JPS6332496A - モノクロ−ナル抗体、その製法およびこのモノクロ−ナル抗体を用いた肺炎マイコプラズマ症診断剤および診断方法 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体、その製法およびこのモノクロ−ナル抗体を用いた肺炎マイコプラズマ症診断剤および診断方法Info
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- JPS6332496A JPS6332496A JP61173762A JP17376286A JPS6332496A JP S6332496 A JPS6332496 A JP S6332496A JP 61173762 A JP61173762 A JP 61173762A JP 17376286 A JP17376286 A JP 17376286A JP S6332496 A JPS6332496 A JP S6332496A
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- mycoplasma
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- mycoplasma pneumoniae
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は肺炎マイコプラズマ症、即ちマイコプラズマニ
ユモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｅｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）感染症の診断に用いて好適なモノクローナル抗体お
よびその製造方法に関する。
ユモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｅｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）感染症の診断に用いて好適なモノクローナル抗体お
よびその製造方法に関する。
本発明はさらに上記モノクローナル抗体よりなる肺炎マ
イコプラズマ症診断剤および該診断剤による診断方法に
関する。
イコプラズマ症診断剤および該診断剤による診断方法に
関する。
今日性なわれている肺炎マイコプラズマ症の診断方法に
は■マイコプラズマニュ七二重、（以下Ｍ、ｐｎ、と略
記する〕の感染生菌の直接分離による方法、および■血
清学的診断方法がある。■の方法としては、 ５ｐ−４
培地による分離がＴｕｌ１７により行なわれているが、
この方法は直接螢光抗体法による同定との併用によって
菌の検出感度を高めている（ｒＹａｌｅ Ｊ、 Ｂ１１
１ Ｍｅｄ、Ｊ５６．５１１〜５１５（１９８３））。
は■マイコプラズマニュ七二重、（以下Ｍ、ｐｎ、と略
記する〕の感染生菌の直接分離による方法、および■血
清学的診断方法がある。■の方法としては、 ５ｐ−４
培地による分離がＴｕｌ１７により行なわれているが、
この方法は直接螢光抗体法による同定との併用によって
菌の検出感度を高めている（ｒＹａｌｅ Ｊ、 Ｂ１１
１ Ｍｅｄ、Ｊ５６．５１１〜５１５（１９８３））。
■の方法として、補体結合反応（ＣＦ）または間接赤血
球凝集反応（ＩＨＡ）等がある。またＲｏｕｓａｅａｕ
らは螢光抗体法（工Ｆ）Ｋ、よるＩｇＭまたはｒｇＧ抗
体の検出をＩＨＡとｐ併用して行なうことにより診断率
を高めているＣｒＪ、 Ｈ７ｇ（Ｌｏｎｄ） Ｊ９５，
３４５〜３５２（１９８５））。
球凝集反応（ＩＨＡ）等がある。またＲｏｕｓａｅａｕ
らは螢光抗体法（工Ｆ）Ｋ、よるＩｇＭまたはｒｇＧ抗
体の検出をＩＨＡとｐ併用して行なうことにより診断率
を高めているＣｒＪ、 Ｈ７ｇ（Ｌｏｎｄ） Ｊ９５，
３４５〜３５２（１９８５））。
またＭ、ｐｎ、に特異的なＩｇＭを検出する方法として
Ｗｒｅｇｈｉｔｔらのμ−捕獲ＫＩｄＳＡがある（「Ｊ
、Ｈｙｇ（Ｌｏｎｄ）Ｊ９４，２１７〜２２７．（１９
８５））。さらにＲ輩１ｅｘｎｅｎらは精製したたんば
（質を用いたＫ１．ＴＳＡにより特異性の高い診断を行
なっている（「Ｊ・Ｃ１１ｎ、 ＰａｔｈｏｌＪ３７
、１１２９〜１１３３ 、 （１９８４））。
Ｗｒｅｇｈｉｔｔらのμ−捕獲ＫＩｄＳＡがある（「Ｊ
、Ｈｙｇ（Ｌｏｎｄ）Ｊ９４，２１７〜２２７．（１９
８５））。さらにＲ輩１ｅｘｎｅｎらは精製したたんば
（質を用いたＫ１．ＴＳＡにより特異性の高い診断を行
なっている（「Ｊ・Ｃ１１ｎ、 ＰａｔｈｏｌＪ３７
、１１２９〜１１３３ 、 （１９８４））。
しかしながら上記■のＭ、ｐｎ、の分離は確実な方法で
はあるが培養に８〜１５日を要し、同定に２〜５週間を
要するため診断に日数がかかり、しかもかなりの手技を
必要とすることから一般的にはあまり用いられていなか
った。一方、■の血清学的診断法における抗Ｍ、ｐｎ、
抗体の検出は回復期に至って初めて可能となるものであ
り非特異反応も少なくなく、実際にはＲア血済を用いた
り、２ａ１以上の方法を組み合わせることにより初めて
診断可能となる現況である。
はあるが培養に８〜１５日を要し、同定に２〜５週間を
要するため診断に日数がかかり、しかもかなりの手技を
必要とすることから一般的にはあまり用いられていなか
った。一方、■の血清学的診断法における抗Ｍ、ｐｎ、
抗体の検出は回復期に至って初めて可能となるものであ
り非特異反応も少なくなく、実際にはＲア血済を用いた
り、２ａ１以上の方法を組み合わせることにより初めて
診断可能となる現況である。
そこで本発明は上気道感染の症状を主訴として来院する
外来患者を直ちに、即ち肺炎に至る前の咽頭炎のレベル
で、肺炎マイコプラズマ症であるか否かを迅速に診断す
ることを可能ならしめる診断剤と診断方法の提供を目的
としている。
外来患者を直ちに、即ち肺炎に至る前の咽頭炎のレベル
で、肺炎マイコプラズマ症であるか否かを迅速に診断す
ることを可能ならしめる診断剤と診断方法の提供を目的
としている。
本発明は上記した問題点を解決しつつ上記目的を達成す
るため以下のような特徴を有している。
るため以下のような特徴を有している。
第１に、本発明により提供されるモノクローナル抗体は
抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマクローン１３０６Ｂ１２ａＡ２から得られ
ることを特徴としている。
抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマクローン１３０６Ｂ１２ａＡ２から得られ
ることを特徴としている。
第２に、本発明により提供されるモノクローナル抗体の
製造方法は、マイコプラズマニュモ二工抗原で免疫化さ
れたマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを細胞融合し
、これより抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングし
そして限界希釈法によりクローニングし、さらにリクロ
ーニングしてクローン化することにより抗マイコプラズ
マニユモニエモノクローナル抗体産生ハイブリドーマク
ローンを得、このハイブリドーマクローンをマウスに腹
腔内接種してマウスをがん化させ、ついでこのマウスよ
り腹水を得、この腹水を透析することにより抗体分画を
得ることを特徴としている。
製造方法は、マイコプラズマニュモ二工抗原で免疫化さ
れたマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを細胞融合し
、これより抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングし
そして限界希釈法によりクローニングし、さらにリクロ
ーニングしてクローン化することにより抗マイコプラズ
マニユモニエモノクローナル抗体産生ハイブリドーマク
ローンを得、このハイブリドーマクローンをマウスに腹
腔内接種してマウスをがん化させ、ついでこのマウスよ
り腹水を得、この腹水を透析することにより抗体分画を
得ることを特徴としている。
第３に本発明により提供される肺炎マイフプラズマ症診
断剤は、抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマクローン１３０６１１２ａＡ２か
ら得られたモノクローナル抗体を緩衝液で希釈したもの
であることを特徴としている。
断剤は、抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマクローン１３０６１１２ａＡ２か
ら得られたモノクローナル抗体を緩衝液で希釈したもの
であることを特徴としている。
第４に本発明により提供される肺炎マイフプラズマ症の
診断方法は、段階： （ａ） 被検者の咽頭後壁を綿棒で擦過すること、な
どＫよって検体を取り出し、 （１）） この検体を緩衝液たとえば［ＬＯ５Ｍ）リ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ７，６中で激しく上下に動かして細
胞を浮遊させて咽頭細胞浮遊液とすること、（Ｃ）
上記咽頭細胞浮遊液の少量をポＩＪ−Ｌ ＋ リジンコ
ートされたスライドガラスに塗抹し、風乾し、固定し、
洗浄し、続いてたとえば過沃素酸のような酸化剤で内因
性ペルオキシダーゼ活性を阻止し、洗浄し、その後正常
ウマ血清溶液と反応させること、 （ｄ） 抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマクローン１５ （１６Ｂ１２ａ
Ａ２から得られたモノクローナル抗体を緩衝液で希釈し
てなる診断剤を（ｃ）で得られたスライドガラス調製物
と反応させ、その後洗浄すること、および （ｅ） （ａ）で得られたスライドガラス調製物にビ
オチニル化された２次抗体を反応させ、洗浄し、アビジ
ン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を反応させ、洗
浄し、例えば３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒド
ロクロリドのような発色試薬および基質としての過酸化
水素水を反応させて呈色させること、 よりなることを特徴としている。
診断方法は、段階： （ａ） 被検者の咽頭後壁を綿棒で擦過すること、な
どＫよって検体を取り出し、 （１）） この検体を緩衝液たとえば［ＬＯ５Ｍ）リ
ス−塩酸緩衝液ｐＨ７，６中で激しく上下に動かして細
胞を浮遊させて咽頭細胞浮遊液とすること、（Ｃ）
上記咽頭細胞浮遊液の少量をポＩＪ−Ｌ ＋ リジンコ
ートされたスライドガラスに塗抹し、風乾し、固定し、
洗浄し、続いてたとえば過沃素酸のような酸化剤で内因
性ペルオキシダーゼ活性を阻止し、洗浄し、その後正常
ウマ血清溶液と反応させること、 （ｄ） 抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマクローン１５ （１６Ｂ１２ａ
Ａ２から得られたモノクローナル抗体を緩衝液で希釈し
てなる診断剤を（ｃ）で得られたスライドガラス調製物
と反応させ、その後洗浄すること、および （ｅ） （ａ）で得られたスライドガラス調製物にビ
オチニル化された２次抗体を反応させ、洗浄し、アビジ
ン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を反応させ、洗
浄し、例えば３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒド
ロクロリドのような発色試薬および基質としての過酸化
水素水を反応させて呈色させること、 よりなることを特徴としている。
本発明のモノクローナル抗体は妬ｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ法により得られた抗Ｍ 、 ｐｎ 、モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマクローン″１３０６Ｂ１２
ａＡ２”より得られる。この抗Ｍ、ｐｎ、モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマクローン″１３０６Ｂ１２ａ
Ａ２”は昭和６１年７月２１日に工業技術院做生物工業
技術研究所に寄託申請されたが、その受託は拒否された
。本モノクローナル抗体のアイソタイプは０ｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ法によりハツカネズミＩｇＧ２ｂであること
がわかった。本モノクローナル抗体はｂｌｏｔ法による
とＭ 、 ｐｎ、の分子量約１６０キロダルトン（ＫＤ
ａ）の細胞膜蛋白分子上に位置するエピトープを認識す
ることがわかった。ｂ１ｏｔ法については実施例で詳述
する。さらに本発明のモノクローナル抗体はマイコプラ
ズマオラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｅｍａ ｏｒａｌｅ）、
マイコプラズマホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏ
ｍｉｎｉｓハマイコプラズマノ４ツカーレ（Ｍｙｃｏｐ
ｌａｓｍａ ｂｕｃｃａｌｅ）、マイコプラズマブリバ
リウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ
ハマイコプラズマプリマタム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ｐｒｉｍａｔｕｍ）、マイコプラズマフアウシウム（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆａｕ−ｃｉｕｍ）およびマイコ
プラズマフェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の食菌抗原のいずれとも反応しな
かった。また本発明のモノクローナル抗体が認識するエ
ピトープが存在する約１１、 Ｑ ＫＤａ蛋白抗原に対
する抗体はＭ、ｐｎ、生菌噴ｇ感染ハムスターおよびマ
ウス、さらにヒト患者血清（肺炎マイコプラズマ症回復
期〕中に検出される。
ｅｉｎ法により得られた抗Ｍ 、 ｐｎ 、モノクロー
ナル抗体産生ハイブリドーマクローン″１３０６Ｂ１２
ａＡ２”より得られる。この抗Ｍ、ｐｎ、モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマクローン″１３０６Ｂ１２ａ
Ａ２”は昭和６１年７月２１日に工業技術院做生物工業
技術研究所に寄託申請されたが、その受託は拒否された
。本モノクローナル抗体のアイソタイプは０ｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ法によりハツカネズミＩｇＧ２ｂであること
がわかった。本モノクローナル抗体はｂｌｏｔ法による
とＭ 、 ｐｎ、の分子量約１６０キロダルトン（ＫＤ
