JPS63276485A - ホロスポラ属を原生動物から単離する方法 - Google Patents
ホロスポラ属を原生動物から単離する方法Info
- Publication number
- JPS63276485A JPS63276485A JP10979187A JP10979187A JPS63276485A JP S63276485 A JPS63276485 A JP S63276485A JP 10979187 A JP10979187 A JP 10979187A JP 10979187 A JP10979187 A JP 10979187A JP S63276485 A JPS63276485 A JP S63276485A
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- Japan
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- holospora
- solution
- nucleus
- density gradient
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、宿主である原生動物からのダラム陰性菌ホロ
スポラ属の単離方法、特に、ゾウリムシ等の原生動物の
核（大杉または小桟）内に存在するホロスポラ屈を生き
たまま単離することにより、医学および農学等の分野に
おいてベクターとして利用できるホロスポラ属を原生動
物から単離する方法に関する。
スポラ属の単離方法、特に、ゾウリムシ等の原生動物の
核（大杉または小桟）内に存在するホロスポラ屈を生き
たまま単離することにより、医学および農学等の分野に
おいてベクターとして利用できるホロスポラ属を原生動
物から単離する方法に関する。
［従来の技術］
ゾウリムシ（Ｐ ａｒａｉｅｃｉｕｉ ）等の原生動物
の核内に共生するダラム陰性菌であるホロスポラ（Ｈｏ
１ｏｓｐｏｒａ）としては、Ｈ，ｏｂｔｕｓａ、 Ｉ」
、 ｕｎｄｕｌａｔａ。
の核内に共生するダラム陰性菌であるホロスポラ（Ｈｏ
１ｏｓｐｏｒａ）としては、Ｈ，ｏｂｔｕｓａ、 Ｉ」
、 ｕｎｄｕｌａｔａ。
）１． ｃｌｅｇａｎｓ等が知られている。このホロス
ポラは、生活環境で感染型と増殖型という異なる形態を
現わし、ＨｌＯｂｔｕＳａにおいては、感染型ホロスポ
ラは１５μ鴎の長さで、その比重は１．１６ＭｚＺ、増
殖型ホロスポラは１．５〜１５μｍ程度の長さで、その
比＠ ｋｔ １，０９ ａ／ ｘｉである。
ポラは、生活環境で感染型と増殖型という異なる形態を
現わし、ＨｌＯｂｔｕＳａにおいては、感染型ホロスポ
ラは１５μ鴎の長さで、その比重は１．１６ＭｚＺ、増
殖型ホロスポラは１．５〜１５μｍ程度の長さで、その
比＠ ｋｔ １，０９ ａ／ ｘｉである。
感染型ホロスポラは、その細胞壁が強固なので、宿主を
ホモジナイズし、それを連続密度勾配用担体で遠心分離
することで、容易に単離できる。
ホモジナイズし、それを連続密度勾配用担体で遠心分離
することで、容易に単離できる。
しかし、増殖型ホロスポラは、細胞壁が宿主ホモジネー
ト中のライソゾーム酵素によって溶かされるので、この
方法では単離することはできなかった。
ト中のライソゾーム酵素によって溶かされるので、この
方法では単離することはできなかった。
［発明が解決しようとする問題点］ ゛増殖型ホロス
ポラを単離するためには、次の２つの条件を満足しなく
てはならない。
ポラを単離するためには、次の２つの条件を満足しなく
てはならない。
すなわち、
■ 単離の操作中に、増殖型ホロスポラを宿主のライソ
ゾーム酵素に直接接触させないようにする。
ゾーム酵素に直接接触させないようにする。
■ 宿主を飢餓状態にすれば、核中のホロスポラの大部
分は感染型になり、増殖中の宿主核のホロスポラはその
