JPS63290965A - Ｃａ１２５卵巣癌抗原用腫瘍特異性アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は卵巣癌検出に便利な卵巣ｐ瘍連関抗原の新規サ
ブユニットに関する。それはまた新規サブユニットを指
示薬として利用する卵巣癌診断とモニタ一方法に関する
。

本発明はアメリカ国立健康研究所、認可第４０４０６号
によって一部支援された。

（従来技術と問題点） 癌発生初期における有効な検査診断はその治療の最終的
成功に重要である。更にちがった型の腫瘍はしばしばち
がった化学療法又は治療法使用を要するので、腫痒型又
は位置を正確に示す診断が極めて重要である。結局診断
に使われる試験方法が偽陽性又は偽陰性のいづれかが不
正確診断を生ずる様危険が最小である程度に正確である
ことも必要である。

この関係で１イミユノアツセイ”の標題のもとでなされ
る種々の方法は特に癌特異診断試験法の開発を有望にし
ている。“イミュノアツセイ”は原理的に体内に入った
異物質の存在に対する身体免疫系の自然反応によるもの
である。

免疫系は異物質、例えば細菌又はビールスの様な伝染性
生物体によって抗体発生の坤因となり、拐体は特に異物
質（又は抗原）と反応し、また有効ならば身体から生物
体又は異物質の除去を促進する。もちろん抗体発生は伝
染性微生物存在に限るのみでなくまた通常体内の循環に
見出されない癌細胞、異血液群抗原又は胎児特異抗原の
様な多数物質の反応に認められる。

特殊抗原に対する抗体の比較特異性は伝染病、特殊腫瘍
、妊娠および体内薬物存在の様な種々の生理学的条件に
対する極めて特殊正確な診断試験の基準となっている。

実際に試験は特定病気状態を伴なう特異抗原又はエイズ
ビールスの様な特殊微生物に対する抗体をもつと予想さ
れる試験試料を検出できるラベル利き対応“免疫学的パ
ートナ−”、即ち対応する抗体又は抗原にさらして試験
を行なう。捷た“サンドイッチ”型アッセイでは検出さ
れる抗原を含む試験試料を対応する抗体に加えた後第２
ラベル付き抗体を抗原に加えて抗原の存在を示している
検出できるラベル付き”サンドイッチ＃をつくる。試験
試料中の抗原に特異な抗体にまねた抗原の比較結合量が
試料中にある抗原の比較量を示すに使われる補力競争結
合アッセイもある。これらのイミュノアツセイにおける
抗原と抗体の反応は疑わしい状態の存在を示し、反応は
抗原又は抗体上のラベル存在によって眼で確認される。

最もよぐ便われるラベルは基質を加えて接触反応をおこ
させ変色させる酵素であシ、螢光、化学発光又は放射性
分子も一般に使われる。米国特許第４゜０１６．０４３
月、第４，４２９，２７９号および第４．０１８゜６５
３号に見られる様に広範な種々のイミュノアツセイ方法
が最近使われている。

病気検査用の正確なイミュノアッセイの成功的発達はア
ッセイを行なうための適当な抗原又は抗体が入手できる
ことを必要とするう例えば理想的抗原は問題の慣殊条件
に極めて特異であシ、試験試料中におけるその同定は原
因薬剤又は他の付ずい要素の存在を決定的に示すであろ
う。この様な抗原には例えば特定細菌種に特有のりボボ
リサッカリド；特定ビールス型の被膜にのみ発見される
糖蛋白質；又Ｖｉ腫瘍細胞の様な異常細胞型にのみ見ら
れる細胞表面抗原がある。特定細胞型又は種に特異でな
い抗原の選択は同様に抗原をもつ無関係細胞又は生物体
の同定によって多数の偽陽性反応を生ずるので適当抗原
選択は診断精度に重要である。

特異腫瘍型のマーカーとして肺部細胞抗原を確認するた
め特殊の努力がなされている。特異性をもつ病気と結合
した抗原を同定できる試験法開発は早期診断のみならず
′また病気進行評価と行っている治療の効果決定にも臨
床医には実質的価値あるものである。腫瘍に特異な抗原
に対するイミュノアツセイ開発はある程度成功されてい
る。例えば人のコリオノゴナドトロピン（ｈＣＧ）が栄
養肝葉病のモニターに有効使用されている。同様にアル
ファフェトプロティン（ＡＦＰ）、グロスタチン酸フォ
スファターゼ（ＰＡＰ）およびカルジノエンブリオ抗原
（Ｃ，ＥＡ）の様な他のある抗原も一般に″また畢丸、
前立腺および結腸直＆尚との特殊関係で腫瘍検出とモニ
ターにすべて有効使用されている。

しかし前記物質のコレクション以外正確な診断とモニタ
ーリングに実際便利な他の抗原が比較的欠乏している。

これは特に婦人科悪性腫瘍、特に状況診鵬前に骨盤内腔
中にしばしばすでに転移した卵巣癌において事実である
。これらの癌種の多くは一般に非常に激しい進行型を示
し！ｆ、た一般に化学療法によく感応する。故にこの病
気における正確な早期診断方法が非常に望まれている。

