述した
実験での５−ＨＩＡＡ免疫原に対する好ましい客体であ
ったが、ここに略述した構造に対して抗体を製造し得る
ｙ０伺なるインビボ及びインビトロ客体も使用できる。

免疫原の合成 本発明の免疫原はノ・ブテン例えばＺＱがアルデヒド、
アミン、ヒドロキシ、クロロフォーメート、ヨードアセ
トニル又はヨードアセチルである時の式２の一般式で示
されるハプテンと、ポリ（アミノ酸）又は他の免疫学上
で活性なキャリヤーとのカップリングによってつくられ
る。ポリ（アミノ酸）又は他のキャリヤ一部分は・・ブ
テンにカーバメート、アミド、アミノ、チオエーテル、
エーテル結合によって結合できる。好ましい態様では、
ポリ（アミノ酸）はチログロブリン（ＴＧＢ）又はキー
ホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）でちゃ、ハ
プテンはＲ１＝Ｈ，Ｒ−Ｚ＝Ｈである式２に示した構造
を有する。これらの反応物は好ましくはマンニッヒ反応
によってアミノメチル連鎖を形成するのに通常使用され
る条件下でカップリングされる；か＼る条件は当業者に
よく知られている。

本発明のトレーサーは、フルオレセイ／又はフルオレセ
インの誘導体を、Ｒ１＝−Ｚ−Ｙ及びＲ２＝Ｈ（但し２
は１０個以下のヘテロ原子を含有し、月つ直鎖又は枝分
れ鎖として配列された０乃至２０個の炭素及びペテロ原
子の合計ｔ［するアルキル、アルキレン鎖又は枝分れ鎖
であり、そしてＹはＣＯ，Ｈ，ＣＨＯ１ＳＯ３Ｈ，ＣＮ
、　ＣＯＣｌ、　ＯＨ又はＮＨ２である）の、又はＲ１
＝Ｈで且つＲ２＝　ＮＨ２又は−Ｚ　−Ｙ　（但しＺｉ
ｌＯ個以下のヘテロ原子金含有し且つ直鎖又は枝分れ鎖
として配列したＯ乃至２０個の炭素及びペテロ原子の合
計を有するアルキル、アルキレン鎖又は枝分れ鎖であり
、そしてＹはＣ０２Ｈ，ＣＨＯ，５Ｏ３Ｈ，ＣＮ。

ＣＯＣｌＸＯＨ又はＮＨ２である）の式２に示した一般
構造にカップリングさせてつくられる。

フルオレセイン部分はアミン、カルボキシル、アルデヒ
ド、酸クロライド、イミデート又はアルコキシ官能性基
に、式４に示すように、アミド、アミン、尿素、チオ尿
素、カルバメート、チオカルバメート、トリアリールア
ミノ又はスルホニルカルバメート結合に連結できる。好
ましい態様では、フルオレセイン誘導体はアミノメチル
フルオレセインである。Ｒ’＝Ｈであり、３−位置のカ
ルボキシル官能性をメチルエステルとして保護しである
式２に示した前駆体、適切なカルボキシアルキル又はカ
ルボキシアミノアルキルインドールをアミノメチルフル
オレセインとカップリングし、先ず４−位置のカルボキ
シル基と活性エステルを形成する。好ましい活性エステ
ルはＮ−ヒドロキシサクシンイミド活性エステルであや
、そして好ましい方法は無水ＤＭＦ中でのＮ　−Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド活性化経由である。他
の活性化基５例えば酸クロライド、１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノール、又は２−エチ
ル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３′−スルホネ
ートが使用できる；そして他の溶媒例えばテトラヒドロ
フラン、ジメチルスルホキシド又はヘキサメチレンホス
ホラミドが使用できる。反応物は好ましくはアミド結合
を形成する条件下でもカップリングされ、活性エステル
方法を用いるの１１好ましくない。有用なトレーサーは
さまざまの５−ＨＩ　ＡＡ誘導体から形成できる。

検定法 本発明の独特のトレーサー、抗体及び追加試薬は尿中の
遊離５−ＨＩＡＡ及び遊離インドール酢酸（ＩＡＡ）の
両方の濃度を、相熔出を用いる試料調製法を用いずに、
測定できることが見出された。本発明の分析法、即ち本
発明のトレーサー化合物及び免疫原を使用する螢光免疫
検定法による５−ＨｒＡＡ定量法によれば、５−ＨＩＡ
Ａを含有するか又は含有すると考えられる抽出試料を、
トレーサーの生理学上許容し得る塩、５−ＨＩＡＡとト
レーサーの両方に特異性を有する抗体及びバックグラウ
ンド消滅剤と混ぜる。

本発明の好ましい態様では、試薬は、有機抽出剤溶媒、
水性抽出剤から成る前処理抽出試薬と、フルオレセイン
−標識化した５−ＨＩＡＡ（トレーサニ）、５−ＨＩＡ
Ａ及びＩＡＡに特異性を有する抗体及び前処理試薬から
成る試薬テストパックとから成る。尿の５−ＨＩＡＡは
先ず尿中から有機溶媒中に抽出され、次に水相中に続い
て抽出し返される。抽出剤として良好に働らく有機溶媒
の例にはジクロロエタンと第３級アミルアルコールがあ
る。水性抽出溶液は低いイオン強度、低いｐＨ％及び電
子伝導性である必要がある。

この水相を次に上述の免疫原を用いて生じさせた抗体と
混ぜる。限られた抗体サイトに対して、遊離の５−ＨＩ
ＡＡがフルオレセイントレーサーと競合し、複合体を形
成する。

トレーサー及び抗体の濃度を一定に保つことにより、形
成された５−ＨＩＡＡ−抗体複合体対トレーサー−抗体
複合体の比が試料中の５−ＨＩＡＡの総量に直接比例す
ると仮定できる。

