JPS63258496A - 不溶化免疫複合体を用いる抗体の増強された製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、不溶性免疫複合体を用いる、種々の抗原に
対する抗体の増強された製造方法のためのものである。

精製された抗原、他の汚染抗原と共に存在する濃縮され
た（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）抗原、及び不均一混合物が抗原
源として使用される。ポリクローナル単一特異性抗体、
ポリクローナル多特異性抗体、及びモノクローナル抗体
が抗原及びプロティンＡ−セファロースと−・緒にされ
、不溶化された免疫複合体が形成される。この様な複合
体の抗原成分に対する抗体か高い効率で生産さされ、そ
しである場合にはもとの抗血清又はモノクローナル抗体
に勝る改良された特異性をもって生産される。

〔従来の技術〕

糖蛋白質、糖脂質及び腫瘍関連抗原に対するモノクロー
ナル抗体及びポリクローナル抗体の製造のために従来技
術において種々の方法が用いられている。例えば、モノ
クローナル抗体の製造においては高度に免疫原的ビヒク
ルである全体細胞を用いることかできる。しかしながら
この方法は注目の抗体の生産効率が低いという問題点を
有する。

さらに、精製された可溶性の抗原は、ラビット及びヒツ
ジのごとき他の種における同し免疫原に比べてマウスに
おいては免疫原作が低い。

不溶性形態の抗原はマウスにおいて可溶性抗原調製物の
免疫原性を改良することができる。例えば、癌胎児性抗
原のミョウバン沈降物はある場合には免疫原性を増強す
る。しかしながら、所望のレベルの抗体生産を達成する
にはしばしばアジュバントが要求される。伝統的に、ア
ジュバント、例えばフロイントのアジュバントが、ラビ
ット又はヤギの免疫感作のために可溶性抗原調製物に混
合されている。しかしながら、アジｌバントはマウスに
おいてはしばしば無効であり、それが抗体の検出可能な
力価（ｔ　ｉ　Ｌｅｒ）を生成する場合でも抗原特異的
ハイブリドーマの収量は低い。この発明は、抗原特異的
ハイブリドーマの生成に効果的な不溶化された免疫原を
開示する。

従来技術において記載されている可溶性免疫原調製物は
また通常、十分な量の精製された抗原の単離のために多
大の努力を必要とする。可溶性抗原による免疫感作のた
めのほとんどの方法においては５０〜１００７Ｂの精製
された抗原が使用される。

はとんどの細胞表面抗原又は細胞質抗原は細胞により少
量のみ生産されるため、前記の量の抗原を調製するには
生化学的精製においてがなりの努力が必要とされる。こ
の発明の利点は不均一混合物からの所与の抗原の濃縮（
ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）方法を提供することである。こ
の明細書において、゛濃縮″（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）
なる語は、注目の抗原又は抗体の濃度の一ト昇を意味す
る。

この発明によって提供される他の利点は、同し抗原上の
、免疫原の調製において使用された抗体により同定され
るエピトープとは異るエピトープに対するモノクローナ
ル抗体の製造である。Ｔつの抗原の多数のエピＩ・−１
に対する複数の抗体の必要性がすでに示されている。例
えば、糖蛋白質棟内に１個より多くのエピＩ・−１が存
在し得ること、及び糖蛋白質分子の異る亜集団トに種々
異る組合わせのエピｌ−−プが見出され得ることが示さ
れている。すなわち、すべてのエピトープがすべての糖
蛋白質分子上に存在しなければならないわけではなく、
そして／又は所与の組織内で同じ分布を有さなければな
らないわけではない。さらに１１体的には、本発明者等
は、し１一黒色腫関連抗原系における抗原の不均一性の
程度がモノクローナル抗体により認識されるエネＩ−−
−プに依存することを見出した。（Ｍｏｒｇａｎ等、Ｍ
ｏ１．Ｉｍ＋ｎｕｎｏｌｏｇｙ、印刷中）。はどんどの
黒色腫糖蛋白質分子上に発現されるエビＩ・−プを認識
する１一つのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、糖蛋白
質分子の亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａＬｉｏｎ）上にの
み存在するエピトープを認識するＭＡｂより低い抗原的
不均一性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｂｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉ
ｔｙ）を有していた。癌胎児性抗原（ＣＬ；’、Ａ）に
対するモノクローナル抗体を用いて、ＣＥ　Ａ調製物を
ユニークなエピトープを有する分子の集団に亜分割する
ことができる。これはまた、クラス■組織適合性抗原（
肛へ−ＤＲ抗原）に対するモノクローナル抗体を用いて
示された。すなわち、所与の抗原」二の特定のエピトー
プに対するユニーク抗体の生成は、標的腫瘍に対する毒
素、薬剤又は放射性同位元素の提供を含むモノクローナ
ル抗体の医療的適用の最適化のために有用である。

抗原の精製に関して、モノクローナル抗体の製造のため
の従来技術の方法は面倒なものである。

従来技術の方法は複数の一連の段階により単離された可
溶性の精製された抗原により免疫感作することを含み、
この精製の段階は多量の所与のモノクローナル抗体の生
産、この抗体の精製、不溶性マトリクス（例えばセファ
ロース〉へのこの抗体の不溶化、及び不均一な抗原混合
物から抗原を精製するためのモノクローナル抗体アフィ
ニティークロマトグラフィーと組合わされた少なくとも
１つの他のアフィニティー手順（例えばレクチンアフィ
ニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトクラ
フィー、ゲル濾過又は疎水性クロマトグラフィー）の典
型的な使用を含む。この方法は高価であり、時間を要し
、そして不純抗原の入手源としての多数の細胞を必要と
する。さらに、単離された後、可溶性抗原調製物はマウ
スにおいてあまり抗原性でない。従って、既存のモノク
ローナル抗体により認識されるエピトープとは異る抗原
のエピトープに対するモノクローナル抗体を生じさせる
ための一層効果的で■一つ時間を要しない方法が当業界
において求められている。この発明においては抗原源の
精製を行う必要がなく、そしてなお免疫原作が増強され
る。

さらに、それに対してすでにポリクローナル抗血清が存
在する抗原に対するモノクローナル抗体を製造するため
の方法が当業界において必要とされている。これらのポ
リクローナル抗血清が存在すれば、それが少量で、低力
価で、又は多特的（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆ　ｉｃ）形態
（異る特異性を有する多くの抗体を含む）であっても、
これらはこの発明においてモノクローナル抗体の製造の
ために使用され得る。多くの場合において、これらの抗
血清の呈は限定されており、抗体アフィニティークロマ
トグラフィーのためには不十分であり、そしてそれ故に
可溶性精製、抗原を用いる免疫感作法のためには有用で
ない。この発明の免疫感作法の追加の利点は、免疫感作
において使用されたポリクローナル抗血清と比べて異る
特異性のモノクローナル抗体を生じさせることができる
ことである。

さらに、ネズミ由来のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の
抗原結合部位を認識するモノクローナル抗−イデオタイ
プ抗体を効果的に製造するための方法の必要性が当業界
において必要とされている。抗−イデオタイプ抗体がボ
ジティフ及びネカティブの両様に免疫応答を制御するた
めに機能し得ることが幾つかの動物モデルにおいて予想
されそして続いて証明されている。ある場合においては
、レクチンの製造において精製抗原の代りに抗−イデオ
タイプ抗体を用い、こうして所与の抗原の生化学的精製
の必要性を除去することかできる。

幾つかの動物モデルにおいて示される様に、ワクチンと
して使用される抗イデオタイプ抗体は癌のアジュバント
療法において有用であろう。この分野は、ネズミ由来の
モノクローナル抗体を他のネズミモノクローナル抗体に
対して生産することが困難であるという不利な条件下に
ある。ヒト抗体及びラビッ１〜抗体に対するネズミＭ　
Ａ　ｂは好結果に製造されている。しかしなから、腫瘍
関連抗原に対するほとんどのＭＡｂはマウス由来である
。

これらの腫瘍特異的ネズミＭＡｂの結合部位は免疫原作
か低く、これはおそら（Ｆｃ領域の共通配列により誘導
される自己寛容のためであろう。

Ｆｃ領域内の種差が抗原結合部位（イデオタイプ）の増
強された免疫原性をもならず様である。この発明におい
て、不溶化された免疫複合体の使用がモノクローナル抗
体のイデオタイブに対する抗体の生成を増強する。

