JPS6328395A - 水溶液中に難溶性である基質の連続的な生物触媒反応法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水に難溶性（Ｓｐａｒｉｎｇｌｙ　５ｏｌｕｂｌｅ　）
の基質を水浴液中において生物触ｇ　（ｂｉｏｃａｔａ
ｌｙｓｔ　）により反応させるための連続的方法はこれ
まで何ら知られていない。米国特許第４，２６２，０９
２号には、純水性系におけるＤ，Ｌ　−Ｎ−アセチルフ
ェニルアラニンメチルエステルのアルカラーゼによる分
解が記載されている。分解産物の分離は有機溶媒での抽
出により行われる。この方法は酵素を再使用することな
く非連続的に行われ、従ってこの方法は非経済的である
。ドイツ特許出願筒２，９２ス５６５号の記載によれば
、Ｄ、Ｌ　−Ｎ−アセチルフェニルグリシンアルキルエ
ステルが、水と有機溶媒とからなる二相系中でＤＥＡＤ
！＋セファロースに固定化されたサブチリシンを用いて
分解される。この有機溶媒は基質の溶解度を高めるため
に使用される。しかしこれは同時に酵素の活性がかなり
低下されるという欠点をも有する。

既知方法の前記欠点を回避するために一つの方法が開発
された。その方法によれば、水に難溶性である基質を有
機溶媒を添加することなく水溶液中で連続的に生物触媒
と反応させることができる。

従って本発明は容器中に存在する基質を水溶液を用いて
連続的に溶かし出しそしてこれを後続の容器中に存在す
る生物触媒上に導くことからなる、水に難溶性の基質を
連続的に生物触媒反応させる方法に関する。本発明はさ
らにこの方法を実施できる装置にも関する。

以下に本発明の好ましい態様を詳しく説明する。

図面に示されろフローシートにより装置の配置について
示す。基質原液用容６１ａｓ１ｂ等は任意の所望の数で
連続して配置されうる。この容器は基質にいかなる様式
においても影響しない不活性物質から構成される。ガラ
スが用いられるのが好ましい。容器はカラム形でかつ全
長を冷却／加熱ジャケットで包囲されているのが好まし
い。容器の下方区分には金属篩またはフリツ）２＋Ｌ％
２’ｂが存在しており、それらの透過性は原液容器から
の固形物質の流出がｍ止されるように選択される。固形
基質は直接容器に充填されうる。油状の基質は粗い不活
性マ）　ＩＪラックス例えば直径１〜５罵、好ましくは
２〜４＋ｔＩＷを有するシリカゲル顆粒上に吸収させて
そして容器に添加される。この基質原液容器とは空間的
に離れて、生物触嫉を充填されたもう一つの容器３が存
在する。この容器も同様に不活性物質、好ましくはガラ
ス、から成り、出口の前に配置された篩４を備えており
、これがカラムの内容物が洗い去られるのを阻止する。

この容器はカラム形でかつ冷却／加熱ジャケットで包囲
されているのが好ましい。この後に配置され、撹拌器６
を備えた滴定容器５においては、ｐＨの再調整７、なら
びにポンプ８による生成物のとり出し？およびもう一つ
のポンプ１０ｔＣよる水溶液の供給１１が行われる。滴
定容器は不活性物質から構成されそして同じく冷却／加
部ジャケットで包囲されている。水溶液は循環ポンプ１
２により滴定容器から不活性ホースライン１３を経、三
方コック１４ａを経、その供給口１５ａ１１５ｂ等に接
続した基質原液容器を経てポンプにより循環される。さ
らＫこの基質容器から、出口１６ａ、１６ｂ等、ならび
に三方コック１４ｂを経て、それに接続している不活性
ホース／ξイブ１７を経て、生物触媒カラムを通り、そ
して、不活性ホースパイプ１８を経て滴定容器中にポン
プで循環される。

