JPS632592B2 - - Google Patents
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- JPS632592B2 JPS632592B2 JP55124716A JP12471680A JPS632592B2 JP S632592 B2 JPS632592 B2 JP S632592B2 JP 55124716 A JP55124716 A JP 55124716A JP 12471680 A JP12471680 A JP 12471680A JP S632592 B2 JPS632592 B2 JP S632592B2
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- Japan
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- arginine
- oxidase
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- enzyme
- arginine oxidase
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、新規Ｌ−アルギニンオキシダーゼ
（Ｌ−Arginine oxydase）、およびその製造法、
その生産菌に関する。 従来、異種のアミノ酸に対して同程度に作用す
る酸化酵素としては、Ｌ−アミノ酸オキシターゼ
が知られていた〔J.Biol.Chem.、153、387
（1944）、J.Bacteriol.、55、401（1948）、
Biochem.J.、50、258（1952）、J.Bacteriol.、121、
656（1975）、Agric.Biol.Chem.、432531（1979）、
Method in Enzymology、 Ｂ（1971）など〕。 これらのＬ−アミノ酸オキシダーゼは、その基
質特異性が広く、一種のアミノ酸に強く作用する
ものではなく、例えば蛇毒Ｌ−アミノ酸オキシダ
ーゼはＬ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フエ
ニルアラニンに同程度に作用するものであつた。 本発明者らは、新潟県長岡市の用水路の汚泥よ
り分離した細菌Ｂ−0780菌株の培養物中に、Ｌ−
アルギニンに強い基質特性を有し、かつ下記反応
式〔〕 で示される反応を強く触媒する酵素作用を有する
酵素を見い出し、本酵素は、その基質特異性およ
びその酵素作用から明らかなとおり、公知のＬ−
アミノ酸オキシダーゼと全く異なる酵素であり、
よつて新規酵素と認め、Ｌ−アルギニンオキシダ
ーゼと命名した。 まず本発明のＬ−アルギニンオキシダーゼの活
性測定法、基質特異性、酵素作用について述べ
る。 (1) 活性測定法 0.2ML−アルギニン溶液0.1ml、0.2Mジメチ
ルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（PH
6.5）0.2ml、0.3％４−アミノアンチピリン0.1
ml、0.2％フエノール0.1ml、ペルオキシダーゼ
（50U／ml）0.1ml、蒸留水0.3mlよりなる組成の
反応液0.9mlを小試験管に分注し、37℃で３分
間予備加温した後、酵素液0.1mlを加え、正確
に10分間37℃で反応せしめ、その後2.0mlエタ
ノールを加えて反応を停止せしめ、次いでその
反応液を480nｍにて比色測定し、その吸光度
を求める。 酵素単位としては、37℃で１分間に1μモル
の過酸化水素を生成する酵素量を１単位（1U）
とした。 酵素力価の算出方法は、次式にしたがつた。 力価（Ｕ／ml）＝△A480nｍX0.699 ×希釈倍率 （△A480nｍは、480nｍにおける吸光度を示
す） (2) 基質特異性 Ｌ−アルギニンオキシダーゼ0.047U含有液
0.1ml、５ｍＭ基質（第１表に記載の各基質）
含有液0.1ml、１ｍMEDTA0.1ml、0.2Mジメチ
ルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（PH
6.5）0.2ml、0.3％４−アミノアンチピリン0.1
ml、ペルオキシダーゼ（50U／ml）0.1ml、0.2
％フエノール0.1ml、蒸留水0.2mlよりなる反応
液を用いて反応せしめ、以下、活性測定法に基
いて各基質に対する活性を測定した結果、第１
表に示すとおりであつた。
（Ｌ−Arginine oxydase）、およびその製造法、
その生産菌に関する。 従来、異種のアミノ酸に対して同程度に作用す
る酸化酵素としては、Ｌ−アミノ酸オキシターゼ
が知られていた〔J.Biol.Chem.、153、387
（1944）、J.Bacteriol.、55、401（1948）、
Biochem.J.、50、258（1952）、J.Bacteriol.、121、
656（1975）、Agric.Biol.Chem.、432531（1979）、
Method in Enzymology、 Ｂ（1971）など〕。 これらのＬ−アミノ酸オキシダーゼは、その基
質特異性が広く、一種のアミノ酸に強く作用する
ものではなく、例えば蛇毒Ｌ−アミノ酸オキシダ
ーゼはＬ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フエ