ａ）の細胞膜蛋白分子上に位置するエピトープを認識す
ることがわかった。ｂ１ｏｔ法については実施例で詳述
する。さらに本発明のモノクローナル抗体はマイコプラ
ズマオラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｅｍａ ｏｒａｌｅ）、
マイコプラズマホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏ
ｍｉｎｉｓハマイコプラズマノ４ツカーレ（Ｍｙｃｏｐ
ｌａｓｍａ ｂｕｃｃａｌｅ）、マイコプラズマブリバ
リウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ
ハマイコプラズマプリマタム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ｐｒｉｍａｔｕｍ）、マイコプラズマフアウシウム（Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆａｕ−ｃｉｕｍ）およびマイコ
プラズマフェルメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｎｓ）の食菌抗原のいずれとも反応しな
かった。また本発明のモノクローナル抗体が認識するエ
ピトープが存在する約１１、 Ｑ ＫＤａ蛋白抗原に対
する抗体はＭ、ｐｎ、生菌噴ｇ感染ハムスターおよびマ
ウス、さらにヒト患者血清（肺炎マイコプラズマ症回復
期〕中に検出される。
本発明のモノクローナル抗体の製法を実施す゛ るにあ
っては、まずＭ、ｐｎ、臨床分離株を培養して得た菌体
を遠心分離処理し、得られた沈渣をホルマリン等で処理
して、例えばたんぱく量としてたとえば１０００μｆ／
ＩＲｔの濃度にしてＭ、ｐｎ。
っては、まずＭ、ｐｎ、臨床分離株を培養して得た菌体
を遠心分離処理し、得られた沈渣をホルマリン等で処理
して、例えばたんぱく量としてたとえば１０００μｆ／
ＩＲｔの濃度にしてＭ、ｐｎ。
抗原浮遊液を作成する。次に抗原をマウスに皮下注射し
て免疫させたのち、その肺臓を摘出して脾細胞を得て、
これとマウス骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールを
用いながら細胞融合し、抗体産生細胞をスクリーニング
する。その後限界希釈法によるクローニングを行ない、
さらにリクローニングし、抗Ｍ、ｐｎ、モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマクローンを得る。こうして得ら
れた抗Ｍ 、 ｐｎ、モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマクローンを腹腔内接種し、腫瘍細胞が増殖したら
腹腔穿刺により腹水を採種し、遠心分離処理して、上清
を透析することにより抗体分画を得る。得られた抗体分
画からはさらＫたんぱく質Ａ−セフアロースカラムアフ
ィニティークロマトグラフィーにより工ｇＧ２ｂ分画を
選択的に抽出することができる。
て免疫させたのち、その肺臓を摘出して脾細胞を得て、
これとマウス骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールを
用いながら細胞融合し、抗体産生細胞をスクリーニング
する。その後限界希釈法によるクローニングを行ない、
さらにリクローニングし、抗Ｍ、ｐｎ、モノクローナル
抗体産生ハイブリドーマクローンを得る。こうして得ら
れた抗Ｍ 、 ｐｎ、モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマクローンを腹腔内接種し、腫瘍細胞が増殖したら
腹腔穿刺により腹水を採種し、遠心分離処理して、上清
を透析することにより抗体分画を得る。得られた抗体分
画からはさらＫたんぱく質Ａ−セフアロースカラムアフ
ィニティークロマトグラフィーにより工ｇＧ２ｂ分画を
選択的に抽出することができる。
以上のようにして得られたモノクローナル抗体は適当に
希釈して肺炎マイコプラズマ症診断剤として用いること
ができる。
希釈して肺炎マイコプラズマ症診断剤として用いること
ができる。
本発明のモノクローナル抗体を肺炎マイコプラズマ症診
断剤として用いるにあっては、アビジン−ビオチン−ペ
ルオキシダーゼ複合体法（以下ＡＢＣ法と略記）が行な
われる。被検検体は被検者の咽頭擦過細胞液から作成さ
れたプレパラートを用いる。
断剤として用いるにあっては、アビジン−ビオチン−ペ
ルオキシダーゼ複合体法（以下ＡＢＣ法と略記）が行な
われる。被検検体は被検者の咽頭擦過細胞液から作成さ
れたプレパラートを用いる。
以下実施例により本発明をさらに詳述する。
（実施例１］ 抗Ｍ 、ｐｎ、モノクローナル抗体の
作製 ■ 抗原の調製 Ｍ、ｐｎ、臨床分離株（長崎大学医学部第２内科学教室
・厚耕平教授より分与された）を常用ＦＰＬＯブロス（
ＤｉｆＣＯ製）で４日間培養した菌体をリン酸緩衝食塩
水（以下ＰＢＳと略記） ｐＨ″１２に浮遊し、Ｉ Ｑ
、［Ｊ （Ｊ Ｏｒｐ、ｍで１時間遠心し、その沈渣を
０．２％（ｖ／ｖ ）ポルマリンに浮遊し１晩処理した
ものをフォリンフェノール試薬（Ｌｏｗｒｙの変法）に
て蛋白量として１，０００μｆ／ｍｔの濃度となるよう
菌液を調製し、これをＭ、ｐｎ、抗原浮遊液とした。
作製 ■ 抗原の調製 Ｍ、ｐｎ、臨床分離株（長崎大学医学部第２内科学教室
・厚耕平教授より分与された）を常用ＦＰＬＯブロス（
ＤｉｆＣＯ製）で４日間培養した菌体をリン酸緩衝食塩
水（以下ＰＢＳと略記） ｐＨ″１２に浮遊し、Ｉ Ｑ
、［Ｊ （Ｊ Ｏｒｐ、ｍで１時間遠心し、その沈渣を
０．２％（ｖ／ｖ ）ポルマリンに浮遊し１晩処理した
ものをフォリンフェノール試薬（Ｌｏｗｒｙの変法）に
て蛋白量として１，０００μｆ／ｍｔの濃度となるよう
菌液を調製し、これをＭ、ｐｎ、抗原浮遊液とした。
■ 細胞融合
上記のＭ、ｐｎ、抗原ｉｏｏμｔを完全フロインドアジ
エバント（Ｄｉｆｃｏ製）α１−と共にＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス７週齢雌に皮下注射した。その後６．１５および２
４日目にも同様Ｖζ接種し、６１日目に−Ｍ、ｐｎ、抗
原のみを静脈注射した。免疫開始後３３日目に肺臓を摘
出し、その肺細胞と分子量へ３５０のポリエチレングリ
コールを用いてマウス骨髄腫細胞株″’ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８−ＩＪｌ”（自治医科大学村田道里講師より分与
された）との細胞融合を行なった。ＨＡＴ培地（Ｓｉｇ
ｔｎａ製）でハイブリドーマを選択した。Ｍ 、 ｐｎ
、の分解物を固相とし２次抗体として西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋工ｇＭ十工ｇＡ
（Ｃａｐｐｅｌ製）を用いたＥＬＩＳＡ法により抗体
産生細胞のスクリーニングを行なった。次に限界希釈法
、即ち９６穴プラスチック組織培養プレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ製）にハイブリドーマ細胞が１穴あたりＱ、６個に
なるようにＲＰＭＩ： １６４０（日永製薬製）培地で
希釈して加えてクローニングを行なった。さらに同様の
方法でリクローニングし、クローン化した。
エバント（Ｄｉｆｃｏ製）α１−と共にＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス７週齢雌に皮下注射した。その後６．１５および２