結果は正味のミリ偏光単位、（ミリ偏光単位での）スパ
ンと相対強度を用いて定量化できる。ミリ偏光単位の測
定は、５−ＨＩＡＡが無く貴人量のトレーサーが抗体に
結合した時に最大を示した。正味のミリ偏光単位がより
高けれハ高イ程、トレーサーの抗体への結合がより良い
。スパンは最大及び最小量のトレーサーが抗体に結合し
た点での正味ミリ偏光単位の間の差の指標である。よシ
大きなスパンはより良い数値解析を与える。強度はバッ
クグラウンド以上の信号の強度の尺度である。従ってよ
り高い強度はより正確な測定を与えることになる。強度
は（ＴＤｘ（川装置ゲインを４０にセットし）本発明の
好ましいトレーサーについて、垂直偏光回度の合計とし
て、約１８００強度単位で測定される。トレーサー信号
の強度は、トレーサーの濃度及び他の検定変数によるが
、バックグラウンドノイズの約１乃至４０倍の範囲とす
ることができる。

本発明の改良された検定法の好ましい方法を、これより
詳述する。この伏定法は“均質検定法（ｈｏｍｏｇｅｎ
ｏｕｓａｓｓａｙ　）　”であり、これは終りの偏光の
読取りを、結合したトレーサーを未結合のトレーサーか
ら分離していない溶液で行なうことを意味する。これは
、読取りを行なう前に結合したトレーサーを未結合のト
レーサーから分離する必要のある不均一免疫検定法（ｈ
ｅｆｅｒｏｇｅｎｏｕｓｉｒｒｖｎｕｎｏａｓｓａｙ　
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　）よりもはるかにまさる利点で
ある。

本発明の方法を実施するｐＨはトレーサーのフルオレセ
イン部分をその間環型で存在させるのに光分なものでな
ければならぬ。ｐＨは約５乃至１０の範囲を、より好ま
しくは約６乃至９の範囲を、そして最も望ましくは約７
０乃至７．５の範囲であろう。ｐＨの比較的小さな変化
が螢光の強度と特異的特性に根本的に影響する。

検定方法中に、本発明の均′ω免疫倹定法のｐＦ（に到
達し且つ維持するのにさまざまの緩衝剤が使用できる。

興型的な緩衝剤には硼酸塩、クエン酸塩、用酸塩、炭酸
塩、トリス、バルビタール等がある。本発明にとっては
使用する特定の緩衝剤は臨界的では無いが、しかしトリ
ス及び燐酸塩緩衝剤が好ましい。緩衝剤のカチオン部分
は一般に溶液中用の試薬は５−ＨＩＡＡ及びトレーサー
に特異的な抗体から成る。さらに、５−ＨＩＡＡ前処理
溶液、稀釈緩衝液、５−ＨＩＡＡキヤリプレータ−及び
Ｈ−ＨＩＡＡ対照を含む諸だ液を淑ましくは準備する。

これらの試薬の代表的溶液、そのいくつかをここに記載
するが、はＡｂｂｏ　ｔ　ｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
、　Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、　Ｉ　１ｌｉｎｏｉｓか
ら検定“キット１として購入できる。

木用測置に示すパーセンテージはすべて、特記しない限
りｌ／容量である。好ましいトレーサーの処方では、好
ましいトレーサーを９８．５％ジメチルホルムアミド（
Ｖ／Ｖ）、１．１％１２Ｎ　ＨＣｔ（ｖ／ｖ）、０１％
チオ尿素及び０．３８％ＫＣＬＦｊＱ　（１００ｍｌの
Ｈ２Ｏ中に６３ｒＫＣ４）を加えて（装置ゲイン４０で
）約１８００の強度単位を得る。さまざまの有機溶媒を
、それに相容性であるだけでなく、（ａ）低いｐＨと像
ｐＨ安定性を与え：（ｂ）低い水含量を与え；且つ（ｃ
）電子伝導性であるかにして偏光分析計中で利用できる
便にするさまざまの酸化防止剤及び塩と共に使用できる
。前述の性状を有する好ましい頃は塩化カリウム又はリ
チウムである。好ましい酸化防止剤はアスコルビン酸及
びＮ−アセチルシスティンである。抗血清処方は装置で
用いる普１通のＴＤＸ（町緩衝液に３０％グリセリン（
ｖ／ｖ　）及び００３％す°トリウムアジドを加だもの
で稀釈したウサギの血清から成る。

バックグラウンド消滅処方ば０．　Ｉ　Ｍ　トＩＪス緩
イ蒐１糎中の５０％沃化ナトリウムから成る。ざまざま
の金属塩及び／又はタンパク負がバックグラウンド螢光
減少に使用でき；例には沃化カリウム又はナトリウム、
リボフラビン結合タンパク質等がある。キヤリプレータ
−ｖ′ｉきまざ才の塩、栄素、フレアスティン、ナトリ
ウムアジド、塩酸から成シ、当業者が調製可能な、酸性
（ｐＨ２，２０）人工尿マｌ−ＩＪソックス中５−ＨＩ
ＡＡから成り、本発明では０．５％Ｌ−アスコルビン酸
と０．５％Ｎ−アセチル−ｔ−システィンから成る酸化
防止剤を新規に使用している。キヤリプレータ−濃度は
０．０．２．５．５．０．８．０．１２．０及び２０ｍ
ｃｒ／−である。対照は３．５．６．５及び１Ｏｒｎｃ
？／ｍｌの濃度での上述と同一の人工尿マトリックス中
の５−ＨＩＡＡから成る。

これらはすべて窒素又は他の非酸素ガス例えばアルゴン
又は二酸化炭素でパージ及び密封されている。

試料バックグラウンド強度、干渉及び交叉反応性代謝物
の減少に必要な試料前処理相抽出剤が高性質液体クロマ
トグラフィー電気化学的検出（ＨＰＬＣ−ＥＣＯ）で使
用されて、（ＩＡＡ用ではなく、ＩＡＡは酸化されない
）共溶能ピークを減少しそして電極とカラムの汚染を減
少させていた。本発明は代謝物例えばＩＡＡの減少と、
バックグラウンド螢光と妨害の減少の新たな用途に相抽
出を使用する。

