JPS63269062A - 定量分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ　産業上の利用分野 この発明は、定量対象物質と試薬の化学反応により発生
する光を検出して定量分析を行なう定量分析方法に関す
る。

Ｂ　発明の概要 この発明は、酵素とその酵素に対する基質との反応によ
り生成する過酸化水素（以下、Ｈ２０□と略記）や水溶
液中に存在するＨ２Ｏ２あるいはアデノシン３リン酸（
以下、ＡＴＰと略記）を定量するための方法、に関する
ものである。

−従来の技術 酵素とその酵素に対する基質との反応により生成するＨ
２Ｏ２や水溶液中に存在するＨ２Ｏ２あるいはＡＴＰに
関しては、それぞれ化学発光現象および生物発光現象を
利用することにより定量することが可能である。

Ｈ２Ｏ２は、以下に示すようにペルオキシダーゼなどの
触媒の存在下で、化学発光物質であるルミノールと反応
して発光現象を生ずる。

ペルオキシダーゼ ）＋２０２　＋　Ｉ（２Ｎ−ｐｈ　（ＣＯＮＨ）２　　
　　　　　　　−Ｈ２Ｎ−ｐｈ　（ＣＯＯＨ）　２　＋
　Ｎ２　＋　ｈＶ・・・（１）また、ＡＴＰは、生物発
光物質であるルシフェリンとルシフェラーゼと反応して
、以下のように発光現象を生ずる。

１（０−ｐｈ（ＮＳ）２０Ｈ＋ＡＭＰ　＋ｃｏ２＋　ｈ
Ｖ”’（２）このような発光現象によって生成した光を
計測するための測定装置として、従来では、Ｈ２Ｏ２や
ＡＴＰ溶液のような定量対象物質とそれぞれの反応試薬
を一定量づつ、ピペットなどの手動式分注器により試験
管などの容器へ分取して、発光反応させた後に、この容
器を外光入射を遮蔽した密閉構造の暗箱中にホルダーな
どの治具を用いて保持して、光検出器により計測する方
法が一般的であった。

Ｄ　発明が解決しようとする問題点 ところが、発光現象の発光パターンは、発光物質および
触媒の緩衝液の濃度やｐＨ，また、発光物質の種類によ
り、さらには試薬の混合比などにより種々の発光パター
ンを示すことから種々の条件を固定しないかぎり直ちに
発光現象の相違を比較することができない。

一般的な生物発光および化学発光現象における発光量と
時間の関係は、第４図に示したような発光パターンとな
る。

この第４図において、発光量（ｃｐｓ）は、定量対象物
質と試薬との混合時刻ｔ。から時間の経過にともなって
急激に増大して、時刻ｔ１で最大値（ＣＰＳ）ｍａｘに
達し、その後は徐々に減少する挙動を示す。

第４図のように推移する発光量を正確に計測するには、
定量対象物質と試薬との混合直後の時刻ｔ１における初
期発光量（最大値）を検出することが必要となる。

上記のような種々の発光現象による発光量は、従来、一
般に市販されているエツベンドルフピペット、エクセル
ピペット、ハミルトンシリンジなどの手動式ピペットに
より、試験管などの容器の中に定量対象物質および試薬
を分注した後、混合して光検出器により測光する方法が
用いられている。

しかし、このような従来の測光方法では、′試験管など
の容器を光検出器を収納している測定室へ導入するのに
時間がかかり、初期発光量を計測することが困難であっ
た。

特に、生物発光現象では、発光量が最大値に到達する時
間が著しく短いので、初期発光量を精度よく計測するこ
とができないという欠点を有していた。

これとは別に、極めて希薄な濃度（例えば、ナノモル以
下）の定量対象物質について化学発光物質を利用して定
量する場合では、発光は非常に微弱となり、例えば、１
秒間当たり１０個以下の光子数を計数することも要求さ
れるが、この要求を満たすためには、光検出器へ入射す
る漏れ光量をできるたけ減少させなければならない。