４日目にも同様Ｖζ接種し、６１日目に−Ｍ、ｐｎ、抗
原のみを静脈注射した。免疫開始後３３日目に肺臓を摘
出し、その肺細胞と分子量へ３５０のポリエチレングリ
コールを用いてマウス骨髄腫細胞株″’ｐ３−Ｘ６３−
Ａｇ８−ＩＪｌ”（自治医科大学村田道里講師より分与
された）との細胞融合を行なった。ＨＡＴ培地（Ｓｉｇ
ｔｎａ製）でハイブリドーマを選択した。Ｍ 、 ｐｎ
、の分解物を固相とし２次抗体として西洋わさびペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋工ｇＭ十工ｇＡ
（Ｃａｐｐｅｌ製）を用いたＥＬＩＳＡ法により抗体
産生細胞のスクリーニングを行なった。次に限界希釈法
、即ち９６穴プラスチック組織培養プレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ製）にハイブリドーマ細胞が１穴あたりＱ、６個に
なるようにＲＰＭＩ： １６４０（日永製薬製）培地で
希釈して加えてクローニングを行なった。さらに同様の
方法でリクローニングし、クローン化した。
■ ハイブリドーマの腹水化
プリスタン（ｐｒｉｓｔａｎ ： ２，６，１０．１９
−テトラメチルインタデカン、和光純系製〕α５ｒＰＬ
ｔをＢＡＬＢ ／ ｃマウスに腹腔内接種しその４日後
にハイブリドーマ細胞１０７個を腹腔内に投与した。
−テトラメチルインタデカン、和光純系製〕α５ｒＰＬ
ｔをＢＡＬＢ ／ ｃマウスに腹腔内接種しその４日後
にハイブリドーマ細胞１０７個を腹腔内に投与した。
約２週間後に腫瘍細胞の増殖により腹部膨満を示したマ
ウスより腹腔穿刺にて腹水を採取した。
ウスより腹腔穿刺にて腹水を採取した。
その腹水を３．５００ｒｐｔａで１０分間遠心分離処理
し、その上清を５６℃で３０分間加温し、腹水中に含ま
れるたんぱく分解酵素活性を失活させた。
し、その上清を５６℃で３０分間加温し、腹水中に含ま
れるたんぱく分解酵素活性を失活させた。
■ 抗体の精製
上記得られた腹水に飽和硫酸アンモニウムを４０％飽和
になる濃度まで加え、４℃で一晩静置後１０，０００ｒ
ｏｍ、４℃で２０分間遠心分離処理し、その沈渣をＱ、
Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨａＯＫ懸濁し、再度１Ｑ
、ｌｌ０ｃＩ ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。その
上清を、Ｑ、１ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ＆０に対して４℃
、３６時間透析を行ない抗体分画を得た〇 ■ 抗体のアイソタイプの検索 得られたモノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決
定は、ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙらによる二重二次元拡散
法により行なった。抗体はヤギ抗マウス馳Ｇ 、ヤギ抗
マウスエｇＭ１ヤギ抗マウスエｇＡ１ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ１ 、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ 、ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ２ｂおよびヤギ抗マウスＩｇＧ３を用いた。その結果
今回得られたノ・イブリド−マクローンのうち後述の”
１３０６Ｂ１２ａａ２″は工ｇＧ２ｂ産生クローンであ
った。
になる濃度まで加え、４℃で一晩静置後１０，０００ｒ
ｏｍ、４℃で２０分間遠心分離処理し、その沈渣をＱ、
Ｉ Ｍ ＩＪン酸緩衝液ｐＨａＯＫ懸濁し、再度１Ｑ
、ｌｌ０ｃＩ ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心した。その
上清を、Ｑ、１ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ＆０に対して４℃
、３６時間透析を行ない抗体分画を得た〇 ■ 抗体のアイソタイプの検索 得られたモノクローナル抗体のクラス、サブクラスの決
定は、ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙらによる二重二次元拡散
法により行なった。抗体はヤギ抗マウス馳Ｇ 、ヤギ抗
マウスエｇＭ１ヤギ抗マウスエｇＡ１ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ１ 、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ 、ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ２ｂおよびヤギ抗マウスＩｇＧ３を用いた。その結果
今回得られたノ・イブリド−マクローンのうち後述の”
１３０６Ｂ１２ａａ２″は工ｇＧ２ｂ産生クローンであ
った。
■ たんぱく質Ａ−セフアロースカラムによる抗体の精
製 ■で得られた抗体分画をさらに０．１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液ｐＨａ Ｏで１０倍に希釈し、８μｍのメンブレン
フィルター（ミリポア製ンで濾過し、そのＦ液をたんぱ
く質Ａ−セフアロースカラムに注入し、たんぱく質Ａに
ＩｇＧを吸着させた。次に溶出液としてクエン酸緩衝液
ｐＨ五〇を添加することにより工ｇＧ２ｂのみを溶出さ
せた。これをｃＬ０５Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ１６を
透析外液として４℃、３６時間透析し、以下の実験に用
いた。
製 ■で得られた抗体分画をさらに０．１ Ｍ ＩＪン酸緩
衝液ｐＨａ Ｏで１０倍に希釈し、８μｍのメンブレン
フィルター（ミリポア製ンで濾過し、そのＦ液をたんぱ
く質Ａ−セフアロースカラムに注入し、たんぱく質Ａに
ＩｇＧを吸着させた。次に溶出液としてクエン酸緩衝液
ｐＨ五〇を添加することにより工ｇＧ２ｂのみを溶出さ
せた。これをｃＬ０５Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ１６を
透析外液として４℃、３６時間透析し、以下の実験に用
いた。
■ 抗体の特異性の検索
得られたモノクローナル抗体の特異性はナトリウムドデ
シルスルフェート・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
以下８ＤＳ−ＰＡＧＦ−と略記する〕およびイムノプロ
ット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 二以下ｂｌｏｔ法
と略記する〕により検索した。
シルスルフェート・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
以下８ＤＳ−ＰＡＧＦ−と略記する〕およびイムノプロ
ット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 二以下ｂｌｏｔ法
と略記する〕により検索した。
ｉ） ５Ｄ８−ＰＡＧＥの実施
マイコプラズマニユモニエおよびマイコプラズマオラー
レ、マイコフラスマホミニス、マイコプラズマパツカー