この発明の他の利点は、所与の１つの抗原の複数のエピ
トープに対して向けられた一群のモノクローナル抗体を
生成せしめるための効果的な技法を提供することである
。この技法は抗原の免疫劣性（ｉｍｍｕｎｏｒｃｃｅｓ
ｓｉｖｅ）エピトープを認識するモノクローナル抗体の
生産を促進することである。その結果、種々のモノクロ
ーナル抗体が１つの標的細胞又は抗原に結合することが
でき、これによって標的部位への接合毒素又は放射性同
位元素の高投与量の供給が促進される。増加した濃度の
免疫複合体の供給は細胞変性特性及び／メージング特性
を改良する。なぜなら、１つの標的細胞の多数の別個の
エピトープが結合され得るからである。

さらに、多数のモノクローナル抗体の入手可能性は種々
のエピトープを標的にすることを可能にし、その幾つか
は特定の標的細胞に固有のものであろう。この固有結合
能力は、正常細胞のエピｈ−プとほとんど又は全く交差
反応しないモノクロ−ナル抗体の選択を可能にし、今度
はこのことが高投与量の免疫接合体の投与を可能にする
であろう。

〔発明の概要〕

この発明は、抗体の増強された製造方法であって、抗体
を不溶化されたプロティンＡ上に吸収せしめ、これによ
ってイムノソルベントを形成し；抗原をこのイムノソル
ベントと一緒にして不溶化された免疫複合体を形成せし
め；この不溶化された免疫複合体により動物を免疫感作
し：そしてこの免疫感作された動物から抗体を回収する
；段階を含んで成る方法を開示する。

この発明の関連する観点は、 可溶性抗原の免疫原性を改良し、これによって特定のモ
ノクローナル抗体の生産を増強する方法であって、抗体
を不溶化されたプロティンＡに吸収させてイムノソルベ
ントを形成せしめ；前記可溶性抗原を前記イムノソルベ
ントと一緒にして不溶化された免疫複合体を形成せしめ
；この不溶化された免疫複合体により動物を免疫感作し
；この免疫感作された動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と
融合せしめて、前記可溶性抗原に対するモノクローナル
抗体を生産することかできるハイブリドーマを形成し；
このハイブリ１〜−マを培養して前記モノクローナル抗
体を生産せしめ；そしてそして該ハイブリドーマの生産
物として前記モノクローナル抗体を回収する；段階を含
んで成る方法を開示する。

この発明の他の観点は、 既存のモノクローナル抗体により認識されるエピトープ
とは異るエピト−プに対して特異的なモノクローナル抗
体の製造方法であって、多価抗原の第一エピｌ−−プに
対して向けられた既存のモノクローナル抗体を不溶化さ
れたプロティンＡ上に吸収せしめ、これによってイムノ
ソルベントを形成せしめ；このイムノソルベントを前記
抗原と一緒にして不溶化された免疫複合体を形成せしめ
、この複合体においては前記第一エピトープか前記既存
のモノクローナル抗体によりマスクされており；この不
溶化された免疫複合体により動物を免疫感作し；この免
疫感作された動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と融合せし
めて前記第二エピト−プに対する第二モノクローナル抗
体を生産することができるハイブリドーマを形成し；こ
のハイブリドーマを培養して前記第二モノクローナル抗
体を生産ぜしめ；そして該ハイブリドーマの生産物とし
て前記第二モノクローナル抗体を回収する；段階を含ん
で成る方法を開示する。

この発明の他の観点は、モノクローナル抗−イデオタイ
プ抗体の製造方法であって、第一抗体を不溶化されたプ
ロティンＡｎに吸収せしめ、これによってイムノソルベ
ントを形成せしめ；このイムノソルベントにより動物を
免疫感作し：この免疫感作された動物からの脾細胞を骨
髄腫細胞と融合せしめて、前記第一抗体のイデオタイプ
に対するモノクローナル抗体を生産することができるハ
イブリドーマを形成し；このハイブリドーマを培養して
前記モノクローナル抗体を生成ぜしめ；そして該ハイブ
リドーマの生産物として前記モノクローナル抗体を回収
する；段階を含んで成る方法を開示する。

免疫原として使用するための不溶化された免疫複合体、
及びモノクローナル抗−イデオタイプ抗体の製造におい
て使用するためのイムノソルベントもまた開示される。

さらに、腫瘍関連抗原の複数のエピトープに結合する種
々のモノクローナル抗体が開示される。

この発明の他の観点は、抗体９．２．２７により認識さ
れないヒト黒色腫関連プロテオグリカンのエピトープと
結合することができるモノクローナル抗体である。さら
に、この様な抗体を生産することができる連続性ハイブ
リドーマセルラインも含まれる。

この発明のこれらの観点及び他の観点は、下記の具体的
な説明、及び図面により一層明らかになるであろう。

〔具体的な記載〕

抗体の増強された製造のための本発明の方法は、従来技
術の抗原精製段階を含まづ、そしてまた、従来技術の方
法によって得られた抗原反応性ハイブリドーマの数以上
にその数を増大せしめ、従って、目的とする抗原に対す
るモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を製造す
る全体の効率を高めることができる。

本発明を実施するために、抗原混合物内の目的とする抗
原の相対量を決定する必要がある。従って、細胞表面抽
出を、次の物質、たとえばリチウムショートサリチレー
ト、ブタノール、等張性尿素、非イオン性洗剤又はイオ
ン性洗剤により行い、可溶性抽出物を生成せしめる。た
とえば、非イオン性洗剤による抽出は、しばしば、周辺
膜タンパク質の調製のために使用され得る。可溶性抽出
物は、目的の抗原が１％（ｗ／ｗ）又はそれよりも多く
の抽出調製物を代表す場合、濃縮された抗原源である。

しかしながら、より少なく濃縮された抽出調製物もまた
使用され得る。

次に、抽出調製物が、タンパク質含有量について検定さ
れる。リン酸緩衝溶液中１１００ｎ〜１０μｇのタンパ
ク質を、１００μｌの体積のポリビニルマイクロタイタ
ープレートに添加する。１晩乾燥せしめた後、目的とす
る抗原の存在が、ＥＬＩＳ＾技法によって固相の目的抗
原にポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を結
合することより検出される。比較するために、非抗原産
生細胞からの類似する抽出物を使用することができる。

抗原の量は、ウェル中で目的のタンパク質の希釈により
力価（ｆｉｔｅｒ）で表わされ得る。抽出調製物中にお
ける目的とする抗原の存在を確認した後、固相抗原対抗
体又は抗体源を力価検定することができる。免疫源の調
製のための抗血清又はモノクローナル抗体は、最つども
高い力価、適切な種類の動物における産生及び／又はプ
ロティンＡ−セファロースに結合することができるネズ
ミ免疫グロブリンのサブクラスを基準として選択され得
る。

不溶化された免疫複合体を形成するために使用される典
型的なタンパク質濃度は、プロティンへ−セファロース
２０μＮ（充填された体積）当りポリクローナル抗血清
２０μｌである。他方、ＭＡｂ免疫グロブリン５〜５０
μｇが、同じ体積のプロティンＡ−セファロースで不溶
化され得る。イムノソルベントは、転倒型回転により室
温で２時間、続いてリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）により洗
浄することにより行なわれる吸収法によって形成される
。もう１つの態様において、前記イムノソルベントは、
目的とする抗体を直接的にＣＮＢｒ−セファロースに結
合することによって製造される。

次に、そのイムノソルベントを用いて、抗原抽出物を吸
収する。イムノツルベンｌ−への抽出タンパク質の非特
異的付着を最少にするために、その抽出物を、正常免疫
グロブリン−プロティンＡ−セファロースにより予備吸
収する。正常免疫グロブリンを、ウサギ又はヤギ血清か
ら、又は特異抗原の吸収のために使用されるのと同しサ
ブクラスの非特異的マウスモノクローナル抗体から得る
ことができる。予備吸収は、次の３段階で行なわれる： （１）室温で２時間、非特異的イムノソルベント及び抽
出調製物のインキュベーション；（２）さらに２時間、
新しい非特異的イムノソルベントのアリコートへのその
抽出調製物の移行；及び（３）非特異的イムノソルベン
トの第３アリコートへのその上清流の移行、及び４℃で
１晩のインキュベーション。非特異的結合成分のこの消
費の後、抗原調製物を、特Ｗ抗原に対する抗１ｗ清又は
ＭＡｂにより再力価検定し、そして不溶化された免疫複
合体の続く調製のために少量づつ凍結することができる
。

