JPS63304985A - 新規なプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗生物質や農薬の修飾剤として極めて有用な
り一アミノ酸の酵素合成などに特に有効に用いられる、
アラニンラセマーゼ（以下ＡＩａＲと略す）及びＤ−ア
ミノ酸トランスアミナーゼ（以下Ｄ−ＡＴＡと略す）を
コードする遺伝子を有する新規なプラスミドに関するも
のである。

（従来技術） 従来バチルス　ステアロサーモフィラスＩＦ０１２５５
０由来の耐熱性ＡＩａＲをコードする遺伝子を有するプ
ラスミドｐＩＣＲ４（バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）　２５　、３２６８−３２７４　（１
９８６））やバチルス　エスピー　ＹＭ−１由来の耐熱
性Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝子を有するプラスミドｐ
ｌｃＴ１１３（特願昭６２−３９１７３号）などが構築
されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、遺伝子組換え技術を用いてＡｌａＲ及びＤ−Ａ
ＴＡの二酵素を調製し、同時に該二酵素を使用する場合
、前述した該二酵素をコードする遺伝子を有する別個二
つのプラスミドで別々に宿主を形質転換し、形質転換株
を選択後、それらを別々に培養して該二Ｅ９ｇを調製す
る必要がある。

この方法では操作が繁雑で、時間、費用等がかかり、経
済的に有利でない。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明は、該二酵素をコードする遺伝子を一つの
プラスミド上に構築することにより、形質転換、培養な
どの該二酵素の調製を一度に行い、大幅な省エネルギー
、省力、省時間を可能とならしめることを目的とする。

即ち、本発明は、ＡｌａＲ及びＤ−ＡＴＡをコードする
遺伝子を有するプラスミドである。

本発明のプラスミドを得るには、例えば、ＡｌａＲをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、およびＤ−ＡＴＡを
コードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得し、取得した
二つのＤＮＡ断片とベクターとしての役割を有するＤＮ
Ａを、ジャーナルオプ　モレキュラー　バイオロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ
ＯＶ＞　９６．１７１−１８４　（１９７５〉に記載の
方法に従い、制限酵素で消化し、次いでリガーゼを用い
て結合することにより調製することができる。

本発明に好ましく用いられるＡｌａＲをコードする遺伝
子としては、耐熱性、安定性などの点から、例えば好熱
性の微生物の染色体ＤＮＡ由来の遺伝子があげられる。

その中でもＡｌａＲ活性の高いバチルス　ステア０サー
モフイラス由来の遺伝子が望ましい。これらの具体例と
してＩＦＯＩ２５５０、ＡＴＣＣ７９５３などがある。

又、Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝子としては、同じく耐
熱性、安定性などの点から好熱性の微生物の染色体ＤＮ
Ａ由来の遺伝子があげられる。中でもバチルス属の中等
度高熱菌由来の遺伝子が好ましい。

これらの具体例としてバチルス　エスピー　ＹＭ−１、
バチルス　エスピー　ＹＭ−２（微工研菌寄第８０５８
号）などがあげられる。

また、ベクターとしての役割を有するプラスミドとして
は、特にプラスミドｐＵｃ１８が好ましい。またυ１限
酵素としては、例えばｌ：ｃｏＲＩ。

３ａＣｒなどがあげられ、リガーゼとしては例えばＴ４
ＤＮＡリガーゼがあげられる。

本発明のプラスミドとしては、例えば前記した方法で、
プラスミドｐＵｃ１８に、バチルス　ステアロサーモフ
ィラスＩＦＯ１２５５０の染色体ＤＮＡ由来のＡｌａＲ
をコードする遺伝子と、バチルス　エスピー　ＹＭ−１
の染色体ＤＮＡ由来のＤ−ＡＴＡをコードする遺伝子を
導入したプラスミドｐＩＣＲＴ１１１があげられる。

本発明のプラスミドは、例えば常温で生育する細菌に導
入する事ができ、このプラスミドを導入することにより
形質転換された細菌を得ることができる。この常温で生
育する細菌としては例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　）属に属する細菌があげられ、エシェリヒ
ア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）が好まし
い。この中でもエシェリヒア　コりＨ［３１０１が特に
好ましい。

また、本発明のプラスミドにより上記常温で生育する細
菌を形質転換するには、例えばジャーナル　モレキュラ
ー　バイオロジー５３，１５９−１６２（１９７０）の
方法に従って、０℃付近で塩化カルシウム処理した上記
細菌と本発明のプラスミドとを接触させることにより行
えばよい。