反応物は有機抽出剤溶液と酸性抽出剤溶液ｐ）ら成る。

有機抽出剤は６６％（シ〜）ジクロロエタンと３３係（
≠）第３級アニルアルコールから成る。更に当業者に知
られているさまざまの有機溶媒、例えばヘキサン、ヘプ
タン、ジクロロメタン、クロロホルム又は酢酸エチル、
又はその混合物、単独又はさまざまのアルコール例えば
第３級アミルアルコールとの組合わせから成ることがで
きる。酸抽出剤は如何なる水性溶液でもよいが、好まし
くは低イオン強度水浴液で電子伝導性であり低ｐＨを有
するものであろう。好ましくは酸抽出剤は水中の０．０
１Ｍ燐酸から成る。試料相抽出の使用はＩＡＡｔ対５−
ＨＩＡＡ量の比を減少し、測定されるＩＡＡを８０％乃
至９０％減少させる。排除されるＩＡＡの量は、因子例
えばａ）試料ｐＨｓ低ｐＨ例えば３．５−１．０は５−
ＨＩＡＡのより高い回収比に適し、高いｐＨ例えば６−
１０はＩＡＡの高い回収比に適する；ｂ）有機溶媒、よ
シ極性の溶媒が５−ＨＩＡＡの回収に適し、極性の小さ
い溶媒はＩＡＡの回収に適するｔ　　ｃ）試料、有機溶
媒及び水性抽出剤溶液の容ｔ：及びｄ）試料、有機溶媒
及び水性抽出剤溶液のイオン強度、による。更に試料相
抽出の使用は、バックグラウンド螢光を増加させ不正確
な読みを生じる可能性のある妨害化合物を減少させる。

好ましい方法はＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｉｒｖｉｎｇ。

Ｔ’ｅｘａｓから購入できるＡｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ（Ｒ
）偏光分析計と組合わせて使用するように特に設定され
ている。２００マイクロリツトル（μｔ）の尿が必要で
ある。未知試料は先ず３．５乃至１．５のｐＨ範囲に酸
性化する必要がある。好ましい方法は尿のｐＨが３．５
乃至１．５の範囲になる迄６Ｎ塩酸を加えることである
。キヤリプレータ−及び対照は既に酸性化されている。

キヤリプレータ−；対照及び未知の試料を正確にピュペ
ット（２００μｔ）してミクロ遠心管に入れ、次に有機
抽出剤溶液の正確な容量（２００１ｔｔ）を加える。こ
れを好ましくはＶｏｒｔｅｘミキサー上ではげしく混合
し、次に２相が完全に分離する迄遠心分離する。

正確な容１（１００μｔ）の底部有機エキストラクトを
取出して第２のミクロ遠心管にピペットで入れ、その中
には正確な容積（２００μｔ）の酸抽出剤がすでにピペ
ット投入されている。例示した容積は好ましい容積であ
る力木溶液を何倍かした容積を使用しても良い。この第
２のミクロ遠心管を激しぐ混合し、２相が完全に分離す
る迄、遠心分離する。マイクロ遠心管の少なくとも１０
０μｔの上側水層をＴＤｘ（Ｒ）試料カートリッジの試
料ウェルに移す。

ＴＤｘ（Ｒ）分析計と共にＴＤｘ（Ｒ）５−ＨＩＡＡ（
尿）検定キットを用いる場合には、試料カートリッジを
直接試料カルーセル（ｃａｒｏｕｓｅｌ　）中に入れ、
各キット中の３試薬容器からふたをそれぞれ外して試薬
パックをＴＤＸ（Ｒ）分析計のそれぞれのウェル中に入
れる。装置の“運転゛ボタンを押すと、この点から分析
法は完全に自動化される。

手動検定法を実施する時は、試料を前処理溶液、抗体及
び稀釈緩衝液と混合してバックグラウンドを読取る。ト
レーサーを次に検定液と混合し、培養後、螢光偏光を読
取る。

各キヤリプレータ−１対照又は試料の螢光偏光値が測定
されて、装置例えばＡｂｂｏ　ｔ　ｔ　ＴＤｘ”偏光分
析計の出力テープに印刷される。標準曲線は非線型回帰
分析を用いる各キヤリプレータ−の偏光度対その濃度を
プロットすることにより装置内で形成される。各対照又
は試料の濃度は記憶された校正曲線で読取られて出力テ
ープ上に印刷される。

前述の好ましい方法について、トレーサー、抗体、前処
理溶液、キヤリプレータ−１及び対照は約２乃至８℃に
貯蔵する必要があり、一方、稀釈緩衝液は室温に保存さ
れることに留意されたい。標準曲線及び対照は２週間毎
か、各キヤリプレータ−及び対照を２回測定した時に対
照が該当範囲から外れた時は実施し直す必要がある。対
照は毎日テストする必要があり、すべての試料は所望な
らば２回テストする。

前述の詳細な記載及び以下の実施は例示を目的とするも
のであって、本発明の範囲を限定しようとするものでは
無いことを理解されたい。当業者にとってはさまざまの
改変がありうることが知られており、従って本発明の範
囲は特許請求の範囲とその法律上の均等物でだけ限定さ
れるものとする。

〈実施例〉 実施例１乃至３２は、本発明の構想に従い実施した実験
を記述している。

実施例１ １２のＴＧＢを２７ｍ１の水にとかした。この溶液に３
４．７■の５−ヒドロキシインドール−３−酢酸の水（
４，５ｍ／）溶液、３Ｎ酢酸ナトリウムの２．４　ｍｌ
及び７．５％ホルムアルデヒドの７．３　ｍｌを加えた
。反応混合物を室温で２０　ｈｒ攪拌した。得られた溶
液を水で徹底的に透析して凍結乾燥し、式１０に示す所
望の抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）を得た。

実施例２ キーホールリンバットのヘモシアニンＩ　ＫＬＨ）への
５１２のＫＬＨを２’１ｍｌの水に溶かした。この溶液
に３４．７■の５−とドロキシインドール−３−酢酸の
水（４，５ｍ１）溶液、３Ｎ酢酸ナトリウムの２．４コ
及び７５チホルムアルデヒドの７．３コを加えた。反応
混合物を室温で２０ｈｒ攪拌した。生成溶液を水で徹底
的に透析して冷結乾燥し、式１１に示す所望の抱合体を
得た。

実施例３ ５００〜の５−ヒドロキシインドール−３−酢酸を塩化
水素で飽和した５ｍｌの無水メタノールに溶かした。室
温でｌｈｒ攪拌して後、反応混合物を水で稀釈し、５％
重炭酸ナトリウムで中和して酢酸エチルで抽出した。有
機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発した。粗生成物
を酢酸エチル：へキサン（５０：１５０）を溶離剤とす
るシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製し、
式１２に示す所望エステルの２３５■（８８チ）を得た
。