ニルアラニンに同程度に作用するものであつた。 本発明者らは、新潟県長岡市の用水路の汚泥よ
り分離した細菌Ｂ−0780菌株の培養物中に、Ｌ−
アルギニンに強い基質特性を有し、かつ下記反応
式〔〕 で示される反応を強く触媒する酵素作用を有する
酵素を見い出し、本酵素は、その基質特異性およ
びその酵素作用から明らかなとおり、公知のＬ−
アミノ酸オキシダーゼと全く異なる酵素であり、
よつて新規酵素と認め、Ｌ−アルギニンオキシダ
ーゼと命名した。 まず本発明のＬ−アルギニンオキシダーゼの活
性測定法、基質特異性、酵素作用について述べ
る。 (1) 活性測定法 0.2ML−アルギニン溶液0.1ml、0.2Mジメチ
ルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（PH
6.5）0.2ml、0.3％４−アミノアンチピリン0.1
ml、0.2％フエノール0.1ml、ペルオキシダーゼ
（50U／ml）0.1ml、蒸留水0.3mlよりなる組成の
反応液0.9mlを小試験管に分注し、37℃で３分
間予備加温した後、酵素液0.1mlを加え、正確
に10分間37℃で反応せしめ、その後2.0mlエタ
ノールを加えて反応を停止せしめ、次いでその
反応液を480nｍにて比色測定し、その吸光度
を求める。 酵素単位としては、37℃で１分間に1μモル
の過酸化水素を生成する酵素量を１単位（1U）
とした。 酵素力価の算出方法は、次式にしたがつた。 力価（Ｕ／ml）＝△A480nｍX0.699 ×希釈倍率 （△A480nｍは、480nｍにおける吸光度を示
す） (2) 基質特異性 Ｌ−アルギニンオキシダーゼ0.047U含有液
0.1ml、５ｍＭ基質（第１表に記載の各基質）
含有液0.1ml、１ｍMEDTA0.1ml、0.2Mジメチ
ルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（PH
6.5）0.2ml、0.3％４−アミノアンチピリン0.1
ml、ペルオキシダーゼ（50U／ml）0.1ml、0.2
％フエノール0.1ml、蒸留水0.2mlよりなる反応
液を用いて反応せしめ、以下、活性測定法に基
いて各基質に対する活性を測定した結果、第１
表に示すとおりであつた。
【表】
【表】
上記第１表に示すとおり、本発明の酵素はＬ
−アルギニンに対して強く作用し、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、DL
−トリプトフアンの基質に対して極めて微弱に
作用を示し、さらにその他のＤ−、Ｌ−および
DL−アミノ酸およびＬ−ロイシル−Ｌ−リジ
ン、Ｌ−ロイシル−グリシン、Ｌ−ロイシル−
Ｌ−アルギニンに対しては作用を示さないもの
であることから、本発明の酵素は、Ｌ−アルギ
ニンに基質特異性を有すると認められる。 (3) 酵素作用 0.5ｍML−アルギニン溶液0.1ml、0.2Mジ
メチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH6.5）0.9ml、Ｌ−アルギニンオキシダー
ゼ溶液20μl（1.3U）よりなる反応系を用いて、
37℃、10分間反応せしめ、反応における酸素
消費量、アンモニア生成量をそれぞれ酸素電
極、アンモニア電極にて測定した。その結
果、Ｌ−アルギニン0.05μモル当り、酸素消
費量は0.047μモル、アンモニア生成量は
0.048μモルであつた。 活性測定法におけるＬ−アルギニン溶液の
代りに0.5ｍML−アルギニン溶液0.1mlを用
い、かつＬ−アルギニンオキシダーゼ溶液
0.1ml（1.3U）を用いて、以下活性測定法に
準じて行ない、反応における過酸化水素生成
量を測定した。その結果、Ｌ−アルギニン
0.05μモル当り、過酸化水素生成量は0.049μ
モルであつた。 以上の結果より、下記反応式〔〕 で示される酵素反応を触媒すると推定される。 以上の基質特異性および酵素作用から明らかな
とおり、本発明の酵素は、従来より知られていた
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる新規酵素と
認められ、その基質特異性の特徴よりＬ−アルギ
ニンオキシダーゼと命名した。 さらに本発明のＬ−アルギニンオキシダーゼに
関して限定するものではないが、その分子量、
Km値、等電点、至適PH、PH安定性、熱安定性、
至適温度、金属塩およびキレート剤の影響、コフ
アクターの影響について記載する。 (1) 分子量 140000±14000（セフアクリルＳ−200を用い
るゲル過法にて） (2) Km値 Km＝25×10-3M±2.5×10-3M（Ｌ−アルギ
ニンに対して） (3) 等電点 PH4.8±0.4（キヤリア−アンホライトを用い
る電気泳動法にて） (4) 至適PH 緩衝液として、ジメチルグルタル酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（PH3.8〜7.5）（第１図中、
〇−〇にて示す）、リン酸緩衝液（PH6.0〜7.8）
（第１図中、●−●にて示す）およびトリス−
塩酸緩衝液（PH6.8〜8.8）（第１図中、△−△
にて示す）を用い、各PHにおける本酵素の活性
測定を行なつた結果、第１図に示すとおりで、
本酵素の至適PHは6.5付近（37℃にて）と認め
られた。 (5) PH安定性 緩衝液として、ジメチルグルタル酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（PH3.8〜7.5）（第２図中、