以上のようにして形質転換された細菌の例として、プラ
スミドｐｌＣＲＴ１１１が導入されたエシェリヒア　コ
リ　１−ＩＢ１０１／ｐＩＣＲＴ１１１株があげられる
。この菌株は耐熱性のＡｌａＲ生産能、耐熱性のＤ−Ａ
ＴＡ生産能及びアンピシリン耐性を有する点以外は、公
知のエシェリヒアコリ　ＨＢｌｏｌと同じ菌学的性質を
有している。この菌体は、非伝達性を伝達性に変えるこ
となく、また非病原性を病原性に変えることなく、安全
性が保持されている。

本発明のプラスミドは、下記の式１に示されるＤ−アミ
ノ酸の合成、すなわち、ＡＩａＤＨ，Ｄ−ＡＴＡ、Ａ　
ｌ　ａＲ及びギ酸脱水素酵素（以下ＦＤ　Ｈと略す）の
触媒作用により、触媒量のＯＬ−アラニン（以下０Ｌ−
Ａｌａと略す）とＮＡＤ”の存在下、ギ酸、アンモニア
及びα−ケト酸からＤ−アミノ酸を合成する方法（特願
昭６１−４８２３３号）等に特に有効に使用することが
でき、ＡｌａＲおよびＤ−ＡＴＡの調製を容易にするも
のである。

式　　１ （発明の効果） 本発明のプラスミドは前述したように、有用な微生物、
例えば常温で生育する細菌を形質転換することにより、
細菌にＡ　ｌ　ａＲ，Ｄ、−ＡＴＡ生産能を同時に賦与
することができ、形質転換された細菌からＡＩａＲ及び
Ｄ−ＡＴＡを大量にかつ容易に、しかも同時に得ること
ができるので、前述したＤ−アミノ酸の製造等に非常に
有用である。

（実施例） 次に、実施例に基づいて本発明の詳細な説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。

（１）耐熱性ＡＩａＲをコードする遺伝子を有するプラ
スミドｐＩＣＲ１１３（ｐｌｃＲ４をサブクローニング
したもの）および耐熱性Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝子
を有するプラスミドｐｌｃＴ１１３の調製 プラスミドｐｌｃＲ１１３は、ベクターｐＢＲ３２２に
、バチルス　ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２５５０
の染色体ＤＮＡ由来のＡｌａＲをコードする遺伝子を導
入した°プラスミドであり、プラスミドｐ［ｃＴ１１３
は、ベクターｐＵＣ１８に、バチルス　エスピー　ＹＭ
−１の染色体ＤＮＡ由来のＤ−ＡＴＡをコードする遺伝
子を導入したプラスミドである。

後述する（５）に記載したのと同様の方法でプラスミド
ｐＩＣＲ１１３を尋人したエシェリヒアコリ　８８１０
１株を、５０μｇ／Ｍ１のアンピシリンを含む１１のス
ーパーブロース（Ｉｊ中にポリペプトン１５ｇ、酵母エ
キス２０ｇ、グリセロール５ａｆｌ、１００ｍの１Ｍリ
ン酸カリウムｍＩＩ液（ｐ１１７．６）を含む）で３７
℃、２〜３時間培養後、クロラムフェニコール溶液（１
−のエタノールに３４ＩＩ１ｇを添加）を６ａｆ加え、
更に１６時間培養した。

