JPS6325555A - アミノ酸配列の決定法および該方法に用いられる装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、ポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配
列の決定法、並びにその様な決定を行うための装置に関
するものである。

タンパク質の配列分析に最も広範に用いられでいる方法
は、アミノ酸残基の連続除去に係るエドマン（Ｅｄｍａ
ｎ　）分解法である。この方法は、２段階からなる化学
的工程により、ペプチドのＮ末端からアミノ酸を除去す
ることからなる。アミノ酸１個を開裂するための操作を
以下に示す。

第１段階では＃活性化剤（グループ〕（カップリング剤
と称され、上記のダイアグラムではフェニルイソチオシ
アネートで例示される）が、配列決定されるべきポリペ
プチドのＮ末端アミノ酸の遊離アミン基に結合する。こ
の段階はカップリングと称され、高いｐＨ（ｐＨ８〜９
）値の、カップリング塩基を含有するバッファー中で行
われる。エドマン法では、通常、カップリング剤として
フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）を用０る。メ
チルインチオシアネートやペンタフルオロフェニルイソ
チオシアネート等の他の試薬も用いられた例がある（１
．２）。カップリング反応の機能は、第１番目と第２番
目の残基間のペプチド結合が、タンパク質中の他のペプ
チド結合よりも酸加水分解を受は易くなる様にすること
にある。

第２段階では、過剰のカップリング剤とバッファーを除
去した後、開裂剤（無水の酸）を加えて活性化されたペ
プチド結合を加水分解する。次に、適当な有機溶媒で、
開裂されたアミノ酸誘導体を抽出することができる。以
後のサイクルのために、新らしく形成されたＮ末端を有
する残余のペプチドはそのまま残される。抽出された誘
導体は構造中にアミノ酸を含有しているので、第１番目
のＮ末端アミノ残基を同定するための情報を含んで０）
る。側鎖（Ｒ１）に基づθ）で誘導体を２０程度Ｉこ区
別することにより、各開裂反応の後に得られた誘導体を
同定し、アミノ酸を確認することができる。

理想的には、この工程を繰返し行えば、各残基を逐次、
同定することができる。しかしながら、カップリング反
応と開裂反応の収率は決して１００にではないことから
、反復的な化学反応を無制限に行うことは実際にはでき
ない。カップリングしたＮ末端ペプチド結合は他の結合
よりも酸加水分解を受は易いが、無作為な開裂も起こり
得るし、また、起きで０）る。

エドマン法は、アミノ酸配列決定の手技法並びに自動化
法に用いられている。

手技法は、タンパク質の小部分に係る小ざいペプチドの
アミノ酸配列を決定する場合、あるいは、自動配列決定
装置（ａｕｔｏｍａｔｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　）の
費用が折合わない場合に最もよ（用いられる。そのよう
な方法は多数報告されている（３．５）。

大多数の方法では、まず最初、タンパク質またはペプチ
ドを細長い紙片（ペーパースｌ−ＩＪツブ）等の支持体
に適用する。試料が乾燥した後、固定化ペプチドに溶媒
−バッファー系（例えばジオキサンマタはビ□リジン等
）を適用する。カップリング反応は４０〜５０’Ｃにお
いて数時間で完了し得る。

この段階では、Ｎ末端が副反応によって遮断（ブロック
）されることを避けるため蛋こ酸素を排除しておくこと
が重要である。カップリング反応が終了した後、過剰の
試薬（ＰＩＴＣ等）と副生成物（即ち、ジフェニルチオ
ウレア）とを、ＰＴＣ（フェニルチオカルバミル）ペプ
チドを損失させない様に除去する。この段階Ｉこ用いる
幾つかの溶媒Ａ　が示唆されている（例、ベンゼン、ア
ルコール−エーテル）（６）。これらの副産物のベンゼ
ンによる単独抽出は、その速度は遅いがカップリングし
たペプチドを除去してしまうことはない。酢酸エチルま
たはアルコール−エーテル混合物による抽出は、副産物
°を除去する点でより好ましいが、疎水性の小さいペプ
チドをも抽出してしまうかもしれない。

最初の洗浄の後、ＰＴＣ−ペプチドをチアゾリノンアミ
ノ酸と遊離のペプチドに開裂する。内在性のペプチド結
合の開裂は水性条件下で起こると思われるので（７）、
大多数の方法は、トリフルオロ酢酸やヘプタフルオロ酪
酸等の無水の酸を必要としている。この段階の反応の間
、カップリング反応の場合よりも低温で反応させると共
；こ、試料室（容器）中の水を排除する。プロリル残基
またはグリシル残基の場合、カップリングしている残基
の開裂が困難であるため、より高い温度またはより長い
反応時間を必要とするかもしれない。この時点で過度に
激しい加水分解条件を用いると内在性ペプチド結合の擬
似開裂が起こり得る。

最終段階では、２−アニリノ−ｔ−チアゾリノン・アミ
ノ酸（ＡＴＺ）をベンゼンおよび酢酸エチルで抽出する
。Ａ　Ｔ　Ａ　−ＡｒｇおよびＡＴＺ−Ｈｉｓ以外の大
多数のアミノ酸誘導体は定量的；こ相移動する。酢酸エ
チルル独実用はＡ　Ｔ　Ａ　−ＡｒｇおよびＡＴＺ−Ｈ
ｉｓを抽出する１こはより好ましいが、疎水性の小ペプ
チドも抽出されてしまう。減圧乾燥して痕跡量の水と開
裂剤である酸とが除去されるなら、アセトンは中間的な
物質として満足し得るものである。抽出されたＡＴＺ−
アミノ酸は不安定であり、水性加水分解番こよって安定
なＰＴＨ（３−フェニル−２−チオヒダントイン）形）
こ転換しなければならない。それにはエドマンの方法が
一般的に用いられている。転換反応は、チアゾリノンが
加水分解されてＰＴＣ−アミノ酸中間体となり、これが
転移してＰＴＨになる反応である。

ベンゼン／酢酸エチル抽出物を窒素気流中で蒸発乾固し
た後、希塩酸に溶かす。素早く温度を８０℃；こして１
０分間維持した後、降温させる。溶液を乾燥した後、少
量のバッファーに溶かし、その後、ＰＴＨ−アミノ酸誘
導体を分析する。

一般に、アミノ酸配列決定は、その目的のために考えら
れた器具を用い、自動的に行われる。その様な自動化法
に用いられる化学反応は、手技法におけるそれと基本的
］こは同様である。現在の自動シーケンサ−（配列決定
装置）は、液相（スピニング・カップ、ｓｐｉｎｎｉｎ
ｇ　ｃｕｐ）法または気相法に基いて考案されている。

液相装置の場合には、回転する反応カップの内壁にタン
パク質試料を薄膜状にのばす。反応カップの底に入れた
エドマン試薬が遠心力でタンパク質の膜上に押し上げら
れる間、このタンパク質は固定化されている。カップ上
部の周囲の溝に突出した液をすくい出すことで、液をカ
ップの頂部かむ除去する。

スピニング・カップ・シーケンサ−に関する記載は、エ
ドマンおよびベツグ（Ｂｅｇｇ）の原文献にみられる（
７）。その様なシーケンサ−を操作する際昼こは回転中
のカップ１こ試料溶液を入れ、減圧乾燥してカップの下
方堅固１こ薄膜を形成させる。試料サイズは通常、適当
な溶媒約５００μｇ中に試料を１００〜３００ｎｍｏｌ
溶かしたものである。

試料が乾燥した後、自動分析サイクルを開始する。

第１段階は、回転反応カップへのカップリング試薬（ヘ
プタン中５％ＰＩＴＣ）とバッファーの導入である。通
常、バッファーには、カップリング反応に必ｆ、　ｆｌ
　ｐ　）（を維持するため；こＮ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−
アリルアミン（ＤＭＡＡ）が含有されている。ＤＭＡＡ
と界面活性剤とを含有してし）る好適なバッファーは、
登録商標クアドロール（Ｑｕａｄｒｏｌ　）として市販
されている。このカップリング混合物はタンパク質膜上
に拡散され、それを溶かす。続いて５５℃で約２０分間
反応させる。

減圧下、ＰＩＴＣと溶媒を部分的に除去した後、ベンゼ
ンを加えてカップリング反応を止める。ベンゼンにより
、タンパク質が沈降し、過剰のＰＩＴＣ試薬と、幾らか
のＰＩＴＣ分解産物が除去される。バッファーとしてク
アドロールを用いる場合、過剰のバッファーと、より多
くの分解帝物を除くため番こカップを酢酸エチルで洗浄
する。減圧乾燥後、タンパク質はカップ内に白色フィル
ム状１こ残存する。

開裂反応の開始］こあたり、無水へブタフルオロ酪酸（
ＨＦ　Ｂ　Ａ　）を加える。揮発性のＨＦＢＦはタンパ
ク質フィルムを被い、これを溶解し５僅か２〜３分後に
、Ｎ末端アミノ酸をアニリンチオアゾリノン誘導体とし
て開裂する。最後に、残存するＨＦＢＦを減圧下に除き
、遊離されたＡＴＺ−アミノ酸を塩化ブチルで抽出し、
フラクションコレクターにとる。上記工程の各サイクル
毎に、新らしい残基がフラクションコレクター中）こ放
出される。

