JPS63267290A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡＩａＬ−アラニン Ａｒｇ　Ｌ−アルギニン ＡｓｎＬ−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨｉｓＬ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン １−ｅｕｌ−一ロイシン ＬＶＳＬ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−−プロリン ３ｅｒ　　ｌ−セリン ７ｈｒｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す、）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（＋−１２Ｎ）−及び−（Ｃ
ＯＯＩ−１）はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及
びカルボキシ末端側を示すものであり、（５′　）−及
び（３′　）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３
′末端側を示すものである。

（ａ　発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植した１ｙ１８ｔｈＡ肉腫によ
る癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し
、この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃ
ｒｏｓｉｓｌ”ａｃｔＯｒ　、以下ＴＮＦと略記するこ
ともある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ
ら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になッテ、Ｐｅｎｎ１ｃａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ！仏子の発現について報告した［　Ｄ　、　　ｐ　ｅ
ｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　≦１１２．　７
２４（１９８４）　］　。その後、自弁ら［Ｔ、　５ｈ
ｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［塞材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、ＷａＨら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎａら
、　５ｃｔｅｎｃｅ、ユ２８．　１４９（１９８５）　
　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ　ａｒ
ｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦｍ伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こず原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａ１ｌｌｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　、
ユ６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ
、　Ｒ８３ｅｌｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　
３１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている
。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ　ｓ　Ａ　ｆ及びＣｙｓ″’のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願
公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６ｌ−１０６７
７２）　、Ｇ　ＩＶ”の他のアミノ酸残基への置換（特
願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４８
号）。

Ａ１　ａ　／＃の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６
１＝２３３３３７号）が報告されている。また、アミノ
末端側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠
失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６１
−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活
性を有していること（特願昭６１−９００８７号）、１
〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており
、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大
になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０２３８１＠
）　、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有して
いること（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１１ア
ミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特
願昭６１−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその、組換え微生物
細胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方
法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ　＞　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＡＳｐ−Ｌｙｓ　−
Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　
ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅ
ｌＪ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｓｎ−Ａ
　ｒＯ−Ａ　ｒ（］−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉ
ａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ｇ　ＩＹ　−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ＝
　Ａ　ｒｏ−△Ｓｔ１−　Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ
　ｅｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｔ　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ
　−１ｌｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａ
ｌ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−ＣＶｓ−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　
−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｔ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ
　ｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−１ｌｅ　−
Ｓｅｐ　−Ａｒ（１−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ
−Ｔ’１ｌｒ−Ｇｌｎ　−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−△１ａ−１１ｅ　−Ｌ　ＶＳ　
−Ｓ　ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−ＣｙＳ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　
ｒ（１−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　
Ｉｙ−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐ
　ｒｏ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｙｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉ
ｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｖａｔ　−Ｐｈｅ　−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ−’Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒａ−Ｌｅ
ｕ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−１ｌｅ　−
Ａｓｎ　−Ａ　ｒａ　−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ｔ　Ｉ
／ｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　５ｌ）−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ
　Ｉｕ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉ’／−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ−ＴＶ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｉ　１ｅ−Ａ　Ｉａ−Ｌ
ｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍活性ポリへ
ブチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合したポリペ
プチドを提供することによって達成され、また上記新規
抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む
組換えプラスミドを提供することによって達成され、更
にかくして得られた組換えプラスミドによって形質転換
された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて目的
とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及び
この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物
を提供することによって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｑ　、　
ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧ△。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

”　３　ｏＩｌｌｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｑ　ｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　
　Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒＳ　　ｏｆＢ
　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　
、　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ　
、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）
　］。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎａｅｒら、Ｊ
。

ＡＬ　　Ｃｈｅｍ、３ｏｃ、、８９．４８０１（１９６
７）　］及びホスファイト法［Ｍ、Ｄ、　Ｍａｔｔｅｕ
ｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　　Ｌｅｔｔ、、　　２１．
　　７１９（１９８０）　　コ　があるが、合成時間、
収率、操作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成磯を
用いたホスファイト法による合成が好ましい。合成した
オリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高
速液体クロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合
せて用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、Ｂ　
ｏｌｉｖａｒら、　　Ｑｅｎｅ　、　　２．　９５（＋
９７７）　］のようなベクターに一度クローン化した後
、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が好
ましい。このようなヒトＴＮＦ−遺伝子を構成するブロ
ックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは
ｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡｒＩＴ片を連結した後、適当
なプロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配
列の下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすること
ができる。使用可能なプロモーターとして、トリプトフ
ァン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）
。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、　＋
ｐｐブＯモーター等があげられるが、とりわけｔｒｐプ
ロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有する
プラスミドとして、好ましくはＩＩＹ　Ｓ　３１Ｎ、又
はＩ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ３！ｉ
伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を
付与することができる。このようなターミネータ−とし
て、１ｐｐターミネータ−９ｔｒｐ　Ａターミネータ−
等があげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−
が好適であり、ｔｒｐＡターミネータ−を有するプラス
ミドとして、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