培養後、菌体を遠心分離により回収し、溶液Ｉ（５０ｍ
Ｍグルコース、２５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１）Ｈ８
，Ｏ）　、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、５ｑ／ｄリゾチーム
）２０ｄと激しく混合し３０分間放置した。次に溶液Ｉ
Ｉ（０，２Ｎ　　ＮａＯＨ，１％５ＤＳ（ソディウムド
デシルサルフエート））４０ｍを加え、軽く撹拌し氷上
に１０分間放直後、５Ｍ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ４，
８）を３〇−加え激しく撹拌し、氷上に１０分間放置後
遠心分離によりタンパク、ＲＮＡ、および染色体ＤＮＡ
を含む沈殿を上清と分離した。次に粗プラスミドを含む
上清に１１０ｄの冷エタノールを加え、−８０℃３０分
放置後、遠心分離によりプラスミドＤＮＡをエタノール
沈殿として回収した。沈殿を乾燥後、１６ｄＴＥ　（１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，Ｏ）、１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ＞、リボヌクレアーゼＡ　（ＲＮａｓｅＡ、生
化学工業製、１０ｇｗ／ｄ）２００．１１を加え３７℃
で１時間反応させ、フェノール−クロロホルム（１：１
）抽出により変性タンパクを除去し、２倍Ｍのエタノー
ルを添加して一８０℃で３０分間放置し、プラスミドＤ
ＮＡをエタノール沈殿として回収した。続いてベレット
状のプラスミドを少量のＴＥに溶解し、塩化セシウム（
１ｄのプラスミド溶液に１ｇを添加）及びエチジウムブ
ロマイド（１０ｄの塩化セシウム溶液にエチジウムブロ
マイド溶液（１０Ｎ１ｇ／ｄ）０．８ｄを添加）を加え
、４５，０００ｒｐｍで１２時間超遠心分離し、ｃ　ｃ
　ｃ　（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ｃｌｏｓｅｄ　ｃｉｒ
ｃｕｌａｒ）ＤＮＡのバンドのみを回収し、旦−ブタノ
ール抽出によりエチジウムブロマイドを除去した後、Ｔ
Ｅに対して充分に透析し、精製ｐＩＣＲ１１３を得た。

また、精製ｐＩＣＴ１１３もｐＩＣＲ１１３と同様の手
順で調製した。

（２）プラスミドｐＩＣＲ１１３のＥＣ０ＲＩ−ｓａｃ
　ｒ断片の調製 （１）で得られたｐＩＣＲ１１３４０μ９を制限酵素３
ａｃｌ（宝酒造社製）３００Ｕを含むＳａｃ　Ｉ用緩衝
液（１０ｍＭ　　トリス−塩酸Ｗ衝液（ｐＨ８，Ｏ）　
、　７ｍＭ　　ＭＣＪＣＩ　　、７ｍＭ　　２−ＭＥ、
０．０１％ＢＳＡ）４００μｐ中で５時間反応させ消化
した後、５Ｍ　　ＮａＣ１８μｍ、冷エタノール８５０
μｍを添加し、遠心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿
として回収した。回収したＤＮＡペレットを２０μｍの
ＴＥに溶解し、１５０Ｕの制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造
社製）を含むＥＣＯＲＩ用緩衝液（５０ｍＭ　　トリス
−塩１１１１１ｉ１（１）１１７．５）　、７ｍＭ　　
ＭｇＣＩ　　、１００ｍＭ　　ＮａＣＩ　、７ｍＭ　　
２−ＭＥ、０．０１％ＢＳＡ）４００μβ中で３７℃、
５時間反応させ、冷エタノール８００μｍを添加するこ
とにより、ＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。こ
のＤＮＡを２０μｍのＴＨに溶解し、０．７％ＬＭＰ（
ｌｏｗ　ｍｅｌｔｉｎｇ　ｐｏｉｎｔ　）アガロース（
ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　＠　）を用いて４℃において１００■で５〜
６時間電気泳動を行い、△１ａＲをコードする遺伝子を
有する１、９ＫｂのＥＣＯＲｌ−８ａｃ　（断片を分離
し、この断片を含むアガロースを切り取り、５倍容量の
ＴＥを加え６５℃で５分間加熱してアガロースを溶解し
た。この溶液を、フェノール抽出、フェノール−クロロ
ホルム（１：１）抽出、クロロホルム抽出を各１回行い
エタノール沈殿としてＤＮＡ断片を回収した。このＤＮ
Ａ断片を少ωのＴＥに溶解し、逆相液体クロマトグラフ
ィー（ＮＥＮＳＯＲ３１Ｍ２０、デュポン類）により精
製し、５０％メタノールで溶出した後、乾固してプラス
ミドｐｌｃＲ１１３の精製ＥｃｏＲｌ−８ａｃ　Ｉ断片
を調製した。

（３）プラスミドｐｌｃＴ１１３のＥＣ０Ｒ（−８ａＣ
Ｉ断片の調製 （１）で得られたプラスミドｐｌＣＴ１１３３０μ９を
Ｓａｃ　１３００Ｕを含む３ａｃ　ｌ用緩衝液４００μ
ｐ中で３７℃で５時間反応させ消化した後、５Ｍ　　Ｎ
ａＣ１８μｍ、冷エタノール８５０μｍを添加し、遠心
分離によりＤＮＡをエタノール沈殿として回収した。回
収したＤＮＡベレットを２０μｍのＴＥに溶解し、ＥＣ
０Ｒ１１５０Ｕを含むＥＣ０ＲＩ用緩衝液４００μオ中
で５時間反応させ消化した後、８００μｍの冷エタノー
ルを添加し遠心分離によりＤＮＡをエタノール沈殿とし
て回収した。