収集されたＡＴＺ−アミノ酸のフラクションはペプチド
またはタンパク質試料を構成しているアミノ酸残基の配
列順序を表わしている。このフラクションを、より安定
なＰＴＨ−アミノ酸産物に転換することができる。この
溶液を８０℃において、１．０ＭＨＣｌ　中で１０分間
、あるいは、６０℃において、２５％ＴＦＡ（１−ＩＪ
フルオロ酢酸）／水中で１０分間加熱する。加熱を終了
した後、Ｐ　Ｔ　Ｈ−ＡｒｇおよびＰＴＨ−Ｈｉｓｉｌ
外の全ＰＴＨ−アミノ酸誘導体を酢酸エチルで抽出する
ことができる。この場合、２相の分離を必要としない液
体りａマドグラフィー分析が朗利である。即ちこの方法
によれば存在する全ＰＴＨ−アミノ酸を単一の注入で測
定することができる。通常、クロマトグラフィーに先立
ち、フラクションを低温で乾燥してプレ（予備）濃縮す
る。

このスピニング・カップ・シーケンサ−は、正確にカリ
プレート（検定）された量の試薬を用いる必要があり、
さもないと、連続的な沈殿と再溶解の間中、持続的に循
還していなければならないタンパク質がカップから簡単
１こ洗い流され、タンパク質の損失と変性をもたらすこ
ととなり、さらには、被検試料の沈殿を助けるためにポ
リブレン（Ｐｏ１ｙｂｒｅｎｅ　）またはブロックされ
たタンパク質の如きエキステンダー（増容剤）の必要な
場合が多いという不利な点を有している。タンパク質性
のエキステンダーの使用は、それがエドマン分解のサイ
クル中にしばしば加水分解されるので不都合を招く。こ
うして加水分解されたエキステンダーには、被検試料と
一緒に配列決定される遊離のアミ／末端が含まれている
ことから、測定を妨害する残基が導入されることになる
。

自動化固相シーケンサ−は、固体支持物質］こペプチド
を共有結合約８こ結合させて固定化することと、溶解−
沈殿サイクルを行わないことを除き、液相系と概ね同様
薔こエドマン分解を行うことからなる。試薬および溶媒
を、必要に応じて、結合ペプチドのカラムに方向を定め
ることなくポンプ注入する。、この型のシーケンサ−で
は、試料ペプチドが最初に、共有結合的１こ支持物質１
こ結合する必要がある。この操作を行うための方法は、
既に幾つか報告されている。最も信頼できるカップリン
グ法はリジンのε−アミノ基Ｑ■またはホモセリンのＣ
末端（１５１を用いる方法である。通常、カップリング
の収率は約８０％にも達するが、ペプチドはリジンまた
はＣ末端のカルボキシル基を含有していなければならな
い。共有結合的なカップリング）こ通常用いられる２つ
のタイプの支持体はポリスチレンａηと多孔性ガラス０
３）である。両者共、機能的な基による置換率が高く、
配列決定番こ用いられる試薬や溶媒１こ対して不活性で
ある。リジン含有小ペプチドの場合は一役１こ、ジイソ
チオシアネートカップリング法によりアミノポリスチレ
ンと結合させる。リジン不含ペプチドの場合は、カルボ
キシル活性化によりトリエチレンテトラミン樹脂を結合
させる。大きいペプチドおよびタンパク質の場合は、ジ
インチオシアネートで活性化した後。

アミノガラス支持体；こ固定化する（１８）。

・ベグ６敷下１を結合させた後、樹脂を洗浄し、小さい
ガラス製カラムに充填する。次いで、反応カラムをシー
ケンサ−内の加熱されたホールダー（支持部分）に置く
。この時点から、同相装置における化学工程は、共有結
合的１こ結合しているペプチドの洗浄による流失を懸念
することなく、広範囲に及ぶ試薬、バッファーおよび溶
媒をカラムに通すことができることを除いて、手技法お
よびスピニング・カップ法における工程と殆んど同様の
工程に従う。日常的に用いられる固相配列決定法Ｇこお
ける試薬口は、ＰＩＴＣ（アセトニトリル中５Ｖ／Ｖ％
）、ピリジン二Ｎ−メチルモルホリニウムトリフルオロ
アセテート・バッファー（２：３Ｖ／Ｖ）　、およびト
リフルオロ酢酸である。二基ｆヒエチレンおよびメタノ
ールは溶媒として用いられる。ＡＴＺ−アミノ酸画分を
フラクションコレクターで集め、次いで、上記の如く手
技的または自動的にＰＴＨ−アミノ酸誘導体に転換する
。

被検タンパク質の共有結合による固定化を利用する固相
シーケンサ−は商業上、広範囲）こ普及されていない。

このことは、主に、共有結合による固定化が、各ポリペ
プチドに特殊な条件を要求し、タンパク質の損失を招く
という特性に起因している。

気相シーケンサ−は、予め固定化された（ｐｒｅｉｍｍ
ｏｂｉｌｉｚｅｄ）タンパク質を用いる点で固相シーケ
ンサ−と関連している。しかしながら、共有結合瘉こよ
る固定化によってペプチドの損失を回避するのではなく
、ガス状のアルカリ性バッファーカップリン剤の使用に
より、非共有結合的に吸着されたポリペプチドの溶出を
防止している。この気相シーケンサ−は商業上かなりの
成功を収め、スピニングカップ・シーケンサ−および固
相シーケンサ−にとって代わるものである。

気相シーケンサ−の初期の型のものは米国特許４．０６
５，４１２に記載されている。この特許出願に記載のシ
ステムに基づく市販のシーケンサ−は、アプライドバイ
オシステム（Ａｐｐ　ｌ　ｉ　ｅｄ　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ　）（フォースター市、カリフォルニア）から販
売されている。このシステムにおいて、タンパク質また
はペプチドはタンパク質エキステンダー（ポリブレン）
含有ガラスファイバーディスク］こ非共有結合的＋ｃ沈
着（デポジット）シている。タンパク質およびエキステ
ンダーは、小さいガラス容器１こ入れたガラスファイバ
ーディスク内１こ固定されたフィルム（膜）を形成して
いる。気体および液体状のエドマン試薬は容器頂部の小
さい開口部から入り、底部から流出する。

カップリング試薬はペプチドを追い出さないと考えられ
る有機溶媒（ヘプタン）１こ添加されている。カップリ
ング反応は、カップリング試薬の溶液でガラスディスク
の全面を湿らせ、有機溶媒を乾燥除去した後に起きる。

この反応はガス状のカップリング塩基、トリメチルアミ
ン（ＴＭＡ）を導くこと１こより開始される。カップリ
ン塩基と水蒸気との蒸気流によりタンパク質フィルムの
ｐＨ値が高くなる。スピニングカップ・シーケンサ−と
は対照的に、試料容器（室）は小さく、単純である。液
体状のバッファー溶液を用いないので、ある種のペプチ
ドは共有結合的な結合なしに配列決定され得る。しかし
ながら、この方法では、カップリング試薬を有機溶媒；
こ加えねばならず、また、別個の工程でカップリング塩
基を導入しなければならない。その上、ガス状のカップ
リング塩基を用いる場合には、液状バッファー溶液を用
いる場合はど容易１こ反応をコントロールできないとい
う不都合かある。溶液中での至適ｐＨは約９．０である
。ｐＨ９，５［上になると、カップリング試薬は急速）
こ水と反応し始め、副生成物（アニリドおよびジフェニ
ルチオウレア）を形成する。より高いｐＨ値では、前記
米国特許４，０６５，４１２＋こ記載の如く、ペプチド
またはタンパク質の分解が問題となってくる。反応物表
面のｐＨを効率良くコントロールするためには、気相の
流速、並びにガス雰囲気中の塩基（例、Ｔ　Ｍ　Ａ　）
の濃度を正確１こコントロールする必要がある。流速お
よび濃度の正確なコントロールが必要とされることは、
結果的に、高度１こ熟練したオペレーターを要する。

複雑かつ高価な器具を与えることになる。各試薬成分の
正確なカリブレーションを確保するため）こは、装置全
体の温度コントロールが必要とされる。

また、この気相システム１こは、タンパク質を小さいガ
ラスディスク上に保持するため］こポリブレン１〜２〜
を用いなければならないという問題点がある。即ち、ポ
リブレンは副生産物をも効率良く保持するという不都合
をもたらす。ポリブレンを用いず１こ、気相シーケンサ
−で、共有結合的番こ結合したペプチドの配列決定を行
うと副生産物のピークが非常に少くなったという報告が
ある（１９）。