実施例４ ５−ヒドロキシ−４−（２−アミノエチル）−３−イン
ドール酢酸メチルエステル １ｍｌのエタノールに浴かした１　０　（Ｉ）ｊ’　（
０，４８ｒｒｍｏｌ　）の５−ヒドロキシ−３−インド
ール酢酸に３７％ホルムアルデヒドのＱ、　５　ｍｌ　
’ｋ、次に４０％ジメチルアミンの０．５−を加えた。

２ｍ１ｎ、後、反応混合物ｋ　５　ｍｌの酢酸エチルで
稀釈し、分液ロートに移した。有機相を水洗し、硫酸マ
グネシウムで乾燥した。粗生成物はアセトンを溶離剤に
用いるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製
した。収量は式１３に示す無色結晶（ｍｐ、１１０℃）
の８５■であった。

実施例５ ５−ヒドロキシ−３−カルボメトキシメチル−４−イン
ドールメチル−トリメチル−アンモニウムアイオダイド
３０−の無水酢酸エチル中の３５６”Ｗ（１，３５ｍｍ
ｏｌ　）の５−ヒドロキシ−４−（ジメチルアミノメチ
ル）−３−インドール酢酸メチルエステルに３−の沃化
メチルを加えた。２４ｈｒ後、沈殿した固体を戸別して
５４７〜の式１４に示す所望の塩を得た。

実施例６ ５−の無水ニトロメタン中の５４７ｍｇ＋　（１，３５
ｍｍｏｌ　）の（５−ヒドロキシ−３−カルボメトキシ
メチル−４−インドールメチル）−トリメチルアンモニ
ウムアイオダイドに微粉砕した５４■の水酸化ナトリウ
ムを加えた。反応混合物を窒素雰囲気下で４ｈｒ還流し
、次に硼酸のＩ和溶液が４０ｍ入っている分液ロートに
移した。反応混合物をクロロホルム（合計１００ｄ）で
抽出して、硫酸マグネシウムで乾燥した。粗生成物を酢
酸エチル：ヘキサン（１：１）全溶離剤として用いるシ
リカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製し、１１
４■（３３％）の式１５に示す所望生成物を得た。

実施例７ ０．５５酢酸エチル中の５０■の５−ヒドロキシ−４−
（２−ニトロエチル）−３−インドール酢酸メチルエス
テルの溶液を、１α３の酢酸エチル：エタノール（１：
１）中の予備水素化した酸化白金に加えた。反応混合物
を水素気球下で攪拌し、ＴＬＣでモニターした。３．５
ｈｒ後、反応混合物を触媒から戸別し、溶媒を除去して
、残渣を、クロロホルム−メタノール−酢酸（９０：１
０：５）を溶離剤として用いるシリカゲル上のＰＴＬＣ
で精製し、１０■の式１６に示す無色の固体を得た。質
量スペクトルｆ７０ｅＶ）相対強度２４８　（Ｍ”＝２
４８　）、２３１（５０）、２１９（１００）。

実施例８ ５−ヒドロキシ−４−（Ｎ−カルボベンゾキシクリシル
アミノ）−３−インドール酢酸メチルエステル５４”Ｆ
（０，２１ｍｍｏｌ　）の５−ヒドロキシ−４−（２−
アミンエチル）−３−インドール酢酸メチルエステルと
６０■（０，１８ｍｍｏｌ　）のＮ−カルボベンゾキシ
グリシン−ｐ−ニトロフェニルエステルｆ、３ｍｌのＤ
　Ｍ　Ｆ　ＫｆｆｉカＬ＊。

反応混合物を室温で１５ｈｒ攪拌し、ロータリーエバポ
レーターで真壁蒸発させた。残渣を酢酸エチルに熔かし
、アセトン：ヘキサン（２：１）を溶離剤（Ｒｆ＝０５
２）に用いるシリカゲル上のカラムクロマトグラフィー
で精製し、６０〜の式１７に示す純粋所望物質を得た。

実施例９ ５−ヒドロキシ−４−（グリシルアミノエチル）−３−
上記実施例８で製造した化合物の６０■を、４ｄのエタ
ノール中で５■の１０％Ｐｄ／ｃで４Ｑｐｓｉ下で水素
化した。

２．５ｈｒ後、すべての原料物質が消費された（ＴＬＣ
確認）。

反応混合物をセライト濾過し、エタノール洗浄して真空
濃縮した。所望生成物、式１８に示す、の収量は３０．
１■（７４チンであった。

実施例１０ ５−カルボキンメチルオキシインドール−３＝酢酸メチ
ルエステル ２０５η（１ｍｍｏｌ）の５−ヒドロキシインドール−
３−酢酸メチルエステルを５ｍｌのア七トンに溶かし、
それぞれ５５２岬の微粉砕した夏炭酸カリウムの２部金
加え、次に３３２−のｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテー
トを加えた。

反応混合物を４ｈｒ還流し、無機物を戸別し、有機Ｐ液
を蒸発さぜた。油状残渣を酢酸エチル−ヘキサンを用い
てシリカゲル上でのクロマトグラフィーでＭ’Ｓし、所
望のｔｅｒ　ｔ−ブチル−メチルエステルを得た。収率
は９１％であった。この生成物ヲトリフルオロ酢酸と塩
化メチレンの１：２混合物の３ｍｌにとかした。室温で
ｌｈｒ後、反応混合物を蒸発乾固して、所望の生成物、
５−カルボキシメチルオキシインドール−３−酢酸メチ
ルエステル（８９チ収率）、゛式１９に示す、を得た。

実施例１１ ５−ヒドロキシ−４−（Ｎ−カルボキシメチル、Ｎ−メ
チル）アミノメチル−インドール−３−酢酸メチルエス
テル １００ｍ／フラスコに２５４．３１ｎｑ（１当ｔ）のパ
ラホルムアルデヒド、７７０１ＮｉのＮ−メチルアミノ
酢酸と２０　ｍｌのジオキサンを入れた。反応混合物を
油浴（５０℃）中で３０ｍ１ｎ、ｌ’ｌ押して、室温に
冷却した。１７３８９の５−ヒドロキシインドール−３
−酢酸メチルエステルと２０ｍ１のジオキサン中の８６
０■のトリエチルアミンを加えた。