〇−〇にて示す）、リン酸緩衝液（PH6.0〜7.8）
（第２図中、●−●にて示す）、トリス−塩酸緩
衝液（PH6.8〜8.8）（第２図中、△−△にて示
す）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH8.7〜9.2）（第２図中、▲−▲にて示す）を
用い、37℃、24時間保持した後、本酵素の活性
測定を行なつた結果、第２図に示すとおりで、
本酵素はPH6.0付近に安定性を有すると認めら
れた。 (6) 熱安定性 ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（PH6.5）を用いて各温度で10分間処理した
場合の熱安定性の結果は第３図に示すとおり
で、その結果、本酵素は25℃まで安定であると
認められた。 (7) 至適PH 活性測定法における反応液と同一組成よりな
る反応液を用い、種々の温度にてその至適温度
を測定した結果、第４図に示すとおりで、本酵
素の至適PHは25℃付近と認められた。 (8) 金属塩およびキレート剤の影響 活性測定法における反応液に、各々第２表に
示す金属塩、キレート剤を添加して、その影響
を求めた。その結果、第２表に示すとおりであ
つた。
−アルギニンに対して強く作用し、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、DL
−トリプトフアンの基質に対して極めて微弱に
作用を示し、さらにその他のＤ−、Ｌ−および
DL−アミノ酸およびＬ−ロイシル−Ｌ−リジ
ン、Ｌ−ロイシル−グリシン、Ｌ−ロイシル−
Ｌ−アルギニンに対しては作用を示さないもの
であることから、本発明の酵素は、Ｌ−アルギ
ニンに基質特異性を有すると認められる。 (3) 酵素作用 0.5ｍML−アルギニン溶液0.1ml、0.2Mジ
メチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH6.5）0.9ml、Ｌ−アルギニンオキシダー
ゼ溶液20μl（1.3U）よりなる反応系を用いて、
37℃、10分間反応せしめ、反応における酸素
消費量、アンモニア生成量をそれぞれ酸素電
極、アンモニア電極にて測定した。その結
果、Ｌ−アルギニン0.05μモル当り、酸素消
費量は0.047μモル、アンモニア生成量は
0.048μモルであつた。 活性測定法におけるＬ−アルギニン溶液の
代りに0.5ｍML−アルギニン溶液0.1mlを用
い、かつＬ−アルギニンオキシダーゼ溶液
0.1ml（1.3U）を用いて、以下活性測定法に
準じて行ない、反応における過酸化水素生成
量を測定した。その結果、Ｌ−アルギニン
0.05μモル当り、過酸化水素生成量は0.049μ
モルであつた。 以上の結果より、下記反応式〔〕 で示される酵素反応を触媒すると推定される。 以上の基質特異性および酵素作用から明らかな
とおり、本発明の酵素は、従来より知られていた
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとは異なる新規酵素と
認められ、その基質特異性の特徴よりＬ−アルギ
ニンオキシダーゼと命名した。 さらに本発明のＬ−アルギニンオキシダーゼに
関して限定するものではないが、その分子量、
Km値、等電点、至適PH、PH安定性、熱安定性、
至適温度、金属塩およびキレート剤の影響、コフ
アクターの影響について記載する。 (1) 分子量 140000±14000（セフアクリルＳ−200を用い
るゲル過法にて） (2) Km値 Km＝25×10-3M±2.5×10-3M（Ｌ−アルギ
ニンに対して） (3) 等電点 PH4.8±0.4（キヤリア−アンホライトを用い
る電気泳動法にて） (4) 至適PH 緩衝液として、ジメチルグルタル酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（PH3.8〜7.5）（第１図中、
〇−〇にて示す）、リン酸緩衝液（PH6.0〜7.8）
（第１図中、●−●にて示す）およびトリス−
塩酸緩衝液（PH6.8〜8.8）（第１図中、△−△
にて示す）を用い、各PHにおける本酵素の活性
測定を行なつた結果、第１図に示すとおりで、
本酵素の至適PHは6.5付近（37℃にて）と認め
られた。 (5) PH安定性 緩衝液として、ジメチルグルタル酸−水酸化
ナトリウム緩衝液（PH3.8〜7.5）（第２図中、
〇−〇にて示す）、リン酸緩衝液（PH6.0〜7.8）
（第２図中、●−●にて示す）、トリス−塩酸緩
衝液（PH6.8〜8.8）（第２図中、△−△にて示
す）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（PH8.7〜9.2）（第２図中、▲−▲にて示す）を
用い、37℃、24時間保持した後、本酵素の活性
測定を行なつた結果、第２図に示すとおりで、
本酵素はPH6.0付近に安定性を有すると認めら
れた。 (6) 熱安定性 ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝
液（PH6.5）を用いて各温度で10分間処理した
場合の熱安定性の結果は第３図に示すとおり
で、その結果、本酵素は25℃まで安定であると
認められた。 (7) 至適PH 活性測定法における反応液と同一組成よりな
る反応液を用い、種々の温度にてその至適温度
を測定した結果、第４図に示すとおりで、本酵