不溶化された免疫複合体のインビボ安定性は、抗体及び
プロティンＡが４−アジドザリチル酸のＮ−ヒ１〜ロキ
シスクシンイミドエステル（Ｎｌ２−八Ｓ＾）（Ｔａｅ
？、＜　５　、凌す上、ｆｌｉｏｃｈｅｍ、１２１　：
　２８６，１９８２）による処理により架橋される場合
に、増強される。他方、抗体及び抗原は、Ｎ１（Ｓ−＾
Ｓ＾による処理により架橋され得る。架橋は、血清の解
離を妨ぎ、従って、免疫複合体のインビボでの保持を高
めるであろう。

不溶化された抗体に添加されるタンパク質の合計量は、
Ｅｉ、ＩＳ八により評価される与えられた抗原の相対的
濃縮を基準にして概算される、従って、抗原調製物が精
製された抗原である場合、２５０ｎｇ又はそれよりも少
ない純粋な抗原かそれぞれのイムノツルベン１へ及びそ
れぞれの免疫感作のために使用される。適切な抗原が調
製物のわずか１％を構成する場合、典型的には、５−１
０μｓの抗原調製物が使用される。抗原源として使用さ
れる可溶性抽出物が、１％よりも低い、その所与の抗原
の濃度を有する不均一抗原混合物である場合、１０ｔｔ
ｇ又はそれよりも多くの抽出物が、不溶化された抗体へ
の吸収のために使用される。４°Ｃで２・〜１４時間の
インキュベーションの後、その不溶化された免疫複合体
は、ＰＢＳにより洗浄され、そして［１ＡＬＢ／ｃマウ
スの腹膜内に注射される。

肺臓内免疫感作が所望される場合、イノ、ノソルベン）
へは、２７−ゲージの釘による胛臓内注射の前に、より
小さなセファロース粒子を製造するなめに、Ｄｏｕｎｃ
ｅ装置て均質化される。腹腔的免疫感作が３〜６週間、
毎週予定される場合、典型的にはわずか１回の肺臓内注
射、典型的には、５〜１０μｇの抗原調製物が必要とさ
れる。腹腔的免疫感作及び肺臓内免疫感作の両者につい
て、肺臓細胞が最終免疫感作の後、３〜７日で収得され
、そしてハイブリドーマが標準技法によって調製される
。ハイブリドーマのスクリーニングは、免疫感作のなめ
に使用されたもとの抗原標的混合物荷対して、並びに対
象の抗原を含まないことが知られている標的抗原混合物
に対してＥＬｒＳ＾によって行なわれる。

不溶化された免疫複合体はまた、免疫原付の低い可溶性
抗原の免疫原作を改良することができ、従って、高力価
抗血清又はこれまで得られなかった特異的モノクローナ
ル抗体の製造を可能にする。

さらに、既知のモノクローナル抗体への抗原の結合を通
して抗原が不溶化された免疫複合体中に導入される場合
、そのモノクローナル抗体によって認識されるエピトー
プは、たぶん効果的にマスクされる。マスクされたエビ
ト−１を有する不溶化された免疫複合体中の抗原による
免疫感作は、その抗原のマスクされていないエピトープ
に対して向けられた第二世代のモノクローナル抗体のよ
り効果的な産生を可能にする。この技法は、非腫瘍関連
抗原の腫瘍関連エピトープに対して向けられたモノクロ
ーナル抗体を産生ずるために有用である。所与の抗原の
異なったエピトープを認識するモノクローナル抗体はま
た、腫瘍遺伝子生成物及び原腫瘍遺伝子生成物の分別に
も有用である。

モノクローナル抗−イディオタイプの抗体の製造のため
には、ヒ１〜又はマウスモノクローナル抗体が、プロテ
ィンへ−セファロースに吸収される。

その得られた免疫吸収剤を洗浄して非結合抗体を除去し
、そして次にゲラ歯頚を免疫するために使用される。免
疫感作されな肺臓細胞と骨髄腫細胞との融合により産生
されたハイブリドーマを、２種の方法の１つによってス
クリーニングする。ラッ１〜がプロティンＡ−セファロ
ース上に不溶化さく３８） れたネズミ抗体により免疫感作される場合、ハイブリト
ーマのスクリーニングは、抗−ラットペルオＡ−シダー
ゼ接合体試薬を用いて間接的ＥＬＩＳ八によって行なわ
れる。マウスが免疫感作される場合、ハイブリドーマの
スクリーニングは、標的細胞への酵素によりラヘルされ
た特異抗体（イディオタイプ）の結合の推定上の抗−イ
ディオタイプの抗体による阻止により行なわれる。

不溶化された免疫複合体免疫原の好結果は多くの要因に
よる。第一は特異抗体への吸収による所与の抗原の相対
的濃縮である。しかしながら、これは、固定化抗体源と
してポリクローナル抗血清を使用する実験の好結果のた
めの理論的根拠を示さない。ポリクローナル抗血清に関
して、この方法が所与の抗原の大きな濃縮を生むことは
予期できないであろう。この好結果における２番目の要
因は、Ｂ−細胞の分化及び増殖を高めることに役割を演
じることがてきる、セファロース上に不溶化されたプロ
ティンＡのアジュバント性である。

可溶性プロティンＡはマウスＢ−細胞のための良く知ら
れ／こマイ１ヘジエンであり、分化剤である。

プロテインＡは、二１次増殖シグナルとして作用し、そ
して目的抗原に対１〜であらかじめ感作されたＢ−細胞
のクローン性拡張を引き起こす。これらの免疫原の好結
果をもならず３番目の要因は、免疫複合体が免疫応答の
調節の天然のモードであり得ることである。多くの研究
は、抗原−抗体複合体がリンパ節の枦胞領域に関係し、
そしてＦｃレセプターに選択的に結合されることを指摘
して来た。

マクロファージによる濃縮及び続く提示は、Ｂリンパ細
胞の感受性化を導き、そして従って免疫応答の増強を導
くことができる。イース具−ボにおいて、不溶化された
免疫複合体が、プロディンＡ結合に対する宿主の免疫プ
ロプリンとの競争のによりしたいに解放されることが予
期されるであろう。

例」− 単一特異性多クローナル抗血清を利用するモノクローナ
ル抗体の発生 α−２マクログロブリン（α２ｍ）が、ヒｌ〜黒色腫細
胞より合成されかつスペント培地に分泌されていること
が判明している（Ｍｏｒｇａｎ　、、ｌＮＣ１γｉ：５
５７゜１９８４）。この分子の同定は、α２ｍの正常血
清形に対し生じた単一特異性ポリクローナル抗血清を用
いて行なわれた。α２ｍの黒色腫細胞形は、血清α２ｍ
とはゾ同し分子量を有しかつそれと同しサブユニット組
成を有することが判明している。未発表の研究によると
、従って、α２ｍの黒色腫形を含むスペント培地および
血清α２ｍに対する多クローナル抗血清の不溶性複合体
を利用してα−２マクログロブリンの黒色腫細胞対する
モノクローナル抗体が生成された。これらの抗−α２ｍ
ＭＡｂｓの特異性を第１図に示す。３群の抗体からのデ
ータを示す。第１の群は、正常血清、黒色腫スペント培
地および牛血清からのα−２マクログロブリンと反応す
る。第２の群のＭＡｂは、黒色腫スペント媒地および正
常血清中のα−２マクログロブリンのしＩ〜形のみを認
識した。第３の群の抗体はα２ｍのメラノーマ細胞形と
のみ反応し、正常ヒト又は牛血清形のいずれをも認識し
なかった。

これらの結果は以下のことを実証する。すなわち、モノ
クローナル抗体の生産は、単一特異性ポリクローナル免
疫複合体を利用することによって増加することができ、
かつ生じたモノクローナル抗体は、腫瘍細胞形が正常血
清抗原に分子的に酷似しているとしても、その正常血清
の対応物に対するよりもむしろ抗原の腫瘍細胞形に対し
選択的である。

抗−α２ｍモノクローナル抗体の特異性は、更にフロー
サイトメ１へり−により特徴づけられた。

α２ｍ（ＦＭＸ）を合成するヒＩ−黒色腫細胞系を抗−
α２ｍＭＡｂと共にインキュベ−１〜した。合成されて
いるが、細胞表面上では発現されていないα２ｍを検出
するため、ＦＭＸ細胞をＭＡｂと２インキユベートする
前にリソル・シチンにより透過性にした。α２ｍを欠く
無傷の、及び透過性にされたヒｌ−Ｔ細胞（ＣＥＭ）を
、ネガティブ対照として用いた。抗−中間フィラメント
ＭＡｂを透過性にした後の細胞内抗原への接近について
のポジディプ対照として用いた。第２図は細胞内α２＋
ｎのみと抗−α２ｍＭＡｂとの結合を証明し、α２＋１
１がＦＭＸ細胞の表面で発現されていないことを示す。