この発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＤＢＲ３２２
由来のベクターにり０−ン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦＩ伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はρＴＮ
Ｆ４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限醇素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
ブラ、スミドとして、好ましくはＤＴＮＦ　４１６．　
　Ｉ）ＴＮＦ４１６Ａ又はＩ）ＴＮＦ４７６が用いられ
る。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大賜菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ、β−，２７９（１９７８）　］を用いて、微
生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ−６０Ｏｒ−
１株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、“Ｍｏ＋ｅｃｕ＋ａｒＣｌｏｎｉｎａ”　
、　　Ｐ　　４４０．　　Ｃ０Ｉｄ　　　５ｐｒｉｎ。

Ｈａｒｂｏｒ　　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　、ＮｅＷ
　　ＹＯｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要
に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ま
しい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえ
ば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜
３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プ
ロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−イン
ドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により絹換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＯ８と略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
Ｍ　ｅｔｈΔ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉ
ｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　Ｉら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ、Ｊ。

Ｉｎ＋ｕｎｏｌ、、　１２Ｇ、　　２３５（１９８１）
　］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡
便さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による
評価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦｌ伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐｅｎｎｉｏａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ前
駆体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設
け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′
側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれ
ぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制
限酵素ＣｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳
開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーター
との連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下
流には制限酵素１−（ｉｎｄｌ［［による切断部位を設
け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにし
た。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５Ｉｄの溶出用バッフｐ　−［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ
　（ＤＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とうした
。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行
なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲ
ル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお
、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰
り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ３ｉ伝子のクローン化） 実施例２で作成した１１本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７＞を用いて、ヒトＴＮＦｆｆ
ｌ伝子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツｌ〜の
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ＧＯ１ｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μρの５０ｉ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐｔ−＋　９．５）　、　ｔｏ
　１Ｍ　　Ｍ（Ｊ　Ｃ１ｚ　。

５　　ｍＭジチオスレイトール、ＩＯＩＩＩＭ　　ＡＴ
Ｐ水溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了
後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混
合し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μｐの６６１ＭＴ
ｒｉＳ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，６）　、　　６．６　ｍＭ
　　ＭＣＩ　Ｃ１２゜１０１１１Ｍジチオスレイトール
、１ｉＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトのＴ
４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で１５
時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）を行ない、エチジウ
ムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行なう
。目的とする大きさく約２２０ｂｐ　）のバンド部分を
切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミド
ゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μりの大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ旦の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉ
ｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　　、　　６０　　ｇ＋Ｍ　
　　Ｎａ　　Ｃ１，７ｍＭＭＱＣＩｚ水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド
・バイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応
を行なった。