幾つかのアミノ酸誘導体の同定が、大量の副生産物ピー
クによって不明瞭になる。

また、存在しているにしても極く少量の水性溶媒の存在
下、気相シーケンサ−を用いて反応させる場合の問題点
は、被検試料から生成した安全の塩頌、尿素等の変性剤
、あるいはバッファーイオンがＮ末端残基のα−アミ７
基の反応を妨げる、あるいは、同定または不要の副産物
の洗浄を目的とするアミノ酸誘導体の溶媒抽出を干渉し
得るということにある。

さらにまた、気相シーケンサ−には、カップリング反応
完Ｔ後、残存する水蒸気を全て、不活性ガスにより乾燥
除去しなければならないという欠点がある。次いで、デ
ィスク支持容器に有機溶媒を流して副産物を除去する。

この溶媒の流速を、固定化されたタンパク質が溶解また
は離脱しないよつＨこ、正確にコントロールすることが
重要である。この溶媒流の方向は一方向であり、工程中
番こはフィルム再形成工程が含まれていないので、溶解
したペプチドは全て洗液と共に流失されること番こなる
。

長い間、アミノ酸配列決定の被検試料を調製する際には
、通常、透析膜または高速液体クロマトグラフィーを用
いてポリペプチドを相互昏こ分離するか、あるいは、不
純物から分離する方法がとられていた。しかしながら、
その様な工程はアミノ酸配列決定１こ用いる器具には導
入されていず、実際、これらの工程は試料の損失を招く
ために、好ましくないと考えられている。

発明の目的 本発明は、従来のシーケンサ−よりも経費が少くてすみ
、精密にカリプレートされた流体または気体供給システ
ム、さらには完壁な温度コントロールを必要としないシ
ーケンサ−を提供することを目的とするものである。

また本発明は、従来のシーケンサ−システムよりも使用
が簡単であり、その操作に熟練者を要しないシーケンサ
−を提供することを目的とするものである。

また本発明は、従来のシーケンサ−によって得られた繰
り返し収率よりも高い値（％）が得られるので、従来の
システムよりも多数回（サイクル）使用することのでき
るシーケンサ−を提供することを目的とするものである
。

また本発明は、予め精製されていない、不純物を含有す
るペプチドを用いることができるシーケンサ−を提供す
ることを目的とするものである。

このことにより、従来のシーケンサ−の場合に行ってい
た試料の調製および回収工程におけるタンパク質の損失
を避けることができる。これは、試料調製とシーケンサ
−の操作とを組み合わせた本発明の工程を通して、アミ
ノ酸配列を得るために必要なポリペプチドがはるかに少
量ですむことを意味する。

また本発明は、エドマン反応の反応条件およびエドマン
試薬を適切１こ選択すること１こより、市販の気相シー
ケンサ−の場合よりも、サイクル時間を実質上短縮し、
また正確１こカップリング反応をコントロールすること
ができるシステムを提供することを目的とするものであ
る。

また本発明は、安価な複数カラムシーケンサ−内で配列
決定の化学反応を行い、複数の被検試料番こついて同時
にアミノ酸配列決定を行うことができるシステムを提供
すること、即ち１本発明は、配列決定装置内での流体伝
達耐性（ｆｌｕｉｄ　ｄｅｌｉｖｅｒｙｔ　ｏｌｅｒａ
ｎｃｅｓ）の低い安価なターレットバルブを用い得るよ
うにすることを目的とするものである。

また本発明は、ポリペプチドが水性試薬］こ不溶；こな
る程、変性または修飾されることがないアミノ酸配列決
定のためのシステムを提供することを目的とするもので
ある。ペプチドが自由に水と会合し得る状態であると、
アミノ末端が不溶性のマトリックスに折りたたまれ難い
ので、配列決定用試薬が近付き堆くなるおそれがなく、
より正確に配列決定を行うことができる。

また本発明は、ポリブレン等のタンパク質エキステンダ
ーを用いることに付随する経費と作業の困難さを解消す
ることを目的とするものである。

また本発明は、アミノ酸配列決定；こ関する反応の間、
温度コントロール上の利点を充分に認識し得るようなア
ミノ酸配列決定装置を提供することを目的とするもので
ある。

また本発明は、使用上の簡（資）性と容易性のため暮こ
、置換可能な試料室カセットを有するアミノ酸シーケン
サ−を提供することを目的とするものである。

本発明のその他の目的および特徴は添付の図面との関係
において、以下の記載から明らかになるであろう。

発明の要約 これら本発明の目的は、アミノ酸の配列決定システム中
でのポリペプチド被検試料の取り扱い方法を革命的に変
化させることにより達成された。

従来技術においては、試料室からのタンパク質のウォッ
シュ・アウト（流失）に基く損失を防ぐために、少くと
も一部の処理間、即ち、液状のエドマン試薬を用いる処
理工程の期間中は、被検試料を堅固に固定化することが
必須であると考えられてきたが、本出願人は、被検試料
を事実上、シーケンサ−の試料室内で自由１こ移動させ
ておき、その内部に固定または沈殿しないようにすると
、多大の利益が得られるということを認め、本発明を完
成するに至った。本出願人は、従来の液相シーケンサ−
１こ２つの重要な変更を施すことにより、さもなくば固
定化されていないポリペプチド昼こ伴う試料の流失を回
避すること；こ成功した。まず、本発明の改良シーケン
サ−は試料室内の流れを多方向に変えることができる。

この結果、試料室の相対するポート（口部）から試薬を
連続的１こ導入し、そのことにより、１つの溶媒と一緒
に１方向に試料を移動させ、他の溶媒と一緒に反対方向
に移動させることができる。

第２に、本発明の好ましい態様のシーケンサ−は、試料
室に、室内の溶媒流路に−列（タンデム）に複数の、異
るポリペプチド吸着剤を配列させたものを含有している
。吸着剤は、第１の吸着剤と溶媒との間のポリペプチド
試料の分配率が、第２の吸着剤と同じ溶媒との間の分配
率と異るように選択される。このことは、特定の溶媒で
試料室を溶離したとき、特定のポリペプチドの、試料室
内での（そして、タンデムな吸着剤の間での）１方向へ
の移動速度が他方向への移動速度よりも遅くなることを
意味する。この現象と、上記の多方向性の液流に関する
態様とが相まって、水溶性タンパク質が室ポート間でつ
り合っている室内のあるバンドに集中する。即ち、水溶
性タンパク質は、配列決定用試薬の導入につれて室内を
あちらこちらに移動するが１反対の性質を有する複数の
吸着剤の使用と、多方向性の流れにより、室からの流失
が妨げられる。

本発明の好ましい態様は、（ａ）流体流路を形成し、該
流路に沿って第１ポートおよび第２ポートを有するフロ
ースルー試料室、（ｂ）該試料室の流路内に配置された
、クロマトグラフィー用の媒体。

および（ｃ）該第１および第２ポートから交互に流体試
薬を連続的に導入する手段であって、流体試薬を、該ク
ロマトグラフィー用媒体の流路を連続的に反対方向に向
って通過させる導入手段、を含むペプチドのシーケンサ
−を提供するものである。

本発明の好ましい態様では、試料室内１こ試料ポリペプ
チドの同相・溶媒分配特性が異る別個の吸着剤がタンデ
ムに配されている。このことと５上記の多方向性の流れ
とを併用すること；こより、ポリペプチドを試料室内１
こ止まらせておく。

好ましＧ、）クロマトグラフィー媒体に；ま、クロマト
グラフィー特性の異る、２種の別個のクロマトグラフィ
ー媒体セグメント（最適品：１方が親水性で他方が疎水
性）をタンデムに配置したものが含まれる。− 本発明の好都合なシーケンサ−は、第１ポートおよび第
２ポートを有する室であって、該室内の流体流路内昏こ
不連続な複数の吸着剤、好ましくはクロマトグラフィー
用樹脂がタンデムに配されている室内で配列決定反応を
行うことを特徴とするものである。

代表的な方法においては、水溶性ペプチドをクロマトグ
ラフィー用媒体に沈着させ、セグメント間の界面へ移動
させる。次いで試料を第１方向に流れるカップリング試
薬およびカップリング塩基と接触させ、カップリング試
薬をペプチドとコンジュゲート（複合体形成）させる。

次いで、洗浄溶媒液を実質上反対方向に流し、未反応の
カップリング試薬と不純物とを除去する。しかる後、開
裂試薬を反応混合物中、第１方向に流し、カップリング
したペプチドからアミノ酸誘導体を開裂させる。次蚤こ
、試料室内を第２方向に向けて抽出溶媒液を流し、開裂
したアミノ酸を抽出して取り出すが、他方、残余ペプチ
ドはクロマトグラフィー媒体中に止まらせる。上記の液
体による溶離工程はすべて、ポリペプチドが関連する溶
媒）こついて、移動速度の「速い」樹脂から「遅い」樹
脂へと移行するよう、その流れの方向を選択する。「速
い」樹脂とは、溶媒相へのポリペプチドの分配率がより
大きいために、同じ溶媒内で、ポリペプチドに対する親
和性がより大きい「遅い」樹脂と比べてポリペプチドの
樹脂間での移動速度をより速くする樹脂を指す。次いで
、アミノ酸誘導体を得て分析し、この操作を逐次、アミ
ノ酸誘導体に繰返して行う。可逆的液流により、試料室
で、移動性等電点クロマトグラフィーが行われることと
なる。