ＣＥＭ細胞は一貫して非反応性であり、培地からのウシ
α２ｍのエンドサイト−シスが分析を損なわなかったこ
とが示された。

例ター α形質転換増殖因子（αＴＧＦ）は、腫瘍増殖の制御に
おいて、特に内分泌生長調整において重要である。この
ペプチド増殖因子のアミノ配列式の全部又は一部を代表
する合成ペプチドは入手できるが、αＴＧＦに対するモ
ノクーロナル抗体を生成せしめることは困難であった。

全体黒色腫細胞に対し生起した多特異性ラビット抗血清
を、黒色腫圧から逆相ＨＰＬＣにより単離されたＴＧＦ
の調製物に対して力価検定した。抗血清はαＴＧＦ調製
物に対比して低力価（１，：４）を示し、これは５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により約２０％のα
ＴＧＦおよび８０％の他の汚染尿タンパつてあった。こ
の抗血清−抗原調製品をプロティンＡ−セファロースに
結合させ、そして６週間の免疫感作を利用してモノクロ
ーナル抗体を生じさせた。これらの融合から誘導したハ
イブリドーマクローンの例を第１表に示す。

第　　１　　表 反応性 ＴＧＦ＋　、ＥＧＦ”　　　　　　　２３ＴＧＦ−、Ｅ
ＧＦ＋　　　　　　６９ ＴＧＦ＋　、ＥＧＦ−８ ＊モノクロ一ナル抗体を、黒色腫患者からの尿αＴＧＦ
並びに精製しトＥＧＦへの結合について尿αＴＧＦ調製
品に応答して発生した大部分のモノクローナル抗体は、
ヒト上皮成長因子（ＥＧＦ）並びにαＴＧＦと反応した
。尿αＴＧＦに生じた数種のモノクローナル抗体は、優
先的にＥＧＦと反応するが、αＴＧＦのＣ−末端がら誘
導された１７−アミノ酸ペプチドとは反応しなかった。

１個の単クローナル抗体はαＴＧＦに対し特異性を示し
たが、ヒトＥＧＦには非反応性であった。

これらの結果は、αＴＧＦの如き免疫ペプチド増殖因子
が免疫複合体を介しての不溶化により免疫原性にされ得
ることを示す。

鮮ｙ Ｂ細胞リンパ腫の細胞表面に存在するヒト　ＩｇＭに対
するモノクローナル抗イデイオタイプ抗体は、Ｂ細胞リ
ンパ腫の、ある形態の治療において、治療剤として有効
であろう。この抗体の発生を速めるため、および時には
限られた　ＩｇＭ免疫原のほんの少量だけを用いるため
、肺臓内免疫方法を試した。肺臓内に投与された可溶性
ヒト　ＩＢＭは、ハイブリドーマ発生にとって有効な免
疫原ではなかった。しかし、表２に示したように、ヒト
　ＩｇＭに対するネズミのモノクローナル抗体を介して
ヒト　ＩｇＭをプロティンＡ−セファロースに複合体化
した場合、この　ＩｇＭは免疫原性となり、ヒ）ＩＢＭ
の骨髄腫蛋白の抗原結合部位へ向う約１％のクローンを
もたらす。

以下余白 これらの抗　ＩｇＭイディオタイプモノクローナル抗体
の特異性を調べた。ネズミのモノクローナル抗体を、ヒ
ト　ＩｇＭパラプロティンおよび個々の　ＩｇＭ試料の
パネルへの結合について分析を行った。表３は、これら
のモノクローナル抗体が自己のＩＢＭだけに結合し、他
のＩＢＭ試料に結合せず、よって抗イデイオタイプ特異
性を示していることを証明している。

以下余白 鮮す− 耳−１１色−瞳−州−勉−腫」１閃う車１席予Ｊ藍識１
−を千、ノーりａフ−ニーで材−ルｌ九一体（ζり１す
ｐ、ヱ嘱宍２−（とチ翻〕−りａフ−ニーで村、ノに抗
了〔デ」！オ侵−柔２．１穴川（ゆトーヒト黒色腫関連
抗原（２５０ｋｄ　　糖蛋白質／プロテオグリカン複合
体、「プロテオグリカン抗原」とも呼ばれる）を認識す
る抗体９．２．２７は患者のヒト黒色腫細胞を標的とす
る場合に有効である（シュロッフ（Ｓｃｈｒｏｆｆ）ら
、１肋、７４巻、２９９頁、１９８５年；オールドハム
（Ｏｌｄｈａｍ）ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１．　２
巻、１２３５頁、１９８４年〉。９．２．２７により認
識されるこの抗原は、Ｃ８Ｃ１勾配遠心と抗体アフィニ
ティークロマトグラフィを組み合せた選択的抽出技術を
必要とするため、生化学的な精製は困難である。この抗
原はほんの少しの量だけ単離され、それは免疫感作には
不十分であった。抗原の量が不十分なため、ワクチンと
してのこの２５０ｋｄ成分の利用には制限がある。しか
し、ＭＡｂ　９．２．２７を認識するモノクローナル抗
イデイオタイプ抗体の発生により、代わりのワクチンを
提供することができよう。多くの免疫感作方法を調べる
ことにより、ラットおよびマウスにおいて、ネズミモノ
クローナル抗体に対するネズミのモノクローナル抗イデ
イオタイプ抗体を誘導するための最適な方法を決定した
。

これらの方法は、可溶性ＭＡＩ−１をフロイント（Ｆｒ
ｅｕｎｄ）アジュバントと共に用いるという伝統的な免
疫方法を含む。アルブミン担体へＭＡｂを結合させるこ
とによって免疫原を作ったが、免疫原性を高めることに
対する種を越える免疫感作（ラットおよびマウスへ）の
障害を伴った。抗イデイオタイプ抗体の発生の点では、
これらの方法のどれも成功しなかった。

プロティンＡセファロース上に不溶化されなＨＡｂ　９
．２．２７を利用した本発明に係るプロトコールは、ラ
ッ１へにおいて抗イデイオタイプ抗体を発生させること
に成功した。この結果を第４表に示す。

このラットのモノクローナル抗体は、免疫化８＾ｂ　９
．２．２７に結合することが示されたが、マウスのモノ
クローナル抗体の同じサブクラスあるいは他のサブクラ
スとは結合しなかった。従って、免疫性複合体によるネ
ズミのＭ　Ａ　ｂの不溶化は、マウスあるいはラツ１〜
において、マウスのモノクローナル抗体に対する自己寛
容を弱める助けとなるであろう。

以下余白 例擾− 不溶化された免疫複合体を、ヒト黒色腫関連プロテオグ
リカン抗原に対して多数のモノクロナール抗体を生ずる
ように設計された免疫感作法に用いた。

３種の免疫源を、プロテオグリカン抗原に対する抗体を
生じさせるのに用いた。その第１は全細胞であった。こ
のために用いた細胞系は、Δ３７５Ｍ／　Ｍ　、　ＳＫ
　ＭＥＬ−２８，１０％のウシ胎児血清を有するＤＭＥ
Ｍ　（ジェイ、アール、サイエンティフィック（Ｊ、Ｒ
，５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カリフォルニア州ウッドラ
ンド　（Ｗｏｏｄ　１ａｎｄ）　：］中で増殖したＳＫ
　ＭＥＬ−３１および血清を含まない培地Ｃ３ｍｇ／ｌ
のインシコ、リンおよびトランスフェリンおよび５μｇ
／ｌのセレンを有するイスコーヴ（Ｉｓｃｈｏｖｅ）の
培地〕中で増殖したＡ３７５Ｍ／Ｍを含んでいた。免疫
感作は、皮下に１×１０６細胞を用いて１週１回の割合
で３週間行なった。第２の免疫原は黒色腫細胞の抽出物
〔例えば、ヒラマメ−レクチン−またはコムギ胚凝集素
−セファロース４Ｂに吸着したＦＭＸまたはＳＫＭＥＬ
−２８（モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）等、ハイブリドーマ
（トー１節岬り町：２３３．１９８４年）〕から調製し
た。第３のタイプの免疫原は不溶化された免疫複合物〔
例えば、黒色腫Ｎ１４０抽出物および９．２．２７のプ
ロティンＡセファロース結合複合体くギアーデイナ（Ｇ
ｉａｒｃｌｉｎａ）等、ジェイ、イミュノル、（，１，
−Ｉｍｕｎｏｊ、）　、印刷中）〕を用いた。第２およ
び第３のタイプの免疫原を、融合前の連続する６週間に
わたり１週間に１回の割合で注射した。第４の免疫感作
計画は、全細胞注入量（ｐｒｉｍｉＢ　ｄｏｓｅ）を免
疫複合体免疫感作と組合わせて、マウスを全細胞の１回
の注射で免疫感作した後１週間に１回５週間にわたり不
溶化された免疫複合物を注射した。