はじめに基質原液容器１ａのみを回路に連結する。水、
または基質の反応が行われる予定の水溶液を基質の上に
通し、そこで少時のち固形基質が抽出されることにより
飽和溶液が得られる。次にこの溶液を基質の反応が行わ
れる生物触媒カラムに加える。この連続的抽出方法によ
り基質の連続的溶解が確保され、従って反応されうる物
質が常にサイクル中に循環していることになる。１ａか
らもはや何ら基質が利用できない場合は、１ｂその他が
これと交代される。

この方法は水に難溶性である基質のすべての生物触媒反
応に原則的に用いられうる。生物触媒とは、例えば好ま
しくは固定されており、適当な反応に用いつる酵素また
は微生物を意味することが理解されるべきである。この
反応に最適の条件は当業者に知られているかまたは簡単
な予備実験により判定されうる。

この方法は特に好ましくは光学活性化合物の反応または
ラセミ分割に用いられ、特に一般式（式中好ましくはＲ
１は（Ｃ１〜Ｃ５）−アルキルであり、Ｒ２は水素また
はヒドロキシルであり、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキ
ル、ベンジルまたは（Ｃｓ〜ｃ５）−アルコキシまたは
ベンジルオキシであり、そしてｎは０．１または２であ
る）を有する芳香族Ｄ，Ｌ　−Ｎ−アシルアミノ酸エス
テルの分割に用いられる。本発明方法を用いて一般式■
Ｒ４００Ｇ−（ＣＨ２）　−ＣＨ−ＧＯＯＲ４Ｉ ＭＨＩ［ （式中好ましくはＲ４は（Ｃｓ〜ｃ６）−アルキルでア
’）、Ｒ５ハ水素マたハフ　シ、Ｉ！／基ＣＯＣＨ３、
Ｃ０ＣＨ２ＣＬ。

ＣＯＣ２Ｈ５またはｃｏｃ２Ｈ４ｃｚまたはウレタン型
の基でありそしてｎは１または２である）を有するアシ
ル化されたＬ型α−アミノ−ジカルボン酸のモノエステ
ル分解も同様に好都合に行われつる。

エステラーゼ、例えばα−キモトリプシン、好ましくは
ヨーロッノぐ特許出願第３，４３８，１８９号記載の無
機担体上に固定化されたα−キモトリプシンのようなセ
リンプロテアーゼを用いて、一般式１を有する化合物の
Ｌ−型から鏡像異性体選択的エステル分解により一般式
■ （式中Ｒ２、Ｒ３およびｎは前記した意味を有する）を
有する光学的に純粋なＬ−アミノ酸誘導体が得られ、こ
のものは後続の反応により対応する遊離のＬ−アミノ酸
に変換されうる。アミノ基が保護されてない対応する化
合物も使用されうる。特に好ましい基質はなかんずくト
リプトファン、Ｎ−アセチルフェニルグリシンエチルエ
ステル、フェニルアラニン、チロシン、３．４−ジヒド
ロキシ−フェニルアラニン、および保護されたかまたは
保護され、てないアミ／基を有するホモフェニルアラニ
ンである。

式Ｉの固形ラセミ化合物を前記したように水溶液で抽出
することによりこの化合物の飽和溶液を得、これを酵素
を充填したカラムに通す。

この反応は好都合には２０〜４０°Ｃ１好ましくは６０
℃、およびｐＨ５〜８で逐行される。ラセミ化合物の酵
素的分割により溶液中におけるＬ−鑓像異性体の濃度が
低下する。何故ならＬ−鏡像異性体は相当する酸に分解
されるからである。

抽出系は常にラセミ化合物の飽和範囲で操作されるので
、非反応性のＤ−鏡像異性体の大部分は結晶化により沈
澱する。結晶化は好ましくはラセミ化合物の局所濃度が
特に高い場所または結晶核が存在する場所、例えば好ま
しくは基質原液容器中で行われる。溶解度に応じ、Ｌ−
酸と同様に水溶液中に存在する溶解されたＤ−エステル
の残量が系中に常に残留する。連続的にポンプ送りされ
た溶液からｐＨ７で適当な溶媒例えばメチレンクロライ
ドまたは酢酸エチルを用いて残留エステルを除去する。