このため、試験管などの容器やこの容器を保持するため
のホルダーなどを収納する測定室は、外光が入射しない
密閉構造の暗箱で構成する必要がある。

ところで、この暗箱は、内部に試験管などの容器やその
容器を保持するホルダーおよびそのホルダーを移動する
移動空間を必要とするため装置のコンパクト化の障害と
なる。

定量対象物質および試薬を混合した直後の初期発光量を
精度よく計測するために、自動分注器を用いる方法が考
えられる。

すなわち、自動分注器の分注針あるいは分注針に接糸光
されたポリテトラエチレンフルオダイド製などのチュー
ブに対して邪魔にならないような暗箱の位置に試験管な
どの容器を取出すための取出口を設けて、容器を取出口
の位置から正確な分注位置まで水平に移動させた後に、
その容器へ試薬の注入を行なって発光量の計測を行なう
方法である。

この目的に使用する注入器として自動分注器を採用すれ
ば、定量対象物質と試薬との混合直後の初期発光量の計
測が可能となるが、自動分注器を用いて計測する方法で
は、容器取出し位置と分注位置との間を機械的な方法に
より、容器を保持したホルダーの移動を行なわなければ
ならないために故障の原因となる。

また、試験管などの容器を出し入れする必要があるため
、密閉状態の暗箱内部がほこりなどにより汚染される危
険性も大きい。

さらに、自動分注器を用いた場合、分注される試薬が試
験管などの容器の外壁を伝わり、密閉構造の暗箱内部に
漏れることがあり、口ａ箱を構成する金属が腐食されて
しまう恐れがある。

この問題は、容器の内径を広くすれば解決できるが、そ
の反面では使用する定量対象物質および試薬は、高価な
ものもあるので容器の内径はできるだけ小さくし液量を
マイクロ化した方が有利であるという背反する要件を満
足させることかできないでいる。

とくに、２種類の試薬を同時に分注する場合、容器の内
径は、構造上最低１５ｍｍ程度は必要となり、定量対象
物質および試薬は、１００μｍ以上必要となることから
、試薬のマイクロ化ができないという問題がある。

一方、試験管などの容器を使用する場合では、当然その
容器を保持する治具が必要である。

発光量は、距離の２乗に反比例して減衰するので、容器
と光検出器との間の距離は、できるだけ接近させた方が
効率的であり、この手段が完全である場合にのみ、微弱
の光を検出することかできる。

しかし、容器をホルダー内に挿入するために、容器と光
検出器との間の距離を接近させるのに限界がある。

また、このように試験管などの容器を使用するバッチ式
測定の場合では、容器を使い捨てにするとコストがかか
るし、さらに、容器を洗浄して再使用しようとすると、
労力と時間を要するなどの問題がある。

自動分注器を用いた場合、測定中は、シリコンまたは前
述のようなフッ素系の合成樹脂製の送液チューブ内に試
薬が満たされているので、チューブの劣化が速いという
問題がある。

Ｅ　問題点を解決するための手段 この発明は、定量対象物質および試薬を混合することに
より発生する光を検出して、定量分析を行なう定量分析
方法であり、その具体的内容は、特定の測定フローシス
テムを使用して、液体試料を光学的方法により分析する
ことを特徴とする定量分析方法、に関するものである。