免疫感作された肺臓細胞をＡｇ８．６５３．Ｎ５−１骨
髄腫細胞と、膵臓：骨髄腫１０：１の割合で融合するこ
とによってハイブリドーマを製造した。このハイブリド
ーマを最初に、直接２段階イムノペルオキシダーゼ法〔
ウッドハウス（Ｗｏｏｄｈｏｕｓｅ）等、ジェイ、ナト
ル、カンク、インスト、　（Ｊ、Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃ、Ｉｎ５ｔ、）７４　：　３８３．１９８５年
〕を用いて黒色腫細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞への結合に
ついて試験した。引き続いて、黒色腫細胞への結合は陽
性であるがＢ細胞およびＴ細胞への結合は陰性であるハ
イブリドーマをフローサイトメトリーによってスクリー
ニングした。

簡単に述べると、Ｂ細胞およびＴ細胞の並びに＾３７５
Ｍ／Ｍプロテオグリカン陽性および＾３７５１°プロテ
オグリカン陰性黒色腫細胞の単一細胞懸濁液を、Ｉ　Ｘ
　１０６細胞当り１μｇの抗体の濃度でモノクロナール
抗体とインキュベーションした。次いで、フルオレセイ
ンイソチオシアネート結合ヤギ抗マウス抗体〔イアゴ社
（Ｉａｇｏ　Ｉｎｃ、）、カリフォルニア州バーリンゲ
ーム（Ｂｕｒｌ　ｉｎｇａｍｅ）　）を用いて結合モノ
クロナール抗体を検出した。標準化されたフルオレセイ
ン粒子〔ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ）、カリフォルニア州マウテイン・ヴイ
−（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ））を用いてエピック
ス・シー・サイト−フルオログラフ（Ｅｐｉｃｓ　Ｃｃ
ｙｔｏ−ｆｌｕｏｒｏ−ｇｒａｐｈ）　［カウンター・
タイアグノステイクス（（：Ｈ１ｊ６ｒｌ）ｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ）、フロリダ州バイアレア（Ｈｉａｌｅａｈ
）　）　　で標的細胞結合を分析して遊離フルオレセイ
ン当量を計算した。第３図は、プロテオグリカン陽性細
胞と反応する（第３Ａ図）がプロテオグリカン陰性細胞
とは結合しない（第３Ｂ図）４種の黒色腫陽性モノクロ
ナール抗体およびＭＡｂ　９．２．２７を用いて得られ
た結果を示している。

次いで、プロテオグリカン陽性黒色腫細胞系と反応性で
あるが正常または抗原陰性細胞系とは反応性でないモノ
クロナール抗体を間接ＥＬＩＳＡアッセイ〔モーガン（
Ｍｏｒｇａｎ）およびマツキンタイル（ＭｃＩｎｔｙｒ
ｅ）、カンク、レス、　（Ｃａ収」ｅｓ２−）４３−：
３１５５．１９８３年〕で試験した。アッセイは黒色腫
細胞のＮＰ４０抽出物を用いて実施した。多数の推定上
の抗プロテオグリカンモノクロナール抗体がＭＡｂ９．
２．２７と同様にして黒色腫細胞抽出物と反応したが、
一部は反応しながった。

次いで、ＭＡｂ　９．２．２７と同様のＥＬＩＳＡパタ
ーンを生じたモノクロナール抗体を、ヒト黒色腫、皮フ
および腎臓の試料を用いてイムノペルオキシダーゼ染色
法によって評価しな。後者の２つの正常組織は、９．２
．２７の既知の正常組織交差反応性の全てを示す。黒色
腫被検物、皮フの表皮内の基底細胞および腎臓の集合管
を強く染色したモノクロナール抗体は推定上の抗プロテ
オグリカン抗体（ｒ　９．２．２７様Ｊ）であると考え
られさらに調査を行なった。

二重決定基ＥＬＩＳ＾を行なってプロテオグリカンの反
応性を評価した。この二重決定基ＥＬＩＳＡは２つの方
式で用いた。第１の方式は捕捉抗体としてＨＡｂ　９．
２．２７Ｆ（ａｂ）　′２を用い、標準化された抗原の
供給源ＳＫ肛Ｌ−２８ＮＰ４０抽出物を添加し、続いて
推定上の抗プロテオグリカン抗体の上澄を添加した。

インキュベーションの後、ビオチン抗マウスＦｃ特異的
試薬を用いて結合モノクロナール抗体を検出した。この
アッセイにおいて陽性に発色した抗体を抗プロテオクリ
カン抗体であると考えた。第２の方式のアッセイにおい
て、抽出物中の抗原を、ＨＡｂ　　９．２．２７　、Ｎ
Ｒ−Ｍ２Ｏ３、Ｍｌ（−Ｍｌ−０３、ＮＲ−Ｍｌ　−０
４およびＮＲ，−Ｍ２Ｏ３を含む固相抗体によって捕捉
しな。ビオチニル化された同一の抗体を種々の組合せに
用いて結合抗原を検出した。これらの条件下で同一のエ
ピト−プを認識する抗体は発色しなかったのに対し、区
別性のあるエビ１〜−ブを認識する抗体は有意な発色を
与えた。このアッセイによって、１抗体当り１個だけの
エピトープが、同じ抗体を用いて捕捉および検出するこ
とによって試験される抗原上に存在していると仮定され
る。

このレベルの反応性をなお示す抗体を免疫沈殿および５
ＯＳ−ＰＡＧＥによって評価しブロデオグリカン抗原に
対する反応性を確認した。５種の抗プロテオグリカン抗
体をさｔ、に詳細な評価に対して選択した。

融合数および推定子の抗プロテオクリカン抗体数の概要
を第５表に示す。

以下余白 策−−−−−５−人。

融合の概要および結果 シフチン／抽出物　　　　　７　　　　　　　　１．６
１９　　　　　　　　　　１全細胞　　　　　７　　　
　１．７６７　　　　　４免疫複合体　　　５　　　　
１．２６１　　　　　０全細胞」−免疫 複合体　　　　　２　　　　１．３０２　　　　６７全
細胞免疫感作は比較的少数の推定−１−の抗プロテオグ
リカン抗体を生じさせた。しがしながら、感作と全細胞
による感作及びこれに続く１０チオグリカン抗原および
阿＾ｂ　９．２．２７の不溶化免疫複合体を用いて追加
免疫の組み合わせを行なうことによって、多数の推定」
二の抗プロテオグリカン抗体が生じた。５種の推定上の
抗プロテオグリカンモノクロナール抗体を一層の分析の
なめに選択した。

これらの抗体およびこれらを生産する細胞系を第６表に
示す。

表示した細胞系の寄託は米国メリーランド州ロックヴイ
ル在の＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ，に対して行なわれ、表示した寄
託番号を付された。

第一　ｑ−−−人 モノクロナール抗体者およびハイブリッド細胞県名ｔ）
９ｒｊｆ−ル抗体　　　　　バイア’ｌＪＪ”細胞系　
　　　　ΔＴＣＣ寄託番号ＮＲ−Ｍｌ−０２　　　ＮＲ
−Ｍｌ−０２＾１９２３　　　１１１１−９３５２ＮＲ
−１’１１０３　　　ＮＲ−Ｍｌ−０３＾２２１Ｓ　　
　　Ｉ（Ｅｌ−９３４９ＮＲ−８１０４ＮＲ−Ｍｌ−０
４＾１９９３　　　１１Ｂ−９３５１８Ｒ−８１０５Ｎ
１（−８１０５八２１０６　　　　　　　ＨＢ−９３５
ＯＮＲ−Ｍｉｌｅ　　　ＮＲ−Ｍｌ−０６＾３−２７　
　１１Ｂ−９３４８これらの抗体の反応性の特徴を第７
表に示す。

