JPS6323882A - アヘンアルカロイドおよびそれらの代謝物のための免疫検定法、トレ−サ−、免疫原および抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、アヘン群のアルカロイドまたはその代謝物の
存在または量を液体、特（生物学的液体例えば尿、血清
または血漿中で測定するための螢光偏光免疫検定操作の
ための方法および試薬ならびに試薬の製法に関する。更
に詳しくは、本発明は、１）試料中のアヘンアルカロイ
ド（ｏｐｉａｔｇａｌｋａｌｏｉｄｓ）および（または
）その代謝物の存在または量を測定するための試薬（ト
レーサーおよび抗体）；２）抗体を育成するのに用いる
免疫原化合物；３）トレーナ−および免疫原化合物を製
造するのに使用する合成方法；および４）検足を実流す
るための分析方法に関する。

〔背景技術〕

ケシ科の植物、特にハハベル・ンムニフエルム（Ｐａｐ
ａｖｇｒＳｏｒｔ＞％ｉｆａｒｍ）はその二次代謝の結
果としてアヘンとして知られている多くの５員環アルカ
ロイドを著しい鎗で生産する。最も重要なのはモルヒネ
〔後記式（１）〕およびコディンし後記式＋２Ｊ）であ
る。これらの化合物は古米からその麻薬性、鎮痛性ある
いは麻酔性のために医療に使用されてきた。また、以前
から、これらの化合物の反覆使用は、影響をうけた個人
の正常な機能を障害するノベルに進む傾向を有するよ５
にこれらのものへの渇望または習慣性になることが知ら
れている。

これらのものの薬理学的性質を改変しようとして、桑化
学者等は、５員環アルカロイド骨格を残している天然ア
ヘンの半合成誘導体を多数製造し、そのうちのいくつか
は医療用に商業上生産されている。Ｎ要な例には、ジア
セチルモルヒネ〔ヘロイン、後記式（３）　）　、とド
ロモルヒネＣｆ記式（４１］、ヒドロコドン〔後記式（
５；〕、オキ７コド７〔後記式＋６１１．オキシモルホ
ン〔後記式＋７）　Ｅ　Ｍよびレボルファノール〔後記
式（８）〕が包含される。これらの誘導体は多少なりと
も親化合物の習慣性の傾向を保持している。

アヘンの温州によって生じる問題のために、この群のほ
とんどのものの生産、分布および使用は西欧社会全体に
わたって厳しく制約されている。これらの努力は、その
無認可の消費を検出する方法により一部支持されていて
、この方法はアヘンおよび（または）その代謝物に対し
て迅速、洒頼性のある、かつ選択性がある。このような
試験は尿の試料で最もひんばんに実施されている。それ
はこれらの試料が普通血液試料よりも入手しやすいから
である。その他の生物学的液体はこれらの分析のメディ
アとして広汎に検討されていない。

過去、アヘンは生物学的試料で薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、放射線免疫検定法
（ＲＩＡ）あるいは酵素免疫検定法（ＥＸＡ）により検
出されていた。しかし、これらの検定法に欠陥を伴って
いないものではない。ＴＬＣは労力が大きく、また感度
が欠けている。ＨＰＬＣおよびＧＣは共に労力が大きく
、生物学的母体から分子ｉ物を抽出するのに高度に熟練
した人を必要とし、−万〇〇は同じく誘導工程を必要と
している。ＲＩＡ試薬は直ぐに分解し、関与する人の安
全を防設し、モニターする厄介な方法を必要とし、また
安全な方法で処分しなければならない有害な廃棄物を発
生する。ＥＸＡは、試薬の熱および（または）細菌傾向
の故に、また酵素活性を改変するマトリックス効果の故
に、変化しやす（・ものである。

螢光偏光免疫検定法（ＦＰＩＡ）操作によｐ、均一拮抗
結合検定で生成するトレーサー抗体複合体の量を測定す
るための濱頼し得る定性手段が提供される。典型的には
、この拮抗結合免疫検定において、リガンド（技術によ
り測定すべき生物学的関心のある物質）は、リガンドＳ
よびリガンド類似体に対して特異的な抗体での制限され
た数のレセプター結合部位について、標識試薬、あるい
は「リガンド類似体」または「トレーサー」と拮抗する
。試料中のリガンドの濃度が抗体に結合しているリガン
ド類似体の量を定め：縮合しているリガンド類似体の量
が頭巾のリガンドの量に反比例する。その理由はリガン
ドおよびリガンド類似体は各々それらの濃度罠比例して
抗体に結合しているからである。

螢光偏光技術は、螢光標識化合物は平面偏光された元で
励起されるとその回転速度と逆に関連する偏光度を有す
る螢光を発するという理論に基くものである。従って、
螢光ラベルを有するトレーサー−抗体複合体を平面偏光
で励起すると、発光された光は高度に偏光きれた１１で
ある。それは発色団が元が吸収および発光される時間の
間回転が拘束されるからである。逆（、未結合トレーサ
ーが平面偏光で励起されると、その回転は対応するトレ
ーサー−抗体共役体の回転よりも速くなる。帰来として
、未結合トレーサー分子から発する光が脱偏光される。

このような螢光偏光技術は、ワ／グ（Ｗ５ｓｇ）等の米
国特許第４，４２０，５６８号で適用されていて１発色
団としてトリアジニルアミノフルオレ上４フ部分の使用
に向けられている。

アヘン抗原共役体および抗体は次のとおりの文献、特許
に開示されている。スベクター（Ｓｐｍａｔｏデ）の米
国特許第３，７０９，８６８号、ルペ７スｐイア（Ｒｓ
ｋａｎａｔａｉｓ）？よびウルマン（Ｕｌ　１ｒｎａｎ
）の米国特許第３．８６７，３６６号、クロス（Ｇｒｏ
ａｎ）の米国特許第４．０２２．８７８号、ワイナー（
Ｗａｉｎｍｒ）等、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ）、第
１７６巻、第１１４３頁（１９７２年）および丈イエン
ス、第１７８巻、第６４７頁（１９７２年）、＠田等日
本薬理学会誌、第２４巻、第１６５頁（１９７４年）お
よび同誌、第２４巻、第７０７頁（１９７４年）、モリ
ス（Ｍａｒデｉｓ）。

プロシーディンゲス・オブ・ザ・ンサイエテイ・フォア
・エンドクリノロシイ（Ｐｒｏｅｅｇｄｉｔｓｇｓ　　
ｏｆ　　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙｆｏｒ　Ｅｎｄｏａｒ
ｉｎｏｌｏｇｙ）、第６４巻、６Ｆ（１９７５年）、デ
ィクソン（Ｄｉｚｏり等、リサーチ・コミューニケーシ
ョンズ・イン・ケミカル・パンロジイ・アンド・ファー
マコロジイ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍ５％ｔｃａｔ
４ｏｓｘ　　ｉｎ　Ｃルーｉ６ａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ
　ａｓｄ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ’）、第２９巻、
第５３５頁（１９８０年）および同誌第３２巻、第５４
５頁（１９８１年）、ピット−ｒ　ｙ　（Ｐｉ　ｔ　ｔ
ｒｎａｎ　）等、ジャーナル・オプ・ファーマシューテ
イカル・サイエンス（ＪＯ％ｒ％ａｌｏｆ　Ｐｈａデｍ
ａｃａｓｔｉｃａｌ　！３ｃｔａｎｃｇ　）、第６９巻
、第６９巻、第１６０頁（１９８０年）、バートレット
（Ｂαデｔｌａｔ　）等、ユーロピアン・ジャーナル・
オブ・クリニカル・ファーマコロジイ（Ｅｘｒｏｐ−α
％ＪＯ％ｒ％ａ１ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｐｈａｒｍ
ａｅｏｌｏｇｙ）、第１８巻、第３３９頁（１９８０年
）およびフィンドレイ（Ｆｉｓｄｌａｙ）等、クリニカ
ル・ケミストリー（Ｃｌ１ｓｓｉｅａＥ　Ｃｈｍｉｓｔ
ｒｙ）、第２７巻、第１５２４頁（１９８１年）。アヘ
ンのフルオレセイン共役体は、ウルマンの米国特許第３
．９９８，９４３号および同第４．２５５．３２９号、
ルベンステインおよびロイテ（Ｌ−％ｔｇ）の米国特許
第３．９３　＆０７４号、ウルマン等、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｓｒｘａｌ　
　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇ４ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
）、第２５１巻、第４１７２頁（１９７６年）およびコ
ルブ（Ｋｏｊ＆）等、ライフ・サイエンス（ＩＡｆａ　
Ｓｅｔｍ＊ｃａ）、第３３巻、Ｓす、１．第４２３頁（
１９８３年）に開示されている。