Ｆ　　作　　用 この発明で述べている特定の測定フローシステムとは、 （１）試薬または洗浄水を循環するための送液ポンプ、 （２）試薬または洗浄水の流路を切り換えるための流路
切り換えバルブ、 （３）試薬が循環している流路内へ定量対象物質を注入
するためのインジェクションバルブ、（４）試薬または
定量対象物質を別の構造物質に変換するため、または、
光学的に測定するための物質に変換するために樹脂や酵
素を充填した１つ以上のカラム、 （５）前記カラムの交換が容易にできるようにしたカラ
ム接続ジヨイント、 （６）前記カラムを温度調節するためのヒータ、（７）
前記カラムが２つ以上の場合に、同時にまたは別々に通
過させるための流路切り換えバルブ、（８）前記カラム
を通過したとき発生する光を効率よく測定するための外
光入射を遮蔽した密閉構造のフローセル、 （９）前記カラムと前記フローセルまでの距離を等しく
した配管（シリコンチューブまたはフッ素系合成樹脂製
チューブ）、 （ｌＯ）前記フローセルを通過したとき、発生している
光を検出するための光検出器、 （１１）前記光検出器の受光面に設けられた開閉シャッ
タ、 （１２）前記光検出器からの信号を増幅するための増幅
器、 （１３）前記増幅器により増幅された電流パルスを電圧
パルスに変換するための変換器、 （１４）電圧パルスをＴＴＬレベルに波形整形するため
の波形整形回路、 （１５）ＴＴＬレベルに波形整形されたパルスを計測す
るためと種々の制御を行なうためのマイクロプロセッサ
、 （１６）前記マイクロプロセッサで計測した計測値を表
示するための表示器、 （１７）前記マイクロプロセッサで計測した計測値を印
字するためのプリンタ、 （１８）前記マイクロプロセッサで計測した計測値をレ
コーダへ出力させるためのアナログ変換器、を備えてい
る測定装置を使用する液体試料を光学的方法により分析
する定量分析方法、である。

この測定方法をモデル的に示したものが、第１図である
。

この第１図によって認められるように、液体が流れる経
路は２系統存在しており、その第１流路は、蒸留水また
は試薬（ＤＷ）−ポンプ（Ｐ１）→バルブ（Ｂ１）→イ
ンジェクションバルブ（り→バルブ（Ｂ２）→カラム（
Ｃ１）またはカラム（Ｃ２）−バルブ（Ｂ３）−フロー
セル（Ｆ）一廃液ボトル（Ｈ）である。

また、第２流路は、試薬または蒸留水（Ｌ）−ポンプ（
Ｐ２）→バルブ（Ｂ１）→インジェクションバルブ（Ｉ
）→バルブ（Ｂ２）→カラム（Ｃ１）またはカラム（Ｃ
２）→バルブ（Ｂ３）→フローセル（Ｆ）→廃液ボトル
（Ｈ）である。

これらの第１および第２の流路は、バルブＢ１の切り換
えにより行なわれ、それぞれ同時に２つの流路を試薬が
流れる場合と、そうでない場合とがある。

上述の制御は、装置表面パネル（図示せず）上に設置さ
れた流路切り換えスイッチにより選択することができる
。

“また、カラム（Ｃ１）とカラム（Ｃ２）は、同様に装
置表面パネル上のカラム切り換えスイッチを選択するこ
とにより流路を決定するようになっている。

さらに、インジェクションバルブ（Ｉ）とカラム（Ｃ１
）との間の距離とインジェクションバルブ（Ｉ）とカラ
ム（Ｃ２）との間の距離は、等しく、カラム（Ｃ１）と
フローセル（Ｆ）との間の距離とカラム（Ｃ２）とフロ
ーセル（Ｆ）との間の距離は等しくなフている。

この発明を実施する際に使用する装置は、マニュアル操
作と自動操作が可能である。

マニュアル操作および自動操作のいずれの場合も、装置
表面パネル上の主電源スイッチ、スタートスイッチ、ス
トップスイッチ、ポンプ（Ｐｉ）スイッチは、手動で操
作するように設計されている。

また、マニュアル操作では、定量対象物質をインジェク
ションバルブへ充填する操作と、インジェクションバル
ブが定量対象物質を第１および第２流路内へ注入する操
作を手動で行なうようになっている。

マニュアル操作と自動操作の選択は、装置表面パネル上
の切り換えスイッチにより行なわれ、定量対象物質は、
インジェクションバルブ（１）から注入し、試薬との混
合溶液は、酵素などの触媒が充填されたカラム（Ｃ１ま
たはＣ２）を通過したとき発光が起る。