残る水相をｐＨ２に５１ｉ整しそして再び抽出する。こ
の抽出液はＬ−酸を含有しており、これはＮ−アシルア
ミノ酸の場合は例えば酸加水分解により、純粋なＬ−ア
ミノ酸に変換されつる。Ｄ−エステルは、好ましくはヨ
ーロッパ特許出願第３．４３８，１８９号の記載に従っ
て実施されるラセミ化のあと再循環されうる。

同様に一般式■を有する化合物のＬ−型の選択的なエス
テル分解により一般式■ （式中Ｒ４、Ｒ５およびユは前記した意味を有する）を
有する相当するモノエステルが得られうる。一般式■を
有するアミノ酸ジエステルの加化分解はセリンプロテア
ーゼ、好ましくは固定されたα−キモ）　＋）プシンを
用いて不発明により実施される。アミノ酸ジエステルま
たはそれらのＮ−アシル誘導体の純粋なＬ−鏡像異性体
またはＤ，Ｌ−ラセミ化合物が使用できるが、しかしな
がらＬ−型のみが加水分解される。それゆえこの方法は
ラセミ分割にも適する。この反応はｐＨ５〜８および２
０〜４０℃で進行する。

不発明方法は水溶液中で操作できるので、酵素に最も好
ましい条件下に酵素反応を行うことができる。特に、固
定された酵素を用いる場合には、このことは生物触媒を
有機溶媒と接触させる方法に比較して使用寿命および空
間／時間的収量の増大を意味する。

以下の実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例　１ Ｄ、Ｌ　−Ｎ−アセチル−フェニルアラニンメチルエス
テルのラセミ分割 装置の組み立て 高さ３０α、直径４ｃｍを有する容１ｔ４００−のガラ
スカラムを加熱ジャケットで被覆したものを基質容器と
して使用する。Ｇ２フリットを容器の排出口より上流に
配置する。生物触媒カラムとして同様に０２フリツトを
備えた、高さ９画、直径３ｃｆｎを有する加熱しうるガ
ラスカラムが用いられる。容量４００−を有する滴定容
器も同様にガラス製である。この容器に配置された自動
滴定器（Ｍｅｔｒｏｍ　６５　Ｓ　Ｄｏｓｉｍ＆ｔ、ス
イス、Ｈｅｒｉｓａｕ）を用いて、酵素カラムから流れ
出る水溶液を５ＮＮａＯＨを用いて滴定して設定値ｐＨ
７となす。前記した容器はＰｖＣ管（直径８謔）により
膜ポンプ（Ｒ４０９Ｗ型、■ｍｍｅｎｈａｕｓｅｎ社製
、Ｋａａｓｅｌ　）を介して相互に連結されている。循
環速度毎時３．７ｔで操作される。滴定容器にはさらに
流れインデューサー（Ｉ、ＫＥ２１１５、Ｂｒｏｍ＋ｎ
ａ、スウェーデン）を備えたシリコーン導管（直径１．
３１１１１）が配管されていて、これを通じて最終生成
物がポンプで排出されうるしまたは新たな水溶液が連続
的に供給されうる。流入または流出速度は苺分２．５−
である。

滴定容器から得られる最終生成物の分析はＲＰ−１８カ
ラムでのＨＦＬＣ（移動相：メタノール（２，５ｔ）、
Ｈ２Ｏ（２，５ｔ　）、ＫＨ２ＰＯ４１２，５１および
硫酸水素テトラブチルアンモニウム２．５ｇ、４０％Ｈ
３ｐｏ４を用いてｐＨ２，８２に調整）により、２１０
μでσＶ検出器を用いて行われる。