卵巣癌の選択検出に便利な抗原分離のため多くの研究が
発表されている。例えばフナ−７とウルバツク（Ａｍ、
　Ｊ。

の７６％の血漿中に著しくあけられたＯＣＡと名づけら
れた抗原を記載している。不幸にも良性婦人病患者、妊
娠女性および無病比較対照者の約１（ｌの高水準でも抗
原はおこるので陽性試験結果は見込として信用できない
。同様にスミスとオ＃（Ｏｂｓｔｅｔ、　＆　Ｇｙｎｅ
ｅｏｌ、　５ｕｒｖ。３９：３４６（１９８４））　　
は卵巣癌連合抗原を報告しているが、この抗原は未だそ
の特異性と罹病患者の診断とモニタリングにおける安定
性について評価されていない。

最近のバストら（Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、Ｍｅｄ、　
３０９　：　８８３（１９８３））のＣＡ１２５として
知られている漿液性嚢腺癌卵巣抗原の発見は卵巣癌患者
モニターリングに太いに価値あるとわかっている。この
抗原は卵巣癌細胞ライン０ＶＣＡ４３３でねずみを刺戟
しておけられた却クローン性抗体０Ｃ１２５を使って分
離された。そＩ″Ｉは０ＶＣＡ４３３細胞並びに１３又
は１４の他の卵巣癌細胞ラインおよび黒色腫細胞ライン
の細胞表面抗原を認めるため示されている。この抗原は
組織培養媒質（マスクらのＣａｎｃｅｒＲｅｓ、４４　
：　２８１３（１９８４））　　から部分精製された高
分子量（２００，０００ダルトンｖ上）糖蛋白質である
。前記単クローン性抗体を使用して種々の癌型をもつ多
くの患者の血清中のＣＡ　１．２５存在を試験した。結
果は卵巣癌患者の８３％が高水準（ｍｌ当ｐ３５単位以
」二）であったが８８８通常患者血清の代か１％だけが
この水準以」二の滴定値を示した。この結果はＣＡ１２
５抗原の非卵巣特異性のある水準を示しているが、患者
病状の進行又は恢復による抗原の上昇又は低下水準の観
察は診断済患者病状の進行度モニターリングにおける抗
原の利用性を示している。診断目的のＣＡ１２５利用は
ある程度それが通常開発製品であると思われる事実によ
って更に複雛化される。相当量が妊娠中羊膜液中に発見
されている。（オブライアンらの担。

Ｇｙｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ａｂｓｔｒａｃｔ、　ｐ
、　５４．３月（１９８５））それｆ′ｉまた子宮内膜
症又は骨盤炎症の様な良性病状に関連して増加すると発
見されている。通常組織内のＣＡ１２５の少量の存在で
さえＣＡ−１２５に特異な抗体の非腫瘍組織並びに癌組
織との交互反応の機会を相当与える。したがって卵巣癌
の有力マーカーとしてＣＡ１２５抗原は実質的に有望で
あるが、非卵巣腫瘍とＣＡ１２５の通常組織水準からの
妨害を除去できる方法は未だ決定されていない。更に知
られた単クローン性抗体０Ｃ１２５は通常抗原と腫瘍抗
原の両方と反応すると思われる。したがってなお通常組
織と交叉反応の可能性なく卵巣癌の検出およびモニター
に信頼して使用できる真に卵巣腫瘍に特異なイミュノア
ッセイ法はないのである。今や意外にも抗原ＣＡ１２５
が卵巣腫瘍と連関した（　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　）　
ＣＡ　１２５に特異であると思われる従来発見されてい
ないサブユニットをもっことが発見されたのである。試
験した通常組織はＣＡ１２５分子のこの部分の存在を示
さずにいた。この独特なサブユニットの発見により卵巣
癌のマーカーとしてＣＡ１２５’！ｚ使用する試験方法
が非卵巣腫瘍と連関したＣＡ１２５抗原との交叉反応を
減少又は除去し改善される改良手段をもたらした。

（発明の開示） 本発明は腫瘍と連関したＣＡ１２５抗原にのみ発見され
る分子量約４０，０００ダルトンをもつＣＡ１２５抗原
のサブユニットに関する。

本発明Ｖｉ凍た腫瘍と連関したＣＡ１２５の４０，００
０ダルトンサブユニツトの特異性をもつ単クローン性抗
体に関する。

本発明は更に卵巣癌をもつと思われる個体の血清を腫瘍
と連関したＣＡ１２５の４０，０００ダルトンサブユニ
ツトに対し特異性をもつ抗体と接触させることより成る
卵巣癌の検出法とモニターリング方法に関する。

独特な腫瘍連関ＣＡ１２５サブユニツトの発見は今や腫
瘍をもつ患者の血清が通常患者又は良性婦人病患者の血
清と容易に区別できる手段を提供する。容易にＣＡ１２
５抗原から分離できる新規サブユニットは単クローン性
抗体製造に使用でき、それはイミュノアツセイに使った
ときその腫瘍連関サブユニットに対する特異性によって
腫瘍連関血清から通常のものを区別できる。