本発明は上掲のものを超える技術分野での利点を提供し
、特に％有効な免疫原、選択的抗体、高度に選択性の螢
光トレーサー、抗体および螢光トレーサーの製法、およ
びトレーサーＳよび抗体を用いる検定が特別に試料中の
アヘンアア力ロイドの１踵またはそれ以上の測定のため
に提供される点に利点が提供される。本発明に従って行
われる検定は以下に説明するように特に正確である。

〔発明の構成〕

本発明は、アヘンアルカロイドまたはその代謝物の検定
に使用し得ろ抗体を育成するのに用いられるノ・ブテン
および免疫原、アヘンアルカロイドまたはその代謝物の
螢光偏光免疫検定法に使用するためのトレーサー、該検
定を実施する方法、およびトレーサー、・・ブテンおよ
び免疫原の合成法に関する。

従って、本発明の第一の特徴は、免疫原担体物質例えば
蛋白質に共有結合し、そして抗体を育成するのに用いた
場合、多数の異ったアヘンアルカロイドおよびその代謝
物に対して高度の交差反応性を有する抗血清を提供する
が、−万ではその他のアルカロイドまたは薬物に対し２
てほとんど親和性を示さなζ・新規な化合物の発見に関
する。それ故、本発明によれば、式（９） 〔式中αおよびα′の−１は水素であり、そして他方が
ヒドロキシであるか、あるいは両刃が一緒になって一〇
（ケトン）を形成し；βおよびβ′は共に水素であるか
、あるいは両刃が一緒になってそれら１ＪＳ結合してい
る炭素原子に結合している結合を形成し：そしてα“は
水素またはヒドロキシである〕で表わされる構造式を有
し、アヘンアルカロイドの３−位でのグルクロナイド代
謝共役体の温和な酸化開環から得られるジアルデヒドで
ある化合物が提供される。

本発明の第二の特徴によれば、構造式（１０）〔式中α
およびα′の−１は水素であり、そして他方がヒドロキ
シであるか、あるいは両方が一緒になって一〇（ケトン
）を形成し；βおよびβ′は共に水素であるか、あるい
は両方が一緒になってそれらが結合している炭素原子に
縮合している結合を形成し；そしてα″ＩＩ詠素はヒド
ロキシである〕を有するアヘンアルカロイドのグルクロ
ナイド復合体を水溶性過ヨウ素酸塩で酸化し、このよう
にして形成　　　　　−されたアルデヒド化合物を免疫
原担体物質例えば蛋白質または合成ポリペプチド上の一
級アルキルアミンと反応させ、そして得られた縮合生成
物をホウ水素化物試薬例えばホウ水素化ナトリウムまた
はシアノホウ水素化ナトリウムで還元する各工程からな
ることを特徴とする免疫原の製法が提供される。

本発明の第三の特徴によれば、本発明は新規な免疫原に
より育成される抗体に関する。この特徴によれば、抗体
は当業者に周知の方法により上述の叩く合成された化合
物に反応して調製されろ。

本発明の第四の特ａは新規な構造を有する独特にトＬ／
−サーの発見に関する。本発明のこの特徴によれば、こ
れらのトレーサーは次の式（１１）で表わすことができ
る。

！ 〔式中、ＸおよびＹの−１が水素であり、そして他方が
水素、フッ素、塩素、臭素、シアノまたはＣ，−Ｃ，ア
ルキルであり； Ｚが”ＮＨ、ンｃ−ｏ、ンＣ−ＮＨＩたは＞ＳＯ２であ
り； Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であり
、Ｒは、０−２０個の炭素原子および（１２個以下のへ
テロ原子を包含する）へテロ原子からなり、かつ直鎖筐
たは有枝鎖に配列され、そして２個までの環構造を含有
する結合基であり、但し４個以下のへテロ原子が順に結
合されていてもよ（・が、２個以上の硫黄または２個の
窒素または１個の酸素が順に結合されていない； Ｅは非結合性電子対、酸素原子またはメチルであり；α
およびα′は共（水素であるか、またはそれらの−万が
水素であり、また他方がヒドロキシ、メチルまたはフル
オロであ九あるいは両方が一緒になって一〇（ケトン）
を形成し【もよい； α“は水素またはヒドロキシであり；そしてβおよびβ
′は共に水素であるかまたは両方が一緒になってそれら
が結合している２個の炭素原子を結合する結合を形成し
ていてもよく、但しαがＨであシ、α′がＯＨであり、
Ｅが電子対であり、そしてα“、ＸおよびＹが（・ずれ
も水素である場合βおよびβ′は結合を形成していない
〕本発明の第５の特徴は、上記のドアーサー化合物に対
する合成先駆物質として役立つ独特の化合物の発見に関
する。

本発明のこの特徴によれば、トンーサー先駆物質は次の
式（１１）の構造式で表わすことができる。

〔式中。

ＸおよびＹの−１は水素であυ、そして他方は水素、フ
ッ素、塩素、臭素、シアノまたはＣ，−Ｃ，アルキルで
あり；Ｚは結合官能基例えば）ＮＨ１’：；Ｃ−０、ン
ｓｏ、または−Ｓ−であり； Ｑは水素、ヒドロキシまたは脱離基であり；Ｅは非結合
性電子対、酸素原子またはメチルであり；αおよびα′
は共に水素であるか、またはそれらの−万が水素であシ
、１だ他方がヒドロキシ、メチルまたはフルオロであり
、ｌたは両方が一緒になって一〇（ケト／）を形成し； α“は水素またはヒドロキシであり：そしてβおよびβ
′は共に水素であるか、または両方が一緒になってそれ
らが結合している２個の炭素原子を結合する結合を形成
し、但しαがＨであり、α５１０Ｈであシ、Ｅが電子対
であり、そしてα“、ＸおよびＹがいずれも水素である
場合βおよびβ′は結合を形成していない〕本発明の第
６の特徴によれば、式（１１）〔式中、 ＸおよびＹの−１は水素であり、ナして他方は水素、フ
ッ素、塩素、臭素、シアノまたはＣ，−Ｃ，アルキルで
あり；Ｚは結合官能基例えばンＮＨ、ンｃ−ｏ、”ｓｏ
、ｔたは−Ｓ−であり； Ｑは水素、ヒドロキシまたは脱離基であシ；Ｅは非結合
性電子対、酸素原子またはメチルであシ：αおよびα′
は共に水素であるか、またはそれらの−万が水素であり
、１だ他方がヒドロキシ、メチルまたはフルオロであり
、または両方が一緒になって一〇（ケトン）を形成し； α“は水素またはヒドロキシであり；そしてβおよびβ
′は共に水素であるか、または両方が一緒になってそれ
らが結合している２個の炭素原子を結合する結合を形成
し、但しαがＨであり、α’ｆ）ＳＯＨであり、Ｅが電
子対であり、そしてα“、ＸおよびＹがいずれも水素で
ある場合βおよびβ′は結合を形成して−・ない〕を有
する化合物をフルオレセインまたはフルオレセインの誘
導体とカップリングさせることによるトレーサーの製法
が提供される。