操作 この実験では合計４個つ基質カートリッジＩａ。

１ｂＮＩＣおよび１ｄが連続して接続される。

基質原液容器は以下のとおり充填される。

１　　ａ　−４４，２６，９（０，２モル）１ｂ・・・
６６．３９．９（０，３モル）１Ｃおよび１ｄ・・・８
８．５２ソ（０，４モル）Ｄ、Ｌ−Ｎ−アセチルフェニ
ルアラニンメチルエステル この基質は予め２００〜４００−の再蒸留水を用いて注
入可能なスラリーとなしそして少量のｏ、ｉＭＫ−燐酸
塩緩衝液（ｐＨ７）を用いてｐＨ７に調整する。温度を
３０°Ｃとなした基質容器１ａを回路に接読しそして滴
定容器中洗存在する液からその系を完全に充填するに充
分な水をポンプで送る（ｊＭＨｚＯ量約５００ｍ）。系
中において基質が飽和濃度の２．２％となるまで１５分
間ポンプで循環させる。次にヨーロツ／ぞ特許出願第３
．４３８，１８９号、実施例１記載の方法により調製さ
れた、固定されたα−キモトリプシン　２５−を充填さ
れた生物触媒カラムを回路に接続する。

酵素カラム中の反応は３０℃で行われる。ポンプによる
循環速度、流入速度および流出速度のような工程の制御
は手動により行われる。ＨＰＬＣ分析により、エステル
および酸の濃度に関するデータが得られる。

滴定容器は温度３０°Ｃに保持される。反応の開始時に
はエステル：酸の濃度比は約１＝１である。Ｌ−エステ
ルの酵素による分解は非常に速やかにかつ高い変換率を
以って進行する。このことは９３．７％までがＤ−エス
テルからなる、循環しているエステルの光学純度を挾査
することＫより確認される。反応が進行するに伴い濃度
比は２０　：　８０に達する。基質容器中にＤ−エステ
ルの結晶が明らかに沈積するのが観察されうる。この時
点で滴定容器から反応溶液を連続的にとり出しそして同
じ速度で水をポンプにより添加する。

以下の数字が流出する反応溶液について測定された。

Ｄ−エステルの濃度　　　　＆２〜７．４　ｉ　／　ｔ
Ｌ−酸の濃度　　　　３１．：ｌ／を 分解速度　　　　　　　Ｄ−エステル　０．２２モル／
時時間×　ｔ もし何ら分解されうるＬ−エステルがもはや溶液中に存
在しない場合は酵素による分解工程は停止している。基
質カートリッジ１＆中には１５．４５ｇの分解できない
Ｄ−Ｎ−アセチル−フェニルアラニンメチルエステルが
存在している。

〔α）、　　＝−１３，６°（ｃ　＝　０．５、エタノ
ール〕、純度（０−フタルジアルデヒド／　ＢＯＣ−Ｌ
−システィンを用いる「プレカラム」誘導体形成後の）
ＩＰＬＣ）　：　Ｄ−型　９９１％。

系中の分解しうるＬ−エステル濃度が低下してくると、
滴定曲線は漸近的に限界値に近接してくる。新しい基質
カートリッジ１ｂ等を適時に接続することによりこれを
回避することが上策である。次に基質カートリッジ１＆
はさらに３０分経過後回路からとり外される。かくして
連続的な滴定曲線が得られる。

この試験は２５６分後総変換率約９０％のところで中止
された。５Ｎ　ＮａＯＨの総消費量は１１６３７ゴ（９
０％）であった。水溶液の総消ｇｔ量は４．４ｔであっ
た。連続的にとり出された水溶液を＋６℃に冷却すると
、さらにＤ−エステルが晶出して、その原液の濃度比が
８３：１７（酸：エステル）となった。

基質容器中の残留物を乾燥しそして分析する。

その結果を下記の表にまとめる。

１　ａ　　４４．２６１０．２　５００　１５．４５１
０．０７　７０％ｌ　ｂ６６．３９１０．３　２００　
２７．２８１０．１２　８２％１ｃ　　８Ｂ、５２１０
．４　　５０　５５．０２１０．１５　７５％合計　２
８７．７０／ｉ、３　　９５０　１０８．３９１０．４
９水溶液５００ｄ（総量４．４ｔの一部）を１５０−と
なるまで濃縮しそしてメチレンクロライド１５０−を用
いて２回抽出する。回転蒸発器でメチレンクロライド相
を蒸発させるとさらに３，５ｇのＤ−エステルが得られ
る。残留する水相を回転蒸発器で濃縮すると粘稠な油状
物２２．２１が残り、これを５Ｎ　ＨＣｌ　１５０−と
２時間還流煮沸する。濃縮後に１４．、ｌのＬ−７エニ
ルアラニン塩酸塩が得られる。