第１図は本発明装置（ご用いられる二方向性フロー、二
相性樹脂シーケンサ−の模式図である。

第２ａ〜２ｅ図は、エドマンの配列決定法に従い、本発
明の装置を用いて実施される工程の説明図である。

第３図は本発明のシーケンサ−１こ用いられる、好まし
いカセット試料室またはカートリッジ試料室の対称的な
端部の断面図である。

本発明の好ましい実施態様の詳細な説明本発明は総体的
；こ、末端アミノ酸とのカップリングおよび生成したア
ミノ酸誘導体の開裂からなるサイクルを繰り返し行うこ
とによりタンパク質またはペプチドの配列を決定するこ
とに関するものである。記載を簡単にするために、ペプ
チドという語句は試料物質としてのペプチドおよびタン
パク質両者を包含するものとする。本発明は特に、発明
の背最；こ関する記載中で述べた塩基性エドマン法に適
用されるものである。本出願の方法はこの方法を引用し
ている。しかしながら、適当な修飾を施せば、同様の機
能的な工程を含む池の配列決定法にも本発明の方法を適
用し得ることは理解されるであろう。

本発明の好適なシーケンサ−の実施例を第１図に従って
説明する。ペプチド等を含有している水性試料溶液をシ
リンジ１０１こよりライン１２ａを経て、ライン１２へ
と適宜供給し、フロースルー（通り抜け）試料室１４へ
手技的；こ充填するか。

あるいは室１４の１方の端に設けられたポート１６から
流し込む。室１４は細長い、光透過性のフロースルーカ
ラムであることが好ましい（例、ガラス製）。室の総容
積は変化されるが、通常、乾燥したがラスビーズ２０〜
４０１ｆｔ９を含有する、約。

２０ｍｅであることが好ましい。室１４にはクロマトグ
ラフィー用の媒体（メディアム）１８が入っており、こ
の媒体１８は、少くとも、カラムの流路に沿い、流体に
よって互い１こ連係されている媒体であって、そのクロ
マトグラフィー特性において明確をこ異っている第１ク
ロマトグラフイー媒体セグメント１８ａと第２クロマト
グラフイー媒体セグメント１８ｂを有している。セグメ
ント１８ａおよび１８ｂはタンデム（直列）に配されて
おり、互いの周り番こ界面を形成していることが好まし
い。媒体１８ａは親水性であり、媒体１８ｂは疎水性で
あることが好ましい。その他、陰イオンおよび陽イオン
交換ＨＰＬＣ支持体である。シンクロパック（５ｙｎｃ
ｈｒｏｐａｋ　）　ＡＸ　３００、Ｑ３００、ＣＭ３０
０　　または５３００等のその他のクロマトグラフィー
媒体も適する。

図示実施例においては、下方の静止相、即ちクロマトグ
ラフィー媒体１８ａは順相ＨＰＬＣ媒体の形の現水性媒
体である。この媒体；ま、ペプチドの親水基に関する保
持時間が長く、エドマン反応の疎水性副生成物に対する
親和性の低いものでなければならない。この下方の静止
相には、コントロールされた多孔性ガラス〔例、エレク
トローヌクレオニックス（Ｅｌｅｃ’ｔｒｏ　Ｎｕｃｌ
ｅｏｎｉｃｓ　）　Ｉｎｃ。

フェアーフィールド、ＮＪ供給のもの〕またはシリカ（
Ｎｕ−Ｇｅｌと呼称）を用いることができる。

適当なセグメント１８ａの容量は０．１　ｍｅである。

その特性を示すと、Ｎｕ−Ｇｅｌ　９５２　　ＡＣ２０
０オングストローム（孔のサイズ）、２００〜４００メ
ツシユである。

上方の疎水性相セグメント１８ｂはアルキル（０８〜Ｃ
１８〕と結合したシリカの如き、逆相ＨＰＬＣ材料から
なる。この物質は良好な流動性を有し、配列決定用試薬
１こ抵抗性を示す。セグメント１８ｂの好適な容量は０
．１　ｍｅである。シリカと結合（カップリング）した
５ｙｎｃｈｒｏｐｒｅｐの特性は、孔のサイズ３００オ
ングストローム、粒子サイズ３０ミクロンである。

二数の静止相システムは、下記の如くペプチドを保持す
ることができるという理由から好ましいが、単一相（好
ましくは親水性タイプの）システムモ両方向性のフロー
システム１こ用い得ることは理解されるであろう。

全体として、クロマトグラフィー相１こおいては。

移動性ペプチド、即ち、クロマトグラフィー材料と共有
結合的に結合せず、可逆的に吸着されているペプチドが
、水溶液中で上方へ移動する際に、この逆相材料を用い
たシステムにより、このシスム内に保持されるという点
が屯要である。タンパク質や疎水性ペプチドは、高濃度
の席順や他の変性剤（例、尿素、ＳＤＳ、スクロース等
）をも含有する溶液として用いてもよい。過剰量の試薬
、副産物およびアミノ酸（ＡＴＺ）誘導体の有機溶媒抽
出の際−こは、下方の順相カラムにペプチドが保持され
る。

クロマトグラフィー媒体は、クロマトグラフィー床の粒
子は通さず、液体のみを通す適当な物質を頂部と底部に
配し、これにより、液体が流れている間、粒子床が保持
されるものであることが好ましい。図示されているよう
１こ、その様な保持手段は適宜、ガラスまたはテフロン
ウールで形成された多孔性のプラグ（Ｆ１１７である。

第１図；こおいてライン１２はポート１６に対し、取り
外し自在にシールされている。室１４の上端１こはライ
ン１２で連係された第２ボー１−２０が設けられている
。このシステムは、ポート１６およびポート２０におい
て流体に対して密閉性を有している。シーケンサ−の、
ポート１６および２０での流体１こ対する厳密なシール
（タイト・シール）を通常の方法で容％＋こ行い、また
それを解くことができるよう、その両端に適当な解除の
ための付属品または連結具８１が設けられている。この
様にすれば、配列決定後は、室１６はカートリッジとな
るので、ペプチドの交差汚染を避けるために各ラン（操
作）毎に室１６を取り外してきれいなカートリッジと交
換することが好ましい。

適切な試料室は小さいガラス製カラム（直径２闘）であ
って、これには、管８２から温度を調節した流体が通過
するようにした水ジャケット８゜の如き適当な温度調節
手段が備えられているとよい。カラムの下方端８１での
取付けは、カラムを５緊密；こ取付けるためｔこ小さい
穴（Ｌ５ｍｍ）をあけたテフロンチューブ小片を差し込
んだ部分で溶融させることにより行われている（第３図
参照）。

次いで、このチューブをバネの張力または○−リングと
ネジ止め等の方法でしっかりと保持するとよい。

本発明システムは、総合的に番号２８で示した第１貯蔵
手段または貯蔵ブロックにれには試薬カップリング試薬
およびカップリング塩基の容器を含む）を含んでいる。

ブロック２８からの流れはライン３０を通り４方向バル
ブ３２１こ至る。図示するごとく、ブロック２８１こは
加圧された不活性がズ（例、窒素）の貯蔵所３４、溶媒
容器（コンテナー）３６．ｉ気バッファー（カップリン
グ塩基）容器３８、液体バッファーＣカップリング塩基
）容器４０およびカップリング試薬（ＰＩＴＣ）容器４
２が含まれる。「バッファー」および「カップリング塩
基」という言葉は相互変換的に用いられている。

また本発明システムには、ライン４６によりバルブ３２
に連結された開裂試薬ブロック４４が含まれている。ブ
ロック４４ｉこは、不活性ガスの貯蔵所４８、溶媒容器
５２、開裂試薬（ＴＦＡ’）蒸気の容器５４並びに液体
開裂試薬（ＴＦＡ）の容器５６が含まれている。バルブ
３２はライン５８を介して２番目の４方向性バルブ６０
と連結されており、このバルブ６０の位置には、廃棄（
ウェスト）ライン６２に向う位置と、誘導体化されたア
ミノ酸を適当な検出器（図示されず）と連結されたライ
ン６４に導くような位置とが含まれている。ライン１２
は試料室１４とバルブ６０とを連結するものである。

ライン２２は４方向性バルブ６６１こ連結されており、
このバルブ６６はライン６８１こより番号７０で示され
る溶媒ブロックの一連の容器に連結されている。ブロッ
ク７０は、不活性ガスの貯蔵所７２、アセトニトリル溶
媒を入れるためのバルブ付きの容器７４、酢酸エチル溶
媒を入れるためのバルブ付きの容器７６およびベンゼン
溶媒を入れるためのバルブ付きの容器７８を順次含んで
いる。この溶媒貯蔵所とバルブ６６との間には高圧バル
ブ（図示せず）を介在させておくとよい。

記載の匣宜上、試料室は、ポート１６を底部に、ポート
２０を頂部に配するよう、垂直方向【こ表わされている
。しかしながら、試料室の方向性が本発明方法に何ら影
響しないことは理解されるであろう。例えば、倒立また
は水平であってもよい。