本発明の第７の特徴は分析方法、すなわち、試薬として
式（１１）のトレーサーＣＱがフルオレセインまたはフ
ルオセイン誘導体である）および上記の如くして製造し
た免疫原との反応で養成されたアヘンアルカロイドに対
する抗血清を用いて検定を行う方法に関する。本発明の
この第７の特徴によると、改良された螢光偏光免疫検定
法が提供される。この方法は、アヘンアルカロイドまた
はそれからの代謝産物を含有する疑（・のある液体を、
アヘンアルカロイドに対する抗血清およびフルオレセイ
ン標識アヘン銹導体〔すなわち、式（１１）の化合物、
但しトレーサーの町変物α、α−αζβ、β−Ｅ、Ｘお
よびＹで足義されろトレーサーの置換パターンは抗血清
を育成させるのに用いた免疫原のパターンとは異ってい
る〕（均一溶液中抗血清の存在（対して検知し得る螢光
偏光反応を生成し得る〕と接触させ、−万均一溶液中を
平面偏光を通過させ、そしてそれからの螢光偏光反応を
測定する工程からなる。

本発明の第８の特徴は、リボフラビンによる潜在的な螢
光干渉を除くことに関する。リボフラビン結合性蛋白質
（ＲＢＰ）は各試料ある（・は検定に使用されろ試薬の
１種またはそれ以上に直接添加し、そこでこのものは存
在するすべてのりボフラピンと結合してＲＢＰ−リボフ
ラビン複合体となり、かくして螢光干渉を除去する。そ
の他の螢光−急冷物質もまたこの目的に使用し得る。

定義および説明事項 本発明はフルオレセインおよびフルオレセインの誘導体
の使用を包含している。特に、トレーサー化合物の有用
性のために必要なフルオレセインおよびその誘導体の特
性はフルオレセインの螢光である。フルオレセインは１
周囲の酸濃度（ｐＨ）に左右されて、式（１２）に例示
する如く２種の互変異性体の形態で存在する。

ラクトン 酸 開環（酸）形態では、多くの共役二重結合が存在し、こ
れらの結合はフルオレセインの該形態（およびフルオレ
セイン部分を含む化合物）を青色光を吸収し、そして約
４ノナ秒の励起状態ライフタイム後に緑色の螢光を発生
し得るようにする。開環丁６よび開環形態が共存してい
るとぎは、−環および閉環形態中の分子の相対濃度はｐ
Ｈレベルの調整により容易に変えられろ。一般に、本発
明のトレーサー化合物は溶液中に生物学的に許容し得る
塩例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム等として
存在し、本発明の分析方法に用いるとぎは化合物物をそ
の開環、螢光形態で存在させる。存在する特定の塩はｐ
Ｈレベルを調節するのに使用される緩衝剤によって左右
される。例えば、リン酸ナトリウム緩衝剤の存在下に、
本発明の化合物は一般にナトリウム塩として開環形態で
存在する。

本文で使用される「フルオレセイン」なる用語は、個々
の化合物としであるいはまり犬ぎい化合物の成分として
、螢光に関すること７除いて、特別な分子について存在
していたとして開環および閉環形態両刃を包含すること
を意味する。開環形態は螢光力Ｓ生じるのに必要である
。

フルオレセイン分子の炭素原子のナンバリングは、分子
の開環または閉環形態を考慮されるか否かによって、変
化する。従って、フルオレセインおよびその化合物に関
する文献は炭素原ナンバリングについて統一されていな
い。閉環形態では、フェニル環上のラクトンのカルボニ
ルに対するパラ−炭素を“６”と番号付けしている。開
環形態では、フェニル環上のカルボン酸基のパラ−炭素
を′″５″と番号付けしている〔式（３）を参照〕。こ
の記載では、閉環形態のす／バリフグを採用する。その
理由は合成で用いる原料が最も普遍的にこのシステムで
番号付げ場れているからである。従って、カルボキシル
基に対しているフルオレセインおよびその化合物の炭素
原子を本発明の記載の目的のたりに“６”と番号付けす
る。

抗体に複合していない溶液中のトレーサーは、螢光の吸
収および再発光に必侵な時間よりも少い時間で自由回転
する。結果として、再発光した元は相対的に無作為に配
向され、その結果抗体に複合されていないトレーサーの
螢′ｙｔ４１Ｍ光が低く、零に近づいてくる。特定の抗
体と複合すると、このようにして形成きれたトレーサー
−抗体複合体は、比較的小さいトレーサー分子の回転よ
りもゆっくりとした抗体分子の回転をとり、これによっ
て観察される偏光が増大する。従って、リガンドが抗体
部位についてトレーサーと競合すると、遊離トレーサー
と遊離トレーナーー抗体複合体の得られた混合物の螢光
の観察される偏光は、トレーサーとトレーサー−抗体複
合体との中間のＩｌｌとろ。試料が高濃度のりガントを
含有しているとぎは、観察される偏光値は遊離リガンド
の値に近く、すなわち低くなる。倶試試料が低濃度のリ
ガンドを含有しているとぎは、偏光値は結合リガンドの
頭に近く、すなわち高くなる。免疫検定の反応混合物を
垂直に偏光した光次いで水平に偏光した元で順次励起し
、そして発光嘔れた元の垂直に偏光した成分のみを分析
することにより、反応混合物の（ｆ元の偏光は正確に測
足することができる。偏光と測定きれるべきリガンドの
０度との間の正確な関係は、既知の濃度の検飢体の偏光
値を測足することにより好都合に確立することができる
。リガンドの濃度をこのようにして用意した標準曲線か
ら内挿することができろ。

本発明に従って形成された特別な抗体およびトレーサー
は以下に論述するように極めて良好な検定を生じろこと
がわかった。

試薬 アヘンアルカロイドおよびその代謝物のための拮抗結合
免疫検足法馨デザインする対象は、抗体での認、Ｖ部位
のために薬物（すなわち、アヘンアルカロイドまたはそ
の代謝物）とトレーサーとの間の合理的に釣合いのとれ
た拮抗を確立するにある。ハプテンおよびトレーサーの
ための広く変り得る構造はこの目標を達成するのに有利
である。本発明の目的のために、「ハプテン」は、一般
にアヘンアルカロイドのグルクロン酸共役体からなる免
疫原の前駆体である。

使用し得る抗体は種々のアヘンアルカロイド訪導体から
生産されろ。所定のアヘン例えばモルヒネグルクロナイ
ドから製造される免疫原は、該薬物に対して非常に高い
親和性を示しているが、同一の基本５員環アルカロイド
溝造を有するその他のアヘンに対して緩和な親和性をも
示す抗体を誘出する。抗血清の適切な選択により極めて
狭いかまたは極めて広い反応選択性を提供することかで
ざる。

本発明の現在好ましい形態にお（・て、免疫原のモルヒ
ネグルクロナイド、式（９）を有する化合物（αが水素
であり、α′がヒドロキシであり、α“が水素であり、
そしてβおよびβ′が結合を形成している）から誘導さ
れる。この構造はアヘンアルカロイド濫用のスクリーニ
ング検定に用いるのに好ましい。その理由は、モルヒネ
およびその代謝先駆物質ジアセチルモルヒネ（ヘロイン
）が最もひんばんに濫用されている化合物であるからで
ある。それで、上記の好ましい先駆物質に反応して生成
された抗体は、モルヒネおよびモルヒネグルクロナイド
を最も良り認識するものであり、そしてこれらの２種の
化合物はアヘン濫用の疑いのある人から得られる生物学
的体液で最もみつかる可能性のあるものである。