関連サブユニットの源泉、ＣＡ１２５は卵巣腫瘍をもつ
とわかっている患者血清から分離できる。抗原は糖蛋白
質分離技術の知られたどんな方法によっても分離できる
が、これができる最も信用できる方法はＣＡ１２５抗体
（セントコル社販売キット）を用いＣＡ１２５抗原を単
りローン性抗体結合粒にさらす分離法である。捷だＣＡ
ｌ２５抗原は分子ｅ適法で精製できる。４０ＫＤサブユ
ニツトはＣＡ１２５抗原の電気泳動後４０ＫＤバンドの
切除と溶離によって分離できる。

かく精製されたサブユニットは抗体製造に使われる。多
クローン性および単クローン性抗体はいづれも本発明の
サブユニットによる感作によってえられ、いづれも本発
明のイミュノアツセイに使用できる。両型の血清生成方
法はこの分野でよく知られている。多クローン性血清は
あ捷り好ましくないが、精製抗原サブユニットの有効量
を適当する実験動物に注射し動物から血清をとシ知られ
た免疫吸着法によりサブユニットに特異な血清を分離し
て比較的容易に製造される。この方法で製造さｉ′また
抗体は事実上どんなイミュノアツセイにも使用できるが
、製品の異質可能性のため一般にこれらはあ１り好まし
くない。

本発明のイミュノアツセイにおける単クローン性抗体使
用は大量製造可能なことと製品の均質性によって特に好
ましい。不死細胞ラインとイミュノジエニツク調合に対
し増感されたリンパ細胞の溶着によってえられた単クロ
ーン性抗体製造用ハイブリドマ細胞ラインの製造は当業
者に既知の方法によって行なわれる。（例えはドライラ
ード、　Ｊ、Ｙ。

とホフマンＴ、のＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｉｒｎ
ｍｕｎｏｌｏｇｙＩｔ巻、Ｌ。シュワルツ（１９８１）
　　における６ハイプリドマ“に関する基本事実；コー
ラ−Ｇ。とミルスタインＣ６のＮａｔｕｒｅ　　２５６
．４９５−４９７（１９７５）：　ＥｕｒｏｐｅａｎＪ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　６巻、
５１１−５１９（１９７６）、コブロウスキーらの米国
特許第４，１７２，１２４号；コブロウスキーらの米国
特許第４，１９６，２６５号、およびワンプの米国特許
第４，２７１，１４５号全参照、これらはいづれも参考
としてこの明細書に加えておく）。

多クローン性血清製造とちがって動物の選択はリンパ細
胞と溶着できる適当力不死細胞ラインの利用度による。

はつかねずみとねすみはハイドリドマ方法に選択される
動物で、好んで使われる。もし適当な不死化人間（又は
非人間）細胞ラインが使用できれば人も増感されたリン
パ細胞源として使用できる。本発明の目的に選択された
動物は約１０μ２の精製ザブユニットを注射される。普
通注射用物質はフロイント完全補助液中に乳化される。

応援注射も必贋であろう。抗体製造検査は抗血清を適当
なラベル利き抗原で試験して行なわれる。リンパ細胞は
増感された動物肺臓又はリンパ腺を無菌状態で除去し融
合させてえられる。別にリンパ細胞は例えばＣ，リーデ
ィングのＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

ｙり去、且ジ：２６１−２９１　（１９８２）に記載の
とお）試験管内で刺戟又は免疫化できる。

融合に適した多くの細胞ラインが開発されており、交雛
プロトコルに対する特定ラインの選択は成長特性の速度
、均一性、成長媒質の成分に対する物質代謝不足および
よい融合頻度に対するポテンシャルの様な多くの基準の
いづれか一つに向けられる。

中間雑種、特に似た株間の雑種は中間釉融合よりもよく
働らく。骨髄腫免疫グロブリンを分が・能力損失につい
てえらばれた突然変異体を含む多くの細胞２インが使わ
れる。

これらには次のはつかねすみ骨髄腫ライン：　Ｍ　Ｐ　
Ｃ＋　１−Ｘ４５−６ＴＧ、Ｐ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ　
４−１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８又はＸ６３−Ａｇ　８．
６５３、ＳＦ３−０−Ａｇ１４（すべてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
／Ｃからえられた）、Ｙ　３−’Ａｇ　１．２．３　（
ねずみ）およびＵ２６６（人）の様なその突然変異体が
ある。

ＭＪＷ合ｔａエブスクインーバール又に、センダイビー
ルスの様なビールス又はエチレングリコールのいづれか
によっておこされる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）は哺乳動物身体細胞融合の最も有効な薬剤である１、
ＰＥＧ自体細胞には有毒であろう、そして融合を試みる
前に種々の濃度について生活力への影豐を試験する必要
がある。ＰＥＧの分子量は１，０００乃至６，０００で
変ってもよい。それは塩溶液又は無血清媒質中に約５０
チシ警に稀めたとき好結果を与える。現在の場合ねずみ
細胞を用いて３７℃のＰＥＧに約３０秒さらすとよい。