この発光している混合液は、フローセル（Ｆ）を通過し
て廃液ビン（Ｈ）へ到達し、ここで貯留するようになっ
ている。

混合液の発光エネルギーは、混合液がフローセル（Ｆ）
を通過する。とき、光検出器（Ｓ）の受光面に設けた開
放状態のシャッタ（ＳＨ）を通して光検出器（Ｓ）によ
り光電子（電気信号）に変換される。

この信号を増幅器（Ａ）により増幅すると共に電流パル
スを電圧パルスに変換し、この電圧パルスを波形整形回
路（Ｗ）によりＴＴＬレベルに波形整形した後、マイク
ロプロセッサ（Ｍ）により計測する。

この計測値は、装置に内蔵された表示器（Ｄ）に表示す
るが、計測値を装置に内蔵しているプリンタ（ＰＲ）お
よび／または装置外部のレコーダ（Ｒ）へ出力したいと
きには、装置表面パネル上のスイッチとテンキーにより
出力設定を行なえばプリンタ（ＰＲ）およびレコーダ（
Ｒ）へ計測値を出力することが可能である。

さらに、計測値をマイクロプロセッサ（Ｍ）にメモリす
ることが可能であるため、計測値の演算処理、たとえば
、ある時間間隔の積分値、変動系数などの算出を行なう
ことが可能である。

光検出器（Ｓ）の受光面に設けた開閉シャッタは、装置
表面パネル上のスタートスイッチを２度ＯＮにしたとき
、開放状態になるように設計されている。

Ｇ　実施例 以下、実施例を示してこの発明の構成および効果をより
詳細に説明する。

実施例　１ ルミノール・ペルオキシダーゼ系による過酸化水素の定
量 前記反応式（１）に従って発生する光を計測する場合に
ついて説明する。

定量対象物質はＨ２Ｏ２水溶液で、試薬（Ｌ）は、とし
てルミノールを０．２モル／Ｑｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９
，８）　に溶解したルミノール溶液である。

また、カラム（ＣＩ）には、以下の酵素を充填した。

使用した酵素は、ペルオキシダーゼ（２６４Ｕ／ｍ　ｇ
）である。

まず、装置表面パネル上のポンプ（Ｐ１）の０Ｎ−ＯＦ
ＦスイッチをＯＮにして蒸留水（ＤＷ）を第１流路内に
循環した。

分注器としてマイクロシリンジを用いて種々の濃度に調
整したＨ２Ｏ２水溶液をインジェクションバルブに充填
し、パネル上のスタートスイッチをＯＮにするとポンプ
（Ｐ１）が停止し、ポンプＰ２が自動的に作動し始める
。

ルミノール溶液が、第２流路内を循環し始め完全にイン
ジェクションバルブ（Ｉ）を通過した後に再度スタート
スイッチをＯＮにすると計測が開始する（ブランク測定
）。

インジェクションバルブ（Ｉ）に充填されたＨ２Ｏ２水
溶液を流路内へ注入すると、Ｈ２Ｏ２水溶液とルミノー
ル溶液との混合液は、カラム（Ｃ１）中のペルオキシダ
ーゼと接触しつつフローセル（Ｆ）を通過して廃液ビン
（Ｈ）へ到達して貯留する。

フローセル（Ｆ）を通過するとき、予め設定した計測プ
ログラムに従って所定時間の計測を行なう。

第２図は、この結果を示した一例であり、既知濃度のＨ
２Ｏ２水溶ン夜を１Ｏ−９〜１０−５モル／Ωｌにおい
て測定した結果を示したものである。

図中、実線はＨ２Ｏ２水溶液とルミノール溶液を混合し
て、５秒後から３０秒間の発光量の積分値を示したもの
で、破線はその３０秒間の最大値を示している。

実施例　２ ルシフェリン・ルシフェラーゼ系によるＡＴＰの定量 この例では、前記の反応式（２）に従フて、反応が進行
した時に発生する光を計測する場合について説明する。