以下余白 亀」−漬 ＥＬＩＳＡによる抗黒色腫抗体の反応性プールされたＢ
お よびＴ細胞培養物　０．０４７　　０．０５３　　０．
０７１　　０．０６５　　０．０２７プールされた黒色 種培養物　　　　　　０．７７１　　０．５７５　　０
．６６０　　　０．５７１　　　０゜９０８＾３７５　
ｍｅｔ　ｍｉｘ黒色 腫細胞　　　　　　　１．０９７　　０．８８６　　０
．９６１　　　０．６８８　　　１．０３６八３７５−
ン（リエ餌 細胞　　　　　　　０．００７　　０．００１　　０．
０１８　　　０．０１８　　　０．０５１＾３７５　ｍ
ｅｔ　ｍ１ｘ ＮＰ−４０抽出物　　　　１．００８　　０．７７２　
　０．８０８　　　０．７７４　　　１．１３０ＳＫ−
ＭＥＬ−３１ＮＰ−４０ 抗プロテオグリカンモノクロナール抗体の詳細なイムノ
ペルオキシダーゼ評価を実施した。反応性のパターンは
、全抗体が実質」−全腫瘍細胞を染色する、代表的な黒
色腫切片の強く均一な染色によって示される低い程度の
抗原の不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を含み
、ＭＡｂ　９．２．２７と同一であった。平滑筋および
内皮細胞反応性も、全抗体を用いて見い出された。

抗プロテオグリカンモノクロナール抗体のエピトープ比
較も、それぞれＥＬＩＳＡおよびフローサイ１〜メ１へ
り一で、二重決定基および付加（ａｄｄｉｔｉｏｎ）ア
ッセイの両方を用いて実施した。第８表はＭＡｂ９．２
．２７　、　ＮＲ−Ｍｌ−０３およびＮＲ−Ｍｉ０５が
捕捉および検出の両方のために用いられた場合に陽性の
信号を与えなかったことを示しており、各々かユニーク
エピ１ヘープを認識することを暗示している。

対照的に、ＭＡｂ　ＮＲ−Ｍｌ−０２およびＮＲ−ＭＬ
−０４はいかなる組合せにおいても陽性の信号を与えな
かったので、同一のエピ１−一プを認識するものと思わ
れる。

ｌ」 二重決定基固相ＥＬＩＳ＾によるエピトープ比較９．２
．２７　　　０．０１６　　１．６５７　　　１．５５
４　　　１．５５８　　　１．１６７ＮＲ−Ｍｌ−０２
１，７３１０，１０７１，２２９０，０９４０，９２７
ＮＲ−Ｍｌ−０３０，６３６０，５２７０，０５４０，
５７５０，４０６ＮＲ−Ｍｌ−０４１，８４７０，０３
０１，４４５０，１１９１，０７８ＮＲ−Ｍｌ−０５０
，９２８０，８８００，９０１０，７４００，１２１こ
の仮説は、フローサイトメ１〜リーを用いた付加的細胞
表面結合によって確められた。各抗体の螢光強度を用い
て、第９表は、別個のエピ１−−プを認識する抗体の組
合わせが、２種の抗体のみの螢光強度の理論合計から対
照抗体の値を差し引いたものの１００％またはそれ以上
を与えたことを示している。ＮＲ−Ｍｌ　−０４および
ＮＲ−Ｍｌ−０２は予期値の半分の値しか与えなかった
。このことはこれらのＭＡｂが同じエピトープを認識す
ることを示している。６１の他の抗プロテオグリカンモ
ノクロナール抗体を、９．２．２７　、　ＮＲ−Ｍｌ−
０３、ＮＲ−Ｍｌ−０５およびＮＲ−Ｍｌ　−０２／Ｎ
Ｒ−Ｍｌ　−０４によって認識される４つの決定基に対
する付加性についてスクリーニングした。試験したこれ
ら６１の抗体はいずれも、免疫複合体免疫感作計画で用
いられる抗体阿Δｂ９．２．２７と同じエピトープを認
識しなかった。これら６１の抗体中１０の抗体はＮＲ−
Ｍｌ−０２およびＮＲ−Ｍｌ−０４と同じ決定基を認識
すると思われたのに対し、３つの抗体だけがＮＲ−８１
−０３またはＮＲ−Ｍｌ　−０５と同し決定基を認識し
た。４８の抗体は、５種の特徴付けられた抗体によって
特定されるエピトープを認識しなかった。

以下余白 策９−六 間接的蛍光イム−ノアッヤ不（ｑよろ一工切トニズ比較
剣、、２．＝２７　　にＤｇＱ−ＯＰ！３−７　７Ｍ区
世　墜−用二屏　ト１スー月−１刈４　　ＨＲ水口羽９
．２．２７　　　　９６ ＫＤ２００　　　　９６　　１．１８ Ｐ９７　　　　　９２　　１０７　　１１９ＺＭＥＯ８
８６５８９５９９ Ｎｆ（−Ｍｌ−０２９０１００１０５９１，９７ＮＲ−
Ｍｌ−０４８８１０４１０９９２５９ＮＲ−Ｍｌ、−０
５９５９４１００９７８５７２１０４ＮＲ１０４ＮＲ−
１００Ｎ１０　　　Ｎ／Ｄ　　Ｎ／Ｄ　　　Ｎ／Ｄ　　
　　Ｎ／Ｄ　　　　Ｎ／Ｄ（培養された黒色腫細胞にお
ける理論的染色強度に対する％、Ｎ／Ｄ次いで、代表的
抗プロテオグリカンモノクロリ〜−ル抗体を、マウスお
よびヒトＩｇＧに対するＦｃレセプターを発現する連続
性単球細胞系ＴＲＦ’−１を用いてＦｃ媒介結合につい
て評価した。これを第１０表に示す。ＴＨＰ−１細胞系
はＩｇＧ−１に対するレセプターを発現しないので、Ｉ
ｇＧ−１抗プロテオグリカンモノクロナール抗体（ＮＲ
−Ｍｌ−０２およびＮＲ−Ｍｌ　、−０４）の結合はバ
ックグラウンドレベルであった。興味深いことに、Ｉｇ
Ｇ−２ｂ　ＮＲ−Ｍｌ−０５抗体も結合しなかったのに
対し、Ｉ　ｇ　Ｇ−２ａ抗体であるＮＲ−８１、、−０
３および９．２．２７はいずれも極めて十分に結合した
。