甲状腺グロブリンは下に示す合成実施例で用いられる免
疫原担体物質であるが、種々の蛋白質担体χ使用するこ
とができろのは明白であり、アルブミン、血清蛋白例え
ばグロブリ／、眼レンズ蛋白、リボ蛋白質等が包含きれ
る。例示的な蛋白質担体には牛血清アルブミン、キイホ
ール・リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ　　ｌｉｍｐａｔ）
ヘモシアニン、卵アルブミン、牛ｒ−グロブリン等が包
含されろ。あるい１才また。

十分な数の利用可能なアミン基（例えばリジンまたはオ
ルニチン残基上のアミン基）を有する合成ポリ（アミノ
酸）を使用し得ろし、また反応性官能基を担有するその
他の合成または天然重合体性物質も使用し得る。更に、
炭水化物、イースト、多聞類あるいは免疫原担体として
使用し得ろ他の物質をハブテンに共役させて免疫原を生
成させることができろ。

抗体 本発明に使用される抗体は、兎または羊に適切な免疫原
に対する反応？：訪起させろことによって製造される。

免疫原を当業者に周知の方法で動物に投与する〃）あゐ
（・は一連の接種による免疫能細胞の試験管内培養物に
投与する。羊力ｊ本文に詳述する実験でのアへ／アルカ
ロイド免疫原に対する好ましい免疫宿主であるが、抗体
を生産し得ろいずれの試験管内または生体内宿主を使用
し得ることが明白である。

トレーサーの構造 本発明のトレーサーは式（１１）で示でれる一般構造式
で表わすことができる。本発明の好１しく・！！１様で
は、トレーサーは式（１４）の構造式を有している。

トレーチーは、例えば式（１３）で示されるよ５なアミ
ド。

アミジノ、トリアジニルアミノ、カルバミド、カルバモ
イル、スルホンアミド筐たはスルホニルカルバモイル基
によりフルオレセイン誘導体に結合されているアヘンア
ルカロイド誘導体である。

式１３−１　　　　　　　　式１３−２式１３−３　　
　　式１３−４　　式１３−５−Ｃ（ＮＩＩ）−ＮＨ−
ＦＬ　　　　　−ＮＨ−Ｃｏ−ＮＨ−Ｆｔ式１３−６　
　　　　　式１３−７ −０−Ｃ０−ＮＨ−Ｆｔ　　−３Ｏ，−ＮＨ−７１式１
３−８　　　　式１３−９ −０−Ｃ０−ＮＨ−３Ｑｔ−ＮＨ−７１式１３−１０ トレーナ−は、適当なフルオレセイン誘導体を７ミノ、
カルボン酸、スルホン酸、ヒドロキシ、イミデート、ヒ
ドラジド、イソシアネート、クロロホルメート、クロロ
スルホニルカルバモイルまたは類僚の基を含有するアヘ
ンアルカロイド訪導体と以下の合成方法および実施例に
関して詳述している如く結合させろことによって製造さ
れる。

例示として、次のフルオレセイン誘導体のいずれも使用
し得る。

Ｆｔ−Ｎｌｌ、　　　　　　　　　　フルオレセインア
ミンＦｔ−ＣＯ，Ｈカルボキシフルオレセイ７Ｆｔ−Ｎ
ＨＣＯＣＨ，Ｉ　　　　　　　α−ヨードアセトアミド
フルオレセイン Ｆｔ−ＮＨＣＯＣＨ，Ｅデ　　　　　α−ブロモアセト
アミドフルオレセイン 本発明のトレーサーは、フルオレセイン部分あるいはフ
ルオレセインの誘導体を式（１１） 〔式中、Ｑは水素、ヒドロキシまたは脱離基であり；Ｚ
はＮＨ，Ｓ、Ｏ，Ｃ−０，ＳＯ，ｊたはＣ−ＮＨであり
、セしてＲは先述のとおりの結合基である〕を有する化
合物とカップリングさせることによって製造されろ。フ
ルオレセイン部分は式（１２）で示すようにアミド、ア
ミジン、尿素、カーバメート、スルホンアミド、トリア
ジニルアミノまたはスルホニルカーバメート結合により
アミン、カルボキシ、イミデートあるいはアルコキシ官
能基に結合石せること力Ｓできる。現存の好ましい態様
において、フルオレセイン誘導体にジクロロトリアジニ
ルアミノフルオＶセイン（ＤＴＡＦ）（異性体Ｍ）であ
ジ、このものを式（１０）で示される前駆物質とカップ
リングさせろ。

〔式中、ＲはＣＭ、Ｃ（０）ＮＨ（ＣＨ，）、であり、
ＺはＮＨであり、ＱはＨであり、αおよびα“はＨであ
り、α′はＯＨであり、βおよびβ′がＨであり、セし
てＥは電子対である〕。

ＤＴＡＦはアヘ／アルカロイドのアミノアルキｌＬ／ｇ
４体と、２種の化合物をメタノール中ＦＪＯ＠乃至溶媒
の沸点の温度でかくはんすることによって、カップリン
グさせる。

塩基性化合物例えばトリエチルアミンを、所望により、
殊に反応でアミン先駆物質の塩（例えば塩酸塩または酢
酸塩）を用いるときは、加えてもよい。他のＧｅｉ：例
えばジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキサイ
ドを使用してもよい。使用し得るトレーサーは種々のア
ヘンアルカロイド誘導体から製造することができる。

末端アミノ基例えばアミン、ヒドラジニル、ヒドラジド
あるいはその類似体を有するいずれのアヘンアルカロイ
ド誘導体も、活性エステル法あるいは混合無水物法によ
ってカルボキシフルオレセインに、また単に２ｍの物質
を溶液中でかくはんすることによってＤＴＡＦｔたはア
ルコキシクロロトリアジニルアミノフルオレセインにカ
ップリングさせろことができる。アミン基はホスゲンと
の反応によりインシアネート基に変換することができろ
。久に、このものをアミノフルオレセインと縮合させて
トレーサーを生成させる。

末端メルカプト基を有するアヘンアルカロイド誘導体は
不活性溶媒中でα−ブロモアセトアミドフルオレセイン
あるいはα−ヨードアセトアミドフルオレセインとカッ
プリングさせる。

末端カルボン酸基例えばカルボン酸、（アミノヒドロキ
シ）アルキルカルボン酸等を有するすべてのアヘンアル
カロイド誘導体を活性エステル法あるいは混合無水物法
によりアミンフルオレセインにカップリングさせる。

末端ヒドロキシ基を有するすべてのアヘンアルカロイド
鰐導体は、溶液中でのＤＴＡＦ、α−ヨードアセトアミ
ドフルオレセインあるいはα−ブロモアセトアミドフル
オレセインとの反応によりフルオレセインにカンプリン
グすることかでざる。ヒドロキシ基は、クロロスルホニ
ルイソシアネートあるいはホスゲンとの反応によりそれ
ぞれクロロスルホニルカルバモイルあるいはクロロホル
メート基に変換することができる。次にこれらの誘導体
を溶液中でアミノフルオレセインとカップリングさせて
トレーサーを生成させる。

アヘンアルカロイドのスルホン酸誘導体は、塩素化試薬
例えば塩化チオニル、塩化ホスホリル、五塩化リン等と
の反応により相当するスルホニルクロライドに変換する
。次に、スルホニルハライドを、通常添加塩基性化合物
の存在下に、アミノフルオレセイ／あるいは反応性アミ
ノ基を担有するその他のフルオレセイン誘導体と反応さ
せてトレーサーを生成させる。

末端ニトリル基を有するアヘンアルカロイド誘導体を塩
化水素ガスの存在下に無水アルコール中でイミデートに
変換される。次に、イミデートな溶液中でフルオレセイ
／とカップリングさせてトレーサーを製造する。

検定 本発明の特別なトレーサーは、尿試料中で高度の選択性
および特異性でもってアヘンアルカロイドの存在を検出
することか見い出された。次の式（１１〜（８）は、本
発明に従って足性的に検出することができるアヘンアル
カロイドの構造を示す。