実施例１におけると同様に、定量対象物質としてＡＴＰ
含有溶液、試薬（Ｌ）をルシフェリン溶液、カラム（Ｃ
１）にルシフェラーゼ（酵素）を充填した系により、Ａ
ＴＰ量を定量分析することができるが、この実施例２で
は、試薬（Ｌ）をルシフェリンとルシフェラーゼの混合
液として、カラム（Ｃ２）には何も充填せず、カラム（
Ｃ２）を通過させて測定した結果について説明する。

まず、装置表面パネルに設置されたポンプ（Ｐ１）の０
Ｎ−ＯＦＦスイッチをＯＮにして、蒸留水（ＤＷ）を第
１流路内に循環する。

次に、分注器としてマイクロシリンジを用いてＡＴＰ含
有溶液をインジェクションバルブ（１）に充填したのち
、装置表面パネル上のスタートスイッチをＯＮにすると
ポンプ（Ｐ１）が停止し、ポンプＰ２が自動的に作動し
始める。

ルシフェリン・ルシフェラーゼ溶液が第２流路内を循環
し始め、完全にインジェクションバルブ（１）を通過し
たのち、再度スタートスイッチをＯＮにすると計測を開
始してブランク値を測定する。

次に、インジェクションバルブ（１）に充填されたＡＴ
Ｐ含有溶液を流路内へ注入するとＡＴＰ含有溶液および
ルシフェリン・ルシフェラーゼ溶液が反応して発光する
。

ＡＴＰ含有溶液とルシフェリン・ルシフェラーゼ溶液の
混合液は、カラム（Ｃ２）とフローセル（Ｆ）を通過し
て廃液ビン（Ｈ）へ到達して貯留するが、フローセル（
Ｆ）を通過する際に予め設定した計測時間の間計測を行
なう。

第３図には、１ｏ−１ｆ〜１０−４モル／９１の既知濃
度のＡＴＰ標準液と菌から抽出したＡＴＰ溶液の測定結
果を示す。

図中の実線は、ＡＴＰ標準液とルシフェリン・ルシフェ
ラーゼ溶液を混合して、５秒後から３０秒間の積分値を
示し、破線は、その３０秒間の最大値を示す。またｘ印
は菌から抽出されたＡＴＰ量を示す。

Ｈ発明の効果 この発明は、特定の測定フローシステムを使用して、液
体試料を光学的方法により分析することにしたので、以
下に述べるような効果を期待することができる。

（１）定量対象物質および試薬の混合により発生する光
を検出して定量分析を行なう場合、外光入射による誤検
出を防ぐ、ことができるとともに微弱な光でも正確な検
出が可能となり、定量分析の精度が著しく向上する。

（２）光検出器受光面に入射される外光を遮蔽すること
ができる。

これによって光検出器を保護することができると共に、
光検出器が光電子倍倍管である場合は、暗電流の増加を
防止できるので微弱光も確実に計測することができる。

（３）初期発光量を正確に検出することができるので、
定量分析の感度が著しく向上する。

（４）試験管などの容器の代りにフローセルを使用する
ことにより、外光入射を遮蔽するための密閉構造の暗箱
を小型化できるとともに、試験管などの容器を出し入れ
する必要がないので、暗箱内での機械的なり動機構を設
ける必要がない。

（５）定量対象物質および試薬などが測定中、外界の空
気などに接触しないクローズド・システムになっている
ため、外部から汚染を防止することができる。

また、クローズド・システムになっているために、試薬
が暗箱および装置内部へ漏れることがなく、暗箱を構成
する材料、例えば金属が試薬などによって腐食されるの
を防止できる。

（６）定量対象物質および試薬量が１０μｍ以下の液量
でも測定が可能となったが、この微量分析を高感度な形
で測定を行うことが可能となった。

（７）定量対象物質および試薬を混合するために、試験
管などの容器およびその容器を保持する治具を必要とし
ないため、発光源と光検出器との距離を接近させること
ができる。

そのため、微弱な光でも正確な検出が可能となり、定量
分析の精度が著しく向上する。

（８）定量対象物質および試薬を混合する際に試験管な
どの容器を必要としないため、これらを使用することに
よる容器コストは無く、また、洗浄して再使用するとい
う労力と時間が節約できる。