制限酵素Ｃ１ａ■による切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ文の５０　ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｆ　（＋）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　
Ｎａ　ＣＬ　１０１Ｍ　　ＩＶＨＩＳＯａ水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２２の大部分
を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ
　７ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｊＯ＜水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法ＣＣ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、　　
１０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ
　ｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩ→５ａｌＩ）をアガロー
スゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦｉ伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミド１）ＢＲ３２２の
大部分を含む約３．７Ｋｔ＋ｐのＤＮＡ水溶液と混合す
る。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ
断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−ｍ−株の形質転
換は、通常のＣａＣ５２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒ
ｄらの方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのし
培地（１％トリプトン、０．５％ｎｆＥエキス、０．５
％Ｎａ　ＣＲ，ＤＨ７，２）にエシェリヒア−］すＣ６
Ｃ６００ｒ−株の１８時間培養基を接種し、国体を含む
培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｌａ、）が０．
３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム
・バッファ　−［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ１，５ＩＢＭ　
　ＭｇＣｌ２゜５１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（１）Ｈ
７，６，０℃）］中で２回洗い、２１１１の冷したカル
シウム・バッファー［１００１Ｍｃａ　Ｃ１ｚ　、　２
５０　　ｓＭ　　ＫＣｆ、　５１μＭＭＯＣ第２　　、
　５　　１Ｍ　　　　ＴｒｉＳ−ＨＣｆ　　（ｐｔ−＋
　　　７．６゜０℃）コ中に再懸濁させ、０℃で２５分
間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ｊＩｅのＬＢＧ培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣオ、　　０．０８
％グルコース、　　Ｉ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃で
１時間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシ
リン（シグマ）３０μ９／ｄを含むし培地プレート］に
１００μｌ／プレートの割合で接種する。プレートを３
７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドＤＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋｂｐ＞を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４ＫｂＤ＞を、それぞれ作成した。第４図及び第
５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成
方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、　
Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６
５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ３
を、実施例３と同様にして制限酵素Ｃｆａ工及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　
ｌ−８ａｌＩ　）　ラボ’Ｌｊ　７　りＩＪ　／Ｌ。

アミドゲルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｚをｉｏｏμｐの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
＜　　１）Ｈ７，５）　、　６０ｉ　Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１
，７ｍＭＭＱＣ１ｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰＶｕＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時
間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じ
て１ｂｌＪ限酵素３ａｌ■による切断、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ３１ｉ！伝子の一部を含む約１
７０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕｌＩ＞をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
ｕｔｉも１００μＵの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
Ｒ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，７
ｍＭＭｇＣ１２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限
酵素ＰｖｕＩＩ及び４０ユニツトの制限酵素）−１ｉｎ
ｄｌＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ断片
（ＰＶＵＩＩ→ＨｉｎｄＩＩＩ）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドＩ
）ＹＳ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μグを、上記と同
様に制限酵素Ｃ１ａＩ及び）ｌｉｎｄｌ［で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミド１）ＹＳ３ＩＮの大部
分を含む約４．７Ｋｂｌ）のＤＮＡ断片（ＣｊａＩ←Ｈ
ｉｎｄｌ［をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ３ｕ伝子の一部を含む約
２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミド１）ＹＳ３１Ｎの大部分を含む約
４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｉ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦｍ伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋｂｌ）
）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミド１）ＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｌ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎ　５μびを、
上記の方法に準じて制限酵素ｐｖＪで部分分解した後、
さらに制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法
に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐ
のＤＮＡ断片［ｐ　ｖｕＩＩ　（２１＋　Ｈｉｎｄ　ｍ
コをアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するＡリボヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μびに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰｖｕＩｆ　（２Ｊ”　Ｈｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ　］と混合し、エタ／−／Ｌ［１（ｉｔ、実施例３
の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリＣ６００１’−１株に導入し、形質転換
株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋｂ
ｌ））を有するクローンを選択した。このようなプラス
ミドは、プラスミド１）ＹＳ３１Ｎからコピー数制御領
域除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニ
ング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ−
を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり
、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドＩ）ＡＡ４１　２μ９を、上記と同様に
制限酵素（ＪａＩ及び１−（ｉｎｄｌ［Ｉで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０，８％）の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大
部分を含む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ−
Ｈｉｎｄｌｌｒ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵素
ＣｆａＩ及び）（ｉｎｄｉ［［で切断し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦＩ転子全域を含む約４９０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片（Ｃオａ　Ｉ’−’Ｈｉｎｄ　ｌ）を
ポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７ＫｂＯのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝子
全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタ
ノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ト株に導入し、形質転換株の中より目的
のプラスミドＯＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂｐ
）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、ヒ
トＴＮＦｍ転子をより効率良く発現させる能力を有して
おり、第８図にその′作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮ　Ｆ３！伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮ２ｏμ９を、実施例４の方法
に準じて制限酵素ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄｎＩで切断
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）
及びアガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後
、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２
つのＤＮＡ断片（約４９０ｂＤ及び約４．γＫ　ｂｐ、
両方共ＣＩＢ　Ｉ　Ｈｆ−Ｊ　ｉｎｄ　ｍ　）をゲルよ
り回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦＩ転子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０ＩｉＭの１０１１１Ｍ　　Ｔｒｉ
Ｓ−）−ＩＣｊ　（＋）Ｈ７，５）　、　６０　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃ１，７ｍＭＭＯＣ１２水溶液に溶解させ、１
０ユニツトの制限酵素ＡＶａＩ（宝酒造）を添加して、
３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない
、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分
を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断片（ＡｖａＩＨＨｉｎｄ
■）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチドを、実施例２の方法に準じて、上の鎖と下の鎖
とに分けて合成、精製した。得られた２本の合成オリゴ
ヌクレオチドそれぞれ０．５μ３について、実施例３の
方法に準じて、末端のリン酸化を行なった後、アニーリ
ングさせた。