高温は避けるべきで、融合系の各成分を融合前３７℃で
培養すると最適結果かえられる。

リンパ細胞と悪性細胞の比率は肺臓細胞間の細胞融合を
避けるため適当とする必要がある。骨髄腫−リンパ細胞
比率１ｉ、１：１乃至１：１０範囲でよい結果かえられ
る。

うまく融合された細胞はこの分野で利用される方法で骨
髄腫ラインから分離できる。最も普通のよい方法はヒボ
キサンチングアニンフオスホリボシルトランスファーゼ
（ＨＧＰＲＴ）の欠乏している、雑種成長のみをさせる
に使われる一般にヒポキサンチンＩ　Ｘ　１０”　Ｍ、
アミノプテリンＩ　Ｘ　１０−５Ｍおよびチミジン３　
Ｘ　１０−’　Ｍより成り普通ＨＡＴ媒質として知られ
ているアミノプテリン含有媒質中で成長しない悪性ライ
ンの選択にある。融合混合物は融合直後又は２４時間後
にＨＡＴ含有培養媒質中で成長させうる。普通栄養スケ
ジュールはＨＡＴ媒質中で２週間保存を要しその後は正
常培養媒質又はヒボキサンチン、チミジン−含有媒質の
いづれかを用い補給する。

成長する集落の抗原製剤を認める抗体の存在が試験され
る。ハイブリドマ抗体の検出は抗原が固体支持体に結合
され推定抗体を含むハイブリドマ上澄液に反応させられ
る様な試験法を使ってすることができる。抗体の存在は
種々の指示薬を使って“サンドインチ”法によって検出
できる。

殆んどの一般方法は雑種成長中分泌された抗体濃度範囲
内での使用には十分敏感である。

雑種のクローニングはえらばれた媒質中で細胞成長２１
−２３日後に実行できる。クローニングは液相中で細胞
限定稀釈により又は型置体アガロース中で成長する単細
胞の直接選択によってなされる。限定稀釈においては細
胞懸濁液がウェル当り１細胞のみをもつ統計的確率とな
る様連続稀釈される。アガロース法においては雑種はフ
ィーダー細胞をもつ下層の上の型置体上層中に種つけさ
れる。上層からの集落はつまみ上げられ結局ウェルに移
される。

抗体を分泌している雑種は種々の組織培養フラスコ中で
成長させられ種々の濃度の抗体を含む上澄液を生ずる。

高濃度をえるために雑種を動物中に移して炎症性腹水液
をえることもできる。抗体をもつ腹水症は腹腔的注射後
８−１２日で収穫できる。腹水液は高濃度抗体を含むが
、炎症性腹水液からの単クロナールおよび免疫グロブリ
ンの両方も含む。次いで抗体精製も例えば親和力クロマ
トグラフ法によってできる。

患者血清中のＣＡ１２５　４０ＫＤサブユニツト抗原の
存在はこの抗体と単クローン性又は多クローン性、事実
上どの型のイミュノアツセイを用いても確認できる。も
ちろんこれには重位置又は２位置両方又は非競争型“サ
ンドインチ”アッセイ並びに伝統的競争結合アッセイが
ある。サンドイッチアッセイは中でも一番便利で普通便
われるアッセイで、本発明の使用によい。サンドイッチ
アッセイ法の多くの変法があり、そのいづれもが本発明
に包含されるものと考えている。簡単にいえば代表的進
歩したアッセイではラベルなし抗体は固体基質上に固定
され試験される試料は結合分子と接触させられる。適当
培養期間、抗体−抗原２元複合物生成に十分な時間後に
検出信号を出しうるレポーター分子でラベルされた第２
抗体を加えて抗体−ラベル付き抗体の３元複合物生成に
十分な時間培養する。反応しない物質を洗い去り抗原の
存在をレポーター分子の出す信号観察によって決定する
。結果は単に肉眼観察により定性的に又は既知量のハプ
テンを含む対照試料との比較により定量的にいづれでも
求められる。進歩したアッセイの変法には試料とラベル
伺き抗体の双方を同時に結合抗体に加える同時アッセイ
又はラベル付き抗体と試験する試料を先ず混合し培養し
た後ラベルなし表面結合抗体に加える逆アッセイがある
。この方法は当業者にはよく知られている。ここで用い
る１サンドイツチアツセイ”は基本的２位置方法のすべ
ての変法を包含するものとする。

抗原は問題（抗原又はハプテンいづれが）の分子に特異
な抗体の制限量が検出される未知量分子を含む溶液およ
び検出される分子の検出できるラベル付き既知量を含む
溶液又はそれと同様のものの特定量と混合される様な競
争結合アッセイによっても検出できる。ラベル付きとラ
ベルなし分子が抗体の結合できる位置を競う。遊離分子
と抗体結合分子の相分離は各相中にあるラベル量を測定
するので試験試料中の抗原又はハプテンのｆを示す。こ
の一般競争結合アツセイにおける変法は最近多数ある。