旋光度Ｃａ〕ｉ０＝　−１０，５°（ｃ＝１、Ｈ２Ｏ）
、純度（キラール力ラムを用いるガスクロマトグラフィ
ー）：Ｌ−型　９９４％。

Ｌ−フェニルアラニン塩酸塩５ｇをエタノール４５ｄお
よびＨ２Ｏ５−中に溶解させ、３３％ＮａＯＨを用いて
ｐＨ６，１２に調整した。析出した固形物質を水洗する
。Ｌ−７エニルアラニン２．６０９が得られる。

旋光度〔α）”＝−３３，８°（ｃ＝１、Ｈ２Ｏ）実施
例　２ Ｄ、Ｌ−Ｎ−アセチル−フェニルアラニン−ｎ−プロピ
ルエステルのラセミ分割 以下のことが相異する以外は実施例１におけると同様に
操作する。

０１個のみの基質原液容器を使用、充填量Ｄ，Ｌ−Ｎ−
アセチルフェニルアラニンｎ−プロピルエステル７４．
７９ｇ（０，５モル）、０装置に水５５０−を充填、 ０生物触媒カラムに固定されたα−キモ）　ＩＪプシン
５−を充填、 ０ポンプによる循環速度　３．３ｔ／時、およびＯ流入
／流出は２−７時。

プロピルエステルの溶解度が低いので（３０°Ｃ１ｐａ
７ｏで０．５％溶液）、未反応のＤ−エステルが速やか
に晶出する。エステルの相対濃度は４〜５時間反応後で
２４％である。この期間内に物質は連続的にとり出され
つる。

反応は１５時間後に中止された。実施例１の記載に従い
さらに後処理して、光学純度（キラール力ラムを用いる
ガスクプマトグラフイー）９９３％を有するＬ−フェニ
ルアラニン塩酸塩４．０５ｇが得られる。

実施例　３ Ｌ−Ｎ−クロロアセチル−グルタミン酸ジエチルエステ
ルのモノエステル分解 Ｌ−Ｎ−クロロアセチル−グルタミン酸ジエチルエステ
ル１０！９をアセトン３　ｏ　ｏｉ中に溶解させそして
シリカゲル顆粒（直径２．　′５ｍ　）（ＳｈｅｌｌＳ
９７０、Ｇ２．３）を加える。この混合物を回転蒸発器
でゆっくりと濃縮し、そして次にこの被覆された球をさ
らに３０分間高真空にかける。これを次に基質原液容器
に入れる。実施例１に記載の装置に水４００ｍを充填し
、そして基質で飽和された水溶液を得るために１０分間
ポンプで循環させる。次に酵素カラムを回路に接続する
。

実施例１の記載に従ってさらに処理する。

８５分後に反応を停止した。ＨＰＬＣ分析の結果によれ
ばＬ−Ｎ−クロロアセチルグルタミン酸−γ−モノエチ
ルエステルへの分解は定量的に行われている。

実施例　４ Ｄ、Ｌ−Ｎ−アセチル−フェニル−グリシンエチルエス
テルのラセミ分割 Ｄ，Ｌ−Ｎ−アセチル−フェニルグリシンエチルエステ
ルはＣ，Ｓ、　Ｍａｒｖｅ１氏の方法（Ｊ、Ａｍ。

Ｃｈ＠ｍ、　Ｓａｃ、　４２．２２６５　（ｔ９２ｃ＋
））により製造される。

ラセミ分割を行うには実施例１記載の操作に従い操作す
るが１本のカラムにのみ４４．２６ｇ（０，１モル）の
基質を充填する。

ポンプによる循環速度　　　４．５ｂ１時滴下速度　　
　　　　　２３．５ｄ／時分解速度　　　　　　　　　
４．５ミリモル／時空間／時間　収量　　　　フェニル
グリシン３４ｇへ　Ｘ　時間 この反応は基質の８９％が変換されたところで停止され
た。