大部分が増殖型であるが、いずれの場合も感染型と増殖
型が少しずつ混在している。
分は感染型になり、増殖中の宿主核のホロスポラはその
大部分が増殖型であるが、いずれの場合も感染型と増殖
型が少しずつ混在している。
したがって、増殖型を単Ｉ！１１′１Ｊるためには、混
在する感染型と分離することができなければならない。
在する感染型と分離することができなければならない。
本発明の目的は、上記した要求を満足し、感染型ホ［１
スポラのみならず、非常に壊れやすい増殖型ホロスポラ
を原生動物の核内から生きたます効率的に単離する方法
を提供することにある。
スポラのみならず、非常に壊れやすい増殖型ホロスポラ
を原生動物の核内から生きたます効率的に単離する方法
を提供することにある。
［問題点を解決するための手段および作用１本発明者は
、上記従来技術の問題点に鑑みて種々検討した結果、混
在する感染型と増殖型のホロスポラを生きたまま単離出
来る本発明を完成するに至った。
、上記従来技術の問題点に鑑みて種々検討した結果、混
在する感染型と増殖型のホロスポラを生きたまま単離出
来る本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、ホロスポラを核内に持つ原生動物を
洗浄した後、等張液と界面活性剤を含む溶液に懸濁し、
ピペッティングにより細胞を破壊して得られた核を、バ
ッファー溶液中でさらに破壊した後、密度勾配遠心用担
体で遠心分離することを特徴とするホロスポラ属を原生
動物から単離する方法である。
洗浄した後、等張液と界面活性剤を含む溶液に懸濁し、
ピペッティングにより細胞を破壊して得られた核を、バ
ッファー溶液中でさらに破壊した後、密度勾配遠心用担
体で遠心分離することを特徴とするホロスポラ属を原生
動物から単離する方法である。
以下、本発明の方法をさらに詳しく説明する。
先ず、ホロスポラを体内に持つ原生動物を適当な水溶液
で洗浄する。洗浄液としては例えば、クエン酸ナトリウ
ム２園Ｍ１リン酸ナトリウムバッファー２ ｍＭ、塩化
カルシウム１．５１Ｍを含有するドリル（ＤｒＶ＋）代
演（以下、ドリル代演という）や、ト’Ｊ ス−３ｒＡ
ｉｇ！（１）８７．９＞ １０１Ｍ、塩化カルシウム３
１Ｍ、塩化マグネシウム８ ｇ＋Ｍを含有するバッファ
ー溶液（以下、７８０Ｍバッファーという）等がある。
で洗浄する。洗浄液としては例えば、クエン酸ナトリウ
ム２園Ｍ１リン酸ナトリウムバッファー２ ｍＭ、塩化
カルシウム１．５１Ｍを含有するドリル（ＤｒＶ＋）代
演（以下、ドリル代演という）や、ト’Ｊ ス−３ｒＡ
ｉｇ！（１）８７．９＞ １０１Ｍ、塩化カルシウム３
１Ｍ、塩化マグネシウム８ ｇ＋Ｍを含有するバッファ
ー溶液（以下、７８０Ｍバッファーという）等がある。
次に、洗浄された原生動物を適当な濃度の等張液と適当
な′ｍ度の界面活性剤を含む溶液の数１１に懸濁して数
分間撹拌する。ここで用いられる等張液としては、例え
ば食塩や蔗糖の水溶液があるが、蔗糖の０．０５〜０．
３Ｍ水溶液が好ましく用いられる。
な′ｍ度の界面活性剤を含む溶液の数１１に懸濁して数
分間撹拌する。ここで用いられる等張液としては、例え
ば食塩や蔗糖の水溶液があるが、蔗糖の０．０５〜０．
３Ｍ水溶液が好ましく用いられる。
また界面活性剤としては、例えば、オクチルフェノール
エチレンオキサイド等の非イオン系界面活性剤の０．
０５〜１重最％溶液が好ましく用いられる。この界面活
性剤により、核内にホロスポラを持つ原生動物の細胞膜
が溶解される。また、等張液により、細胞膜破壊の際の
浸透圧変化によって核躾が破壊するのを防止できる。
エチレンオキサイド等の非イオン系界面活性剤の０．
０５〜１重最％溶液が好ましく用いられる。この界面活
性剤により、核内にホロスポラを持つ原生動物の細胞膜
が溶解される。また、等張液により、細胞膜破壊の際の
浸透圧変化によって核躾が破壊するのを防止できる。