このプラスミドｐＩＣＴ１１３の［ｃｏＲＩ−８ａｃ　
Ｔ断片はベクターｐＵＣ１８由来の部分である。

（４）プラスミドＩ）ＩＣＴ１１３のＥＣ０ＲＩ−８ａ
ｃ　Ｉ断片とプラスミドｐｉｃＲ１１３の１旦０ＲＩ−
３ａＣＩ断片ノ連結 （３）で調製したベクターｐＵｃ１８由来の部分である
ｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲｌ−８ａｃ　Ｉ断片を２０μ
ｐのＴＥに溶解し、（２）で調製したｐｌｃＲ１１３の
ＥＣＯＲｌ−８ａｃ　Ｉ断片を２０μｍのＴＥに溶解し
た。ｐＩＣＴ１１３の旦ｃｏＲｌ−８ａｃ　Ｉ断片溶液
１１．ｐＩＣＲ１１３のＥｃｏＲｌ−８ａｃ　Ｉの断片
溶液８μｍをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）７００
ＬＪを含むＴ４ＤＮＡリガーゼ用緩衝液（６６ｍＭトリ
ス−塩１ｌｌｌ衝液（１）Ｉ７．６）　、６．６ｍＭ　
　ＭｇＣＩ２．１０ｍＭ　　ジチオスライトール（ＤＴ
Ｔ）、１ｉＨＡＴＰ）２０μρ中で一晩反応させＤＮＡ
断片を連結した。

＜５）（４）で連結したＤＮＡによるエシェリヒア　コ
リ　ＨＢｌｏｌの形質転換 エシェリヒア　コリ　ＨＢｌｏｌを１００ｄのＹＴ培地
（ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５び、ＮａＣｌ０
．５ｇを含む１００Ｉｄの培地、ｐＨ７，２）で２〜３
時間培養し、遠心分離により菌体を回収して冷１００ｍ
Ｍ　　Ｍ　ｇＣｌ　２で洗浄後、冷１００ｍＭ　　Ｃａ
Ｃｌ２に１濁し１時間氷上に放置した。次に遠心分離に
より上滑を除去後、冷１００ｍＭ　　ＣａＣｌ２５ｍに
再懸濁し、コンピテントセルとした。

次に（４）で得られた連結したＤＮＡ溶液１０μｍとコ
ンピテントセル懸濁液２００μΩを０℃で混合し、時々
撹拌しながら氷上に６０分間放置した後、４２℃で２分
間放置し、氷上で急冷した。

次にこの懸濁液に１ｄのＹＴ培地を加え、３７℃で１時
間振盪培養した後、アンピシリン含有（５０μｇ／ｄ）
ＹＴ−寒天培地（寒天２０グ／１）にブレーティングし
、３７℃で一晩培養し、形成したコロニーをアンピシリ
ン含有ＹＴ−寒天培地に再ブレーティングし、３７℃で
一晩培養して得られたコロニーを形質転換株とした。

（６）目的とするプラスミドを保有する形質転換株の選
択 （５）で得られた１５個の形質転換株より１０株をアン
ピシリン含有（１００μｇ／ｄ）ＹＴ培地５ｄで一晩培
養し、該株から（１）と同様の方法に従い、小スケール
で各プラスミドを単離した。

これらのプラスミドを（２）の方法に従いＥＣ０Ｒ１お
よびＳａｃ　Ｉで消化したところ、全ての７ラスミドが
、それぞれ１ケ所ずつ切られて約４゜５Ｋｂの単一なバ
ンドを生じた。また、ＥｃｏＲｌ、５ａＣＩのダブル消
化により、約２．７Ｋｂと約１．９Ｋｂの２本のバンド
を生じたことより、すべてのプラスミドが、ベクターｐ
ＬＪＣ１８由来の部分であるｐＩＣＴ１１３のＥｃｏＲ
Ｉ−８旦ｃｌ断片とＡＩａＲをコードする遺伝子を有す
るｐｌｃＲ１１３のＥｃｏＲｌ−８ａｃ　Ｉ断片が１つ
ずつ結合したものであることがわかった。これらのプラ
スミドをｐｌｃＲ１１４とした。