知られたイミュノアツセイのいづれにおいても実用目的
には１抗体が一般に同相に結合し、またサンドイッチア
ッセイの第２抗体又は競合アッセイいづれかの第２分子
、既知量抗原は検出できるラベル又は報告用分子をもち
抗原−抗体反応を肉眼確認させる。サンドイッチアッセ
イの様に２抗体を使うときは抗体の片方が４０ＫＤサブ
ユニツトに対し特異であセ、他方がサブユニット又はＣ
Ａ１２５抗原に対して特異であればよい。次の記述は一
般進歩的ザンドイツチアツセイの論説に関するものであ
るが、一般法はどんな考えられるイミュノアッセイにも
応用できると諒解されている。

代表的進歩したサンドイッチアッセイにおけるザブユニ
ット分子に特異性をもつ第１抗体は固体表面に共有的又
は受働的いづれかで結合している。固体表面は典型的に
ガラス又は重合体であり、最も普通に使われる重合体は
セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチ
レン、ポリビニルクロライド又はボリグロピレンである
。固体支持体は管、粒、板又は微小板又はイミュノアッ
セイ実施に適したどんな表面でもよい。結合させる方法
はこの分野でよく知られており、一般に交差共有結合又
は不溶性担体への分子の物理的吸着よシ成る。結合後重
合体−抗体複合物は試験試料用製剤中で洗われる。次い
で試験試料アリコートを固相複合物に加えサブユニット
を全部抗体に結合させるに十分の時間２５℃で培養する
。培養時間は変ってもよいが、一般に約２乃至４０分で
よい。培養後抗体サブユニット固相を洗浄乾燥しハプテ
ン部分に対し特異の第２抗体と共に培養する。第２抗体
はそれのハプテンへの結合を示すに使われるレポーター
分子に結合させられる。本明細書と特許請求範囲で使用
する゛レポーター分子”とはその化学特性によシ抗原と
結合した抗体を検出させる分析指示信号を出す分子を意
味する。検出は定性又は定量的いづれでもよい。この種
のアッセイに最も普通に使われるレポーター分子は酵素
、螢光団又は放射性核種含有分子のいづれかである。酵
素イミュノアツセイの場合酵素は一般にグルタルアルデ
ヒド又は過よう素酸塩によって第２抗体に共役される。

しかし経験者がたやすく応用できる共役方法が種々ある
ことは容易に認められるであろう。普通債われる酵素に
はせいようわさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリ性ボス
ファターゼ等がある。特殊酵素と共に使われる基質は一
般に加水分解の際対応する酵素によって検出できる変色
をする様えらばれる。例えばりん酸ｐ−ニトロフェニル
はアルカリ性ホスファターゼ共役物と共に使用するに適
している。

ヘルオキシダーゼ共役物に対しては普通１．２−７エニ
レンジアミン、５−アミノサリシクリン酸又はトリジン
が使われる。また上記発色物質よりもむしろ螢光性生成
物を生ずる螢光発生物質を使うこともできる。すべての
場合酵素ラベル付き抗体を第１抗体ハプテン複合物に加
えて結合させた後第２抗体ハプテン複合物に加えて結合
させ、次いで過剰試薬を洗い流すのである。

適当基質を含む溶液を抗体−抗原−抗体３兄複合物に加
える。基質は第２抗体に結合した酵素と反応して定性的
に見える信号を出し、それは更に普通分光分析法によっ
て試料中にあるハブテン量を定量測定できる。

またフルオレセインやローダミンの様な螢光性化合物は
抗体とその結合能力を変えずに化学的にカップルさせる
ことができる。フルオロクロムでラベルした抗体は特定
波長光で活性化されると光エネルギーを吸収し分子内に
励起状態を生じ特有長波長光を放出する。この放出は光
顕微鏡により確認できる特定色としてあられれる。ＥＩ
Ａにおける様に螢光ラベル付き抗体は第１抗体−ノ・ブ
テン複合物に結合させられる。未結合試薬を洗い流した
後残シの３元複合物を適当波長光にあてると昭められた
螢光は問題のノ・ブテンの存在を示す。免疫螢光および
ＥＩＡ方法はいづれもこの分野で確立されており本発明
方法に特に好ましい。しかし放射性同位体、化学発光体
又は生物発光体の様々他のレポーター分子も使用できる
。必要目的にあう様方法をどう変えるかは経験者には容
易にわかるであろう。

本発明の好捷しい実施態様には卵巣癌検出用キットがあ
る。このキットは４０ＫＤサブユニツトに特異性をもつ
抗体を入れている第１容器とＣＡ１２５の４０ＫＤサブ
ユニツト又はＣＡ１２５自体に特異性をもつ第２抗体を
入れている第２容器を入れる様２分しておシ、抗体の１
方は検出信号を出しうるレポーター分子でラベルされて
おり、他方は固体表面に固定されているのである。