本明細書においては、底部とは、順相または親水性クロ
マトグラフィー媒体（［下方媒体Ｊ））こ近接した入口
を指し、頂部とは、逆相または疎水性クロマトグラフィ
ー媒体（「上方媒体」）に近接したポート（開口部）を
指すものとする。

方法論 第１工程（第２ａ図）では、注入バルブ１０内に入れた
、適当に水溶液化された試料、をライン１２ａからライ
ン１２を経てカラムの底から室１４内番こ充填する。大
部分のタンパク質と幾らかのペプチドは下方の親水性媒
体セグメント１８ａｉこ保持される。タンパク質が高濃
度の塩または変性剤中に存在しているときには、このタ
ンパク質は下方の媒体セグメント１８ａから溶離されて
セグメント１８ｂまで上方移動し、そこで保持される。

カラムに通す溶媒をこの分析から回収し、全タンパク質
がカラムに保持されていることを確認することができる
。この場合、バルブ６０はバイパス（う回）位置に、バ
ルブ６６は図示された位置にあり、過剰量の溶媒をライ
ン８０から採取する。ブロック７０からの溶媒はライン
８０を通って放出され、廃棄される。

通常、媒体１８番こ試料水溶液を流し、溶液中のタンパ
ク質が、カラム内を上昇しても上方の疎水性媒体セグメ
ン）１８ｂによりその進行を妨げられるようにする。ペ
プチドの充填は系の底部から行うことが好ましいが、頂
部から充填してもよいことｆご注意されたい。

第２工程 この工程では、試料の注入に用いた入口１０から溶媒を
注入すると、該溶媒はカラムを上昇し、ライン８０から
洗浄採取容器に排出される。洗浄溶液は、好ましくはカ
ラムの底部から頂部へと流れ、頂部から排出される移動
相であり、水または低濃度のアセトニｌ−ＩＪルを用い
るとよい。この段階で、残存する塩類変性剤または小さ
い、望ましくないペプチドまたはアミノ酸が試料室から
除去される。第１および／または第２段階は、自動また
は手技的１こ行うことができ、さらには、シーケンサ−
を用いるかあるいは装置から分離して行い、以後の配列
決定のために保存すること１こよっても行える。

第３工程 この工程では、適当な溶媒（例、アセトニトリルまたは
へブタン）に入れた適当なカップリング試薬（ＰＩＴＣ
）、好ましくはへブタン中２％ＰＩＴＣを供給する（第
２ｂ図参照）。１つの実稚態様ではまず最初に、容器４
２１こあるＰＩＴＣをバルブ３２およびバルブ６０１こ
向けて流し、排出することによりこれら２つのバルブ間
のデッドボリューム（空の空間）５８を充填する。次い
で、バルブ３２およびバルブ６０の位置を同時Ｇこ変え
、ブロック４４の貯蔵所４８内の不活性ガスを、バルブ
３２とバルブ６２との間のデッドポリ・ニーム・ループ
５８に存在しているカップリング塩基が正確１こコント
ロールされた量で反応カラム１４の底部から通過するよ
うに送る。容量を注意深くコントロールするためのこの
方法の採用は任意であるが、そうすることが好ましい。

カラム内にカップリング試薬が送り込まれたら、不活性
ガスを貯蔵所３４からライン３０およびバルブ３２を経
てライン８２で示されている排出部へ送り、バルブ３２
１こ存在している未使用の試薬を洗い流す。

別法として、第３工程は、バルブ３２と、反応カラムに
連結されたバルブ６０＋こ設けられたカップリング塩基
コントロールバルブ（図示せず）を開けるだけで容器４
２のカップリング試薬を直接、バルブ３２およびバルブ
６０を通って反応カラムの底部に導入することによって
も行い得る。この方法は、上記の正確なループ容量を用
いる方法に比べて、試料室を通るカップリング塩基の量
が正確にコントロールされないことから、あまり好まし
くない。この方法は一般に、ペプチドが疎水性セグメン
ト１８ｂによって保持されている場合に、用いることが
できる。この別法では１間違って大量のカップリング試
薬が用いられたとき、小さいペプチドが親水性媒体セク
ションの頂部から溶出するのを避けるためにアセトニト
リルよりもヘプタンに入れたＰＩＴＣを用いることが好
ましい。

上記の２つのカップリング試薬導入法のいずれかを行っ
た後、試料室の頂部または底部から、貯蔵所３４．４８
または７２の不活性ガスを流すことによりシステムを乾
燥させることが好ましい。

この乾燥は、溶媒の除去機能を果す。しかしながらこの
ステップは任意である。

第４工程 この工程では、工程３と類似の方法でカップリング塩基
「バッファー」を導く（第２ｂ図）。

正確にコントロールされた少量のバッファー液を導き、
連続的に導入される量のバッファーにより小ペプチドが
カラム上方まで運ばれるのを防止するために上記の工程
３の最初１こ述べたループ法を用いることができる。こ
の液体バッファーは、供給＃、２８の揮発性バッファー
と併用（例、トリメチルアミンまたはトリエチルアミン
と水）してもよい。一般に、この様にして導かれる液体
の量はクロマトグラフィー媒体全体を湿潤する１こは少
なすぎるので、ペプチドはカラムを上昇するが試料室か
ら外へ出ることはないであろう。ペプチド試料が疎水性
媒体に保持されるのに充分な大きさであれば、室１４の
容積を越える量の液体バッファーを用いることができる
。この場合は、非連続的な親水性−疎水性２相系を利用
し、大きいペプチドを順相支持体と上方の逆相支持体と
の界面に集中させる。

導入する液体バッファーの容量をカラム容積以上に増加
する番こは、まず、ブロック２８の容器４０Ｅこ設けた
液体バッファーバルブを開け、液体をバルブ３２および
６０から流出させる。次いで、バルブ６０を、液体バッ
ファーがラインからカラムへ上昇する位置にす早くシフ
トさせ（例、２秒間）、その直後にバルブ３２を廃棄に
転じる。ブロック４４の不活性ガス供給源４８のガスを
用い、バッファーをバルブ６０およびライン１２から反
応カラムの底部１こ強制的に送る。このタイミングは、
全クロマトグラフィー媒体１８を湿潤させ、過剰量の遊
離のバッファーがカラムの頂点から溶出するのに充分な
量の液体バッファーが試料室に入るよう調節するとよい
。カップリング塩基の選択は以下の基準に従う二カップ
リング塩基はｐＨを８〜１０の範囲内にコントロールし
ており、ペプチドと試薬の両者を溶解するものである。

適当なカップリング塩基には、コントロール（Ｑｕａｄ
ｒｏｌ）、ＤＭＡＡ、ＤＭＢＡ等が含まれるが、これら
は、現在一般に供給されている製品のプロパツール含量
（例、５〜２０％）よりもプロパツール含量の低いもの
を用いることが好ましい。その様な現水性溶液は一般番
こ、ペプチドを、親水性のクロマトグラフィー媒体を通
って緩やかに上方移動させるが、疎水性媒体セグメント
内で極めてゆっくり移動させることが最も好ましい。

本発明の系が、その様な大量の液体バッファーを使用し
得るという融通性を有することから、正確にｐＨをコン
トロールすることでカップリング反応の効率を増大させ
ることができる。所望により、液体バッファー中にはタ
ンパク質の溶解性を助長するためにＳＤＳ等の界面活性
剤を含有させてもよい。含有され得るもう一つの試薬は
天然のアミノ酸と同様、−級アミンであるノルロイシン
（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ　）であって、これはＰＴＣア
ミノ酸の内部基準並びに担体捕捉剤として使用すること
ができる。

第３工程および第４工程は、カップリング試薬およびカ
ップリング塩基を順次加えるように記載されているが、
この工程で咀要なのは、これら２試薬を同時にペプチド
昼こ接触させるという点のみである。従って、本発明の
系では、カップリング試薬とカップリング塩基とを混合
添加することによって第３工程と第４工程とを一緒に行
うことができる。

第５工程 この工程は、カップリング反応終了後、不活性ガスを流
してカラムを乾燥することに関する。好適な方法として
、まず、ガスを上方に流し、水性の液体を疎水性物質の
方向に流動させる。この作業は、貯蔵所３４の不活性ガ
スをバルブ３２および６０からライン１２を通ってカラ
ム内を上方に通すことにより行われる。次いで、大多数
の液体が除去された後、例えば、高圧ガスをバルブ７２
からバルブ６６とライン２２を通り、カラムライン１２
からバルブ６０を経てライン６４から排出するよう供給
することにより乾燥を完了するとよい。

完全に水を除去することが望ましいが、スピニングカッ
プシーケンサ−やガスシーケンサ−の如き上記の先行技
術１こおける場合程、重要なことではない、これは、有
機移動相を親水性をこする原因物質である水によるペプ
チドの移動が、次に加えられる。ペプチドを親水性物質
と疎水性物質の界面に再び集中させる様、作用する液体
バッファー１こよって平衡化されてしまうからである。