式１　　　　　　　　　　　式２ 式３　　　　　　　　　式４ 式５　　　　　　　　　式６ 式７　　　　　　　　　　式８ 本発明の検定法は、先行技術の方法よりも迅速かつ便利
のよいアヘンアルカロイドの検定法を提供する。その理
由は、この検定法は分析前に試料処理を心安とせず、試
薬は化学的、熱的に安定であり、検定システムはアヘン
類似化合物に対する交差反応性が最小であり、そしてそ
の簡２性のために検定を高度に自動化された装置で迅速
に実施することができるからである。

本発明の分析法、すなわち本発明のトレーサーおよび抗
体化合物を用いる螢光免疫検定操作法によるアヘンアル
カロイドの検出方法によれば、アヘンアルカロイドまた
はその代謝物を含有しているかまたは含有している疑い
のある試料をトレーサーの生物学的に許容し得る塩およ
びアヘンアルカロイドとトレーサーとして特異的な抗体
と混和する。

アヘン薬物あるいは代謝物およびトレーサーは限られた
数の抗体部位と競合し、複合体を形成する。トレーサー
および抗体の濃度が一定に保たれているので、形成され
るアヘンアルカロイドー抗体複合体対トレーサー−抗体
複合体の比が試料中のアヘンアルカロイドの量に正比例
する。従って、混合物を＠線状の偏光で励起し、そして
トＶ−サーおよびトレーサー−抗体複合体くより発する
螢光の偏光を測定すると、試料中にアヘンが存在してい
るか否かを定性的に測定することができる。

結果をネット・ミ’）偏光単位、スパン（ミリ偏光単位
で）および相対強度に関して足置することができる。ミ
リ偏光単位の測定により、いずれのアヘンアルカロイド
の不存在下に最大量のトレーサーが抗体に結合された場
合の最火偏党が指示される。ネット・ミリ偏光単位が高
いほど、抗体に対するトンーサーの結合が一層良くなる
。スパンは、抗体に結合されたトレーサーの最大および
最小の量のところでのネット・ミリ偏光の差の指標であ
る。スパンが大きいほどデータの数字上の解析がより良
くなる。強度は、基底値（ｂａａｋｇｒｏｘｓｄ　）上
の信号の強度の尺度である。それで、より高い強度はよ
り正確な測定１直を与えることとなる。

強度は、垂直偏光強度プラス２倍の水平偏光強度の和と
して１本発明の好ましいトレーサーに対して、約０．５
−２．０ノナモルで測定される。トＶ−サー信号の強度
は、トレーサーの濃度およびその他の検定可変物によっ
て、基底１直ノイズの約４倍乃至約５０倍の範囲にあり
得る。本発明の目的のためには、基底須ノイズの少くと
も６倍の強度が好ましい。

表■〜ＩＶＫは、本発明の種々の態樋で得られた結果を
スパン、ミリ偏光単位および強度で示す。表■〜■のい
ずれにおいても、用いた抗血清は羊で産出され、表■で
は抗血清は兎由来である。このデータから明らかな如く
、式（１４）のトレーサーの使用によって得られる検定
がすぐれた結果を生じ、現在のところ最も好ましい。更
に１式（２２）、（１６）および（１９）で示されるト
レーサーかまた許容し得る結果を生じ、それ故代替とな
る好ましいトレーサーである。なお、各表および他の所
にみられるトレーサーの式は次の如くである。

式１７ 〃 式１９ 式２４ 表　　■ 羊１０４ 式１４　　１５４　　　６６　　　８３　　　７．０１
式％ Ｇ、ミリ偏光単位で表わす ｄ、　　）レーサー強度対基底値ノイズ螢光の強度の比
で表わ表　　■ 羊１０５ 式１４　　１６２　　　５９　　　８４　　７．０％式
％ 式　　　　　１５３　　　６６　　　　　８１　　　７
．０１０５　　　　２３　　　　　　４１　　　５３．
１１２２　　　　４６　　　　　　６２　　　　６．８
８０　　　　３１　　　　　　４３　　　１３．９１２
４　　　　４０　　　　　　５６　　　　６．８１３７
　　　　５４　　　　　　７４　　　　８．４９９　　
　　　２８　　　　　　　４０　　　１１．９６５　　
　　２１　　　　　　２８　　　１１．５１００　　　
　４９　　　　　　６１　　　１１．２９２　　　　３
０　　　　　　３９　　　　９．７７７　　　　　２１
　　　　　　　３３　　　１０．３表　　■ 兎プール 式＄１４　　１６０　　　　７４　　　　８７　　　　
７．ＯＩ中１５　　１４９　　　３８　　　６６　　５
３．１１す１６　　１３７　　　５８　　　７６　　　
６．８＃＋１７　１０８　　５１　　６７　１３．９Ｉ
Φ１８　１４３　　５３　　７６　　６．８Ｉす１９　
　１１８　　　４９　　　　６２　　　８．４１す２０
　　１０７　　　３４　　　　４９　　１１．９本発明
の方法を実施するｐＨは、トレーサーのフルオレセイン
部分がその開環した形態で存在するのに十分なものでな
ければならない。ｐＨは約３〜１２、更に好ましくは約
５〜１０、最も望ましくは約６〜９の範囲にある。検定
操作中種々の緩衝剤を用いてｐＨを達成、維持すること
ができる。代表的な緩衝剤には、ホウ酸塩、クエン酸塩
、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等
が包含　　　　　−される。使用される特別な緩衝剤は
本発明に対して限定的ではないが、トリスおよびリン酸
緩衝剤が好ましい。緩衝剤の陽イオン部分は一般に溶液
中のトレーサー塩の陽イオン部分を決定する。

リボフラビン結合性蛋白質（ＥＢＰ）を、試料中に存在
するりボフラピンがＲＢＰ−リボフラビン複合体に結合
してリボフラビンからの潜在的螢光干渉を除去するため
に、試料または検定試薬の１種またはそれ以上に加えて
もよい。

ＲＢＰは普通卵白から単離される約３２，０００の分子
量を有する蛋白質である。卵から単離すると、ＲＢＰの
各分子はりボフラビン１分子を含有している。このホロ
プロティン形態のＲＥＰは、酸性条件下、透析に工りア
ポプロティンに変換されて結合リボフラビンを除去しな
げればならない。本発明で用いられるＲＥＰアポプロテ
ィンは、ミズリ−、ヤントルイスのシグマ・ケミカル・
カンツマニー（Ｓり惧ａ　Ｃｈ−溝（ＣむＣｏ惟ｐ１す
）から市販されている。

使用量に限定はない力ζ試料中のすべての遊離のリボフ
ラビンを事実上結合するのに十分な量を用いることを条
件とする。

本発明の改善された検定の好ましい方法を詳述する。検
定は「均一な検定」であシ、これは結合トレーサーが未
結合トレーサーから分離されない溶液から終末偏光読み
をとることを意味する。これは結合トレーサーを読みを
とることができる前に未結合トレーサーから分離しなげ
ればならない不均一な免疫検定操作にまさる明白な利点
を示している。

本発明の螢光偏光検定法のための試薬はアヘンアルカロ
イドおよびその代謝物およびトレーサーのための選択的
な抗体を包含している。更に、アヘンアルカロイドー％
Ｍ前処理溶液、希釈緩衝斉しアヘンアルカロイド検量体
、およびアヘンアルカロイドコントロールを包含する主
要な通常の溶液を調製するのが望ましい。これらの試薬
の典型的な溶液のいくつかは本文に開示され、またこれ
らの典型的な溶液は、イリノイ、アボット・パークのア
ボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｔｒｒ
ａｔｏｒｉａａ　）から検定「キット」で市販されてい
る。