次に、室温でピペッティングによって原生動物の細胞を
破壊して、さらに前記した等張液を数１１を添加した試
料を得る。この細胞の破壊方法には、テフ［１ンホモジ
ナイザー、フレンチプレス、凍結融解、超音波処理等の
機械的破壊方法も適用できるが、本発明では、とベット
により細胞が懸濁した溶液を吸ったり、出したりを繰り
返すピペッティングにより効率的に行なうことができる
。この操作によって、界面活性剤で一部破壊された細胞
膜と細胞膜を裏打ちしている細胞骨格が破壊される。
破壊して、さらに前記した等張液を数１１を添加した試
料を得る。この細胞の破壊方法には、テフ［１ンホモジ
ナイザー、フレンチプレス、凍結融解、超音波処理等の
機械的破壊方法も適用できるが、本発明では、とベット
により細胞が懸濁した溶液を吸ったり、出したりを繰り
返すピペッティングにより効率的に行なうことができる
。この操作によって、界面活性剤で一部破壊された細胞
膜と細胞膜を裏打ちしている細胞骨格が破壊される。
次に、遠心管に、蔗糖や蛋白質分解酵素阻害剤等を含む
高濃度の不連続な密度勾配遠心用担体を数１１入れ、そ
の上に上記した試料を止層し、３００〜１０００１Ｊで
遠心して核を分離する。ここに用いられる不連続な密度
勾配遠心用担体としては、例えば０．５〜２．５モルの
蔗糖、０．０５〜０．５ ｍＭのフェニル メチル ス
ルフォニル フルオライド（以下、ＰＭＳＦという）等
を含有する７８０Ｍバッファーを用いることができる。
高濃度の不連続な密度勾配遠心用担体を数１１入れ、そ
の上に上記した試料を止層し、３００〜１０００１Ｊで
遠心して核を分離する。ここに用いられる不連続な密度
勾配遠心用担体としては、例えば０．５〜２．５モルの
蔗糖、０．０５〜０．５ ｍＭのフェニル メチル ス
ルフォニル フルオライド（以下、ＰＭＳＦという）等
を含有する７８０Ｍバッファーを用いることができる。
また、ＰＭＳＦ等の蛋白質分解酵素阻害剤は、原生動物
の細胞質におけるライソゾーム酵素の活性が高いので、
界面活性剤で細胞膜が破壊された時に、ライソゾーム膜
ち壊れて蛋白質分解酵素が放出され、これによって核膜
や核中の細菌が消化されないように加えられる。この蛋
白質分解酵素阻害剤としては、前記したＰＭＳＦの他に
、ナトリウム−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン メチル
エーテル、Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニル エチ
ルクロロメチル ケトン、ジチオスレイトール、ヨード
アセトアミド等が用いられる。
の細胞質におけるライソゾーム酵素の活性が高いので、
界面活性剤で細胞膜が破壊された時に、ライソゾーム膜
ち壊れて蛋白質分解酵素が放出され、これによって核膜
や核中の細菌が消化されないように加えられる。この蛋
白質分解酵素阻害剤としては、前記したＰＭＳＦの他に
、ナトリウム−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン メチル
エーテル、Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニル エチ
ルクロロメチル ケトン、ジチオスレイトール、ヨード
アセトアミド等が用いられる。
この遠心により原生動物の核が沈澱するので、それらを
分離して、０．１〜０．５１Ｍ蔗糖等の低濃度の連続密
度勾配遠心用担体の数１１に懸濁する。
分離して、０．１〜０．５１Ｍ蔗糖等の低濃度の連続密
度勾配遠心用担体の数１１に懸濁する。
次に、分離された核を懸濁液中で破壊する。この核の破
壊は、テフロン製ホモジナイザー等を用いて、手でスト
ロークして破壊する。
壊は、テフロン製ホモジナイザー等を用いて、手でスト
ロークして破壊する。