素の至適PHは25℃付近と認められた。 (8) 金属塩およびキレート剤の影響 活性測定法における反応液に、各々第２表に
示す金属塩、キレート剤を添加して、その影響
を求めた。その結果、第２表に示すとおりであ
つた。
【表】
(9) コフアクターの影響
活性測定法における反応液に、各々第３表に
示すコフアクターを添加して、その影響を求め
た。その結果は、第３表に示すとおりであつ
た。
示すコフアクターを添加して、その影響を求め
た。その結果は、第３表に示すとおりであつ
た。
【表】
また本発明の新規Ｌ−アルギニンオキシター
ゼ生産菌である細菌Ｂ−0780菌株は、新潟県長
岡市の用水路の汚泥を、肉エキス0.4％、ペプ
トン1.0％、食塩0.3％、Ｌ−アミノ酸0.1％およ
び寒天1.5％よりなるスクリーニング用寒天培
地に塗布せしめ、30℃で30時間培養して、Ｌ−
アルギニンオキシターゼ活性を示す生育したコ
ロニーを分取して得たものである。 本菌Ｂ−0780菌株の肉眼的および顕微鏡的観察
に基く各種培地上における培養の特徴は、次に記
載するとおりである。 Ａ 肉眼的観察 (1) 普通寒天斜面培地 線状に生育し、半透明、淡黄色で、生育速
度はやゝ遅い。可溶性色素は産生しない。 (2) 普通寒天平板培地 丸い小さな集落を形成、半透明、淡黄色を
呈する。可溶性色素は産生しない。 (3) ブイヨン培地 生育は弱いが、一様に混濁後、沈澱を生ず
る。 Ｂ 形態的特徴 若い細胞（培養後12時間）は、まつすぐ、ま
たはやゝ曲つた桿状、混棒状またはクラブ状
で、Ｖ字型、Ｗ字型、Ｙ字型およびＵ字型の細
胞配列が観察される。大きさは0.5〜1.0×1.5〜
3.0μ。古い細胞（培養後24時間以上）では短桿
状または球状になる。運動性はない。芽胞形成
能はない。 Ｃ 生理的、生化学的性状 グラム染色、抗酸性染色 − OFテスト Ｏ（酸化） ゼラチンの分解 − デンプンの分解 （＋） カゼインの分解 − エスクリンの分解 ＋ カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 （＋） ウレアーゼ産生 − インドール産生 − H2S産生 − VP、MRテスト − 硝酸塩の環元 ＋ BCPミルク 不変 クエン酸の利用 シモンズ培地 ＋ クリステンガン培地 ＋ 糖より酸の産生 下記の各種の糖より酸を産生するが、キシロ
ースは約４日、他の糖類は約７日頃弱い酸を産
生する。ガスは産生しない。 アドニトール、Ｌ（＋）−アラビノース、メソ
−エリスリトール、フラクトース、フコース、
ガラクトース、グルコース、グリセリン、マン
ニトール、マンノース、メリビオース、Ｌ（＋）
−ラムノース、ソルビトール、キシロース 酸を産生しない糖類 セロビオース、ヅルシトール、イノシトー
ル、イヌリン、ラクトース、マルトース、メレ
ジトース、ラフイノース、サリシン、Ｌ−ソル
ボース、デンプン、シユクロース、トレハロー
ス 酸素に対する態度 好気性 無機窒素源 硝酸塩 − アンモニウム塩 − 脱窒反応 − 生育温度範囲 15〜37℃ 生育PH範囲 PH６〜９ 以上のとおり、本菌Ｂ−0780菌株は、短時間
培養でＶ字型、Ｗ字型、Ｙ字型およびＵ字型の
細胞配列が観察される桿菌で、長時間培養で短
桿状または球状になる好気性の細菌で、またそ
の糖の利用の性状から、アースロバクター
（Arthrobacter）属に属すると認められ
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版（1957）および同第８
版（1974）、さらにアースロバクター属の７種
記載の内、アースロバクター・サイトレウス
（Arthrobacter citreus）に類似するものゝ、
以下の第４表に記載の点において差異が認めら
れる。
ゼ生産菌である細菌Ｂ−0780菌株は、新潟県長
岡市の用水路の汚泥を、肉エキス0.4％、ペプ
トン1.0％、食塩0.3％、Ｌ−アミノ酸0.1％およ
び寒天1.5％よりなるスクリーニング用寒天培
地に塗布せしめ、30℃で30時間培養して、Ｌ−
アルギニンオキシターゼ活性を示す生育したコ
ロニーを分取して得たものである。 本菌Ｂ−0780菌株の肉眼的および顕微鏡的観察
に基く各種培地上における培養の特徴は、次に記
載するとおりである。 Ａ 肉眼的観察 (1) 普通寒天斜面培地 線状に生育し、半透明、淡黄色で、生育速
度はやゝ遅い。可溶性色素は産生しない。 (2) 普通寒天平板培地 丸い小さな集落を形成、半透明、淡黄色を
呈する。可溶性色素は産生しない。 (3) ブイヨン培地 生育は弱いが、一様に混濁後、沈澱を生ず
る。 Ｂ 形態的特徴 若い細胞（培養後12時間）は、まつすぐ、ま
たはやゝ曲つた桿状、混棒状またはクラブ状
で、Ｖ字型、Ｗ字型、Ｙ字型およびＵ字型の細
胞配列が観察される。大きさは0.5〜1.0×1.5〜
3.0μ。古い細胞（培養後24時間以上）では短桿
状または球状になる。運動性はない。芽胞形成
能はない。 Ｃ 生理的、生化学的性状 グラム染色、抗酸性染色 − OFテスト Ｏ（酸化） ゼラチンの分解 − デンプンの分解 （＋） カゼインの分解 − エスクリンの分解 ＋ カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 （＋） ウレアーゼ産生 − インドール産生 − H2S産生 − VP、MRテスト − 硝酸塩の環元 ＋ BCPミルク 不変 クエン酸の利用 シモンズ培地 ＋ クリステンガン培地 ＋ 糖より酸の産生 下記の各種の糖より酸を産生するが、キシロ