（７）プラスミドｐＩＣＴ１１３のＥｃｏＲＩ　−ＥＣ
ＯＲＩ断片の調製 （１）で得られた１）ＩＣＴ１１３　４０μびをＥｃｏ
ＲＩ　　１５０Ｕを含むＥＣＯＲＩ用緩衝液４００μρ
中で３７℃、５時間反応させ消化した後、冷エタノール
８００μｍ添加し遠心分離によりエタノール沈殿として
回収した。このＤＮＡを２０μｍのＴＨに溶解し、（３
）と同様にしてＬＭＰアガロース電気泳動により分離後
、Ｄ−ＡＴＡをコードする遺伝子を有する約１．７Ｋｂ
のＤＮＡ断片を切り出し、（４）と同様にして精製し、
２０μｍのＴＥに溶解してプラスミドｐｌｃＴ１１３の
ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片溶液を得た。

（８）プラスミドｐＩＣＲ１１４のＥＣＯＲＩによる消
化 （６）でＷ４製したｐＩＣＲ１１４の一部（約４μｇ）
を、１０ｔＪのＥＣ０ＲＩを含むＥＣ０ＲＩ用！１衝液
５０μｐ中で３７℃、５時間反応させ消化した後、２０
０μｍの冷エタノールを添加し、遠心分離によりエタノ
ール沈殿として回収し、１０μｍのＴＥに溶解してプラ
スミドｐＩＣＲ１１４のＥｃｏＲＩ消化物溶液を得た。

（９）プラスミドｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片とｐＩＣＲ１１４のｌ：ｃｏＲＩｆｉ化物との
連結 （７）で１ｉｌ製したプラスミドｐＩＣＴ１１３のＥｃ
ｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片溶液８μｍと、（１０）で調製
したｐＩＣＲ１１４のＥＣＯＲＩ消化物溶液０．５μｍ
とをＴ４ＤＮＡリガーぜ７００Ｕを含むＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ用緩衝液２０μｐ中で、１６℃−晩反応させＤＮＡ
断片を連結した。

（１０）（９）で連結したＤＮＡによるエシェリヒア　
コリ　ＨＢｌｏｌの形質転換 （５）と同様にして調製したコンピテントセル２００μ
ｍと（９）で連結したＤＮＡを含む反応液１０μｍとを
混合し、（５）と同様にして形質転換株を得た。

（１１）Ｄ−ＡＴＡ活性を有する形質転換株の選択 （１０）で得られた約２０００個の形質転換株のうち１
６８個のコロニーを５００μ」の緩衝液Ｉ（１０ｍＭ　
　リン酸カリウムＳａＷ液（ｐｌ＋７．２）、０．０１
％２−ＭＥ、５０μＭピリドキサール＝５°−リン酸（
ＰＬＰ））に懸濁し、３０秒間超音波破砕したものを酵
素液としてＤ−ＡＴＡ活性を測定した。

＜Ｄ−ＡＴＡ活性の測定方法〉 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，１）　５０μｍｏｌ、Ｐ
ＬＰ５０ｎｍｏ　Ｉ　、ａ−’ｙｔ”ＪルタルＷＪ１０
μｍｏｌ、Ｄ−アラ二＞　２５　、ｃＺｍｏ　ｌ　、乳
酸１１Ｒ水ＪＲ酵素（ＬＤＨ，ベーリンガーマンハイム
山之内製）５Ｕ１ＮＡＤＨ０，２μｍｏｌ及び酵素を含
む１１ｄの反応液を５０℃でキュベツト中で反応させ、
ＮＡＤＨの減少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を
測定した。尚１Ｕはこの条件下１分間に１μｍｏｌのＮ
ＡＤＨの減少を触媒する酵素量とした。上記方法に従っ
て１６８個のコロニーのＤ−ＡＴＡ活性を測定した結果
、２つのコロニーにＤ−ＡＴＡ活性が認められた。

（１２）Ｄ−ＡＴＡ活性保持株のプラスミドの確認 （１１）で選択した２株から（１）と同様にして小スケ
ールでプラスミドを単離した。これらのプラスミドを、
５ａＣｌで消化したところ約６゜２Ｋｂの単一のバンド
を生じ、ＥＣＯＲＩで消化したところｐＩＣＲ１１４の
ＥｃｏＲＩ消化物と同じ約４．５Ｋｂのバンドおよびｐ
ｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片と同じ約１
．７にｂのバンドを生じた。またＥＣＯＲＩと３ａｃ　
ｉのダブル消化によりｐＩＣＴ１１３のＦＣＯＲＩ−Ｅ
ＣＯＲＩ断片と同じ約１．７Ｋｂのバンド、ｐＩＣＲ１
１４のＥＣＯＲｌ−３ａｃ　ｉ断片と同じ約１．９Ｋｂ
のバンドおよびｐｌｃＴ１１３のＥＣＯＲｌ−８ａｃ　
１断片と同じ約２．７Ｋｂのバンドを生じたことから、
これらのプラスミドは、ｐｌｃＲ１１４のＥｃｏＲＩ消
化物にｐｌｃＴ１１３のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片が
結合したものであることがわかった。