次いで、数１！の適当な濃度の前記の密度勾配遠心用担
体を添加する。ここで用いられる連続な密度勾配遠心用
担体としては、コロイド状シリカをポリビニルピロリド
ンでコーティングしたコロイド状ゾルで、Ｍｕ溶液でコ
ロイド状ゾルの濃度が２０〜４０市（至）％に希釈され
た連続密度勾配遠心用担体が好ましく用いられ、例えば
この目的には、密度勾配遠心用担体く商品名：パーコー
ル、ファルマシア側製） ９体積（Ｖ／Ｖ ）と １体
積（Ｖ／Ｖ）の２．５Ｍ蔗糖溶液または１．５Ｍの塩化
ナトリウムを混合した溶液（以下、ＳＩＰ溶液という）
を用いることができる。ここにおけるパーコールは、１
５〜３０ｎｌ直径のコロイド状シリカをポリビニルピロ
リドンでコーティングした粒子が２３重ｆｉｔ％のコロ
イド状ゾルで市販されているもので、その状態での密度
は、１，１３０±０．００５ Ｑ／１１である。この
ＳＩＰを０．２５Ｍの蔗糖水溶液で希釈して、アングル
ローターで１０００００以上の遠心をすると、１．０〜
１．３ （Ｊ／１１１の範囲で連続密度勾配を自己形
成させることができる。この密度勾配遠心用担体は細胞
に対しては無毒である。
体を添加する。ここで用いられる連続な密度勾配遠心用
担体としては、コロイド状シリカをポリビニルピロリド
ンでコーティングしたコロイド状ゾルで、Ｍｕ溶液でコ
ロイド状ゾルの濃度が２０〜４０市（至）％に希釈され
た連続密度勾配遠心用担体が好ましく用いられ、例えば
この目的には、密度勾配遠心用担体く商品名：パーコー
ル、ファルマシア側製） ９体積（Ｖ／Ｖ ）と １体
積（Ｖ／Ｖ）の２．５Ｍ蔗糖溶液または１．５Ｍの塩化
ナトリウムを混合した溶液（以下、ＳＩＰ溶液という）
を用いることができる。ここにおけるパーコールは、１
５〜３０ｎｌ直径のコロイド状シリカをポリビニルピロ
リドンでコーティングした粒子が２３重ｆｉｔ％のコロ
イド状ゾルで市販されているもので、その状態での密度
は、１，１３０±０．００５ Ｑ／１１である。この
ＳＩＰを０．２５Ｍの蔗糖水溶液で希釈して、アングル
ローターで１０００００以上の遠心をすると、１．０〜
１．３ （Ｊ／１１１の範囲で連続密度勾配を自己形
成させることができる。この密度勾配遠心用担体は細胞
に対しては無毒である。
この懸濁液を、上記した連続密度勾配遠心用担体１００
００〜８００００ （ｌで１０〜１８０分間の密度勾配
遠心を低温で行なう。この遠心操作により、遠心管中に
上下２本のバンドが形成される。遠心管の上のバンドは
、増殖型ホロスポラで、下のバンドは、感染型ホロスポ
ラである。
００〜８００００ （ｌで１０〜１８０分間の密度勾配
遠心を低温で行なう。この遠心操作により、遠心管中に
上下２本のバンドが形成される。遠心管の上のバンドは
、増殖型ホロスポラで、下のバンドは、感染型ホロスポ
ラである。
それぞれのバンドを回収し、ナトリウム−リン酸バッフ
ァー等のバッファー溶液に入れて、遠心により密度勾配
遠心用担体を除去し、４℃程度の低温で保存する。また
、−２０℃程度で凍結保存すれば、伯の［Ｉ菌の混入、
増殖を防止できるので、蛋白質や核酸を調べるのに好適
である。
ァー等のバッファー溶液に入れて、遠心により密度勾配
遠心用担体を除去し、４℃程度の低温で保存する。また
、−２０℃程度で凍結保存すれば、伯の［Ｉ菌の混入、
増殖を防止できるので、蛋白質や核酸を調べるのに好適
である。
［実施例］
以下、実施例によって、本発明をさらに詳しく説明する
。
。
実施例１
ホロスポラ（）−１、０ｂｔｕＳａ）を大枝に持つゾウ
リムシ（Ｐａｒａａ＋ｅｃｉｕｍ ｃａｕｄａｔｕｍ）
１７０ｇを、室温で３分遠心し濃縮した侵、ドリル圧
液に入れ、３分間遠心し、この操作を２回繰り返してゾ
ウリムシを洗浄した。さらに、０．２５Ｍ Ｍ糖を含む
７８０Ｍバッファー溶液で同様の遠心操作を繰り返して
洗浄した。
リムシ（Ｐａｒａａ＋ｅｃｉｕｍ ｃａｕｄａｔｕｍ）