レ、マイコプラズマサリバリウム、マイコプラズマプリ
マタム、マイコプラズマフアウシウムおよびマイコプラ
ズマフェルメンタンスをＰＢＳ 、 ｐＨ７，４に浮遊
させ、フォリンフェノール試薬でたんば＜質量としテ１
，０００μ９／−の濃度に調製し、この抗原浮遊液に等
量の試料用緩衝液（１２５ｍＭ）リスヒドロキシメチル
アミノメタンに４ ％ Ｃｗ／Ｖ）のＳＤＢを加えｐＨ
ａＯとしたもの）を混和し、さらに５％（Ｖ／Ｖ ）量
の２−メルカプトエタノール（２−ｙＥ、 和光紬薬製
）を加えて５分間室温に静置後、１００℃で２分間加熱
しｓ １Ａｏ 量のブロムフェノールブルー溶液を加え
、これをスラブゲルの６穴に７゜ｐｔずつ注入した。そ
れからスラブゲル電気泳動装置に８−８００ ＴＬＥＪ
型（マリンル産業製）を用い、１ｏ ％ （ｖ／ｖ）ポ
リアクリルアミドゲル中で室温条件下、２ＱｔｎＡ、
４時間泳動した。泳動後の分離ハターンを調べるための
たんば＜染色はコマジ−ブリリアントブルーＲ−２５０
（牛丼化学製）を用いて行なった。一方、未染色のゲル
はそのまま次段階のプロッティングに用いた。
レ、マイコフラスマホミニス、マイコプラズマパツカー
レ、マイコプラズマサリバリウム、マイコプラズマプリ
マタム、マイコプラズマフアウシウムおよびマイコプラ
ズマフェルメンタンスをＰＢＳ 、 ｐＨ７，４に浮遊
させ、フォリンフェノール試薬でたんば＜質量としテ１
，０００μ９／−の濃度に調製し、この抗原浮遊液に等
量の試料用緩衝液（１２５ｍＭ）リスヒドロキシメチル
アミノメタンに４ ％ Ｃｗ／Ｖ）のＳＤＢを加えｐＨ
ａＯとしたもの）を混和し、さらに５％（Ｖ／Ｖ ）量
の２−メルカプトエタノール（２−ｙＥ、 和光紬薬製
）を加えて５分間室温に静置後、１００℃で２分間加熱
しｓ １Ａｏ 量のブロムフェノールブルー溶液を加え
、これをスラブゲルの６穴に７゜ｐｔずつ注入した。そ
れからスラブゲル電気泳動装置に８−８００ ＴＬＥＪ
型（マリンル産業製）を用い、１ｏ ％ （ｖ／ｖ）ポ
リアクリルアミドゲル中で室温条件下、２ＱｔｎＡ、
４時間泳動した。泳動後の分離ハターンを調べるための
たんば＜染色はコマジ−ブリリアントブルーＲ−２５０
（牛丼化学製）を用いて行なった。一方、未染色のゲル
はそのまま次段階のプロッティングに用いた。
ｉｉＪ Ｗｅ８ｔ８ｒｎプロット法の実施５Ｊ）Ｓ−
）’ＡＧＥで分離された未染色のゲル上の抗原はＤＮＡ
およびたんぱく用トランスブロッティング装置トランス
−プロットセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 製）を用いて転写用
緩衝液（ＣＬＯ２５Ｍトリス、（１１９２Ｍグリ’／
７ ） ｐＨ＆３ Ｏ液槽中で４℃、ＣＬ２５Ａ１１６
時間通電することによりニトロセルロースシート（５ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｌｌ製）に転写された
。その後、本発明のモノクローナル抗体、マウス血清、
ハムスター血清およびヒト患者血清を室温条件で２時間
反応させた。つぎに標識抗体として西洋わ嘔びペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ 、西洋わさびにルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗ハムスターＩｇＧ、西洋わさびは
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを２時間反応させ
、過酸化水素を基質として、０−ジアニシジン（和光純
系製ンを用いて呈色させた。結果を第１図および第２図
の写真に示す。
）’ＡＧＥで分離された未染色のゲル上の抗原はＤＮＡ
およびたんぱく用トランスブロッティング装置トランス
−プロットセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ 製）を用いて転写用
緩衝液（ＣＬＯ２５Ｍトリス、（１１９２Ｍグリ’／
７ ） ｐＨ＆３ Ｏ液槽中で４℃、ＣＬ２５Ａ１１６
時間通電することによりニトロセルロースシート（５ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ５ｃｈｕｌｌ製）に転写された
。その後、本発明のモノクローナル抗体、マウス血清、
ハムスター血清およびヒト患者血清を室温条件で２時間
反応させた。つぎに標識抗体として西洋わ嘔びペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ 、西洋わさびにルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗ハムスターＩｇＧ、西洋わさびは
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを２時間反応させ
、過酸化水素を基質として、０−ジアニシジン（和光純
系製ンを用いて呈色させた。結果を第１図および第２図
の写真に示す。
第１図中、１ｉｎｅ １及び８、分子マーカー（６７に
１アルブミン；６０に、カタラーゼ；３６Ｋ。
１アルブミン；６０に、カタラーゼ；３６Ｋ。
乳酸脱水素酵素：９４に、ホスホリラーゼｂ；４３Ｋ、
卵白アルブミン；３０Ｋ、炭酸脱水酵素）の８Ｄ８−Ｐ
ＡＧＥパターン、１ａｎｅ ２、全Ｍ、ｐｎ８ｕ−ｍＯ
ｎｉａｅ細胞の５ＤＢ−ＰＡＧＴｒパターン、１ａｎｅ
３〜７は全Ｍ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞のタンパク
質が５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロー
スシートに移され、そしてそれぞれモノクローナル抗体
（ｌａｎｅ３）、実験的に感染させたマウスの抗Ｍ、ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清（１ａｎｅ ４ ）、アジュバ
ントと共にＭ、ｐｎｅｕｍＯｎｉａ８の細胞膜を免疫し
て得られたマウス血清すなわち抗Ｍ、ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ膜血清（１ｉｎｅ ５ハ実験的に感染させたハムス
ター抗Ｍ、 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清（１ａｃｅ６）
、及びヒトのＭ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染回復期の血
清（１ａｎｅ ７ ）によって反応させたものである。
卵白アルブミン；３０Ｋ、炭酸脱水酵素）の８Ｄ８−Ｐ
ＡＧＥパターン、１ａｎｅ ２、全Ｍ、ｐｎ８ｕ−ｍＯ
ｎｉａｅ細胞の５ＤＢ−ＰＡＧＴｒパターン、１ａｎｅ
３〜７は全Ｍ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞のタンパク
質が５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ニトロセルロー
スシートに移され、そしてそれぞれモノクローナル抗体
（ｌａｎｅ３）、実験的に感染させたマウスの抗Ｍ、ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清（１ａｎｅ ４ ）、アジュバ
ントと共にＭ、ｐｎｅｕｍＯｎｉａ８の細胞膜を免疫し