剃−１−庚−宍− フローサイトメ１〜リーによるレセプター結合比較第２
次単独　　・・・　　　　３７，０００　　　　　１　
、ＯＮＲ−Ｍｌ−０２１，Ｇ１　　　４３，０００　　
　　　１．２ＮＲ−旧−０４１，Ｇ１　　　６１，００
０　　　　１．６ＮＲ−Ｍｌ−０５１ｇＧ２ｂ　　　５
５，０００　　　　　１．５ＮＲ−Ｍｌ−０３ＩｇＧ２
ａ　　　１８６，０００　　　　　５．０９．２．２７
　　　　　ＩｇＧ２ａ　　　１．９６，０００　　　　
　５．３以上のことから、本発明の特定の態様を説明の
ために記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸
脱することなく種々の変形を施し得ることが理解されよ
う。従って、本発明は特許請求の範囲による以外には限
定されないものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＥＬＩＳＡにお（）る、３種類の異る由来の
α−２マクログロブリンに対するモノクローナル抗体の
結合を示す。これら３種類の由来は（、）黒色腫スペン
ト培地からのα−２マクログロブリン、（ｂ）正常ヒト
血清からの精製されたＧ２−マ多ログロブリン、（ｃ）
ウシ血清から単離されたウシα−２マクログロブリンで
ある。 第２図は、α−２マクログロブリンに対するモノクロー
ナル抗体のフローサイトメトリーを示す。 上方のパネルは、α−２マクログロブリン（（７２Ｍ〉
又は中間体フィラメン？−抗原（抗−ＴＦＡ）と反応す
るモノクローナル抗体と共にインキュベ＝１〜され、そ
してＦＩＴＣ−ヤギ抗−マウス免疫グロブリンにより染
色されたＣＥＭ（ヒ１〜Ｔ細胞）又はＦＭＸ（ヒト黒色
腫）細胞を示す。下方のパネルは、α２Ｍ又は抗−Ｉ）
？Ａとのインキュベーションに先立ってリソレシヂンに
より透過性にされたＦＭＸ及びＣＩ？、Ｍ細胞を示す。 抗−ＴＦＡは細胞内、非−細胞表面抗原のための陽性対
照である。 第３図は、プロテオグリカン−陽性及びプロテオグリカ
ン−陰性Δ３７５黒色腫細胞に対して試験された黒色腫
反応性モノクロ−リール抗体のフローサイトメ１〜リー
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗体の増強された製造方法であって、 抗体を不溶化されたプロテインＡ上に吸収せしめ、これ
   によってイムノソルベントを形成し；抗原をこのイムノ
   ソルベントと一緒にして不溶化された免疫複合体を形成
   せしめ； この不溶化された免疫複合体により動物を免疫感作し；
   そして この免疫感作された動物から抗体を回収する；段階を含
   んで成る方法。 ２、前記不溶化されたプロテインＡが不活性マトリクス
   に結合したプロテインＡから成る特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ３、前記不活性マトリクスがポリサッカライドマトリク
   スである特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、前記不活性ポリサッカライドマトリクスがセファロ
   ースである特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５、前記不活性マトリクスが粒子の形態である特許請求
   の範囲第２項に記載の方法。 ６、前記粒子がビーズの形態である特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。 ７、抗体を吸収する段階の後に抗体とプロテインＡとを
   架橋する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 ８、抗原を一緒にする段階の後に、抗体と抗原とを架橋
   する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ９、前記抗体がポリクローナル単一特異的抗体である特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 １０、前記抗体がポリクローナル多特異的抗体である特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 １１、前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 １２、前記抗原が精製された均一抗原である特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 １３、前記抗原が不均一混合物の成分である特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 １４、前記抗原が濃縮された抗原混合物の成分である特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 １５、前記抗原が濃縮された抗原混合物の少なくとも１
   ｗ／ｗ％を代表する特許請求の範囲第１４項に記載の方
   法。 １６、前記抗原が可溶性抗原である特許請求の範囲第１
   項に記載の方法。 １７、前記抗原が腫瘍関連抗原である特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 １８、前記抗原が、前記の免疫感作された動物種と同一
   であるか又は進化的に密接に関連している動物種から得
   られたものである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １９、可溶性抗原の免疫原性を改良し、これによって特
   定のモノクローナル抗体の生産を増強する方法であって
   、 抗体を不溶化されたプロテインＡ上に吸収させてイムノ
   ソルベントを形成せしめ； 前記可溶性抗原を前記イムノソルベントと一緒にして不
   溶化された免疫複合体を形成せしめ；この不溶化された
   免疫複合体により動物を免疫感作し； この免疫感作された動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と融
   合せしめて、前記可溶性抗原に対するモノクローナル抗
   体を生産することができるハイブリドーマを形成し； このハイブリドーマを培養して前記モノクローナル抗体
   を生産せしめ；そして そして該ハイブリドーマの生産物として前記モノクロー
   ナル抗体を回収する； 段階を含んで成る方法。 ２０、前記不溶化されたプロテインＡが不活性マトリク
   スに結合したプロテインＡから成る特許請求の範囲第１
   ９項に記載の方法。 ２１、前記不活性マトリクスがポリサッカライドマトリ
   クスである特許請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２２、前記不活性ポリサッカライドマトリクスがセファ
   ロースである特許請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３、前記不活性マトリクスが粒子の形態である特許請
   求の範囲第２０項に記載の方法。 ２４、前記粒子がビーズの形態である特許請求の範囲第
   ２３項に記載の方法。 ２５、抗体を吸収する段階の後に抗体とプロテインＡと
   を架橋する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第１
   ９項に記載の方法。 ２６、抗原を一緒にする段階の後に抗体と抗原とを架橋
   する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第１９項に
   記載の方法。 ２７、前記抗体がポリクローナル単一特異的抗体である
   特許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２８、前記抗体がポリクローナル多特異的抗体である特
   許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２９、前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求の
   範囲第１９項に記載の方法。 ３０、前記抗原が精製された均一抗原である特許請求の
   範囲第１９項に記載の方法。 ３１、前記抗原が不均一混合物の成分である特許請求の
   範囲第１９項に記載の方法。 ３２、前記抗原が濃縮された抗原混合物の成分である特
   許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ３３、前記抗原が濃縮された抗原混合物の少なくとも１
   ｗ／ｗ％を代表する特許請求の範囲第３２項に記載の方
   法。 ３４、前記抗原が可溶性抗原である特許請求の範囲第１
   ９項に記載の方法。 ３５、前記抗原が腫瘍関連抗原である特許請求の範囲第
   １９項に記載の方法。 ３６、前記抗原が、前記の免疫感作された動物種と同一
   であるか又は進化的に密接に関連している動物種から得
   られたものである特許請求の範囲第１９項に記載の方法
   。 ３７、既存のモノクローナル抗体により認識されるエピ
   トープとは異るエピトープに対して特異的なモノクロー
   ナル抗体の製造方法であって、多価抗原の第一エピトー
   プに対して向けられた第一モノクローナル抗体を不溶化
   されたプロテインＡ上に吸収せしめ、これによってイム
   ノソルベントを形成せしめ； このイムノソルベントを前記抗原と一緒にして不溶化さ
   れた免疫複合体を形成せしめ、この複合体においては前
   記第一エピトープが前記第一モノクローナル抗体により
   マスクされており； この不溶化された免疫複合体により動物を免疫感作し； この免疫感作された動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と融
   合せしめて前記第二エピトープに対する第二モノクロー
   ナル抗体を生産することができるハイブリドーマを形成
   し； このハイブリドーマを培養して前記第二モノクローナル
   抗体を生産せしめ；そして 該ハイブリドーマの生産物として前記第二モノクローナ
   ル抗体を回収する； 段階を含んで成る方法。 ３８、前記不溶化されたプロテインＡが不活性マトリク
   スに結合したプロテインＡから成る特許請求の範囲第３
   ７項に記載の方法。 ３９、前記不活性マトリクスがポリサッカライドマトリ
   クスである特許請求の範囲第３８項に記載の方法。 ４０、前記不活性ポリサッカライドマトリクスがセファ
   ロースである特許請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４１、前記不活性マトリクスが粒子の形態である特許請
   求の範囲第３８項に記載の方法。 ４２、前記粒子がビーズの形態である特許請求の範囲第
   ４１項に記載の方法。 ４３、抗体を吸収する段階の後に抗体とプロテインＡと
   を架橋する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第３
   ７項に記載の方法。 ４４、抗原を一緒にする段階の後に抗体と抗原とを架橋