１７０ｇを、室温で３分遠心し濃縮した侵、ドリル圧
液に入れ、３分間遠心し、この操作を２回繰り返してゾ
ウリムシを洗浄した。さらに、０．２５Ｍ Ｍ糖を含む
７８０Ｍバッファー溶液で同様の遠心操作を繰り返して
洗浄した。
次に、０．２５ Ｍ蔗糖、０．２￥１量％非イオン系界
面活性剤（オクチルフェノール エチレンオキサイド、
商品名： Ｎ ０ｎｉｄｅｔ Ｐ −４０）、０．１
１ＭのＰＭＳＦを含む７８０Ｍバッファーにゾウリムシ
を懸濁して、静かにマグネットスターラーによって、室
温で５分間撹拌した。約半数のゾウリムシが破壊される
まで、太めのとベットでピペッティングを行った。
面活性剤（オクチルフェノール エチレンオキサイド、
商品名： Ｎ ０ｎｉｄｅｔ Ｐ −４０）、０．１
１ＭのＰＭＳＦを含む７８０Ｍバッファーにゾウリムシ
を懸濁して、静かにマグネットスターラーによって、室
温で５分間撹拌した。約半数のゾウリムシが破壊される
まで、太めのとベットでピペッティングを行った。
このＳ胞が懸濁した液に０．２５Ｍ蔗糖と０．ＩＭのＰ
ＭＳＦを含む７８０Ｍバッファーを等量添加して試料と
した。
ＭＳＦを含む７８０Ｍバッファーを等量添加して試料と
した。
５０１！遠心管に１．６Ｍ！！糖と０．１ＭのＰＭＳＦ
を含む７８０Ｍバッファーを１０１！入れて、その上に
上記試料１００ｇを重層し、変温で１０分間遠心した。
を含む７８０Ｍバッファーを１０１！入れて、その上に
上記試料１００ｇを重層し、変温で１０分間遠心した。
この遠心操作により、大枝が沈澱したので、それを０．
２５Ｍ ｍ糖を含む水溶液１−に懸濁した。
２５Ｍ ｍ糖を含む水溶液１−に懸濁した。
この懸濁液を１０１！用のテフロンホモジナイザーを用
いて、手で５回ストロークして大杉を破壊し、さらに５
１！のＳ Ｉ ＰＩ３液を添加したくコロイド状シリカ
の最終濃度は３０〜３７．５重量％）。
いて、手で５回ストロークして大杉を破壊し、さらに５
１！のＳ Ｉ ＰＩ３液を添加したくコロイド状シリカ
の最終濃度は３０〜３７．５重量％）。
この懸濁液をアングルローダ−を使用して、３８９００
ｐで６０分のＳＩＰ溶液を用いた連続密度勾配遠心を
２℃で行った。この遠心操作により、上下２本のバンド
が形成された。
ｐで６０分のＳＩＰ溶液を用いた連続密度勾配遠心を
２℃で行った。この遠心操作により、上下２本のバンド
が形成された。
これらのバンド２本をそれぞれペリスタポンプで回収し
、増殖型分画は１０１Ｍのナトリウム−リン酸バッフ？
−溶液（ｐＨ７，０）中で４０００９で１０分の遠心を
３回行ってＳＩＰ溶液を除去した。感染型分画も同じバ
ッフ？−を用いて７００ｇで１５分の遠心を３回行なっ
てＳＩＰ溶液を除去した。
、増殖型分画は１０１Ｍのナトリウム−リン酸バッフ？
−溶液（ｐＨ７，０）中で４０００９で１０分の遠心を
３回行ってＳＩＰ溶液を除去した。感染型分画も同じバ
ッフ？−を用いて７００ｇで１５分の遠心を３回行なっ
てＳＩＰ溶液を除去した。
この２本のバンドから得られた細菌の顕微鏡写真を第１
〜２図に示す。この第１〜２図に示されるように、その
形態的な特徴から、遠心管の上のバンドからは増殖型ホ
ロスポラ（ト１． ｏｂｔｕｓａ）、下のバンドは感染
型ホロスポラ（Ｈ、ｏｂｔｕｓａ）がそれぞれ１ｌｌｌ
ｌｌｌｔされていることが確認された。この単離された
ホロスポラを４℃と一２０℃で凍結して保存した。
〜２図に示す。この第１〜２図に示されるように、その
形態的な特徴から、遠心管の上のバンドからは増殖型ホ
ロスポラ（ト１． ｏｂｔｕｓａ）、下のバンドは感染
型ホロスポラ（Ｈ、ｏｂｔｕｓａ）がそれぞれ１ｌｌｌ
ｌｌｌｔされていることが確認された。この単離された
ホロスポラを４℃と一２０℃で凍結して保存した。
以上の実施例で明らかなように、連続した密度勾配遠心
用担体を用いて、破壊された核から生きたまま感染型お
よび増殖型のホロスポラを容易に単離することができた