本文で示されている％は他に指示のない限りいずれも重
量／容量である。現存好ましいトレーサー処方物は、ｐ
Ｈ６，０の０．１モルクエン酸緩衝剤；５％５−スルホ
サリチレート；および０．１％ナトリウムアジド中の２
００ノナモルトレーサーである。抗血清処方物は、３．
３％正正常面血清容ｆ／容量→；ｊＨ７，５の０．ＩＡ
／）リス緩衝剤、２％エチレングリコールおよび０．１
％ナトリウムアジドで希釈された羊抗血清を包含してい
る。希釈緩衝剤は、ｐＨ７，５の０６１モルリン酸ナト
リウム；０．１％ナトリウムアジド；および０．０１％
牛γ−グロブリンを包含している。前処理処方物は、ｐ
Ｈ７，５の０．１モルトリス緩衝剤：４ｗ／−リボフラ
ビン結合性蛋白質；および０．１％ナトリウムアジドを
包含している。洗滌液は上に掲げた希釈緩衝剤と同一で
ある。検量体は０．１％ナトリウムアジド防腐剤と共に
０１Ｏ１１００，２００，３５０、ＳＯＯおよび１００
０　μｙ／Ｌの濃度で正常なヒトの尿中のアヘンアルカ
ロイドを包含するものが有用である。正常なヒトの尿中
のモルヒネアルカロイドを包含するコントロールは防腐
剤として０．１％ナトリウムアジドを伴う２５０および
８００μｙ／ｌの濃度で提供される。

好ましい操作は、テキサス・アーグイングのアボット・
ラボラトリーズから入手し得るアボット（Ａｂｂｏｔｔ
）ＴＤｚＲ偏光アナライザーと組み合せて使用するよう
ＶＣｔｒｆに設計されている。５０μｔの尿、血ｆＮあ
るいは血漿を必要とする。

検量体、コントロールあるいは未知の試料をＴ　Ｄ　ｚ
　”試料カートリッジの試料Ｍめに直接ピペットで入れ
る。この操作の利点の一つは、試料が特別の調製を何等
必要としないところにある。ＴＤ、Ｒアヘンアルカロイ
ド検定キットをＴＤ□Ｒアナライザーと共に用いている
ときは、試料を直接試料カルーゼル（ｃａｒｏｓｓｍｌ
　）　　に入れ、キット中の４種の試薬容器の各々から
ふたをとシ、セしてＴＤＺＲアナライザー内部の所定の
溜めに入＞そしてこの点から検定操作は完全に自動化さ
れている。

手動での検定が行われているときは、試料を希釈緩衝剤
中前処理溶液と混和し、そして基底値の読みをとる。次
に、トレーサーを検定に混和する。抗体を最後に供試溶
液に混入する。培養後、螢光偏光を読み取る。

各検量体、コントロールまたは試料の螢光偏光値を測定
し、そして装置例えばアボットＴＤ−偏光アナライザー
の出力テープにプリントすることもできる。標準曲線は
、各検量体の偏光対その濃度を非直線回帰分析を用いて
プロットすることによって装置中に形成される。各コン
トロールまたは試料の濃度は保存検量曲線からとり、そ
して出力テープにプリントされる。

前述の好ましい操作に関し、トレーサー、抗体、前処理
溶液、検量体およびコントロールは約２℃乃至約８℃で
保存しなければならず、一方希釈緩衝剤は周囲の温度で
保存しなげればならないことに注目すべきである。標準
曲線およびコントロールは２週間毎に操業しなければな
らないし、また各検量体およびコントロールは重複して
操業しなげればならない。コントロールは１日毎に操業
しなければならないし、そして所望ならばすべての試料
を重複して操業することができる。

前文の詳細な説明および次の実施例は例示を企図したも
のであり、本発明の範囲について限定しているものでは
ないことが明白である。当業者にとって種々の変形が明
白であシ１発明の範囲は特許請求の範囲およびその法的
均等物によってのみ定められることが企図されている。

〔実施例〕

実施例１−１９には本発明の思想に従って行った実験を
記載する。

実施例１゜ モルヒネ−３−グルクロナイド（１００，４〜）を、１
．０Ｍ　ＮａＯＨ３滴を加えて、蒸留水１２ｍに溶解し
た。過ヨウ素酸ナトリウム（３６ｎｙ）を加え、ｐＨを
３に調節し、そして混合物を室温で１３４時間かくはん
した。エチレングリコール（０，０１６ｍ／）を加え、
そしてかくはんを１時間続けた。甲状腺グロブリン（５
０，６■）を加え、ｐＨを８に調節し、そして工時間抜
にシアノホウ水素化ナトリウム１当量を加えた。−夜か
くはんした後、溶液を２日間食塩水に対して透析した。

実施例２゜ モルヒネ（８６■）を、カリウムエトキサイドの１．０
Ｍエタノール溶’Ｑ０．３４５−で処理して、無水エタ
ノールｌ、３ｎＩｌに溶解した。ブロモ酢酸エチル（５
７，６Ｉｎ９）ヲ加え、混合物を窒素雰囲気下に７時間
室温でかくはんした。生成物をシリカゲル厚層プレート
でのクロマトグラフィーによシ精製し、２：１クロロホ
ルム：メタノールで展開すると透明なガラス体３９！ｎ
９が得られた。

実施例３゜ チル）エーテル塩酸塩 モルヒネ−３−エトキシカルボニルメチルエーテル（３
９■）を１０％パラジウム付き炭素１０Ｉｎ９上でエタ
ノール１５−および濃塩酸０．００９−中４０ｐｓｉの
初圧で水素添加した。２時間後、生成物を濾過して単離
し、そして溶媒を除去すると無色のガラス体４９ｒｎ９
が得られた。

実施例４゜ ７．８−ジヒドロモルヒネ−３−（エトキシカルボニル
メチル）エーテル（４９１１９）をメタノールｉ、ｏ−
に浴解し、そして新たに蒸留した１、２−ジアミノエタ
ン０．２０−を加えた。混合物を窒素雰囲気下に室温で
１６時間かくはんした。真空で揮発性物質を完全に除去
すると透明なガラス体５８■が得られ、このものは螢光
ラベルに複合するのに十分な純度を有していた。

実施例５゜ ル）エーテル ７．８−ジヒドロモルヒネ−３−１：（２−アミノエチ
ル）アミノ−カルボニルメチル〕エーテル塩酸［（１９
■）ヲメタノール０．７５−に溶解し、そしてジクロロ
トリアジニルアミノフルオレセイン（異性体Ｉｆ）２７
．９〜を加えた。

室温で３０時間かくはんした後、混合物をジメチルホル
ムアミド０．２０ｄで希釈しそして厚層シリカゲルクロ
マトグラフィープレートにすしをつけた。クロロホルム
−メタノール−酢酸で展開すると精製されたトレーサー
が得られた。

実施例６゜ ７．８−ジヒドロモルヒネからの７，８−ジヒドロモル
ヒフ、８−ジヒドロモルヒネ（１４４Ｉｎ９）およびカ
リウムｔ−ブトキサイド（６７１Ｖ）を静かに加温して
ジメチルホルムアミド（３Ａモレキユラー・シーブで乾
燥）２．５−に溶解した。溶液を冷却し、そしてブロモ
酢酸エチル１００ダを！ＸＪえた。混合物を窒素雰囲気
下室漉で２％時間かくはんし、氷酢酸０．００６−を加
えて急冷し、そしてロータリー・蒸発器で乾個した。残
渣をシリカゲル＃層プレートでりａマドグラフ処理し、
り０ロホルム／メタノール／酢酸で展開すると標記化合
物の酢酸塩１７０ｍりが得られた。