   する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第３７項に
   記載の方法。 ４５、前記抗原が精製された均一抗原である特許請求の
   範囲第３７項に記載の方法。 ４６、前記抗原が不均一混合物の成分である特許請求の
   範囲第３７項に記載の方法。 ４７、前記不均一混合物がヒト黒色腫細胞の抽出物であ
   る特許請求の範囲第４６項に記載の方法。 ４８、前記抗原がヒト黒色腫関連プロテオグリカンであ
   る特許請求の範囲第４６項に記載の方法。 ４９、前記第一エピトープが、モノクローナル抗体９．
   ２．２７に結合するヒト黒色腫関連プロテオグリカンの
   エピトープである特許請求の範囲第３７項に記載の方法
   。 ５０、前記抗原が濃縮された抗原混合物の成分である特
   許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ５１、前記抗原が濃縮された抗原混合物の少なくとも１
   ｗ／ｗ％を代表する特許請求の範囲第５０項に記載の方
   法。 ５２、前記抗原が可溶性抗原である特許請求の範囲第３
   ７項に記載の方法。 ５３、前記抗原が腫瘍関連抗原である特許請求の範囲第
   ３７項に記載の方法。 ５４、前記抗原が、前記免疫感作された動物種と同一で
   あるか又は進化的に密接に関連する動物種から得られた
   ものである、特許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ５５、セルラインＮＲ−Ｍ１−０２Ａ１９２３。 ５６、特許請求の範囲第５５項に記載のセルラインによ
   り生産されるモノクローナル抗体。 ５７、セルラインＮＲ−Ｍ１−０３Ａ２２１５。 ５８、特許請求の範囲第５７項に記載のセルラインによ
   り生産されるモノクローナル抗体。 ５９、セルラインＮＲ−Ｍ１−０４Ａ１９９３。 ６０、特許請求の範囲第５９項に記載のセルラインによ
   り生産されるモノクローナル抗体。 ６１、セルラインＮＲ−Ｍ１−０５Ａ２１０６。 ６２、特許請求の範囲第６１項に記載のセルラインによ
   り生産されるモノクローナル抗体。 ６３、セルラインＮＲ−Ｍ１−０６Ａ３０２６。 ６４、特許請求の範囲第６３項に記載のセルラインによ
   り生産されるモノクローナル抗体。 ６５、モノクローナル抗−イデオタイプ抗体の製造方法
   であって、 第一抗体を不溶化されたプロテインＡ上に吸収せしめ、
   これによってイムノソルベントを形成せしめ； このイムノソルベントにより動物を免疫感作し；この免
   疫感作された動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と融合せし
   めて、前記第一抗体のイデオタイプに対するモノクロー
   ナル抗体を生産することができるハイブリドーマを形成
   し； このハイブリドーマを培養して前記モノクローナル抗体
   を生成せしめ；そして 該ハイブリドーマの生産物として前記モノクローナル抗
   体を回収する； 段階を含んで成る方法。 ６６、第一抗体を不溶化されたプロテインＡ上に吸収さ
   せ、これによってイムノソルベントを形成せしめる段階
   の後に、前記第一抗体により認識される第二抗体を前記
   イムノソルベントと一緒にし、これによって不溶化され
   た免疫複合体を形成せしめる段階を含む、特許請求の範
   囲第６５項に記載の方法。 ６７、前記第一抗体が抗−グロブリンであり、そして前
   記第二抗体が抗−抗原である特許請求の範囲第６６項に
   記載の方法。 ６８、前記不溶化されたプロテインＡが不活性マトリク
   スに結合したプロテインＡから成る特許請求の範囲第６
   ５項に記載の方法。 ６９、前記不活性マトリクスがポリサッカライドマトリ
   クスである特許請求の範囲第６８項に記載の方法。 ７０、前記不活性ポリサッカライドマトリクスがセファ
   ロースである特許請求の範囲第６９項に記載の方法。 ７１、前記不活性マトリクスが粒子の形態である特許請
   求の範囲第６８項に記載の方法。 ７２、前記粒子がビーズの形態である特許請求の範囲第
   ７１項に記載の方法。 ７３、抗体を吸収する段階の後に抗体とプロテインＡと
   を架橋する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第６
   ５項に記載の方法。 ７４、抗原を一緒にする段階の後に抗体と抗原とを架橋
   する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第６５項に
   記載の方法。 ７５、前記第一抗体が、前記免疫感作された動物種と同
   一であるか又は進化的に密接に関連する動物種から得ら
   れたものである特許請求の範囲第６５項に記載の方法。 ７６、免疫原として使用するための不溶化された免疫複
   合体であって、 不溶化されたプロテインＡ上に吸収された抗体；及び 前記抗体により認識されそしてそれと一緒にされた抗原
   ； を含んで成る複合体。 ７７、前記抗体がプロテインＡと架橋されている特許請
   求の範囲第７６項に記載の不溶化された免疫複合体。 ７８、前記抗原が抗体と架橋されている特許請求の範囲
   第７６項に記載の不溶化された免疫複合体。 ７９、前記不溶化されたプロテインＡが不活性ポリサッ
   カライドマトリクスに結合したプロテインＡから成る特
   許請求の範囲第７６項に記載の不溶化された免疫複合体
   。 ８０、前記不活性マトリクスがポリサッカライドマトリ
   クスである特許請求の範囲第７９項に記載の不溶化され
   た免疫複合体。 ８１、前記不活性ポリサッカライドマトリクスがセファ
   ロースである特許請求の範囲第８０項に記載の不溶化さ
   れた免疫複合体 ８２、前記不活性マトリクスが粒子の形態である特許請
   求の範囲第７９項に記載の不溶化された免疫複合体。 ８３、前記粒子がビーズの形態である特許請求の範囲第
   ８２項に記載の不溶化された免疫複合体。 ８４、前記抗体がポリクローナル単一特異的抗体である
   特許請求の範囲第７６項に記載の不溶化された免疫複合
   体。 ８５、前記抗体がポリクローナル多特異的抗体である特
   許請求の範囲第７６項に記載の不溶化された免疫複合体
   。 ８６、前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求の
   範囲第７６項に記載の不溶化された免疫複合体。 ８７、前記抗原が精製された均一抗原である特許請求の
   範囲第７６項に記載の不溶化された免疫複合体。 ８８、前記抗原が不均一抗原である特許請求の範囲第７
   ６項に記載の不溶化された免疫複合体。 ８９、前記抗原が濃縮された抗原である特許請求の範囲
   第７６項に記載の不溶化された免疫複合体。 ９０、前記抗原が濃縮された抗原混合物の少なくとも１
   ｗ／ｗ％を代表する特許請求の範囲第８９項に記載の不
   溶化された免疫複合体。 ９１、前記抗原が腫瘍関連抗原である特許請求の範囲第
   ７６項に記載の不溶化された免疫複合体。 ９２、前記抗原が第二抗体である特許請求の範囲第７６
   項に記載の不溶化された免疫複合体。 ９３、前記抗原が、前記の免疫感作された動物種と同一
   であるか進化的に密接に関連している動物種から得られ
   たものである特許請求の範囲第９１項に記載の不溶化さ
   れた免疫複合体。 ９４、モノクローナル抗−イデオタイプ抗体の製造にお
   いて使用するためのイムノソルベントであって、 不溶化されたプロテインＡ上に吸収され抗体；を含んで
   成るイムノソルベント。 ９５、前記不溶化されたプロテインＡが不活性マトリク
   スに結合したプロテインＡから成る特許請求の範囲第９
   ４項に記載のイムノソルベント。 ９６、前記不活性マトリクスがポリサッカライドマトリ
   クスである特許請求の範囲第９５項に記載のイムノソル
   ベント。 ９７、前記不活性ポリサッカライドマトリクスがセファ
   ロースである特許請求の範囲第９６項に記載のイムノソ
   ルベント。 ９８、前記不活性マトリクスが粒子の形態である特許請
   求の範囲第９５項に記載のイムノソルベント。 ９９、前記粒子がビーズの形態である特許請求の範囲第
   ９８項に記載のイムノソルベント。 １００、抗体を吸収する段階の後に抗体とプロテインＡ
   とを架橋する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第
   ９４項に記載のイムノソルベント。 １０１、前記抗体がポリクローナル単一特異的抗体であ
   る特許請求の範囲第９４項に記載のイムノソルベント。 １０２、前記抗体がポリクローナル多特異的抗体である
   特許請求の範囲第９４項に記載のイムノソルベント。 １０３、前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
   の範囲第９４項に記載のイムノソルベント。 １０４、前記抗原が、前記の免疫感作された動物種と同
   一であるか又は進化的に密接に関連している動物種から
   得られたものである特許請求の範囲第９４項に記載のイ
   ムノソルベント。 １０５、免疫原として使用するための不溶化された免疫
   複合体であって セファロースに直接連結された抗体；及び 該抗体により認識されそしてこれと一緒にされた抗原； を含んで成る複合体。 １０６、前記セファロースがＣＮＢｒ−セファロースで
   ある特許請求の範囲第１０５項に記載の不溶化された免
   疫複合体。 １０７、抗原を一緒にする段階の後に抗体と抗原とを架
   橋する追加の段階を含んで成る特許請求の範囲第１０５
   項に記載の不溶化された免疫複合体。 １０８、前記抗体がポリクローナル単一特異的抗体であ
   る特許請求の範囲第１０５項に記載の不溶化された免疫
   複合体。 １０９、前記抗体がポリクローナル多特異的抗体である
   特許請求の範囲第１０５項に記載不溶化された免疫複合
   体。 １１０、前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
   の範囲第１０５項に記載の不溶化された免疫複合体。 １１１、前記抗原が精製された均一抗原である特許請求
   の範囲第１０５項に記載の不溶化された免疫複合体。 １１２、前記抗原が不均一混合物の成分である特許請求
   の範囲第１０５項に記載の不溶化された免疫複合体。 １１３、前記抗原が濃縮された抗原混合物の成分である
   特許請求の範囲第１０５項に記載の不要化された免疫複
   合体。 １１４、前記抗原が濃縮された抗原混合物の少なくとも
   １ｗ／ｗ％を代表する特許請求の範囲第１１３項に記載
   の不溶化された免疫複合体。 １１５、前記抗原が可溶性抗原である特許請求の範囲第
   １０５項に記載の不溶化された免疫複合体。 １１６、前記抗原が腫瘍関連抗原である特許請求の範囲
   第１０５項に記載の不溶化された免疫複合体。 １１７、前記抗原が、前記の免疫感作された動物種と同
   一であるか又は進化的に密接に関連している動物種から
   得られたものである特許請求の範囲第１０５項に記載の
   不溶化された免疫複合体。