て得られたマウス血清すなわち抗Ｍ、ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ膜血清（１ｉｎｅ ５ハ実験的に感染させたハムス
ター抗Ｍ、 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清（１ａｃｅ６）
、及びヒトのＭ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染回復期の血
清（１ａｎｅ ７ ）によって反応させたものである。
矢印は、１６０にタンパク質を示す。
第２図中、５ＤＥ（−ＰＡＧＩ！：は左の１ａｎｅ、
Ｗｅｓｔｅｒｎプロットパターンは右の１ａｎｅである
。各１ａｎｅはそれぞれＭ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ （
１ａｈｅ Ａ ）または他のマイコプラズ−ｒ （１ａ
ｎｅ Ｂ 、 Ｍ、０ｒａｌｅ ； １ａｎｅ Ｃ、Ｍ
。
Ｗｅｓｔｅｒｎプロットパターンは右の１ａｎｅである
。各１ａｎｅはそれぞれＭ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ （
１ａｈｅ Ａ ）または他のマイコプラズ−ｒ （１ａ
ｎｅ Ｂ 、 Ｍ、０ｒａｌｅ ； １ａｎｅ Ｃ、Ｍ
。
ｈａｍｉｎｉｓ； １ａｎｅ Ｄ、 Ｍ、ｂｕｃｃａｌ
ｅ； １ａｎｅ Ｅ、 Ｍ、ｓａｌｉ−ｒａｒｉｕｍ；
１ａｎｅ Ｆ、 Ｍ、ｐｒｉｍａｆｕｍ； １ａｎｅ
［）、 Ｍ、ｆａｕ−ｃｉｕｍ： ：Ｌａｎｏ Ｈ，
Ｍ、ｆｅｒｍｅｎｆａｎｓ）のタンパクｆｆ３５μｔを
泳動した。
ｅ； １ａｎｅ Ｅ、 Ｍ、ｓａｌｉ−ｒａｒｉｕｍ；
１ａｎｅ Ｆ、 Ｍ、ｐｒｉｍａｆｕｍ； １ａｎｅ
［）、 Ｍ、ｆａｕ−ｃｉｕｍ： ：Ｌａｎｏ Ｈ，
Ｍ、ｆｅｒｍｅｎｆａｎｓ）のタンパクｆｆ３５μｔを
泳動した。
第１および２図かられかるとおり、本発明のモノクロー
ナル抗体はＭ、ｐｎ、の分子量約１６０キロダルトンの
細胞膜たんぱく分子上に位置するエピトープを認識して
おり、さらＫ Ｍ、ｏｒａｌｅ。
ナル抗体はＭ、ｐｎ、の分子量約１６０キロダルトンの
細胞膜たんぱく分子上に位置するエピトープを認識して
おり、さらＫ Ｍ、ｏｒａｌｅ。
Ｍ、ｈｏｍｉｎｉθ、Ｍ、ｂｕｃｃａｌｅ、 Ｍ、ｓａ
ｌｌｉｖａｒｉｕｍ％Ｍ、ｐｒｉ−ｍａｔｕｍ、 Ｍ、
ｆａｕｃｉｕｍおよびＭ、 ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのい
ずれの食菌抗原とも反応しなかった。また本発明のモノ
クローナル抗体が認識するエピトープが存在する約１６
０キロダルトンたんぱく抗原に対する抗体はＭ、ｐｈ、
生菌噴霧感染ノ・ムスターおよびマウス、さらにヒト患
者血清（肺炎マイコプラズマ症回α期〕中に検出された
。
ｌｌｉｖａｒｉｕｍ％Ｍ、ｐｒｉ−ｍａｔｕｍ、 Ｍ、
ｆａｕｃｉｕｍおよびＭ、 ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのい
ずれの食菌抗原とも反応しなかった。また本発明のモノ
クローナル抗体が認識するエピトープが存在する約１６
０キロダルトンたんぱく抗原に対する抗体はＭ、ｐｈ、
生菌噴霧感染ノ・ムスターおよびマウス、さらにヒト患
者血清（肺炎マイコプラズマ症回α期〕中に検出された
。
〔実施例２〕 早期迅速診断
■ Ｍ、ｐｎ、の噴霧感染
ゴールデン・ハムスター４週齢雌を感染群および非感染
群の２群に分け、感染群には２．４×１０８ ＣＦＩＩ
／ｄのＭ、ｐｎ、生菌ＰＰＬＯブロス浮遊液９−をネブ
ライザーを用いて１時間デシケータ−中で被験ハムスタ
ーにｒＩＸｉ感染した。非感染群には対照としてＰＰＬ
Ｏプロス９−を同様に噴震した。
群の２群に分け、感染群には２．４×１０８ ＣＦＩＩ
／ｄのＭ、ｐｎ、生菌ＰＰＬＯブロス浮遊液９−をネブ
ライザーを用いて１時間デシケータ−中で被験ハムスタ
ーにｒＩＸｉ感染した。非感染群には対照としてＰＰＬ
Ｏプロス９−を同様に噴震した。
各々についてさらに翌日も同様に噴Ｚを行なった。
■ 咽頭からのＭ、ｐｎ、の検出
１）咽頭擦過細胞液の調製
感染後１．２．３．６．８．９．１０．１１．１３．１
５および１６６日目感染ノ・ムスターおよび対照群ハム
スターの咽頭後壁を滅菌した耳鼻科用綿棒で擦過し、０
．０５Ｍ）ＩＪスス−酸緩衝液、ｐＨ７，６，０，１−
中で激しく綿棒を上下に動かし細胞を浮遊させ、これを
咽頭擦過細胞液（咽頭拭い液）とした。
５および１６６日目感染ノ・ムスターおよび対照群ハム
スターの咽頭後壁を滅菌した耳鼻科用綿棒で擦過し、０
．０５Ｍ）ＩＪスス−酸緩衝液、ｐＨ７，６，０，１−
中で激しく綿棒を上下に動かし細胞を浮遊させ、これを
咽頭擦過細胞液（咽頭拭い液）とした。
ｉｉ）咽頭からのＭ、ｐｎ、の分離状況の確認１）で得
られた細胞液の一部をＣｈａｎｏｃｋらのＰＰＬＯ液体
培地および寒天培地、さらに重層培地に接種した。判定
は寒天培地は接種後８日目、液体培地および重層培地は
接極後１４日日に行った。感染後１日目より各培地とも
ほぼ平行して分離され７日前後に菌検出のピークがみら
れ、１６６日目も検出された。一方、非感染ハムスター
からは菌は分離されなかった。
られた細胞液の一部をＣｈａｎｏｃｋらのＰＰＬＯ液体
培地および寒天培地、さらに重層培地に接種した。判定
は寒天培地は接種後８日目、液体培地および重層培地は
接極後１４日日に行った。感染後１日目より各培地とも
ほぼ平行して分離され７日前後に菌検出のピークがみら
れ、１６６日目も検出された。一方、非感染ハムスター
からは菌は分離されなかった。
ｉｉｉ ） ＡＢＣ法によるＭ、ｐｎ、の検出１）で
得られた細胞液のうち約２μｔを、ＣｌＯ２（ｗ／ｖ
）ポリーＬ−リジンヒドロプロミド（分子ｉ ２０ Ｑ
、０００．シグマ製って処理されたスライドガラス（以
下ポリ−Ｌ−リジンコートスライドという）に塗抹し、
３０分間風乾し、つぎに９５９６ （ｖ／ｖ、） エタ
ノール中で１０分間固定後、０．０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ７，６で５分間２回洗浄した後、続いて過沃
素酸で内因性はルオキシダーゼ活性を阻止し、再度同様
に洗浄後、正常ウマ血清溶液（ＣＬＯ５Ｍ）ＩＪスス−
酸緩衝液、ｐＨ７，６で１．８％（ｖ／ｖ ）に希釈し
たもの〕と１５分間反応させた。つぎに本発明のモノク
ローナル抗体溶液（α０５Ｍｌ−’Ｊスー塩酸緩衝液、
ｐＨ７，６で５０倍に希釈したもの）と３０分間反応さ
せた後、同様に洗浄した。次に、２次抗体としてビオチ
ン化されたウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ製）を１
５分間反応させ、同様に洗浄後、アビジン−ビオチン−
ペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ製）を２０分間
反応させた後、同様に洗浄した。
得られた細胞液のうち約２μｔを、ＣｌＯ２（ｗ／ｖ
）ポリーＬ−リジンヒドロプロミド（分子ｉ ２０ Ｑ
、０００．シグマ製って処理されたスライドガラス（以
下ポリ−Ｌ−リジンコートスライドという）に塗抹し、
３０分間風乾し、つぎに９５９６ （ｖ／ｖ、） エタ
ノール中で１０分間固定後、０．０５Ｍトリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ７，６で５分間２回洗浄した後、続いて過沃
素酸で内因性はルオキシダーゼ活性を阻止し、再度同様
に洗浄後、正常ウマ血清溶液（ＣＬＯ５Ｍ）ＩＪスス−