本発明の方法とキットは事実上どんな種類の卵巣癌の検
出とモニターリングにも応用できる。これは卵巣癌全体
の約７５％に達する嚢肺癌の検出に特に適している。

本発明の実施については下記実施例によって更によく諒
解されるであろう。

実施例Ｉ ＣＡ１２５腫瘍サブユニツトの分離と精製ＣＡ１２５腫
瘍抗原を卵巣腫瘍患者からとった腹水液から精製した。

腹水液を１０，０ＯＯｘｆで遠心分齢した後１０−のア
リコート中−２０℃で貯蔵した。アリコート１０−をＣ
Ａ１２５１Ｓｆｆ製液からとり、１１００ｍＸ５管の半
量１ＨＷ５５フラクトゲル（ＥＭ試薬）で、また他の半
量を）ｌＷ６５フラクトゲルで満した管に応用した。Ｈ
Ｗ５５とＨＷ６５は高分子量分子を分ける様設計された
分子ｆ過粒である。ＨＷ５５とＨＷ６５混合物は先づＨ
Ｗ５５から７００．０００ダルトン又はそれ以上の分子
を除外分離する。

これらの分子は更にＨＷ６５の大きさを分別して５Ｘ１
０’ダルトンまでの分子を分離する。腹水液はｐＨ７，
２の２０ｍＭビス−トリスプロパン緩衝液と０．１％ア
ジ化ナトリウム中０．１５　Ｍ　Ｍａｉｌ　　を用いて
この管をとおし処理された。

９１１１１！部分が集められ市販アッセイキラトラ使っ
てＣＡ１２５活性度をモニターした。ＣＡ１２５は分子
大きさ約ｌＸｌ０’乃至４Ｘ１０’ダルトンの広範囲で
溶離する。活性をもつ部分を集めてポリエチレングリコ
ールフレーク（）くイオラドアケサイド■）を使い透析
袋中で脱水した。ＣＡ１２５活性をもつ脱水物質を脱イ
オン水中で脱水し、また蒸留脱イオン水に対し十分透析
（Ｘ３）した。くもった懸濁液を１５００　ＯＲＰＭで
２０分間遠心分離し不溶物質全ペレットとし透明液をえ
た。この方法によってＣＡ１２５活性は少しもペレット
に失なわれなかった。更にＣＡ１２５精製は０．２２μ
ｍ無菌フィルター（アミコン社）で上澄液を１過してで
きた。次いでＰ液を１−エツピンデルフ／ミクロチュー
ブ中に分は高速遠心分離凍結乾燥法を用いて乾燥した。

乾燥試料を必要に応じ５ＤｓＢ料緩衝液（６０ｍＭ）’
ＪスｐＨ６，８５１メルカプトエタノール、３チドデシ
ル硫酸ナトリウム、１０％グリセロール）中に懸濁させ
レムリ（レムリ　Ｕ、に、Ｎａｔｕｒｅ、２２７　：　
６８０　（１９７０））方法により１２チポリアクリル
アミドゲルをとおし電気泳動させた。電気泳動稜のゲル
のコマツシー青色着色は４０にダルトン蛋白質、５０に
ダルトン蛋白質および９２にダルトン蛋白質の存在を示
す。ペプチドバンドはコマツシー青をもつバンド位置を
確認した後標準メスを使ってゲルから切除できる。４０
ＫＤバンドは電気溶離緩衝液（２５ｍＭトリスペース１
９２ＭＭグリシン０．１チ５ＤＳｐＨ８，３）中バイオ
ラド電気溶離剤を使い１５０ボルトで３時間でゲルから
電気溶離した。試料を約１−補集し２Ｍ　ＮａＣ１４ｍ
Ｍ　）ＩＪスｐＨ７，０に対し３回交換透析した後脱イ
オン水に対し１夜透析した。試料を高速真空乾燥し一７
０℃で貯蔵した。４０ＫＤサブユニツトを含む各サブユ
ニットの純度確認は再電気泳動法によって行なった。

精製ＣＡ１２５抗原又は粒をえらんだ（抗体をえらんだ
）抗原のいづれかのよう素化後のＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルよう素化はＣＡ１２５腫瘍から生じた抗原の４
０ＫＤサブユニツトの存在を確かめる。

実施例２ 多クローン性抗体調製 兎の背中１０ケ所に精製ＣＡ１２５　４０ＫＤサブユニ
ツト抗原２０μｆ／ｄ　　ｌ含むフロイント完全補助剤
５０μｔを皮肉注射して免疫化した。兎の背中両側の毛
をそって皮肉注射の用意をした。抗原−補助剤混合物を
２接続１ｍ７！ガラスティフロン注射器中に混合してつ
く９１ケ所１０μｌ薬量を投与した。注射４０日後兎に
抗原の１００μＬ　ＰＢＳ当９１０μＶを直接静脈内注
射した。７乃至１０日後兎の耳静脈から採血し血清中の
抗−ＣＡ１２５　４０ＫＤ抗体の存在を試験した。山羊
の杭先被覆したラテックス粒の存在において１２６Ｉラ
ベル付き４０ＫＤサブユニツトを使って兎抗血清の審査
と滴定を行なった。

実施例３ 単クローン性抗体製造 コーラ−とマルスキン（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、
６：５１１−５１９　（１９７６））によって開発され
た方法により単クローン性抗体を製造した。フロイント
完全補助液中ＣＡ１２５　４０ＫＤサブユニツト１０μ
２をはつかねずみ腹腔内注射し免疫化した。注射２週間
後りん酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中抗原１０ｐｆの腹腔
内注射によりはつかねずみを明ばん液（１０■／＋＋ｗ
Ｊ）１００ｐｌ中抗原１０μＶでブーストした。