高圧ガスの下方移動の間１ζ、容器３６からバルブ３２
を通り、ライン８２から溶媒を排出させることにより、
バルブ３２を洗浄するとよい。

第６エ程 この工程では、有機溶媒を試料室内に下方向に流すこと
により不揮発性の副生成物と残存バッファーとをカラム
から除去する（第２Ｃ図）。溶離に用いられる溶媒は、
ヘプタンおよびベンゼンの如き極めて極性の乏しい溶媒
から、酢酸エチルまたはアセトニトリルの如き、やや極
性のある溶媒に至る。溶媒は全てカラム上方から流入し
、下降してカラム底部から溶出する。通常、ライン６８
からバルブ６６を通ってライン２２に導かれる溶媒は約
１０ｐｓｉ〜１００ｐｓｉ　　のオーダーの圧力を有す
る。ブロック７０の容器に付けたバルブは貯蔵所７２か
らの１００　ｐｓｉｌｕ上の子方１こ耐え得るものとし
、カラム内に高圧の不活性ガスを流し、残存する副生産
物や試薬を取り込んでしまい得る気泡を全て押し壊すこ
とができることを必要とする。

第７エ程 この工程では、結合（カップリング）した（ＰＴＣ）ペ
プチドを開裂酸で開裂する（第２ｄ図）。

適当な開裂酸の選択は以下の基準を用いて行う：それは
無水かつ揮発性であって、ＰＴＣペプチドをチアゾリノ
ンアミノ・酸と、アミノ酸１個を失なった遊離のペプチ
ドとに開裂させるのに充分な程。

ｐＨ値の低い酸である。開裂には、液状の酸（ＨＦＢＡ
、ＴＦＡ、ＰＦＰＡ等の、酢酸またはアセトニトリル等
の無水の溶液として）、あるいは酸蒸気を用いるか、あ
るいは両者を併用してもよい。

液体状の酸は反応の動力学を増大させる。他方。

ガス状の酸を用いるとペプチドのカラム頂部からの溶出
の危険性が減少される。従って、ペプチドか比較的大き
く、カラムからの溶出の危険性が大きくない場合には、
反応時間の短縮のために液体状の酸を用いることが好ま
しい。本発明システムの操作は、配列決定の初期段階で
は液体の酸を用い、実質上、ペプチド鎖が減少されてい
る後の段階では気相酸を用いて行うことができる。

酸で気による開裂法を使用する場合は、容器５４の蒸気
をライン４６およびバルブ３２．６０からライン１２を
通り試料室１４の底部番こ導く。貯蔵所５６の液体状開
裂酸を導く場合Ｅこも同様のフローシステムを用いる。

開裂反応は、温度１０℃〜５０℃の間で行うことが好ま
しい。この温度は、水ジヤケツト８０内の循還水の温度
によって変化させる。反応は、上記の如く、不活性ガス
を上方）こ向けて流した後、高圧をかけて下降させるこ
とにより過剰の液状酸またはガス状酸を乾燥すること）
こより停止される。

乾燥は、気相シーケンサ−またはスピニングカップシー
ケンサ−のどちらよりも完壁に行われる。

このことは、ＡＴＺアミノ酸を残存ペプチドから、クロ
マトグラフィー分離するため１こ、これら２つの従来シ
ステム）こおけるよりも極性の高い溶媒を用いて開裂し
たＡＴＺアミノ酸を抽出することができるからである。

この抽出は、これら従来法の場合よりも、残存する少量
の酸；こ左右されることが少ない。

第８工程 この最終工程では、開裂されたＡＴＺアミノ酸を酢酸エ
チルまたはアセトニトリル等の適当な有機抽出溶媒で抽
出する（第２ｅ図）。溶媒の選別基準は次の通りである
：全ＡＴＺアミノ酸は完全に溶離され、遊離ペプチドは
樹脂内で幾らか移動する。

図示する如く、容器７６の溶媒をバルブ６６からライン
２３を通ってカラムを下降させ、バルブ６０からライン
８０を経て、以後の反応のために適当な反応容器に収容
する。開裂したＡＴＺアミノ酸は、その様な容器（図示
せず）内で、常法通り、溶媒中で安定なＰＴＨアミノ酸
に転換される。

通常１反応容器中；こは水性酸転換を行うためにＴＦＡ
水溶液を入れておくか、あるいは加えることができる。

上記の如くにして試料室内に不活性ガスを通して残存す
る有機酸を除く。この時点で、カラムは、引き続きＡＴ
Ｚアミノ酸誘導体を得るために繰返し、配列決定法を行
うのに用いることができる。

酸と反応させてＡＴＺ−アミノ酸をＰＴＨ−アミノ酸に
転換した後（図示せず）、適当な液相クロマトグラフィ
ーにより残基を固定することができる。

上記の本発明システムは、試料室にう回路が設けられて
いるので、試薬の導入システムを直接、洗浄し、洗液を
捨てることができるという利点を有する。その上、マイ
クロ（微量）シーケンサ−の場合、エドヤン分解の化学
に用いられる全ての試薬を導くのに必要なバルブおよび
ラインの容量は、試料室の容積と同容量醗こすることが
できる。

他の試料室をう回することにより、試料を含有している
試料室を経て、バルブおよびライン内に残存している過
剰の試薬を洗い流すことの問題が解消された。このこと
は、試料上の溶媒の流量を減少させることになる。溶媒
薔こよる過剰な洗浄は、試料の抽出１こよる損失、並び
に溶媒中Ｅこ存在する微量の過酸化物によるＰＴＣ−ペ
プチドの酸化をもたらす故１こ、有害である。バルブの
ライン中洗浄は、試料室を乾燥する間に行うことができ
、そのことは洗浄時間の減少に役立つ。

本発明の系の主な利点は、ペプチドを媒体１こ共有結合
的に結合させていないが、系から試料が流失してしまう
ことのない、ペプチドの移動相を用いることかできると
いう点にある。液体試薬はペプチドを溶解し、流れの方
向に移動させるものを選択する。流れの方向を変えるこ
と１こより、ペプチドはカラム内を上下し、親水相と疎
水相との界面に集中する傾向を示す。移動の割合は移動
相（液体試薬）と静止相（クロマトグラフィー媒体）間
の分配率に依存するであろう。

カラム内でのペプチドの集中を例示するために、ペプチ
ド試料の水溶液を試料室に充填し、カラム内を上方；こ
流す。通常、あるペプチドは下方の親水性セグメント；
こ保持され、他のペプチドは上方の疎水性セグメント］
こ保持される。低分子量の化合物はカラムから溶出され
る。カラム内を水性のカップリング塩基とカップリング
試薬とが上方に移動する間番こ、ペプチドは上方の疎水
性媒体１こ移動傾向を示す。その後の第６段階では、カ
ップラー（カップリングした物質）の間を有機溶媒が下
降すること１こより、ＰＴＣアミノ酸が再度、親水相の
媒体に向かつて移動する。次いで、第７段階では再度、
開裂用の酸がカラム内を上昇し、ペプチドは疎水性セク
ション１こ移動する。最後に、下降方向に向けて、ＡＴ
Ｚアミノ酸誘導体の抽出を行う。この様な、親水性のク
ロマトグラフィーセクションと疎水性のクロマトグラフ
ィーセクションの間での流れの方向が変化することに起
因するペプチドの交互移動は、ペプチドの、これら２セ
グメントの界面付近への集中をもたらし、工程中でのペ
プチドの洗浄流失を防ぐことになる。

本明細書で引用し、本文中に数字を挿入して示した各文
献を、次の目録）こまとめて示す。

文献目録 １、　ダツクら（Ｓ、　Ｄａｔｔａ、　ｅｔ　ａｔ、）
、バイオケミストリイ・アンド・バイオフイデイックス
・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
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カル・ソサエティ（Ｊ　、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

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３．　エドマン（Ｐ、　Ｅｄｍａｎ）　、　「タンパク
質の配列１定（Ｐｒｏｔｅｌｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）ｌニードルマン（Ｓ、Ｂ
、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）編、スプリンガーーバーラッジ
（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇｅ）＝−Ｌ−ヨーク
（１９７５）２３７゜ ４、　二アール（Ｈ，Ｄ、　Ｎ１ａｌｌ）　、「自動化
ニドフッ分解（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｅｄｍａｎ　Ｄｅ
ｇｒａｄａｔｉｏｎ）：タンパク質シーケンサー（Ｔｈ
ｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）Ｊメソッヅ
・エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
　、）ＸＸＶＩＩ　（Ｄ）　（１９７４）　９４２゜５
、　タール（Ｇ、Ｅ、　Ｔａｒｒ）、アナリテイカル・
バイオヶミストリイ（Ａｎａｌ、ｂＩＯｃＨＥＭ、）、
６３　（１９７５）３６１−３７０゜ ６、　フレンケルーコンラット（Ｈ，Ｆｒａｅｎｋｅｌ
　−ＣＯｎｒａｔ）　、ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソサエティ　７６　（１９５４）　３６０
６゜７、　エドマンら（Ｐ、　Ｅｄｍａｎ）　＋ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリイ（Ｅｕ
ｒ　、　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１（１９６７）　
８０−９１　。