ースは約４日、他の糖類は約７日頃弱い酸を産
生する。ガスは産生しない。 アドニトール、Ｌ（＋）−アラビノース、メソ
−エリスリトール、フラクトース、フコース、
ガラクトース、グルコース、グリセリン、マン
ニトール、マンノース、メリビオース、Ｌ（＋）
−ラムノース、ソルビトール、キシロース 酸を産生しない糖類 セロビオース、ヅルシトール、イノシトー
ル、イヌリン、ラクトース、マルトース、メレ
ジトース、ラフイノース、サリシン、Ｌ−ソル
ボース、デンプン、シユクロース、トレハロー
ス 酸素に対する態度 好気性 無機窒素源 硝酸塩 − アンモニウム塩 − 脱窒反応 − 生育温度範囲 15〜37℃ 生育PH範囲 PH６〜９ 以上のとおり、本菌Ｂ−0780菌株は、短時間
培養でＶ字型、Ｗ字型、Ｙ字型およびＵ字型の
細胞配列が観察される桿菌で、長時間培養で短
桿状または球状になる好気性の細菌で、またそ
の糖の利用の性状から、アースロバクター
（Arthrobacter）属に属すると認められ
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版（1957）および同第８
版（1974）、さらにアースロバクター属の７種
記載の内、アースロバクター・サイトレウス
（Arthrobacter citreus）に類似するものゝ、
以下の第４表に記載の点において差異が認めら
れる。
【表】
【表】
以上のとおり、本菌Ｂ−0780菌株は、アースロ
バクター属に属する菌と認められるが、本菌株の
諸性状がよく一致する菌はなく、よつて本菌株を
アースロバクター・エス・ビー・Ｂ−0780
（Arthrobacter sp.B−0780）と同定命名した
（微生物寄託番号通知書「微工研菌寄第5663号、
FERM−ＰNo.5663」）。 本発明における新規Ｌ−アルギニンオキシダー
ゼとしては、上記の基質特異性、酵素作用を有す
るものであればよく、その分子量、Km値、等電
点など多少の相異を示すものであつても、上記の
性状、作用を有するものは、本発明のそれに包含
されるもので、この新規Ｌ−アルギニンオキシダ
ーゼを得るための使用菌としては、上記の菌はそ
の一例である。 また本発明の製造法における使用菌としては、
上記の菌はその一例であつて、アースロバクター
属に属するＬ−アルギニンオキシターゼ生産能力
を有するものであればすべて本発明において使用
できる。もちろん微生物は、自然的、人工的に変
異を起こし易く、これらの変異株であつても、Ｌ
−アルギニンオキシダーゼの生産能力を失わない
限り本発明に使用できるものである。 本発明を実施するに当つて、アースロバクター
属に属するＬ−アルギニンオキシダーゼ生産菌に
ついて例示すれば次の如くである。すなわち、ア
ースロバクター属に属するＬ−アルギニンオキシ
ダーゼ生産菌を、抗生物質、酵素などを生産する
通常の方法で培養する。培養の形態は液体培養で
も、固体培養でもよいが、工業的にはＬ−アルギ
ニンオキシダーゼ生産菌の細胞を、その生産用培
地に接種し、深部通気撹拌培養を行なうのが有利
である。 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用される。窒素源として
は、利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ば、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カゼイ
ン、ペプトン、酵素エキス、種々の肉エキス、ア
ルギニンや種々のアミノ酸などが使用される。炭
素源としては、同化可能な炭素化合物であればよ
く、例えば、糖蜜、グルコース、デンプン加水分
解物、グリセリン、シユクロースなどが使用され
る。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシ
ウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム
などの種々の塩類や、消泡剤が必要に応じて使用
される。 培地温度は菌が発育し、Ｌ−アルギニンオキシ
ダーゼを生産する範囲内で適宜変更できるが、特
に好ましくは25〜30℃である。培養時間は条件に
よつて多少異なるが、通常24〜72時間程度であつ
て、Ｌ−アルギニンオキシダーゼが最高力価に達
する時期をみはからつて適当な時期に培養を終了
すればよい。 かくして得られたＬ−アルギニンオキシターゼ
生産菌の培養物において、Ｌ−アルギニンオキシ
ダーゼは大部分その菌体内に含有、蓄積されてい
る。 このようにして得られた培養物よりＬ−アルギ
ニンオキシダーゼを抽出するために一例を挙げれ
ば、まず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を
リン酸緩衝液などの溶液を用いて、リゾチーム処
理、超音波処理、フレンチプレス処理などの種々
の菌体処理手段を適宜選択組合せて、粗製のＬ−
アルギニンオキシダーゼ含有液を得る。 次いで、この粗製のＬ−アルギニンオキシダー
ゼ含有液は、さらに公知の蛋白質、酵素などの単
離、精製手段を用いて精製されたＬ−アルギニン
オキシダーゼを得る。例えば、粗製のＬ−アルギ
ニンオキシダーゼ含有液に、アセトン、メタノー
ル、エタノール、イソプロパノールなどの有機溶
媒により分別沈澱法を用いて、水溶液から沈澱せ