反応混合物を５日攪拌し、溶媒除去後、シリカゲル上の
クロマトグラフィーで精製して、４９２■の所望物質、
式２０に示す、を得た。

実施例１２ アミノメチルフルオレセインへの５−ヒドロキシ−４−
（Ｎ−カルポロキシメチル、Ｎ−メチル）アミノメチル
インドール−３−酢酸メチルエステルのカップリング５
−ヒドロキシ−４−（Ｎ−カルボキシメチル、Ｎ−メチ
ル）アミノメチルインドール−３−酢酸メチルエステル
を１３ｍ１のジメチルホルムアミドに沼かし、１９７■
のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを次に２８６■のＬ３
−ジシクロヘキシルカルボジイミドを加えた。反応混合
物を８ｈ　ｒ　４？拌し、次に９ｍｌのＤＭＦ中の３８
５Ｑのアミノメチルフルオレセインと１３’８４１！ｉ
ｔのトリエチルアミンの浴液中に濾過して入れた。反応
混合物全室温で１４　ｈ　ｒ攪拌した。

粗生成物をシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで
精製した。所望生成物（エステルの加水分解）の収率は
６２チであった。この生成物ｆ　４　ｍｌのメタノール
に熔かしてＩＮ水酸化すｌ−’Ｊウムの４ｍｌを加え、
反応混合物を室温で１ｈｒ攪拌した。反応混合物をＩＮ
塩酸で中和してロータリーエバポレータで真壁蒸発させ
た。式６に示す。黄色固体をＰＴＬＣ（Ｈ２Ｏ−ＭｅＯ
Ｈ−ＨＯＡｃ　Ｉ　６０　：　６０　：　０．５　）Ｊ
ｏ、５を用いるＲＰＣ＋ｓ　）で精製した。

実施例１３ アミノメチルフルオレセインとの５−カルボキシメチル
オキシインドール−３−酢酸メチルエステルのカップリ
ン１３■の５−カルボキシメチルオキシインドール−３
−酢酸メチルニスデルを０．２　ｍｌの無水ジメチルホ
ルムアミドに省かし、この溶液に０．２　ｍｌのＤ　Ｍ
　Ｆに溶かした１０１Ｎｉのジシクロへキシルカルボジ
イミドを、次Ｋ　Ｏ，２ｒｄのＤＭＦ中の６■Ｎ−ヒド
ロキシサクシ／イミドの溶液を加えた。混合物を０．５
ｈｒａ拌し、２２■のアミノメチルフルオレセインを加
えた。１２ｈｒ後、反応混合物を真空蒸発させて、溶離
剤として酢酸エチル：酢酸（１００：０．２）を用いる
シリカゲル上のクロマトグラフィーで生成物ｔＪＦｔ製
した。

生成物を１０％水酸化ナトリクムで０．５ｈｒ加水分解
し、クロマトグラフィーで精製して、式７に示す所望の
トレーサーを、得た。

実施例１４ ドロキシ−４−（２−アミノエチル）−３−インドール
−１ｍ１のＤＭＦ’中の３５ｍ９の５−ヒドロキシ−４
−（２−アミノエチル）−３−インドール酢酸メチルエ
ステルに６８■の（Ｎ−ヒドロキシサクシ／イミドとの
）５−カルボキシフルオレセイン活性エステルを加えた
。反応混合物を１２ｈｒ攪拌して蒸発乾固した。粗生成
′＄！Ｊを１０チ水酸化ナトリウムの３ｍｌに溶かし、
０５ｈｒ後に室温で酢酸で酸性化し′ｆｒ、７式８に示
す所望生成物ばＴＬＣによる精製後、得られた。

実施例１５ ステルのカップリング 式９に示すこの化合物は本質上実施例１４と同じく、カ
ルボキシフルオレセインへの５−ヒドロキシ−４−（グ
リシルアミノエチル）−３−インドール酢酸メチルエス
テルからつくられた。

実施例１６ ２　？　（７，８７ｒｒｍｏｌ　）の５−ブロモインド
ール３酢ａｔ塩化水素で飽和した１６−の無水メタノー
ルに溶かした。

ｌｈｒ室温で攪拌後、反応混合物を水で稀釈し、飽和重
炭酸す）　ＩＪウムで中和してクロロホルムで抽出した
。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて１．
７２（８１％）の所望物質、式２１に示す、を白色固体
として得た。

実施例１フ ルのアルキル化 ４．７−の無水ジメチルホルムアミド中の４００■（１
，４９ｒｒｍｏｌ　）の５−ブロモインドール３−酢酸
の溶液を３０ｍ１ｎ、　８９．５１１９の水素化ナトリ
ウム（６０％オイルサスペンション）と反応させた。５
４５．５■のブロモアセトアルデヒドジエチルアセター
ルを加え、反応混合物を窒素下で６ｈｒ還流した。ジメ
チルホルムアミドを真空除去し、残渣を酢酸エチルで抽
出した。酢酸エチルを蒸発させて、残渣を、４０％酢酸
エチル−ヘキサンを用いるシリカゲル上のカラムクロマ
トグラフィーで精製し、式２２に示す所望生成物の３７
％を得た。

実施例１８ １９３’Ｎｉの５−ブロモ−Ｎ−ホルミルメチル−３−
カルボメチルインドールのジエチルアセタールを１０％
水酸ナトリウム水溶液：テトラヒド口７ラン：メタノー
ル（１：１：１）の５４混合物に溶かした。反応混合物
を室温で１ｈｒ攪拌し、次に水で稀釈した、稀塩酸でｐ
Ｈ４に酸性化して酢酸エチルで抽出した。有機相を硫酸
マグネシウムで乾燥し、真空蒸発させて、所望生成物、
式２３に示す、を得た。

実施例１９ インドール ８０ηの５−プロモーＮ−ホルミルメチル３−カルボキ
シメチルインドールのジエチルアセタールをアセトン：
水混合物（５：１）の１６ｍ１にとかし２２のカチオン
交換樹脂ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８を加えた。反応混合物を窒素
下で１０ｈｒ還流し、次に濾過した。溶媒を真空除去し
て所望生成物、式２４に示す、を得た。