８、　フランケル−コンラットら（Ｈ，Ｆｒａｅｎｋｅ
　ｌ　−Ｃｏｎｒａｔ）「ペプチドおよびタンパク質の
末端および配列研究のための技術における最近の開発（
ＲｅｃｅｎｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　Ｔｅｒｍｉｎａｌａｎｄ　５
ｅｑｕｅｎｃｅ　５ｔｕｄｉｅｓ　　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ　ａｎｄＰｒｏ　ｔｅ　１ｎｓ）　Ｊメソッズ・
オブ・バイオケミストリイ：アナリシス　（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ：Ａｎａｌ、）＋Ｖｏ１．
２．Ｄ、グリツク（ｃ１ｉｃｋ）編、インターサイエン
ス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（１９
５５）３５９−４２５゜ ９、ハーモドソンら（Ｍ、Ａ、　Ｈｅｒｍｏｄｓｏｎ）
バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１
１　（１９７２）４４９３−４５０２゜ １０、ローセンら（Ｒ，Ａ、　Ｌａｕｒｓｅｎ）　、　
ＦＥＢＳレター（Ｌｅｔｔ、）、２１　（１９７２）　
６７−７０゜１１、リンら（Ｊ、Ｄ、　Ｌｙｎｎ）、ア
ナリテイカル・バイオケミストリイ（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）、４５　（１９７２）４９８−５０９゜ １２、テイタニら（Ｋ、　Ｔｉ　ｔａｎｉ）　、ネイチ
ュア（Ｎａｔｕｒｅ）にューバイオロ（Ｎｅｗ　Ｂｉｏ
ｌ、））　、　２３８　（１９７２）３５−３７゜ １３、ワヒターら（Ｅ、Ｗａｃｈｔｅｒ）、ＦＥＢＳレ
ター、３５（１９７３）９７−１０２゜ １４、ウォーターフイづレドら（Ｍ、Ｄ、Ｗａｔｅｒｆ
ｉｅｌｄ）アナリテイカル・バイオケミストリイ、３８
　（１９７０）４７５−４９２゜ １５、ホーンら（Ｍ、　Ｊ　、　Ｈｏ　ｒｎ）　、　Ｆ
ＥＢＳレター、３６（１９７３）　２８５−２８８゜ １６、プレピエロら（Ａ、Ｐｒｅｖｉｅｒｏ）、ＦＥＢ
Ｓレター。

３３　（１９７３）　１３５−１３８゜１７、ローセン
（Ｒ，Ａ、　Ｌａｕｒｓｅｎ）　、ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・バイオケミストリイ、　２０（１９７１
）８９−１０２゜ １８、ローセン（Ｒ，Ａ、　Ｌａｕｒｓｅｎ）　Ｊタン
パク質配列分析における固相法（Ｓｏｌｉｄ　　Ｐｈａ
ｓｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕ
ｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）Ｊピアス・ケミカフ１ｚ
・カンパ＝　−（Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ
ｍｐａｎｙ）　、　１９７５゜ １９、ストリンクラーら（Ｊ、Ｅ、５ｔｒｉｃｋｌｅｒ
）アナリテイカル・バイオケミストリイ、　１４０　（
１９８４）　５５３−５６６゜

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のシーケンサ−の模式図であり、第２ａ
図、第２ｂ図、第２ｃ図、第２ｄ図および第２ｅ１３は
、それぞれ１本発明のシーケンサ−の使用工程の説明図
、第３図は本発明シーケンサ−の試料室の端部の断面図
である。１０はシリンジ、１２および１２ａはライン、
１４は試料室、１６および２０はポート、１７はプラグ
、１８　、１８ａおよび１８ｂは媒体、８０は水ジャケ
ット、８２は管、２８は第１貯蔵ブロツク、３４はＮ２
ガスの貯蔵所、３６は溶媒容器、３８は蒸気バッファー
容！、４ｏは液体バッファー容器、４２はカップリング
試薬容器、３２．６０および６６はバルブ、４４は開裂
試薬ブロック、４８はＮ２ガス貯蔵所、５２は溶媒容器
、５４はＴＦＡ蒸気の容器、５６は液状ＴＦＡの容器、
２２，３０，４６．５８および６８はライン、７０は溶
媒ブロック、７２はＮ２ガスの貯蔵所、７４．７６およ
び７８はバルブ付きの容器。 ＴＦＡ　　ＴＦハ 試料ｙｒ−貢 二岑ヲえ Ｖラフ０りン２パ ＊７Ｊ＜→五め水十五バ′ツフ了−の １寡５砒 〜、２Ｃ１ 下ｆＬ５予 絞■提 Ｆｔ’ｇ、２ｅ。 △ＴＺ−捜沢