実施例７゜ ７．８−ジヒドロモルヒネ−３−カルボキシメチルニー
チク ７　、８−ジヒドロモルヒネ−３−（エトキシ力ルボニ
ルメチル）エーテルの酢酸塩（１６４！Ｎｉ）をメタノ
ール２ｍｌおよび水２１！Ｌｔに溶解し、そして２Ｍ水
酸化す）　ＩＪウム水溶液１−を加えた。溶液を室温で
窒素雰囲気下で５時間かくはんした。溶媒をロータリー
・蒸発器で除去した。残渣を３Ｍ塩酸水浴液１ｓｄＫと
シ、再び乾個すると生成物が塩酸塩として得られ、この
ものは塩化ナトリウムと混和しているが、他の点では薄
層クロマトグラフィーおよびＮＭＲスペクトルによシ本
質的に純粋であった。

実施例８゜ ７．８−ジヒドロモルヒネ−３−カルボキシメチル千−
テル塩酸塩（０，１ｙ＋ａモル（ミリモル）〕をジメチ
ルホルムアミド０．３ｄＫ溶解した。溶液を水浴で冷却
し、そしてトリエチルアミン０．０１４−およびクロロ
ギ酸エチル０．０１０５ｍ／を加えた。溶液を１ｈ時間
かくはんし、そし　　　　　−てその半量を室温で一夜
６−アミノフルオレセインと反応させた。生成物をシリ
カゲル薄層でのクロマトグラフィーにより精製し、クロ
ロホルム／メタノール／酢酸で展開し、次に第二のプレ
ートをクロロホルム／メタノールで展開した。

実施例９゜ モルヒネ−３−エトキシカルボニルメチルエーテル−Ｎ
−オキサイド モルヒネ−３−エトキシカルボニルメチルエーテル（５
９ｍ９）を３０％過酸化水素０．５−にとり、そして７
０℃の油浴で２０分間加熱した。揮発性物質を真空で除
去すると結晶性固体としてほとんど純粋な生成物６２〜
が残った。

実施例１０゜ モルヒネ−３−カルボキシメチルエーテル−Ｎ−オキサ
イド塩酸塩 モルヒネ−３−エトキシカルボニルメチルエーテル−Ｎ
−オキサイド（４０ｍ９）をメタノール１−および水１
−に溶解し、そして２Ｍ水酸化す）　ＩＪクム水浴液０
．２５−を加えた。混合物を室温で一夜かくはんし、そ
して溶媒をロータリー蒸発器で除いた。残渣な３Ｍ塩酸
水溶液０．３５−に再溶解し、そして再び乾個させると
標記化合物７２１１ｇが得られ、主要不純分として１′
算量２９■の塩化ナトリウムを伴っていた。

実施例１１゜ ル塩酸塩 モルヒネ−３−（３−アジドプロピル）エーテル（４６
，５η）を窒素下にメタノール０．５ａ／ｖＩｃ溶解し
、そしてトリエチルアミン５０．５■を加え、次いで１
．３−プロパンジチオール５４ａ５１を加えた。混合物
を周囲の温度で１６時間かくはんし、濾過し、そしてＦ
液を真空で濃縮した。残渣な６Ｍ塩酸で酸性化し、そし
てエーテルで抽出した。水性部分を真空で儂縮乾個する
と生成物が得られた。抽出に用いたエーテルを次に試験
すると過酸化物による顕微な汚染が判った。

実施例１２゜ １−クロロモルヒネ−３−（３−アミノプロピル）エー
テル（６ｒ−ｐ）および６−（＃−スクシンイミジルオ
キシカルボニル）フルオレセイン６．６〜を乾燥ピリジ
ン０．３ｍｌ中周囲の温度で２２時間かくはんした。反
応混合物をシリカゲルクロマトグラフィーブレー）［直
接すしをつけ、そして真空炉で乾燥した。プレートをク
ロロホルム／メタノールで展開し、そして所望の複合体
を含むバンドをメタノールで抽出した。

実施例１３゜ 一チル モルヒネ−３−（２−アジドエチル）エーテル（１４０
■）および１０％パラジウム付きカーボン３０＃Ｉ９を
エタノールおよび３Ｍ塩酸にとり、３気圧および周囲の
温度で１６時間水素添加した。反応混合物を濾過し、そ
して涙液をロータリー蒸発器で濃縮乾個した。残渣をシ
リカゲルでクロロホルム／メタノール／水酸化アンモニ
ウムＶｃヨＦ）／ロマトグラフを行った。−級アミンを
含むフラクションを合し、真空濃縮すると生成物が得ら
れた。

７．８−ジヒドロモルヒネ−３−（２−（フルオレセイ
ン５−カルボキシフルオレセイン（５，２５ｔｈ９）お
よびＮ−ヒドロキシスクシンイミド２ｍ９をジメチルホ
ルムアミド（０，３ｍ）中で混和した。ジシクロへキシ
ルカルボジイミド（２，２１ｋｇ）を加え、そして混合
物を周囲の温度で２時間かくはんした。７，８−ジヒド
ロモルヒネ−３−（２−７ミノエチル）エーテル（５，
３ｗ）およびピリジン２．１　Ｉｎ９を加え、そしてこ
の混合物を周囲の温度で４８時間かくはんした。反応混
合物をシリカゲルクロマトグラフプレートにすしをつけ
、そしてクロロホルム／メタノールで展開スると所望の
複合体が得られた。

実施例１５゜ 一チル ７．８−ジヒドロモルヒネ−３−（２−アミノエチル）
エーテル塩酸塩（５，３Ｍ９）および５−（ブロモアセ
トアミド）フルオレセイン９．４ｍｇをメタノール０．
３−プラスジメチルホルムアミド０．０８−中で混合し
、そしてトリエチルアミン９．７Ｉｎ９を加えた。反応
混合物を周囲の温度で１６時間かくはんし、そしてクロ
ロホルム／メタノール／酢酸でシリカゲルプレートでク
ロマトグラフを行うと所望の複合体が得られた。

実施例１６゜ １１’ロロモルヒネー３−　（３−アミノプロピル）エ
ーテル５．ＯＩｋｇ、５−（４，６−ジクロロ−１，３
，５−トリアジン−２−イルアミノ）フルオレセイン７
．５ダおよびトリエチルアミン６．７ｊＩｇをメタノー
ル中周囲の温度で１６時間かくはんした。反応混合物を
シリカゲルクロマトグラフプレートにすしをつけ、そし
てクロロホルム／メタノール／酢酸で展開すると所望の
複合体が得られた。

実施例１７゜ この化合物は実施例１６の方法に従って１−クロロモル
ヒネ−３−（３−アミノプロピル）エーテル６．０１１
９および６−　（４，６−ジクロロ−１，３，５４リア
ジン−２−イルアミノ）フルオレセイン７．５Ｉｎ９か
ら製造された。

実施例１８゜ セインー５−イルアミノ）−６−クロロ−１，３，５−
トこの化合物は実施例１６の方法に従って７．８−ジヒ
ドロモルヒネ−３−（２−アミノエチル）エーテル塩酸
塩５．３ｒＩ＆９．５・−（４，６−ジク００−１．３
．５−）リアジン−２−イルアミノ）フルオレセイン７
．５■およびトリエチルアミン９．７■から製造された
。