しめて回収してもよく、またはこのＬ−アルギニ
ンオキシダーゼ含有液を、ジエチルアミノエチル
−セルロース、ジエチルアミノエチル−デキスト
ランゲル、トリエチルアミノエチル−デキストラ
ンゲルなどのイオン交換法や、ポリアクリルアマ
イドゲルなどのゲル過剤による吸着クロマトグ
ラフイーを行なえばよく、またこれらの手段を適
宜組合せて、電気泳動法などにて単一の帯を示す
まで精製すればよく、次いで、これを凍結乾燥手
段などにより乾燥してＬ−アルギニンオキシダー
ゼの精製粉末を得る。 このようにして得られた新規Ｌ−アルギニンオ
キシターゼは、その基質特異性に示すとおり、Ｌ
−アルギニンに対して強く作用し、かつＬ−ロイ
シル−Ｌ−アルギニンに作用しないことから、ロ
イシンアミノペプチダーゼ（以下、LAPという）
活性測定に極めて有用な診断用酵素である。すな
わち、LAPに合成基質であるＬ−ロイシル−Ｌ
−アルギニンを作用せしめ、そのLAP活性によ
つて合成基質より生成されるＬ−アルギニンに、
このＬ−アルギニンオキシダーゼを作用せしめ、
次いで、この反応系において消費される酸素また
は生成される過酸化水素やアンモニアの成分を、
公知の電気的測定手段、例えば、酸素電極、過酸
化水素電極やアンモニア電極、その他過酸化水素
に対する呈色手段、螢光手段などに基いて定量
し、よつてLAPの活性測定をするもので、この
際、Ｌ−アルギニンオキシダーゼはその合成基質
には何んら作用せず、LAP活性に基いて合成基
質より生成するＬ−アルギニンにのみ作用するた
めに、極めて正確にLAP活性測定をすることが
できるものである。また、Ｌ−アルギニンオキシ
ダーゼは上記LAP活性測定用酵素としての有用
性に限定されるものではなく、食品成分、発酵液
成分などのＬ−アルギニンの分析用酵素、その他
種々利用されるものである。 次に本発明の実施例を挙げて具体的に説明する
が、本発明は、これによつて何んら限定されるも
のではない。 実施例 ポリペプトン1.0％、酵母エキス粉末1.0％、グ
ルコース1.0％、NaCl0.5％、MgSO40.05％、
K2HPO40.05％、エールリツヒ肉エキス1.0％、ミ
ルクカゼイン1.0％、アルギニン1.0％、消泡剤0.2
％よりなる培地（オートクレーブ滅菌、PH6.7）
100ml含有500ml容三角フラスコ（２本）に、アー
スロバクター・エス・ビー・Ｂ−0780菌株を接種
し、30℃、３日間振盪培養して種培養物を得た。 次いで、同一組成を有する培地20を有する30
容ジヤーフアメンターに、この種培養物２本を
接種し、30℃、２日間、200rpm、通気量20／
分の条件にて培養せしめた。培養終了後、培養物
を遠心分離（5000rpm、10分間）して湿菌体を取
得し、10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）にて２回菌
体を洗浄した。次いで、この湿菌体を５ｍＭ
EDTA含有20ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）に分散
せしめた後、リゾチーム濃度１mg／mlになるよう
にリゾチームを添加した。その後、これを遠心分
離（5000rpm、10分間）して上澄２を得た
（10000U）。 次いで、10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）にて充
填したジエチルアミノエチル−セルロースのカラ
ム（６×30cm）に上清をチヤージせしめ、２の
10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）にて洗浄後、０〜
0.5M KCl含有10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）の直
線濃度勾配法により溶出せしめ、約0.3M KCl含
有10ｍＭリン酸緩衝液にて溶出された活性区分を
回収し、さらに、この活性画分を限外過膜XM
−50（アミコン社製）にて濃縮した。次いで、こ
の濃縮液をセフアクリルＳ−200のカラム（3.6×
80cm）にチヤージし、10ｍＭリン酸緩衝液にて溶
出し、溶出液500〜600mlの間の溶出液を回収し、
これを凍結乾燥してＬ−アルギニンオキシターゼ
の粉末958mg（1380U、1.44U／mg）を得た。
バクター属に属する菌と認められるが、本菌株の
諸性状がよく一致する菌はなく、よつて本菌株を
アースロバクター・エス・ビー・Ｂ−0780
（Arthrobacter sp.B−0780）と同定命名した
（微生物寄託番号通知書「微工研菌寄第5663号、
FERM−ＰNo.5663」）。 本発明における新規Ｌ−アルギニンオキシダー
ゼとしては、上記の基質特異性、酵素作用を有す
るものであればよく、その分子量、Km値、等電
点など多少の相異を示すものであつても、上記の
性状、作用を有するものは、本発明のそれに包含
されるもので、この新規Ｌ−アルギニンオキシダ
ーゼを得るための使用菌としては、上記の菌はそ
の一例である。 また本発明の製造法における使用菌としては、
上記の菌はその一例であつて、アースロバクター
属に属するＬ−アルギニンオキシターゼ生産能力
を有するものであればすべて本発明において使用
できる。もちろん微生物は、自然的、人工的に変
異を起こし易く、これらの変異株であつても、Ｌ
−アルギニンオキシダーゼの生産能力を失わない
限り本発明に使用できるものである。 本発明を実施するに当つて、アースロバクター