第２回注射５日後ねすみ血清中に抗体確認後ねずみを殺
し肺臓をと９出した。７−ダンスホモジナイザー中で３
．５−４ｍ／Ｐ　Ｂ　Ｓ中に肺臓をしずかに崩壊させて
肺臓細胞をえた０次いで室温でＰＲ６遠心分離中１２０
ＯＲＰＭで６分間かけてペレットとした。上澄液ｆ：吸
引フラスコ中にとり出し細胞を０．８３　％　ＮＨ４Ｃ
ｌ　　１５−中に懸濁させた。この懸濁液を室温で５分
培養した後１〇−牛脂児血清１〇−と３７℃で沈降させ
た。細胞を再び室温で１２０ＯＲＰＭで８分間遠心分離
しベレットとし、上澄液を吸引フラスコ中にとシ出し細
胞をＰＢＳ２０−中に再び懸濁させた。

あとの細胞溶着に使うため次の溶液を製造した：ハイポ
キサンチン（Ｈ）：６８０■／１００ｍ＋／Ｈ２０：　
　濃Ｈ２ＳＯ４２−４滴添加、加熱溶解。

アミノプテリン（Ａ）　：　４６．４η／　１００ｄ　
ＨｚＯ：　０．　Ｉ　ＮＮａＯＨ２滴添加、溶解させる
。

チミジン（Ｔ）ニア７５■／１００ｄＨ２０：４５ηグ
リシン滴加。

ＰＥＧ−ＤＭＥ：ＰＥＧを４２℃でとかしＤＭＥｌ−を
３７℃で加え１．ＯＮ　ＮａＯＨでｐＨ７，６に調節。

ＤＭＥＭ：ＤＭＥ５００−にａ−γ−馬血清３７．５ｍ
ｌ。

ＦＣ８３７，５ｍｇ、Ｌ−グルタミン１０．０−およヒ
カラマイシンＯ，Ｆ＋ｓ／ｅ加える。

２Ｘ　ＨＡＴ−ＤＭＥ：ＤＭＥ２００Ｗｔにｈ−７馬血
清２５．〇−１ＦＣ８２５，０１１７！、Ｌ−グルタミ
ン４．０−、ガラマイシン０．２−１Ｈ０，８ｔ！、、
Ａｏ、８−およびＴＯ，８ｍ（２ＸＨＴ−ＤＭＥはＡを
省く）を加える。

クローニング寒天：　Ｈ２０２５−中に非洗浄ディフコ
寒天３５０ＭＩ（ｆ−加えオートクレーブ加熱した。

クローニング媒質：２Ｘ　ＤＭＥ　２５ｄに沢過した処
理したＤＭＥＭ３５ｄ、ａ−γ馬血清７−１ＦＣ８７−
１Ｌ−グルタミン１ｔｎｔ、ガラマイシン０．１−を加
えた。

３０−フラスコ２個のＳ　ｐ　２１０細胞を遠心分離管
に加え１２００ＲＰＭ室温で８分回転させた。牌蔵細胞
をＰＢＳ２０−に再懸濁させた。各懸濁液から０．０１
−をとり出し０．４チドリパン青０．１−とＰＢＳｏ、
３Ｍｔに加え細胞をかぞえた。各懸濁液容量を肺臓細胞
対ｓｐ　２１０細胞比率１０：１となる様調節し懸濁液
を混合した。混合物を室温１２００ＲＰＭにおいて８分
かけてペレット化し約０．１　ｍＡの上澄液をとり去っ
た。細胞を残り液に再懸濁し、ｐＨ７，６のｉ　：　Ｉ
ＰＥＧ−ＤＭＥ溶液１．３７！に加えた。毎分溶液容量
’ｉＤＭＥで２倍とし最終２５−とじた。

細胞を再ひペレット化し、上澄液を傾瀉し十分な５０チ
２Ｘ　ＨＡＴ−ＤＭＥ１５０％処理したＤＭＥＭ（上記
５ｐ２１０細胞からとった上澄液）中に再懸濁させて肺
臓細胞最終濃度約３．５Ｘ１０’をえた。細胞を９６ウ
エル平底ミクロタイタープレート（フローラボラトリー
ズ、ＴＣ−９６）に０．１　ｄ／ウェルに分布させた。

このプレートを湿空気−Ｃ０２混合物中で３７℃で培養
し普通約１０−１２日で可視集落があられれた。ウェル
内容物をＴＣ−２４プレート（フローラボラトリーズ）
内のＨＴ−ＤＭＥ／　　　　処理したＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　
０．５　ｆｆ７！に移した。健全な細胞が成長したとき
（約２−５日後）約０．３５−の媒質をとり酵素結合免
疫吸収アッセイ（ＥＬＩ　ＳＡ）、ヘマグルチニン抑制
アッセイ又はノイラミニダーゼ抑制アッセイに工って抗
体生成を試験した。問題の抗体を生成しているこれらの
細胞がよく成長していれば各培養液からの１滴７ｉｌ−
Ｔｃ−２４中のＤＭＥＭｌ、〇−中に移した。