アニーリング後の２本鎖オリゴヌクレオチドを、先に得
られた約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩ−Ｈｉ
ｎｄｌ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約４
６０ｂ１１のＤＮＡ断片（ＡｖａＩ＋Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
）と浪合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準
じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・
コリＱ　６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミドｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　’４１ｆ３　（約
５．２Ｋ　ｂｌ））を有するクローンを選択した。この
プラスミドはＴＮＦのアミノ末端の７アミノ酸を欠失さ
せた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規
抗腫瘍活性ポリベブタド遺伝子発現型プラスミドであり
、第９図にその作成方法を示した。

さらに、ｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　ＮからｐＴＮＦ　４
０１Ａを作成した場合と同様な方法により、ＴＮＦのア
ミノ末端の７アミノ酸が欠失した形の新規抗腫瘍活性ポ
リペプチド遺伝子を効率良く発現させる能力を有する発
現型プラスミドｐＴＮ　Ｆ　４１６Ａ　（約３．２Ｋｂ
＋））を作成した。第８図その作成方法を示した。

上で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ　４１６Ａを、
実施例３の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［及び５
ａｌＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）及びアガロースゲル電気泳動くゲル濃度０
．８％）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて
、生成する２つのＤＮＡ断片（約２７０ｂｐ及び約２．
９Ｋ　ｂｐ、両方共３ａｌ■−ｅＨｉｎｄＩ［［）をゲ
ルより回収した。

ここで得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の３
′側半分を含む約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を５０μ文の
１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐ＋　７．４）　
、　１０ｍＭ　　Ｍｇ８０４　、１　１Ｍ　　ジチオス
レイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素
３ａｕ３ＡＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切
断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法
に準じて、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の３′側
の部分を含む約１９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｓａｕ３ＡＩ
”Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）　ヲポ’Ｊ　７　りＩＪ　ルア　
ミドゲルより回収した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μりについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