これらのプラスミドをｐＩＣＲＴｌｌｌとした。

よって、得られたプラスミドｐｌｃＲＴ１１１はＡ　ｌ
　ａＲをコードする遺伝子と、Ｄ−ＡＴＡをコードする
遺伝子とを同時に有するプラスミドである。

プラスミドｐＩＣＲＴ１１１の制限酵素切断地図を第１
図に示す。

（１３）Ａ　ｌ　ａＲＳＤ−ＡＴＡ活性の測定プラスミ
ドｐＬＩＣ１８、ｐＩＣＲ１１４、ｐＩＣＴ１１３、お
よびｐＩＣＲＴｌｌｌでそれぞれ形質転換されたニジＩ
リヒア　コリ　Ｈ８１０１を１．５ｊのアンピシリン含
有ＹＴ培地（５０Ｕｇ／ｍｌ＞で３７℃−晩培養し、７
．ＯＯＯｒｐｍで５分間の遠心分離により菌体を回収し
た。回収した国体の湿重量はそれぞれ４．８ｇ、５．７
ｇ、７．２ｇ、５．１ｇであった。

各菌体を５ｍｌ！の緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）　、０．０１％２−ＭＥ、５０ＵＭ　　ＰＬ
Ｐ）に懸濁し１０分間超音波破砕し、１８，０００ｒｐ
ｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を上記緩衝液に
対して透析し、無細胞抽出液を得た。

この無細胞抽出液を用いて、以下の方法に従い各酵素活
性を測定した。

また、タンパク質は、ローリ−らの方法（ジャーナル　
オブ　バイオロジカル　ケミストリー聾ｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒ　）　
１９３　、２６５（１９５１））に従って測定した。

その結果を表−１に示す。

＜Ｄ−ＡＴＡ活性の測定方法〉 前述した通りの方法で行なった。

＜Ａ　Ｉ　ａＲ活性の測定方法〉 グリシン−ＫＣ１−ＫＯＨ！１衝液（ｐＨ９，０）１０
０μｍｏ　ｌ　、ＰＬＰ５０ｎｍｏ　Ｉ　、Ｄ−アラニ
ン５０μｍｏ　Ｉ　、ＮＡＤ＋　２．５μｍｏ　ｌ　、
Ａｌ　ａＤＨ（バチルス　ステアロサーモフィラスＩＦ
ＯＩ　２５５０由来）１０Ｕ及び酵素を含む１ｍの反応
液を５０℃でキュベツト中で反応させ、ＮＡＤＨの増加
に由来する３４０ｎｍの吸光度の上昇を測定した。尚１
Ｕは、この条件下１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの増加
を触媒する酵素量とした。

表　　−１

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｌｃＲＴ１１１の制限酵素切断地
図を表わす。 図中円の一本線はベクターｐＬＪ０１８に由来する部分
、二二は目的酵素をコードする部分を表わ特許出願人　
ダイセル化学工業株式会社第１図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）アラニンラセマーゼ及びＤ−アミノ酸トランスア
   ミナーゼをコードする遺伝子を有するプラスミド
2. （２）アラニンラセマーゼ及びＤ−アミノ酸トランスア
   ミナーゼをコードする遺伝子が、共に耐熱性細菌由来の
   ものである特許請求の範囲第一項記載のプラスミド
3. （３）耐熱性細菌がバチルス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥）
   属細菌である特許請求の範囲第二項記載のプラスミド
4. （４）アラニンラセマーゼをコードする遺伝子が、バチ
   ルス　ステアロサーモフィラス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥
   ￥ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ￥）ＩＦＯ１
   ２５５０由来のものであり、Ｄ−アミノ酸トランスアミ
   ナーゼをコードする遺伝子が、バチルス　エスピー（￥
   Ｂａｃ−ｉｌｌｕｓ￥ｓｐ．）ＹＭ−１（微工研菌寄第
   ８０５７号）由来のものである特許請求の範囲第一項記
   載のプラスミド