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）少くとも１個の流体流路を形成し、該流路に
   沿つて第１ポートおよび第２ポートを有するフロースル
   ー試料室、 （ｂ）該試料室の流路内に配置された、ポリペプチドを
   吸着するための吸着媒体、および （ｃ）該第１および第２ポートに交互に流体試薬を連続
   的に導入する手段であつて、該流体試薬を、該流路に沿
   い、実質上反対方向に向かつて吸着媒体の間を通過せる
   ための手段、を含むタンパク質またはペプチドのシーケ
   ンサー。 ２、流体が液体であり、吸着剤がクロマトグラフィーの
   媒体である第１項記載のシーケンサー。 ３、試料室に、液体導入手段を可逆的およびシール可能
   に装着させるための手段が設けられている第２項記載の
   シーケンサー。 ４、媒体が高速液体クロマトグラフィー用の樹脂である
   第２項記載のシーケンサー。 ５、試料室の第１および第２ポートへの液体導入手段が
   ペプチドの配列決定用試薬を収容するのに適した貯蔵容
   器と連結されている第２項記載のシーケンサー。 ６、液体導入手段が試料室の第１ポートに液体を導くた
   めの第１手段と、実質上、該第１部位と反対側に位置す
   る、試料室の第２ポートに液体を導入するための第２手
   段とを含む第５項記載のシーケンサー。 ７、第１手段および第２手段がそれぞれ、ペプチドの配
   列決定試薬を収容するのに適した別々の第１貯蔵容器お
   よび第２貯蔵容器に連結されているものであつて、試薬
   を貯蔵容器から試料室の第１ポートまたは第２ポートに
   送るものである第６項記載のシーケンサー。 ８、シーケンサーが、貯蔵容器から該第１ポートおよび
   第２ポートへ試薬を送るため、並びに試料室を乾燥する
   ための加圧ガス手段を含むものである第７項記載のシー
   ケンサー。 ９、試料室が細長いシリンダーである第２項記載のシー
   ケンサー。 １０、シリンダーが光透過性である第９項記載のシーケ
   ンサー。 １１、第１容器が配列決定すべきポリペプチドとカップ
   リングするためのフェニルイソチオシアネートまたはそ
   の誘導体の溶液を収容するのに適したものである第７項
   記載のシーケンサー。 １２、溶液に極性溶媒が含有されている第１１項記載の
   シーケンサー。 １３、溶媒がアルカリ性の緩衝化水溶液である第１２項
   記載のシーケンサー。 １４、第２の貯蔵容器が実質上、非極性の有機溶媒を収
   容するのに適したものである第７項記載のシーケンサー
   。 １５、試料室が、試料室を予め定められた温度に維持す
   るための手段と熱的に接触している第２項記載のシーケ
   ンサー。 １６、温度を維持するための手段が水ジャケットである
   第１２項記載のシーケンサー。 １７、少くとも１個の流体流路を規定し、この流路に浴
   つて第１および第２ポートを有すると共に、流路沿いに
   、流体によつて互いに連係された複数の別個のポリペプ
   チド吸着剤が不連続に、タンデムに配列されてなる試料
   室を有するアミノ酸シーケンサー。 １８、樹脂が高速液体クロマトグラフィー樹脂である第
   １７項記載のシーケンサー。 １９、容器中に第１および第２のクロマトグラフィー樹
   脂が含まれている第１７項記載のシーケンサー。 ２０、第１および第２の樹脂が静電的荷電または疎水性
   に関して異なつている第１９項記載のシーケンサー。 ２１、第１の樹脂が電気的陰性の電荷を、第２の樹脂が
   電気陽性の電荷を有する第２０項記載のシーケンサー。 ２２、第２の樹脂が疎水性であり、第１の樹脂が親水性
   である第２１項記載のシーケンサー。 ２３、疎水性樹脂がＣ−４〜Ｃ−１８アルキル置換シリ
   カまたは高分子疎水性樹脂であり、親水性樹脂がコント
   ロールされた多孔性ガラスまたは非置換シリカである第
   ２２項記載のシーケンサー。 ２４、容器中に、実質上ホモジーニアスな第２のクロマ
   トグラフィー樹脂混合物と接している実質上ホモジーニ
   アスな第１のクロマトグラフィー樹脂混合物が含有され
   ており、第１混合物中の樹脂は、静電的荷電および疎水
   性に関して第２混合物中の樹脂と区別されるものである
   第１７項記載のシーケンサー。 ２５、第２混合物が疎水性樹脂と電気的に陰性に荷電し
   た樹脂とを含有しており、第１混合物が親水性樹脂と電
   気的に陽性の樹脂とを含有している第２４項記載のシー
   ケンサー。 ２６、容器が、該容器の実質上反対側に第１の開口部と
   第２の開口部を有するものである第１７項気載のシーケ
   ンサー。 ２７、第１の樹脂と第２の樹脂とが容器内で互いに接触
   すると共に、第１および第２の樹脂は、それぞれ第１お
   よび第２の開口部に近接した位置に配されている第２６
   項記載のシーケンサー。 ２８、様々な液体を第１および第２の開口部に導入する
   ための手段をも含有している第２７項記載のシーケンサ
   ー。 ２９、容器が可逆的かつシール可能に液体導入手段を装
   着する手段を含有している第２８項記載のシーケンサー
   。 ３０、実質上、試料室の反対側に位置する液体導入手段
   がペプチドの配列決定用試薬を収容するのに適した貯蔵
   容器と連結されている第２８項記載のシーケンサー。 ３１、液体導入手段が第１開口部に液体を導入する手段
   と、第２開口部に別の液体を導入する手段とを含有して
   いる第２８項記載のシーケンサー。 ３２、第１および第２手段がそれぞれ、別々の、ペプチ
   ドの配列決定試薬を収容するのに適した第１および第２
   貯蔵容器と連結されており、それによつて、試薬が貯蔵
   容器から試料室の第１または第２開口部に運ばれるもの
   である第３１項記載のシーケンサー。 ３３、試薬が加圧されたガスによつて、貯蔵容器から該
   第１または第２開口部に送られる第３２項記載のシーケ
   ンサー。 ３４、試料室が細長いシリンダーである第２７項記載の
   シーケンサ。 ３５、シリンダーが光透過性である第３４項記載のシー
   ケンサー。 ３６、第１貯蔵容器が、配列決定すべきペプチドとカッ
   プリングさせるためのフェニルイソチオシアネートまた
   はその誘導体を収容するのに適したものである第３２項
   記載のシーケンサー。 ３７、溶液が極性溶媒を含有している第３６項記載のシ
   ーケンサー。 ３８、溶媒がアルカリ性の緩衝化水溶液である第３７項
   記載のシーケンサー。 ３９、第２貯蔵容器が、実質上非極性の有機溶媒を収容
   するのに適したものである第３２項記載のシーケンサー
   。 ４０、試料室が、試料室を予め定められた温度に維持す
   るための手段と熱的に接触している第１７項記載のシー
   ケンサー。 ４１、温度維持手段が水ジャケットである第４０項記載
   のシーケンサー。 ４２、第１ポートと第２ポート、並びにそれらの間に流
   体流路を有し、その内部の流体流路内に複数の非連続的
   なポリペプチド吸着剤をタンデムに配してなる容器。 ４３、実質上混合されることなく、直接、相互接触して
   いる第１吸着剤と第２吸着剤とを有すると共に、第１樹
   脂と第２樹脂が、それぞれ、第１ポートおよび第２ポー
   トに近接して位置している第４２項記載の容器。 ４４、吸着剤が、電荷または疎水性に関して実質上正反
   対の万クロマトグラフィー用の樹脂である第４２項記載
   の容器。 ４５、第１の樹脂が電気的陽性に荷電しており、第２の
   樹脂が電気的陰性に荷電している第４４項記載の容器。 ４６、第２樹脂が疎水性であり、第１樹脂が親水性であ
   る第４４項記載の容器。 ４７、第２の樹脂がアルキル置換シリカであり、第１の
   樹脂が非置換シリカである第４６項記載の容器。 ４８、さらに、第１ポートと第２ポートに連結された加
   圧部品をも有する第４２項記載の容器。 ４９、シリンダー状であつて、約３〜１００ｐｓｉの内
   圧に耐え得るものである第４８項記載の容器。 ５０、電気的陽性に荷電した樹脂が４級または３級アミ
   ノ置換多孔性ポリオレフィンであり、電気的陰性に荷電
   した樹脂が、スルホネート置換多孔性ポリオレフィンで
   ある第４５項記載の容器。 ５１、第１および第２のクロマトグラフィー樹脂が実質
   上連続なクロマトグラフィー樹脂の混合物であつて、第
   １混合物中の樹脂が、第２混合物中の樹脂と、静電的荷
   電および疎水性に関して区別されるものである第４４項
   記載の容器。 ５２、第２混合物が疎水性樹脂と電気的陰性に荷電した
   樹脂とを含有しており、第１混合物が親水性樹脂と電気
   的陽性に荷電した樹脂を含有している第５１項記載の容
   器。 ５３、加圧部品が可撓性の連結具を介してポートと連結
   されている第４８項記載の容器。 ５４、樹脂が、容器内で、開口部間の中央付近で界面を
   形成している第４４項記載の容器。 ５５、第４２項記載の容器と容器の温度を維持するため
   の手段を含有しているアミノ酸シーケンサー。 ５６、さらに、容器内で起きている反応に一致させて容
   器の温度を調節するための手段をも含んでいる第５５項
   記載のシーケンサー。 ５７、フェニルイソチオシアネートと配列決定されるべ
   きポリペプチドとのカップリングにおいては約５５℃に
   、酸抽出においては約０℃〜５０℃に温度が維持される
   第５５項記載のシーケンサー。 ５８、エドマン分解による一連の工程を含む、逐次的な
   カップリング反応と開裂反応によりペプチドを連続的に
   分解する方法であつて、 （ａ）流路に沿つて第１および第２ポートを有するフロ
   ースルー試料室の流路内に配した、ポリペプチドを吸着
   するための媒体上に移動し得る形態の該ペプチドを沈着
   させ、 （ｂ）該沈着させたポリペプチドをカップリング試薬と
   接触させ、 （ｃ）該カップリング試薬と該ペプチドが接触している
   間に、該第１ポートから該第２ポートへ向かう第１方向
   にカップリング塩基を流して該カップリング試薬と該ペ
   プチドの結合のための塩基性環境を与え、 （ｄ）開裂試薬を試料室に、第２方向に向けて流し、該
   結合したペプチドからアミノ酸誘導体を開裂させ、さら
   に （ｅ）液状の抽出溶媒を、試料室に、該第１方向と反対
   の第２方向に流し、該試料室から該開裂したアミノ酸を
   抽出して取り出すと共に、残余ペプチドをその内部の吸
   着剤内に止まらせておくことからなる方法。 ５９、工程（ｃ）と（ｄ）との間に、該第２方向に液状
   洗浄溶媒を流し、該ペプチドを移動させずに、クロマト
   グラフィー媒体から未反応のカップリング試薬と他の不
   純物とを除去する工程をも含む第５８項記載の方法。 ６０、吸着剤が、該流路に沿つてタンデムに配された、
   クロマトグラフィー特性の異る別々の第１および第２セ
   グメントからなるクロマトグラフィー媒体であつて、該
   第１セグメントは該第１ポートに近接し、該第２セグメ
   ントは第２ポートに近接して存在する第５８項記載の方
   法。 ６１、該第１セグメントが親水性である第６０項記載の
   方法。 ６２、工程（ｂ）と（ｃ）を同時に行う第５８項記載の
   方法。 ６３、該第２セグメントが疎水性である第６０項記載の
   方法。 ６４、該第２セグメントが逆相ＨＰＬＣ媒体である第６
   ０項記載の方法。 ６５、該クロマトグラフィー媒体に沿つて該ペプチドを
   、工程（ｃ）および（ｄ）を行う間は第１方向に、工程
   （ｅ）を行う間は第２方向に移動させる第６０項記載の
   方法。 ６６、該ペプチドが、エドマン分解によるアミノ酸配列
   の決定を妨害し得る溶質を含有している溶液から析出し
   ているものである第５８項記載の方法。 ６７、工程（ｃ）のカップリングを水性環境下に行う第
   ５８項記載の方法。 ６８、工程（ｄ）を行う間、無水の液状形の該開裂酸を
   該カラムに通す第５８項記載の方法。 ６９、工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）において、試料
   室の容積を越える充分量の液体を試料室に流す第５８項
   記載の方法。 ７０、工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、試料室の容積を
   越える量の水溶液で吸着剤を洗浄することを含む第５８
   項記載の方法。 ７１、工程（ｃ）で用いる液体がヘプタン、ベンゼン、
   クロロブタン、塩化メチレン、酢酸エチルまたはアセト
   ニトリルからなる群から選択されるものである第５８項
   記載の方法。 ７２、工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の後、不活性ガ
   スで吸着剤を乾燥する第５８項記載の方法。 ７３、溶質が等電点泳動バッファー、ドデシル硫酸ナト
   リウム、スクロース、アミノ酸、または尿素を含有する
   ものである第６６項記載の方法。 ７４、クロマトグラフィー樹脂が、実質上、水性溶液中
   に膨潤し得ないものである第６０項記載の方法。