実施例２０ ング １２０■の（ＢＳＡ）を４−の水にとかした。この溶液
に３．５　ａｔのジオキサン中の２１■の５−プロモー
Ｎ−ホルミルメチル３−カルボキシメチルインドールの
溶液を加えた。塩酸でｐＨを６に調節し、反応混合物を
２ｈｒ攪拌し、次に３０■のナトリウムシアノボロハイ
ドライドを加えた。

更に１６ｈｒ攪拌後、ｐＨを重炭酸ナトリウムの胞和溶
液で８．５に調節し、水で徹底的に透析して凍結乾燥し
て所望抱合体、式２５に示す、を得た。

実施例２１ ジメチルインドール ４ｄの無水ジメチルホルムアミド中の３００■（１，１
２ｍｍｏｌ　）の５−ブロモインドール３−酢酸メチル
エステルの浴液を３０ｍ１ｎ、６７■（１，５当量）の
水素化ナトリウム（６０％オイルサスペンション）と反
応させた。４１２■（１，８当量）の１−クロロ−３−
ヨードプロパンを加え、反応混合物を室温で１２ｈｒ攪
拌した。ジメチルホルムアミドを真空除去し、残渣を酢
酸エチルで抽出した。酢酸エチルを蒸発させて、残渣ヲ
シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製し、所
望生成物、式２６に示す、を得た。

実施例２２ ５−プロモーＮ−γ−ヨードプロピル−３−カルボメト
キシメチルインドール ６ｍｌのブタノンに溶かした１１２．７■の５−プロモ
ーＮ−γ−クロロプロピル−３−カルボメトキシメチル
インドールに１４７■の沃化ナトリウムを加えた。反応
混合物を１６ｈｒ還流し、溶媒を真空下で除去した。残
渣を酢酸エチルで抽出して、水とプラインで洗浄し、有
機相を硫酸マグネシウムで乾燥して、蒸発させた。粗生
成物を３５％酢酸エチル：ヘキサンを溶離剤に用いた１
朋シリカゲルプレート上での調整用薄層クロマトグラフ
ィーで精製して、１５６■の、式２７に示す、所望生成
物を得た。

実施例２３ １０ｍ１の無水酢酸エチルに溶かした１３７”９の５−
ブロモ−Ｎ−γ−ヨードプロピルー３−カルボメトキシ
メチルインドールに１４７．５■の硝酸銀を加えた。反
応混合物を１７ｈｒ還流した。反応混合物を次に不溶性
無機物から戸別して、Ｆ液を蒸発させた。粗生成物は３
５：６５酢酸工チル：ヘキサンヲ溶離剤に用いるシリカ
ゲル上のカラムクロマトグラフィーで精製した。式２８
に示す、所望生成物の収量は８７■（７７％）であった
。質量スペクトル＝（Ｍ＋３５４　）。

実施例２４ ５ｍ１の酢酸エチル：無水エタノール（７：３）に溶か
した８７■の５−ブロモーＮ−７−ニトロブロピルー３
−カルボメトキシメチルインドールに５■の酸化白金を
加え、混合物を２４ｈｒ常圧で水素で水素化した。反応
混合物を無機物から分離し、真空蒸発で謂媒を除去して
７０■の所望生成物、式２９に示す、を得た。質量スペ
クトル：（Ｍ”３２４）。

実施例２５ ６−カルポキシフルオレセインーＮ−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステルへの５−プロモーＮ−γ−アミノプロ
ピル−３−カルボメトキシメチルインドールのカップリ
ング０、２　ｍｌのジメチルホルムアミド中の２０■の
５−ブロモ−Ｎ−γ−アミノプロピルー３−カルボメト
キシメチルインドールに、１５１Ｍ１の６−カルポキシ
フルオレセインーＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステ
ルを加えた。反応混合物を室温で１５ｈｒ攪拌し、蒸発
乾固した。粗生成物を、水：メタノール：酢酸［４０：
６０：０．５）を用いるＷｈａｔｍａｎ　ＰＬＫＣ１Ｂ
プレート上の調整用薄層クロマトグラフィーで精製した
。収量は１４．４１Ｎｉ（８１％）であった。

質素スペクトル：Ｍ＋＝Ｉ　６２３．Ｍ＋Ｈ）。

この生成物を１−のメタノールに溶かし、４００μｔの
１０％水酸化ナトリウムを加えて、インドールの３−カ
ルボメトキシメチル基をカルボン酸に選択的に加水分解
した。

３０ｍ１ｎ、後、反応混合物を氷酢酸でｐＨ６に酸性化
して、蒸発乾固した。粗生成物はクロマトグラフィーで
粗製した。

式３０参照。

実施例２に の実施例は現在性なわれている原始的方法、比色法に対
する本発明の方法の正確さを示す。

切片＝１．４３ 傾き＝０．９１ 相関係数＝０．９９９ 範囲＝０．４８乃至６７２μ５’　／ｍｌ実施例２７ この実施例は電気化学検知付の高圧液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ−ＥＣＤ）に対する本発明の方法の正確
さを示す。

ＴＤｘ対ＨＰＬＣ−ＥＣＤ　（Ｎ＝１２９　）切片＝０
．２８ 傾き＝１．０２ 相関係数＝０．９７６ 範囲＝０．３９乃至１３３．６μ？　／ｍｌ実施例２８ この実施例では５種の尿試料に５−ＨＩＡＡを加え、各
場合での回収した添加物のチを測定し、さらに本発明の
検定法の正確さを評価する。

酸性化した尿試料のそれぞれの一部に５−ＨＩＡＡの濃
保存溶液を０．５．８及び１２ｐ？／ｍｔ５　　ＨＩＡ
Ａのレベルに加えた。発明の詳細な説明に記載した様に
試料相抽出前処理を実施した。

ＴＤｘ分析計を試料と同一の方法で前処理した０、２．
５．５．８．１２及び２０μ？　／　ｍｌの人工尿マト
リックスキャプレータで校正した。標準曲線が装置中に
記憶されて試料はこの曲線で読取られた。

回収した添加５−ＨＩＡＡ％は次のようにして決定した
：内発的５−ＨＩＡＡ（０−２９７ｍｌ添加）を尿に加
えた濃度から引き、添加５−ＨｒＡＡの目標値で割った
。

調整濃度＝測定濃度−内発的濃度 結果を次表に示す： ５．０　　　　　　　　９７．４ ８．０　　　　　　　　９７．８ １２．０　　　　　　　　９７．４ 実施例２９ この実施例はキヤリプレータと対照マトリックスの安定
化機能を示す。