酸緩衝液、ｐＨ７，６で１．８％（ｖ／ｖ ）に希釈し
たもの〕と１５分間反応させた。つぎに本発明のモノク
ローナル抗体溶液（α０５Ｍｌ−’Ｊスー塩酸緩衝液、
ｐＨ７，６で５０倍に希釈したもの）と３０分間反応さ
せた後、同様に洗浄した。次に、２次抗体としてビオチ
ン化されたウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ製）を１
５分間反応させ、同様に洗浄後、アビジン−ビオチン−
ペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ製）を２０分間
反応させた後、同様に洗浄した。
続いて再度内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止するため
アジ化ナトリウムをふくむ３．３′−ジアミノベンジジ
ンーテト、ラヒドロクロリド（ＤＡＢと略記、同位化学
展）と過酸化水素水力ζうなる基質液とを１０分間反応
させて呈色させ、その後脱イオン水で５分間洗浄した。
アジ化ナトリウムをふくむ３．３′−ジアミノベンジジ
ンーテト、ラヒドロクロリド（ＤＡＢと略記、同位化学
展）と過酸化水素水力ζうなる基質液とを１０分間反応
させて呈色させ、その後脱イオン水で５分間洗浄した。
感染１１日目の咽頭擦過細胞塗抹標本の染色像写真を第
３図、第４図および第５図に示す。
３図、第４図および第５図に示す。
第３図は、ｒ１３０６Ｂ１２ａＡ２Ｊクローンに由来す
る抗Ｍ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅモノクローナル抗体を反
応させた感染後１１日目のハムスターから得た咽頭拭い
液と対照としてモノクローナル抗体を反応させない咽頭
拭い液中の細胞を上記の方法で染色したものを示す図で
ある。Ｍ、 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓの集落は、七ツクロ
ーナル抗体で反応させたものは染色され（ａ）、一方対
照は染色されなかった（ｂ）。
る抗Ｍ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅモノクローナル抗体を反
応させた感染後１１日目のハムスターから得た咽頭拭い
液と対照としてモノクローナル抗体を反応させない咽頭
拭い液中の細胞を上記の方法で染色したものを示す図で
ある。Ｍ、 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓの集落は、七ツクロ
ーナル抗体で反応させたものは染色され（ａ）、一方対
照は染色されなかった（ｂ）。
観察は倍率×１００で行なった。
第４図は、第３図と同様に、ただし倍率２００で観察し
たものを示す。染色性は第３図と同様であった。
たものを示す。染色性は第３図と同様であった。
第３図および第４図かられかるように、モノクローナル
抗体と反応させたもの即ち各図中（ａ）はＤＡＢにより
濃褐色に染色される不整形の構造物が認められた。一方
、感染群でも抗体と反応させなかったもの、即ち各図中
（ｂ）の染色性は陰性であった。なお図示しないが、非
感染ハムスターより作製した標本は、本発明のモノクロ
ーナル抗体によって染色されなかった。従って感染群に
おける陽性染色像の特異性が確認された。
抗体と反応させたもの即ち各図中（ａ）はＤＡＢにより
濃褐色に染色される不整形の構造物が認められた。一方
、感染群でも抗体と反応させなかったもの、即ち各図中
（ｂ）の染色性は陰性であった。なお図示しないが、非
感染ハムスターより作製した標本は、本発明のモノクロ
ーナル抗体によって染色されなかった。従って感染群に
おける陽性染色像の特異性が確認された。
第５図は、抗Ｍ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ モノクローナ
ル抗体に感染後１３日後のハムスターより得た咽頭拭い
液の中の細胞を上記の方法で染色したものを示す倍率Ｘ
Ｉ、００００図である線毛つきの細胞が染色された。こ
れはＭ、ｐｎ、は線毛上皮細胞に付着し易いという報告
に沿うものであった。
ル抗体に感染後１３日後のハムスターより得た咽頭拭い
液の中の細胞を上記の方法で染色したものを示す倍率Ｘ
Ｉ、００００図である線毛つきの細胞が染色された。こ
れはＭ、ｐｎ、は線毛上皮細胞に付着し易いという報告
に沿うものであった。
以上詳述したとおり本発明の診断法を実施することによ
り、■モノクローナル抗体を使用するため口腔内の多く
の常在菌が原因となる交叉反応や非特異反応を避けるこ
とが可能である、■ＡＢＣ法を用いることにより少数し
か分離できない咽頭の菌を高感度の染色法で検出するこ
とが可能であるという有利な効果を奏するのである。
り、■モノクローナル抗体を使用するため口腔内の多く
の常在菌が原因となる交叉反応や非特異反応を避けるこ
とが可能である、■ＡＢＣ法を用いることにより少数し
か分離できない咽頭の菌を高感度の染色法で検出するこ
とが可能であるという有利な効果を奏するのである。
第１図は、ウェスタンプロット法によるマイコプラズマ
ニユモニエタンパク質の認識のためのモノクローナル抗
体と実験的に感染させたマウス血清、高度免疫マウス血
清、実験的に感染させたハムスター血清及び回復期のヒ
ト直溝との比較を示す写真である。 第２図は、マイコブラズマニュモニエト他のマイコプラ
ズマのモノクローナル抗体と反応させたときの比較を示
す写真である。左は５Ｄ８−ＰＡＧＥを示し、右はウェ
スタンプロット法によるモノを示す。 第３図は、抗マイコプラズｉニュモニエモノクローナル
抗体に反応させた感染後のハムスターの１１日後の咽頭
拭い液（ａ）とモノクローナル抗体なしの咽頭拭い液（
ｂｉ中の細胞の染色したものを示す写真である。（倍率
Ｘ１０（］）第４図は、第３図と同様の写真であって、
倍率を２００倍としたものである。 第５図は、抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル
抗体に感染後１１日後のハムスターより得た咽頭拭い液
の咽頭拭い液中の細胞を染色したものを示す写真である
。（倍率ｘｌ、０００）図面のｆＴｔ書（内容に変更な
し） 第 ５ 図 （１，ｏｏｏ）
ニユモニエタンパク質の認識のためのモノクローナル抗
体と実験的に感染させたマウス血清、高度免疫マウス血
清、実験的に感染させたハムスター血清及び回復期のヒ
ト直溝との比較を示す写真である。 第２図は、マイコブラズマニュモニエト他のマイコプラ
ズマのモノクローナル抗体と反応させたときの比較を示
す写真である。左は５Ｄ８−ＰＡＧＥを示し、右はウェ
スタンプロット法によるモノを示す。 第３図は、抗マイコプラズｉニュモニエモノクローナル
抗体に反応させた感染後のハムスターの１１日後の咽頭
拭い液（ａ）とモノクローナル抗体なしの咽頭拭い液（
ｂｉ中の細胞の染色したものを示す写真である。（倍率
Ｘ１０（］）第４図は、第３図と同様の写真であって、
倍率を２００倍としたものである。 第５図は、抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル
抗体に感染後１１日後のハムスターより得た咽頭拭い液
の咽頭拭い液中の細胞を染色したものを示す写真である
。（倍率ｘｌ、０００）図面のｆＴｔ書（内容に変更な
し） 第 ５ 図 （１，ｏｏｏ）
Claims (9)
- （１）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローン
１３０６Ｂ１２ａＡ２から得られた抗マイコプラズマニ
ユモニエモノクローナル抗体。 - （２）アイソタイプがハツカネズミＩｇＧ２ｂであり、
そしてマイコプラズマニユモニエの分子量約１６０ｋＤ
ａの細胞膜蛋白分子上に位置するエピトープを認識する
特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 - （３）マイコプラズマオラーレ、マイコプラズマホミニ
ス、マイコプラズマバツカーレ、マイコプラズマサリバ
リウム、マイコプラズマプリマタム、マイコプラズマフ
アウシウムおよびマイコプラズマフエルメンタンスのい
ずれとも反応しない特許請求の範囲第２項に記載のモノ
クローナル抗体。 - （４）マイコプラズマニユモニエ抗原で免疫されたマウ
スの脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを細胞融合し、抗体産
生ハイブリドーマをスクリーニングで取り出し、これを
限界希釈法によりクローニングし、さらにリクローニン
グしてクローン化することにより抗マイコプラズマニユ
モニエモノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローン
を得、このハイブリドーマクローンをマウスに腹腔内接
種してマウスを癌化させ、ついでこのマウスより腹水を
得、この腹水を透析することにより抗体分画を得ること
を特徴とする抗マイコプラズマニユモニエモノクローナ
ル抗体の製造方法。 - （５）抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマクローンが１３０６Ｂ１２ａＡ２で
あることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の製
造方法。 - （６）たんぱく質Ａ−セフアロースカラムを用いたアフ
イニテイークロマトグラフイーによりさらに精製する工
程を設けたことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記
載の製造方法。 - （７）抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマクローン１３０６Ｂ１２ａＡ２から
得られたモノクローナル抗体を緩衝液で希釈した肺炎マ
イコプラズマ症診断剤。 - （８）緩衝液が０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液である特
許請求の範囲第７項に記載の診断剤。 - （９）段階： （ａ）被検者の咽頭後壁から検体を取り出し、 （ｂ）この検体を緩衝液中に浮遊させて咽頭細胞浮遊液
とすること、 （ｃ）上記細胞浮遊液の少量をポリ−Ｌ−リジンコート
されたスライドガラスに塗抹し、風乾し、固定し、洗浄
し、続いて酸化剤で内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止
し、洗浄し、その後正常ウマ血清溶液と反応させること
、 （ｄ）抗マイコプラズマニユモニエモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマクローン１３０６Ｂ１２ａＡ２から
得られたモノクローナル抗体を緩衝液で希釈してなる診
断剤を（ｃ）で得られたスライドガラス調製物と反応さ
せ、その後洗浄すること、および、 （ｅ）（ｄ）で得られたスライドガラス調製物にビオチ
ニル化された２次抗体を反応させ、洗浄し、アビジン−
ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を反応させ、洗浄し
、発色試薬および過酸化水素水を反応させて呈色させる
こと、 よりなる肺炎マイコプラズマ症の診断方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61173762A JPS6332496A (ja) | 1986-07-25 | 1986-07-25 | モノクロ−ナル抗体、その製法およびこのモノクロ−ナル抗体を用いた肺炎マイコプラズマ症診断剤および診断方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61173762A JPS6332496A (ja) | 1986-07-25 | 1986-07-25 | モノクロ−ナル抗体、その製法およびこのモノクロ−ナル抗体を用いた肺炎マイコプラズマ症診断剤および診断方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6332496A true JPS6332496A (ja) | 1988-02-12 |
Family
ID=15966673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61173762A Pending JPS6332496A (ja) | 1986-07-25 | 1986-07-25 | モノクロ−ナル抗体、その製法およびこのモノクロ−ナル抗体を用いた肺炎マイコプラズマ症診断剤および診断方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6332496A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63184064A (ja) * | 1986-07-29 | 1988-07-29 | Ss Pharmaceut Co Ltd | 抗マイコプラズマ・ニユ−モニエモノクロ−ナル抗体及びその製造法並びにこれを利用するマイコプラズマ・ニユ−モニエの同定用及び診断用試薬 |
| CN105717299A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-06-29 | 贵州大学 | 一种基于Mo P113蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63298A (ja) * | 1986-03-27 | 1988-01-05 | シタス コ−ポレイシヨン | イムノブロツトによる抗原の直接同時アツセイ |
-
1986
- 1986-07-25 JP JP61173762A patent/JPS6332496A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63298A (ja) * | 1986-03-27 | 1988-01-05 | シタス コ−ポレイシヨン | イムノブロツトによる抗原の直接同時アツセイ |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63184064A (ja) * | 1986-07-29 | 1988-07-29 | Ss Pharmaceut Co Ltd | 抗マイコプラズマ・ニユ−モニエモノクロ−ナル抗体及びその製造法並びにこれを利用するマイコプラズマ・ニユ−モニエの同定用及び診断用試薬 |
| CN105717299A (zh) * | 2016-02-01 | 2016-06-29 | 贵州大学 | 一种基于Mo P113蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法 |
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