雑種細胞をクローン（Ｃ１ｏｎｅ）するため溶融寒天２
５−とクローン用媒５ｊ　７６　ｍｌを混合し５−をピ
ペットで６０−ペトリ皿にとり放債して固化させた。Ｄ
ＭＥＭ培養からの細胞を５０チｐＭＥＭ７５０％処理し
たＤＭＥＭ中に細胞成長によって１０−１又は１０２に
稀釈した。

無菌管中に２稀釈液の各０１−を入れそれぞれにクロー
ン用媒質／寒天混合物０．９−を加えた。これをよく混
合し下層寒天表面上に注入した。固まった後プレートを
３７℃培養器中で集落が肉眼でわかる寸で大体７−１０
日間培養した。集落をとりＴＣ−９９プレート中のＤ　
Ｍ　Ｅ　Ｍ／処理したＤＭＥＭｏ、１−に移し３７℃　
Ｃ０２培養器中で培養した。培養物が酸性となった（普
通１−４日）後ＴＣ−２４プレート中のＤＭＥＭｏ、０
５−に移した。成長が５０％融合のとき媒質をとり出し
前記のとおり抗体生成を試験した。

４０ＫＤサブユニツトに特異な抗体全生成するクローン
を２５ｃｒｎ２　フラスコ中のＤＭＥＭ５−に移した。

次いでクローンした細胞を凍結するか又は腹水液生成の
ためはつかねずみに注射した。

実施例４ ４０ＫＤサブユニツト抗原用サンドイツチアツセイ血清
中の腫瘍に特異の抗原存在検出のため実施例３における
とおり生成した単りローン性抗体約１００μｌをラテッ
クス粒土に固定し、検査血清試料約１００μｔと接触さ
せた。抗体と血清を約１０分間反応させた後ＰＢＳ溶液
で洗った。ラテックス粒にＣＡ１２５に特異な、せいよ
うわさびペルオキシダーゼと共役した抗体約１００μｔ
を加えた。ラベル付き抗体粗混合物を約１０分間培養し
た。この時点で酵素基質、過酸化水素およびアンチピリ
ンを粒と接触させ、この混合物を約５−１０分培養させ
た。このとき試料が発色し陽性反応、即ち腫瘍に特異な
４０ＫＤ抗原の存在を示した。

前記方法はまた４０ＫＤ抗原に特異の単クローン性抗体
又は４０ＫＤ抗原に特異の単クロナール、多クロナール
又は２多クロナールを用いて行なった。４０ＫＤサブユ
ニツトに特異な１抗体のみおよびＣＡ１２５抗原に特異
な第２抗体を使ってアッセイを行なうこともできる。

特許出願人　　リサーチコーポレーションテクノロジー
ズインコーボレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、約４０キロダルトンの分子量をもつことを特徴とす
   るＣＡ１２５抗原のサブユニット。 ２、腫瘍と連関したＣＡ１２５のサブユニットである請
   求項１に記載のサブユニット。 ３、ＣＡ１２５抗原の４０キロダルトンサブユニットに
   対し特異性をもつことを特徴とする抗体。 ４、単クローン性抗体である請求項３に記載の抗体。 ５、癌をもつと思われる患者の血清をＣＡ１２５の４０
   キロダルトンサブユニットに対し特異性をもつ少なくと
   も１の抗体と接触させサブユニット−抗体反応を検査す
   る工程を特徴とする卵巣癌検出方法。 ６、（ａ）卵巣癌をもつと思われる患者の血清をＣＡ１
   ２５の４０キロダルトンサブユニット又はＣＡ１２５抗
   原のいづれかに対し特異性をもち固体表面に結合してい
   る第１抗体と十分の時間接触させて２元複合物を生成し
   ；（ｂ）上記２元複合物にサブユニット又はＣＡ１２５
   抗原のいづれかに対し特異性をもち検出信号を発しうる
   レポーター分子でラベルされている第２抗体を加えて十
   分の時間接触させて３元複合物を生成させ、かつ上記抗
   体の少くとも１は４０キロダルトンサブユニットに対し
   特異性をもつものであり； （ｃ）レポーター分子の検出信号を観察して３元複合物
   の存在を検出する； 工程より成る請求項５に記載の方法。 ７、（ａ）ＣＡ１２５抗原の４０キロダルトンサブユニ
   ットに対し特異性をもつ抗体を入れている第１容器；お
   よび（ｂ）ＣＡ１２５抗原又は４０キロダルトンサブユ
   ニットに対し特異性をもつ第２抗体を入れている第２容
   器；に分割されているキットであり、上記抗体の１方が
   固体表面に固定されておりまた上記抗体の他方は検出で
   きる信号を発しうるレポーター分子でラベルされている
   ことを特徴とする卵巣癌診断および監視用キット。 ８、レポーター分子が放射性同位体、酵素、螢光性分子
   、光学発光性分子又は生物発光性分子である請求項７に
   記載のキット。 ９、レポーター分子が酵素である請求項７に記載のキッ
   ト。 １０、キットが更に （ｃ）酵素用基質を入れている第３容器； をもつ請求項９に記載のキット。