ｄａｙ　Ｏに２重試料中でキヤリプレータを実験した。

作業日毎に実験後、小瓶を遮光して１時間、室温で開口
し、次に蓋封して２−８℃に保存した。試料は週毎に５
週間テストした。

実施例３０ この実施例はトレーサーマトリックスの安定化機能を示
示す。ｄａｙｏにＯμ？／ｍｔ及び２０μ？／ｍｌのキ
ヤリプレータを、２−８℃に連続貯蔵、室温に連続貯喧
及び−２０℃で７２時間次に２−８℃で連続貯蔵した各
貯蔵や件について２重試料でテストした。これをｄａｙ
　７とｄａｙ　１４にくりかえした。

Ｄａｙ　Ｏ１０４，４２４７，９１４３，５Ｄａｙ　７
　　　１０６．９　　　　２４４．７　　　１３７．９
Ｄａｙ１４　　　１０２．４　　　　２４３．１　　　
１４０．４−２０℃凍結／放置貯蔵 ｍＰ値 Ｄａｙ　Ｏ１０４，４２４７，９１４３，５Ｄａｙ　７
　　　　１０６．０　　　　２４６．８　　１４０．８
Ｄａｙ１４　　　　１０５．８　　　　２４４．３　　
１３８．５室温連続貯蔵 ｍＰ値 Ｄａｙ　Ｏ１０４，４２４７，９１４３，５Ｄａｙ　７
　　　１０３．７　　　２４７．４　１３６．７Ｄａｙ
１４　　　１０８．４　　　２４６．５　１３＆１実施
例３１ この実施例は複数種の免疫原処方を用い複数羽のウサギ
中で所望の抗血清が生じたことを示す。３羽のウサギを
培養し３稲の免疫原ロットをうえた。各動物からの抗血
清を用いた代表的標準回線を示す。

ｍＰ値 ０μ？／ｍｅ　　　　　２０７．３　　２１９．４　　
　２４７．２２５μｔ／ｍｌ　　　　１６１．７　　１
６９．４　　　２１８．６５．０μｆ／ｍ／　　　　１
３９．２　　１４６．３　　　２００．８８．０μｙ／
ａｔ　　　　１２２．８　　１３２．５　　　１８４．
２１２．０μ？／ｍｌ　　　　１１０．５　　１２０．
５　　　１６８．１２０、Ｏμｒ／−９６，５１０８，
２１４９，９スノぐン　　１１１　　１１１　　　９８
実施例３２ この実施例は試料の前処理相抽出プロトコルを用いた時
、バックグラウンド螢光と測定したインドール酢酸の両
方が減ることを示す。試料相抽出を行なうか行なわずに
、校正曲線を二重につくった。１０ｍｃｊ’／Ｉｎｔの
インドール酢酸と高いバックグラウンド螢光を持つ５種
の尿を２重にテストした。テストはそれぞれの校正曲線
に対して抽出して、及び抽出せずに行なった。

バックグラウンド強度 尿＄１　　　　　５９８４　　　　　５５９Ｉ＃２　　
　　　２０４９２　　　　　１１３８＃＃３　　　　　
１０３３７　　　　　　７０７１＃４　　　　　２０４
４５　　　　　１２０４−＃５　　　　　２０３０９　
　　　　１１３６出　願　人　アボット　ラボラトリー
ズ！””。