。
用担体を用いて、破壊された核から生きたまま感染型お
よび増殖型のホロスポラを容易に単離することができた
。
〔発明の効果］
以、Ｌ説明したように、本発明によれば、感染型のみな
らず、増殖型のホロスポラを原生初物から生きたまま効
率的にｉｌ′Ｉｗｉすることができるので、突然変異体
の誘導等が可能になり、医学、農学等の分野を始めとし
て諸産業への応用が期待される。
らず、増殖型のホロスポラを原生初物から生きたまま効
率的にｉｌ′Ｉｗｉすることができるので、突然変異体
の誘導等が可能になり、医学、農学等の分野を始めとし
て諸産業への応用が期待される。
第１図は、密度勾配遠心によりｔｉｍされた増殖型ホロ
スポラ（）ｌ 、 ｏｂｔｕｓａ）の位相差顕微鏡写頁
（６６０倍）、 第２図は、密度勾配遠心により単がされた感染型ホロス
ポラ（Ｈ，ｏｂｔｕｓａ）の微分干渉顕微鏡写真（３３
０倍）。
スポラ（）ｌ 、 ｏｂｔｕｓａ）の位相差顕微鏡写頁
（６６０倍）、 第２図は、密度勾配遠心により単がされた感染型ホロス
ポラ（Ｈ，ｏｂｔｕｓａ）の微分干渉顕微鏡写真（３３
０倍）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ホロスポラを核内に持つ原生動物を洗浄した後、等
張液と界面活性剤を含む溶液に懸濁し、ピペッティング
により細胞を破壊して得られた核を、バッファー溶液中
でさらに破壊した後、密度勾配遠心用担体で遠心分離す
ることを特徴とするホロスポラ属を原生動物から単離す
る方法。 ２、前記等張液が、蔗糖を０．０５〜０．３Ｍ含有する
水溶液である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記界面活性剤が、非イオン系界面活性剤である特
許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４、前記バッファー溶液が、フェニル メチルスルフォ
ニル フルオライドを含有する溶液である特許請求の範
囲第１項、第２項または第３項に記載の方法。 ５、前記密度勾配遠心用担体が、コロイド状シリカをポ
リビニルピロリドンでコーティングしたコロイド状ゾル
を、蔗糖溶液で２０〜４０重量％に希釈したものである
特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10979187A JPS63276485A (ja) | 1987-05-07 | 1987-05-07 | ホロスポラ属を原生動物から単離する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10979187A JPS63276485A (ja) | 1987-05-07 | 1987-05-07 | ホロスポラ属を原生動物から単離する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63276485A true JPS63276485A (ja) | 1988-11-14 |
Family
ID=14519311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10979187A Pending JPS63276485A (ja) | 1987-05-07 | 1987-05-07 | ホロスポラ属を原生動物から単離する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63276485A (ja) |
-
1987
- 1987-05-07 JP JP10979187A patent/JPS63276485A/ja active Pending
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