実施例１９゜ この化合物は実施例１６の方法に従って７，８−ジヒド
ロモルヒネ−３−（２−アミノエチル）エーテル塩酸塩
５．３Ｉｎ９．６−　（４，６−ジクｏｏ−１，３，５
−）リアジン−２−イルアミノ）フルオレセイン７．５
■およびトリエチルアミン９．７Ｉｎ９から製造された
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中αおよびα′の一方は水素であり、そして他方が
   ヒドロキシであるか、あるいは両方が一緒になつて＝Ｏ
   （ケトン）を形成し；βおよびβ′は共に水素であるか
   、あるいは両方が一緒になつてそれらが結合している炭
   素原子に結合している結合を形成し；そしてα″を水素
   またはヒドロキシである〕を有する化合物。 ２、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中αおよびα′の一方は水素であり、そして他方が
   ヒドロキシであるか、あるいは両方が一緒になつて＝Ｏ
   （ケトン）を形成し；βおよびβ″は共に水素であるか
   、あるいは両方が一緒になつてそれらが結合している炭
   素原子に結合している結合を形成し；そしてα″は水素
   またはヒドロキシである〕を有するアヘンアルカロイド
   のグルクロナイド複合体を水溶性過ヨウ素酸塩で酸化し
   、このようにして形成されたアルデヒド化合物を免疫原
   担体物質例えば蛋白質または合成ポリペプチド上の一級
   アルキルアミンと反応させ、そして得られた縮合生成物
   をホウ水素化物試薬例えばホウ水素化ナトリウムまたは
   シアノホウ水素化ナトリウムで還元する各工程からなる
   ことを特徴とする免疫原の製法。 ３、構造式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中αおよびα′の一方は水素であり、そして他方が
   ヒドロキシであるか、あるいは両方が一緒になつて＝Ｏ
   （ケトン）を形成し；βおよびβ′は共に水素であるか
   、あるいは両方が一緒になつてそれらが結合している炭
   素原子に結合している結合を形成し；そしてα″は水素
   またはヒドロキシである〕を有するアヘンアルカロイド
   のグルクロナイド複合体を水溶性過ヨウ素酸塩で酸化し
   、このようにして形成されたアルデヒド化合物を免疫原
   担体物質例えば蛋白質または合成ポリペプチド上の一級
   アルキルアミンと反応させ、そして得られた縮合生成物
   をホウ水素化物試薬で還元することによつて得た免疫原
   に反応して製造された抗体。 ４、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＸおよびＹの一方が水素であり、そして他方が
   水素、フッ素、塩素、臭素、シアノまたはＣ＿１−Ｃ＿
   ３アルキルであり； Ｚが▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学
   式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等がありま
   す▼または▲数式、化学式、表等があります▼であり； Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であり
   、Ｒは、０−２０個の炭素原子および（１２個以下のヘ
   テロ原子を包含する）ヘテロ原子からなり、かつ直鎖ま
   たは有枝鎖に配置され、そして２個までの環構造を含有
   する結合基であり、但し４個以下のヘテロ原子が順に結
   合されていてもよいが、２個以上の硫黄または２個の窒
   素または１個の酸素が順に結合されていない； Ｅは非結合性電子対、酸素原子またはメチルであり；α
   およびα′は共に水素であるか、またはそれらの一方が
   水素であり、また他方がヒドロキシ、メチルまたはフル
   オロであり、あるいは両方が一緒になつて＝Ｏ（ケトン
   ）を形成してもよい； α″は水素またはヒドロキシであり；そしてβおよびβ
   ′は共に水素であるかまたは両方が一緒になつてそれら
   が結合している２個の炭素原子を結合する結合を形成し
   ていてもよく、但しαがＨであり、α′がＯＨであり、
   Ｅが電子対であり、そしてα″、ＸおよびＹがいずれも
   水素である場合βおよびβ′は結合を形成していない〕
   を有する化合物。 ５、α、α″、β、β′、ＸおよびＹが水素であり、α
   ′がヒドロキシであり、そして−Ｒ−Ｚ−Ｑが ▲数式、化学式、表等があります▼ である特許請求の範囲第４項記載の化合物。 ６、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、 ＸおよびＹの一方は水素であり、そして他方は水素、フ
   ッ素、塩素、臭素、シアノまたはＣ＿１−Ｃ＿３アルキ
   ルであり；Ｚは結合官能基例えば▲数式、化学式、表等
   があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲
   数式、化学式、表等があります▼または−Ｓ−であり； Ｑは水素、ヒドロキシまたは脱離基であり；Ｅは非結合
   性電子対、酸素原子またはメチルであり；αおよびα′
   は共に水素であるか、またはそれらの一方が水素であり
   、また他方がヒドロキシ、メチルまたはフルオロであり
   、または両方が一緒になつて＝Ｏ（ケトン）を形成し； α″は水素またはヒドロキシであり；そしてβおよびβ
   ′は共に水素であるか、または両方が一緒になつてそれ
   らが結合している２個の炭素原子を結合する結合を形成
   し、但しαがＨであり、α′がＯＨであり、Ｅが電子対
   であり、そしてα″、ＸおよびＹがいずれも水素である
   場合βおよびβ′は結合を形成していない〕を有する化
   合物。 ７、構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、 ＸおよびＹの一方は水素であり、そして他方は水素、フ
   ッ素、塩素、臭素、シアノまたはＣ＿１−Ｃ＿３アルキ
   ルであり；Ｚは結合官能基例えば▲数式、化学式、表等
   があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、▲
   数式、化学式、表等があります▼または−Ｓ−であり； Ｑは水素、ヒドロキシまたは脱離基であり；Ｅは非結合
   性電子対、酸素原子またはメチルであり；αおよびα′
   は共に水素であるか、またはそれらの一方が水素であり
   、また他方がヒドロキシ、メチルまたはフルオロであり
   、または両方が一緒になつて＝Ｏ（ケトン）を形成し； α″は水素またはヒドロキシであり；そしてβおよびβ
   ′は共に水素であるか、または両方が一緒になつてそれ
   らが結合している２個の炭素原子を結合する結合を形成
   し、但しαがＨであり、α′がＯＨであり、Ｅが電子対
   であり、そしてα″、ＸおよびＹがいずれも水素である
   場合βおよびβ′は結合を形成していない〕を有する化
   合物をフルオレセインまたはフルオレセインの誘導体と
   カップリングさせる方法による螢光トレーサー化合物の
   製造方法。 ８、アヘンアルカロイドまたはそれらの代謝物を検定す
   る方法において、 ａ）試料を、アヘンアルカロイドに対する抗血清および
   アヘン抗血清の存在下に検知可能な螢光偏光反応を生じ
   得る構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＸおよびＹの一方が水素であり、そして他方が
   水素、フッ素、塩素、臭素、シアノまたはＣ＿１−Ｃ＿
   ３アルキルであり； Ｚが▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学
   式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等がありま
   す▼または▲数式、化学式、表等があります▼であり； Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体であり
   、Ｒは、０−２０個の炭素原子および（１２個以下のヘ
   テロ原子を包含する）ヘテロ原子からなり、かつ直鎖ま
   たは有枝鎖に配列され、そして２個までの環構造を含有
   する結合基であり、但し４個以下のヘテロ原子が順に結
   合されていてもよいが、２個以上の硫黄または２個の窒
   素または１個の酸素が順に結合されていない； Ｅは非結合性電子対、酸素原子またはメチルであり；α
   およびα′は共に水素であるか、またはそれらの両方が
   水素であり、また他方がヒドロキシ、メチルまたはフル
   オロであり、あるいは両方が一緒になつて＝Ｏ（ケトン
   ）を形成してもよい； α″は水素またはヒドロキシであり；そしてβおよびβ
   ′は共に水素であるかまたは両方が一緒になつてそれら
   が結合している２個の炭素原子を結合する結合を形成し
   ていてもよく、但しαがＨであり、α′がＯＨであり、
   Ｅが電子対であり、そしてα″、ＸおよびＹがいずれも
   水素である場合βおよびβ′は結合を形成していない〕
   を有する化合物、と接触させ； ｂ）工程（ａ）から得られる溶液に平面偏光を通して螢
   光偏光反応を得て；そして ｃ）工程（ｂ）の溶液の螢光偏光反応を試料中のアヘン
   アルカロイドの存在あるいは量の指標として検知する各
   工程からなることを特徴とする上記の方法。 ９、工程（ａ）において、試料を更にリボフラビン結合
   性蛋白質と接触させる特許請求の範囲第８項記載の方法
   。