、ス、、’、、終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオ
チドを、先に得られた約２．９Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（
ＳａｌＩ　ＨＨｉｎｄ　Ｉ［［）及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチド遺伝子の３′側の部分を含む約１９０ｂｐの
ＤＮＡ断片（Ｓａｕ３ＡＩ＋ｔ−ｆｉｎｄ　Ｉ［Ｉ）と
混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて
、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣｅｏｏｒ−＋ｅ−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７６（約３．２Ｋｂｌ）
）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、次
のアミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ）　　Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＡＳＩ）−Ｌｙｓ−Ｐ
　ｒｏ　−Ｖａｌ　−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−
Ｖａｌ　−Ａｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ
　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ
　ｓｎ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒａ−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　
−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ−Ａ　
ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ
　ｒａ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ　−Ｖ
ａｌ　−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−
Ｇ　１ｖ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　ｌｅ−Ｔｙｒ
−５ｅｒ−ＧＩｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇ　１ｙ−ＣＶＳ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−１ｅｕ
　−１ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−ｌ　
ｌｅ　−３８ｒ　−Ａ　ｒ（１−１ｌｅ−Ａ　ｌａ−Ｖ
ａｌ−５ｅｒ−ＴＶｒ−Ｇ　１ｎ−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｙ
ｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ａ　ｌａ　−１ｌｅ　−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ　−Ｐｒ
ｏ　−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈ
ｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｌａ
　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　
−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｒｏ　−
１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ
−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ＶＳ−
Ｇ　Ｉｙ−Ａ　ＳＯ−Ａ　ｒ（１−しｅｕ　−３ｅｒ　
−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ＩＬＩ　−１ｌｅ　−Ａ　ｓｎ　−
Ａ　ｒｇ　−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ
−Ａ　ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ
−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ｌｎ−Ｖ　ａｌ−Ｔｙｒ−Ｐ　ｈｅ−
ｉｙ−１１ｅ−１Ｉｅ−Ａ　ｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ
）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコード
する新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ドであり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例５で得られた、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ　４１６゜＋）ＴＮ
Ｆ４１６Ａ又は１）ＴＮＦ４７６を有するエシェリヒア
・コリ（：、　６００ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／
−のアンピシリン、０．２％のグルコース及び４　Ｒ９
／ｙｄｌのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ２
ＨＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯａ　−０，０５％Ｎａ
Ｃ１−０．１％ＮＨｚ（Ｊ水溶液（ｐｔ−４７，４＞を
オートクレーブ滅菌した侵に、別途にオートクレーブ滅
菌したＭ（ｌ　ＳＯ４水溶液及びＣａ（Ｊ２水溶液をそ
れぞれ最終濃度２　ｍＭ及び０．１　ｍＭになるように
加える。］　　２５０ａｉ！に接種し、○Ｑ　１ａｚｙ
が０．７に達するまで、３７℃で振とう培養を行なった
。次いで、最終濃度５０μｇ／−の３−β−インドール
アクリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時
時間上う培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ４を含む２０　ｍＭリン
酸バッファ＋、ｐＨ７，４）を用いて菌体の洗浄を行な
った。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファーに懸濁
させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を用
いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の除去
を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファ　−（ｐＨ６，８）　、　ＳＤＳ、　２
−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ最
終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように加え
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木１選
伝、ど−、　４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＣ２
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｎ＋ｍｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０（１９７０）　］を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
ブルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なった。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（高車、　
Ｃ３−９３０型）にかけて、産生された新規抗腫瘍活性
ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算
出を行った。その結果、発現型プラスミド１）ＴＮＦ４
１６を有する大腸菌における新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドの産生量は、発現型プラスミド１）ＴＮＦ４１６Ａの
場合の約５０％にすぎず、発現ベクター１）Ａ　Ａ　４
１及び発現型プラスミドｐＴＮＦ　４１６Ａの有用性が
示された。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料１００μ文と、４×１０５
個／Ｉｆ１１の濃度のマウスし一９２９繊維芽細胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μ文を、９６穴の
組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合し
た。なおこの際に、最終濃度１μｇ／Ｉｄのアクチノマ
イシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培
地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血
清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（日
本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸
ガスを含む空気中、３７℃で１８時間培養した後、クリ
スタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）
メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のク
リスタル・バイオレットを溶解させたもの］を用いて生
細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを洗
い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレットを
１００μ文の０．５％ＳＯ８水溶液で抽出し、その５９
５ｎｍにおける吸光度をＥＬ［ＳＡアナライザー（東洋
測器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生
き残った細胞数に比例する。そこで、新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えな
い対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼー
トの希釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって求
め、その希釈倍率をユニットと定義する。第１１図より
、実施例６で得られた発現型プラスミド１）ＴＮＦ４７
６にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼ
ート　１００μ旦は５０ユニット程度の活性を有してい
ることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドＤＴＮＦ４７６に
コードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌
ライゼート中に含まれ総蛋白質Ｒは、プロティン・アッ
セイ・キット（バイオ・ラッド）を用いて定量し、ウシ
血清アルブミンを用いた検ｍ線より計算した。上記で得
られた活性の値及び蛋白質定量結果より新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの比活性を計口し
たところ、約７５（ユニット／ＩＲｇ−蛋白質）の比活
性を有していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドＥＩ
ＴＮＦＩＢＲ，Ｉ）ＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方
法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの
作成方法を、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作
成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラ
スミドＥＩＴＮＦ４０１Ａ及び新規抗腫瘍活性ポリペプ
チド遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ　４１６Ａの作
成方法を、それぞれ示したものである。第９図は新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮ
Ｆ４１６の作成方法を、そして第１０図は新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４７
６の作成方法を、それぞれ示したちのである。第１１図
は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示した
ものである。 特許出願人　帝　人　株　式　会　礼 式　　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純　　博　
○１ｒ２ｅＷ 鳥　４１ Ｐｖｕ　１［ 怖りｌ Ｑつ　ば） 晃’１１のＢ ｐｖｕ正（１） 慾　８　四 Ｈｉｈｊ　ＩＬ 第９図 第１Ｏ品、８ ）＋１ＪｊＬ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４７６である
   第３項記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする第７項記載微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。