（９）定量対象物質および試薬などを送液するためのチ
ューブ内に、試薬が滞留する時間が短いのでチューブの
寿命が向上する。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明を実施するための測定システムを示し
たフローシート、第２図はＨ２１）２の濃度と発光量の
関係を示したグラフ、第３図はＡＴＰの濃度と発光量の
関係を示したグラフ、第４図は生物発光反応または化学
発光反応による発光量の時間の経過による影響を示した
グラフである。 ＳＡ・・・定量対象物質、ＤＷ・・・蒸留水、Ｌ・・・
試薬、８１〜３・・・バルブ、Ｐ２Ｎ２・・・ポンプ、
Ｃ１〜２・・・カラム、Ｆ・・・フローセル、ＳＨ・・
・シャッタ、Ｓ・・・光検出器、Ａ・・・増幅器、Ｗ・
・・波形整形回路。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定フローにおいて（１）蒸留水または試薬（Ｄ
   Ｗ）→ポンプ（Ｐ１）→バルブ（Ｂ１）→インジェクシ
   ョンバルブ（Ｉ）→バルブ（Ｂ２）→カラム（Ｃ１）ま
   たは（Ｃ２）→バルブ（Ｂ３）→フローセル（Ｆ）一廃
   液ボトル（Ｈ）からなる第一流路と、（２）試薬または
   蒸留水（Ｌ）→ポンプ（Ｐ２）→バルブ（Ｂ１）→イン
   ジェクションバルブ（Ｉ）→バルブ（Ｂ２）→カラム（
   Ｃ１）または（Ｃ２）→バルブ（Ｂ３）→フローセル（
   Ｆ）→廃液ボトル（Ｈ）からなる第２流路とを有する、
   測定フローシステムを使用して、液体試料を光学的方法
   により分析することを特徴とする定量分析方法。
2. （２）液体試料が過酸化水素または酵素とその基質との
   反応により生成する過酸化水素である特許請求の範囲第
   １項に記載の定量分析方法。
3. （３）液体試料がアデノシン３リン酸である特許請求の
   範囲第１項に記載の定量分析方法。
4. （４）光学的方法が生物発光法あるいは化学発光法であ
   る特許請求の範囲第１項に記載の定量分析方法。
5. （５）測定フローシステムが下記の各機能を有するもの
   である特許請求の範囲第１項に記載の定量分析方法。 ａ、送液ポンプ（Ｐ１、Ｐ２）により試薬および洗浄水
   を循環することができる。 ｂ、試薬または洗浄水の流路をバルブ（Ｂ１）により切
   り換えることができる。 ｃ、試薬が循環している流路内へインジェクションバル
   ブ（Ｉ）を介して液体試料を注入することができる。 ｄ、液体試料または試薬を別の構造物質に変換させ、あ
   るいは光学的測定に供する物質に変換させる樹脂および
   酵素を充填した１つ以上のカラムを通すことができる。 ｅ、カラムの温度調節を行うことができる。 ｆ、発生した光を効率よく測定するため外光入射を遮蔽
   したフローセルを備えている。 ｇ、混合液がフローセルを通過したとき、発生している
   光を検出する光検出器を備えている。 ｈ、光検出器の受光面に開閉シャッターを備えている。 ｉ、光検出器からの信号を増幅する増幅器を備えている
   。 ｊ、増幅された信号を電圧パルスに変換することができ
   る。 ｋ、電圧パルスをＴＴＬレベルに波形整形することがで
   きる。 ｌ、１秒間当たりの光量を計数するマイクロプロセッサ
   を備えている。 ｍ、マイクロプロセッサの出力を光量計測値として表示
   する表示器を備えている。 ｎ、マイクロプロセッサの出力を光量計測値として印字
   するプリンタを備えている。 ｏ、マイクロプロセッサの出力を光量計測値としてレコ
   ーダへ出力させることができる。 ｐ、積分値、変動係数、差分計算などの演算処理ができ
   る。 ｑ、演算結果を印字することができる。