属に属するＬ−アルギニンオキシダーゼ生産菌に
ついて例示すれば次の如くである。すなわち、ア
ースロバクター属に属するＬ−アルギニンオキシ
ダーゼ生産菌を、抗生物質、酵素などを生産する
通常の方法で培養する。培養の形態は液体培養で
も、固体培養でもよいが、工業的にはＬ−アルギ
ニンオキシダーゼ生産菌の細胞を、その生産用培
地に接種し、深部通気撹拌培養を行なうのが有利
である。 培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用される。窒素源として
は、利用可能な窒素化合物であればよく、例え
ば、コーン・スチープ・リカー、大豆粉、カゼイ
ン、ペプトン、酵素エキス、種々の肉エキス、ア
ルギニンや種々のアミノ酸などが使用される。炭
素源としては、同化可能な炭素化合物であればよ
く、例えば、糖蜜、グルコース、デンプン加水分
解物、グリセリン、シユクロースなどが使用され
る。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシ
ウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム
などの種々の塩類や、消泡剤が必要に応じて使用
される。 培地温度は菌が発育し、Ｌ−アルギニンオキシ
ダーゼを生産する範囲内で適宜変更できるが、特
に好ましくは25〜30℃である。培養時間は条件に
よつて多少異なるが、通常24〜72時間程度であつ
て、Ｌ−アルギニンオキシダーゼが最高力価に達
する時期をみはからつて適当な時期に培養を終了
すればよい。 かくして得られたＬ−アルギニンオキシターゼ
生産菌の培養物において、Ｌ−アルギニンオキシ
ダーゼは大部分その菌体内に含有、蓄積されてい
る。 このようにして得られた培養物よりＬ−アルギ
ニンオキシダーゼを抽出するために一例を挙げれ
ば、まず培養物を固液分離し、得られる湿菌体を
リン酸緩衝液などの溶液を用いて、リゾチーム処
理、超音波処理、フレンチプレス処理などの種々
の菌体処理手段を適宜選択組合せて、粗製のＬ−
アルギニンオキシダーゼ含有液を得る。 次いで、この粗製のＬ−アルギニンオキシダー
ゼ含有液は、さらに公知の蛋白質、酵素などの単
離、精製手段を用いて精製されたＬ−アルギニン
オキシダーゼを得る。例えば、粗製のＬ−アルギ
ニンオキシダーゼ含有液に、アセトン、メタノー
ル、エタノール、イソプロパノールなどの有機溶
媒により分別沈澱法を用いて、水溶液から沈澱せ
しめて回収してもよく、またはこのＬ−アルギニ
ンオキシダーゼ含有液を、ジエチルアミノエチル
−セルロース、ジエチルアミノエチル−デキスト
ランゲル、トリエチルアミノエチル−デキストラ
ンゲルなどのイオン交換法や、ポリアクリルアマ
イドゲルなどのゲル過剤による吸着クロマトグ
ラフイーを行なえばよく、またこれらの手段を適
宜組合せて、電気泳動法などにて単一の帯を示す
まで精製すればよく、次いで、これを凍結乾燥手
段などにより乾燥してＬ−アルギニンオキシダー
ゼの精製粉末を得る。 このようにして得られた新規Ｌ−アルギニンオ
キシターゼは、その基質特異性に示すとおり、Ｌ
−アルギニンに対して強く作用し、かつＬ−ロイ
シル−Ｌ−アルギニンに作用しないことから、ロ
イシンアミノペプチダーゼ（以下、LAPという）
活性測定に極めて有用な診断用酵素である。すな
わち、LAPに合成基質であるＬ−ロイシル−Ｌ
−アルギニンを作用せしめ、そのLAP活性によ
つて合成基質より生成されるＬ−アルギニンに、
このＬ−アルギニンオキシダーゼを作用せしめ、
次いで、この反応系において消費される酸素また
は生成される過酸化水素やアンモニアの成分を、
公知の電気的測定手段、例えば、酸素電極、過酸
化水素電極やアンモニア電極、その他過酸化水素
に対する呈色手段、螢光手段などに基いて定量
し、よつてLAPの活性測定をするもので、この
際、Ｌ−アルギニンオキシダーゼはその合成基質
には何んら作用せず、LAP活性に基いて合成基
質より生成するＬ−アルギニンにのみ作用するた
めに、極めて正確にLAP活性測定をすることが
できるものである。また、Ｌ−アルギニンオキシ
ダーゼは上記LAP活性測定用酵素としての有用
性に限定されるものではなく、食品成分、発酵液
成分などのＬ−アルギニンの分析用酵素、その他
種々利用されるものである。 次に本発明の実施例を挙げて具体的に説明する
が、本発明は、これによつて何んら限定されるも
のではない。 実施例 ポリペプトン1.0％、酵母エキス粉末1.0％、グ
ルコース1.0％、NaCl0.5％、MgSO40.05％、
K2HPO40.05％、エールリツヒ肉エキス1.0％、ミ
ルクカゼイン1.0％、アルギニン1.0％、消泡剤0.2
％よりなる培地（オートクレーブ滅菌、PH6.7）
100ml含有500ml容三角フラスコ（２本）に、アー
スロバクター・エス・ビー・Ｂ−0780菌株を接種
し、30℃、３日間振盪培養して種培養物を得た。 次いで、同一組成を有する培地20を有する30
容ジヤーフアメンターに、この種培養物２本を
接種し、30℃、２日間、200rpm、通気量20／
分の条件にて培養せしめた。培養終了後、培養物
を遠心分離（5000rpm、10分間）して湿菌体を取
得し、10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）にて２回菌
体を洗浄した。次いで、この湿菌体を５ｍＭ