同　　　弁理士　川　瀬　良　治〆″）・二〇 ・　−一′ 手続補正書 昭和６２年８月７日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １事件の表示 昭和６２年特許願第１６８９３０号 ２発明の名称 ５−ヒドロキシ−３−インドール酢酸の螢光偏光免疫検
定法３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　アボット　ラボラトリーズ ４代理人 ５補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、Ｒ＾１はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであるか、あるいはＲ
   ＾２と一緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ
   ４個以下のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾２はＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＣＨ＿３、ＯＲ
   ＺＱであるか、あるいはＲ＾１又はＲ＾３と一緒になり
   ４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以下のヘテロ
   原子を含有する環式基であり； Ｒ＾３はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであるか、あるいはＲ＾２と
   一緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以
   下のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾４はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又他の
   免疫学的に活性なキャリヤー、又はフルオレセイン又は
   フルオレセイン誘導体であり； ＺはＱがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体の場
   合にはＣＯ、ＮＨ、ＣＨ＿２ＮＨ又はＣＳであり、そし
   てＱがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は
   他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合にはＮ、ＮＨ、
   ＳＯ＿２、ＰＯ＿２、ＰＳＯ又はグルクロニド部分であ
   り；且つ Ｒは、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体
   又は他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合には７個以
   下のヘテロ原子を含有し、そしてＱがフルオレセイン又
   はフルオレセイン誘導体の場合には１０個以下のヘテロ
   原子を含有し、且つ直鎖又は枝分れ鎖に配列されている
   ０乃至２０個の炭素原子と、そしてヘテロ原子の合計を
   有し、２個以下の環構造を含有する結合基である； を有する化合物。 ２、Ｑが４′−アミノメチルフルオレセイン誘導体であ
   る特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３、Ｒ＾１がＨであり； Ｒ＾２がＨ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、又はＩであり；Ｒ
   ＾３がＨであり； Ｒ＾４がＲ−Ｚ−Ｑであり；且つ Ｒは、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体
   又は他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合に７個以下
   のヘテロ原子を含有し、Ｑがフルオレセイン又はフルオ
   レセイン誘導体の場合に６個以下のヘテロ原子を含有し
   、且つ０乃至１０個の合計炭素原子を有している；特許
   請求の範囲第１項記載の化合物。 ４、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、Ｒ＾１はＨ又はＲ−Ｘであるか、あるいはＲ＾２
   と一緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個
   以下のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾２はＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＣＨ＿３、ＯＲ
   ＺＱ、ＯＲＸであるか、あるいはＲ＾１又はＲ＾３と一
   緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以下
   のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾３はＨ又はＲ−Ｘであるか、あるいはＲ＾２と一緒
   になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以下の
   ヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾４はＨ又はＲ−Ｘであり； ＸはＮＨ＿２、ＣＯ＿２Ｈ、ＮＨ−ＣＯＣＨ＿２Ｉ、Ｏ
   Ｈ、ＳＯ＿３Ｈ、ＣＨＯ、ＣＮ又はＣＯＣＩであり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又他の
   免疫学的に活性なキャリヤー、又はフルオレセイン又は
   フルオレセイン誘導体であり； ＺはＱがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体の場
   合にはＣＯ、ＮＨ、ＣＨ＿２ＮＨ又はＣＳであり、そし
   てＱがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は
   他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合にはＮ、ＮＨ、
   ＳＯ＿２、ＰＯ＿２、ＰＳＯ又はグルクロニド部分であ
   り；且つ Ｒは、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体
   又は他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合には７個以
   下のヘテロ原子を含有し、そしてＱがフルオレセイン又
   はフルオレセイン誘導体の場合には１０個以下のヘテロ
   原子を含有し、且つ直鎖又は枝分れ鎖に配列されている
   ０乃至２０個の炭素原子とヘテロ原子の合計を有し、２
   個以下の環構造を含有する結合基である；の化合物を、
   ポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸誘導体）又は他の免
   疫学的に活性なキャリヤーとカップリングさせる工程を
   有することを特徴とする免疫原の製造方法。 ５、構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、Ｒ＾１はＨ又はＲ−Ｙであるか、あるいはＲ＾２
   と一緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個
   以下のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾２はＯＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＣＨ＿３、ＯＲ
   ＺＱ、ＯＲＹであるか、あるいはＲ＾１又はＲ＾３と一
   緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以下
   のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾３はＨ又はＲ−Ｙであるか、あるいはＲ＾２と一緒
   になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以下の
   ヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾４はＨ又はＲ−Ｙであり； ＹはＮＨ＿２、ＣＯ＿２Ｈ、ＮＨ−ＣＯＣＨ＿２Ｉ、Ｏ
   Ｈ、ＳＯ＿３Ｈ、ＣＨＯ、ＣＮ又はＣＯＣｌであり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又他の
   免疫学的に活性なキャリヤー、又はフルオレセイン又は
   フルオレセイン誘導体であり； ＺはＱがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体の場
   合にはＣＯ、ＮＨ、ＣＨ＿２ＮＨ又はＣＳであり、そし
   てＱがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は
   他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合にはＮ、ＮＨ、
   ＳＯ＿２、ＰＯ＿２、ＰＳＯ又はグルクロニド部分であ
   り；且つ Ｒは、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体
   又は他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合には７個以
   下のヘテロ原子を含有し、そしてＱがフルオレセイン又
   はフルオレセイン誘導体の場合には１０個以下のヘテロ
   原子を含有し、且つ直鎖又は枝分れ鎖に配列されている
   ０乃至２０個の炭素原子とそしてヘテロ原子の合計を有
   し、２個以下の環構造を含有する結合基である； の前駆体を、フルオレセイン又はフルオレセインの誘導
   体とカップリングさせる工程を有することを特徴とする
   トレーサーの製造方法。 ６、流体試料中の５−ヒドロキシ−３−インドール酢酸
   の測定方法に於て； （ａ）流体試料を５−ヒドロキシ−３−インドール酢酸
   抗血清、バックグラウンド消滅剤、及び５−ヒドロキシ
   −３−インドール酢酸抗血清の存在に対し検知可能な螢
   光偏光応答をする 構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し、Ｒ＾１はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであるか、あるいはＲ
   ＾２と一緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ
   ４個以下のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾２はＯＨ、Ｃｌ、ＦＮ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＣＨ＿３、Ｏ
   ＲＺＱであるか、あるいはＲ＾１又はＲ＾３と一緒にな
   り４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以下のヘテ
   ロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾３はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであるか、あるいはＲ＾２と
   一緒になり４乃至８個の合計炭素原子を有し且つ４個以
   下のヘテロ原子を含有する環式基であり； Ｒ＾４はＨ又はＲ−Ｚ−Ｑであり； Ｑはポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又他の
   免疫学的に活性なキャリヤー、又はフルオレセイン又は
   フルオレセイン誘導体であり： ＺはＱがフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体の場
   合にはＣＯ、ＮＨ、ＣＨ＿２ＮＨ又はＣＳであり、そし
   てＱがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体又は
   他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合にはＮ、ＮＨ、
   ＳＯ＿２、ＰＯ＿２、ＰＳＯ又はグルクロニド部分であ
   り；且つ Ｒは、Ｑがポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体
   又は他の免疫学的に活性なキャリヤーの場合には７個以
   下のヘテロ原子を含有し、そしてＱがフルオレセイン又
   はフルオレセイン誘導体の場合には１０個以下のヘテロ
   原子を含有し、且つ直鎖又は枝分れ鎖に配列された０乃
   至２０個の炭素原子とヘテロ原子の合計を有し、２個以
   下の環構造を含有する結合基である；を有する化合物と
   接触させ；（ｂ）工程（ａ）から得られた溶液に平面偏
   光光を通過させて螢光偏光応答を得、且つ （ｃ）工程（ｂ）の溶液の螢光偏光応答を、試料の５−
   ヒドロキシ−３−インドール酢酸含量の測定単位として
   検出することを特徴とする流体試料中の５−ヒドロキシ
   −３−インドール酢酸の測定方法。 ７、バックグラウンド消滅剤が沃化ナトリウムである特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、（ａ）１．５乃至２．５の範囲のｐＨを有する有機
   溶媒；（ｂ）該有機溶媒に安定で且つ可溶性の酸化防止
   剤；及び（ｃ）電子伝導性化合物；を含有することを特
   徴とするトレーサーに安定化マトリックスを与える組成
   物。 ９、有機溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、
   酸化防止剤がチオ尿素であり、そして電子伝導性化合物
   が塩酸中の塩化カリウムである特許請求の範囲第８項記
   載の組成物。 １０、（ａ）人工の尿組成物を酸素の無いガスでパージ
   し；（ｂ）パージした人工の尿組成物にＬ−アスコルビ
   ン酸とＮ−アセチル−Ｌ−システインの配合物を添加し
   ；且つ（ｃ）得られた安定化した組成物を酸素に対して
   シールすることを特徴とする、螢光偏光免疫検定法で対
   照及びキヤリプレータ用の人工の尿マトリックスの調製
   方法。