後処理するには、まだ反応器中に存在している液体をポ
ンプで排出された生成物と合一し、この混合物を％量と
なるまで濃縮しそして６℃に冷却した。続いて固形物を
吸引濾過した。Ｄ−エステル２１．９５．９が得られた
〔〔α）、＝１４２．４゜（ｃ＝１、ＣＨ３ｏＨ）　）
。

残留する水相を半濃ＨＣ１を用いてｐＨ２に調整しそし
て固形物を吸引濾過する。Ｌ−Ｎ−アセチル−フェニル
グリシン１５．９５ｇが得られる〔〔α）、＝＋１６８
．７°（ｃ＝１、ＣＨ３０Ｈ）　）。

【図面の簡単な説明】

本発明による連続的生物触媒反応用装置の一例を示す。 図面中１ａ、１ｂは基質を含有する容器、２ａ、２ｂ１
４は篩またはフリット、３は生物触媒を含有する容器、
５は滴定容器、６は撹拌器　７は滴定装置、８．１０お
よび１２はポンプ、９は排出口、１１は供給口、１′５
．１７．１８はホースパイプ、１４ａ、１４ｂは三方コ
ック、１５ａ１１５１）は入口、そしてＬ６ａ、１６ｂ
は出口、を示す。 特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト、
、ｒ、、、′、丁 代理人　弁理士　高　木　千　嘉　２し７．・□外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）容器中に存在する基質を水溶液を用いて連続的に溶
   かし出しそしてこれを後続の容器中に存在する生物触媒
   上に導くことからなる、水に難溶性の基質の連続的な酵
   素反応法。 ２）用いられる基質が光学活性化合物またはそのラセミ
   体であることからなる特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３）用いられる基質が芳香族Ｄ，Ｌ−アミノ酸エステル
   またはＬ−α−アミノ酸ジエステルまたはそれらのアシ
   ル誘導体であることからなる特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ４）芳香族Ｄ，Ｌ−アミノ酸エステルとしてトリプトフ
   ァン、フエニルアラニン、ホモフェニルアラニン、Ｎ−
   アセチルフェニル−グリシンエチルエステル、チロシン
   または３，４−ジヒドロキシフエニルアラニンが用いら
   れることからなる特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５）α−アミノ酸ジエステルとしてＬ−アスパラギン酸
   ジエステルまたはＬ−グルタミン酸ジエステルまたはそ
   れらのラセミ化合物が用いられることからなる特許請求
   の範囲第３項記載の方法。 ６）用いられる生物触媒がエステラーゼであることから
   なる特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項記載の方
   法。 ７）用いられる生物触媒がセリンプロテアーゼであるこ
   とからなる特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８）用いられる生物触媒がα−キモトリプシンであるこ
   とからなる特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９）ａ）不活性物質から構成され、下方区分に篩（２ａ
   、ｂ）を有し、冷却／加熱ジャケットを備えた、１個ま
   たはそれ以上の連続して接 続された、基質を含有する容器（１ａ、１ｂ等）、およ
   び ｂ）不活性物質から構成され、下方区分に篩（４）を有
   し、冷却／加熱ジャケットを備え、ａ）のあとに接続さ
   れた、生物触媒を含有する容器（３）、および ｃ）不活性物質から構成され、撹拌器（６）、滴定装置
   （７）、およびポンプ（８）を経て排出口（９）そして
   もう一つのポンプ（１０）を経て供給口（１１）を備え
   、冷却／加熱ジャケットで包囲され、ａ）およびｂ）の
   あとに接続された滴定容器（５）、 からなり、 水溶液は循環ポンプ（１２）により滴定容器からｄ）不
   活性ホースパイプ（１３）ならびに三方コック（１４ａ
   ）および入口（１５ａ、１５ｂ等）を経て基質容器中に
   循環され、そこから ｅ）出口（１６ａ、１６ｂ等）および三方コック（１４
   ｂ）を経て不活性ホースパイプ（１７）により生物触媒
   容器中に送られ、そしてさらに ｆ）不活性ホースパイプ（１８）を経て滴定容器に送ら
   れて 循環されるものである、 特許請求の範囲第１項記載の方法を実施するための装置
   。