EDTA含有20ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）に分散
せしめた後、リゾチーム濃度１mg／mlになるよう
にリゾチームを添加した。その後、これを遠心分
離（5000rpm、10分間）して上澄２を得た
（10000U）。 次いで、10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）にて充
填したジエチルアミノエチル−セルロースのカラ
ム（６×30cm）に上清をチヤージせしめ、２の
10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）にて洗浄後、０〜
0.5M KCl含有10ｍＭリン酸緩衝液（PH6.0）の直
線濃度勾配法により溶出せしめ、約0.3M KCl含
有10ｍＭリン酸緩衝液にて溶出された活性区分を
回収し、さらに、この活性画分を限外過膜XM
−50（アミコン社製）にて濃縮した。次いで、こ
の濃縮液をセフアクリルＳ−200のカラム（3.6×
80cm）にチヤージし、10ｍＭリン酸緩衝液にて溶
出し、溶出液500〜600mlの間の溶出液を回収し、
これを凍結乾燥してＬ−アルギニンオキシターゼ
の粉末958mg（1380U、1.44U／mg）を得た。
第１図はＬ−アルギニンオキシダーゼの至適PH
曲線、第２図はＬ−アルギニンオキシダーゼのPH
安定性曲線、第３図はＬ−アルギニンオキシダー
ゼの熱安定性曲線、第４図はＬ−アルギニンオキ
シダーゼの至適温度曲線を示す。
曲線、第２図はＬ−アルギニンオキシダーゼのPH
安定性曲線、第３図はＬ−アルギニンオキシダー
ゼの熱安定性曲線、第４図はＬ−アルギニンオキ
シダーゼの至適温度曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも、下記の基質特異性、酵素作用、
分子量、Km値、等電点、至適PHおよびPH安定性
を有する新規Ｌ−アルギニンオキシダーゼ。 基質特異性： Ｌ−アルギニンに基質特異性を有する。 酵素作用： 下記反応式〔〕で示される反応を強く触媒す
る酵素作用を有する。 分子量：140000±14000 Km値：25×10-3M±2.5×10-3（Ｌ−アルギニン
に対して） 等電点：PH4.8±0.4 至適PH：6.5付近 PH安定値：PH6.0付近 ２ アースロバクター属に属するＬ−アルギニン
オキシダーゼ生産菌を培養し、その培養物からＬ
−アルギニンオキシダーゼを採取することを特徴
とする少なくとも、下記の基質特異性、酵素作
用、分子量、Km値、等電点、至適PHおよびPH安
定性を有する新規Ｌ−アルギニンオキシダーゼの
製造法。 基質特異性： Ｌ−アルギニンに基質特異性を有する。 酵素作用： 下記反応式〔〕で示される反応を強く触媒す
る酵素作用を有する。 分子量：140000±14000 Km値：25×10-3M±2.5×10-3（Ｌ−アルギニン
に対して） 等電点：PH4.8±0.4 至適PH：6.5付近 PH安定値：PH6.0付近 ３ アースロバクター属に属するＬ−アルギニン
オキシダーゼ生産菌が、アースロバクター・エス
ピー・Ｂ−0780菌株である特許請求の範囲第２項
記載のＬ−アルギニンオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55124716A JPS5750886A (en) | 1980-09-10 | 1980-09-10 | Novel l-arginine oxydase, its preparation, and bacteria capable of producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55124716A JPS5750886A (en) | 1980-09-10 | 1980-09-10 | Novel l-arginine oxydase, its preparation, and bacteria capable of producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5750886A JPS5750886A (en) | 1982-03-25 |
| JPS632592B2 true JPS632592B2 (ja) | 1988-01-19 |
Family
ID=14892332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55124716A Granted JPS5750886A (en) | 1980-09-10 | 1980-09-10 | Novel l-arginine oxydase, its preparation, and bacteria capable of producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5750886A (ja) |
-
1980
- 1980-09-10 JP JP55124716A patent/JPS5750886A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5750886A (en) | 1982-03-25 |
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