JPS6332497A - ビタミンb↓1↓2の定量法及びビタミンb↓1↓2定量用試薬 - Google Patents

ビタミンb↓1↓2の定量法及びビタミンb↓1↓2定量用試薬

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JPS6332497A
JPS6332497A JP61175332A JP17533286A JPS6332497A JP S6332497 A JPS6332497 A JP S6332497A JP 61175332 A JP61175332 A JP 61175332A JP 17533286 A JP17533286 A JP 17533286A JP S6332497 A JPS6332497 A JP S6332497A
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JP
Japan
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vitamin
medium
bacteria
quantitative determination
quantitative
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JP61175332A
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Asao Murai
村井 朝夫
Masao Yamamoto
山本 理雄
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Ajinomoto Co Inc
Sanraku Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Sanraku Inc
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Publication date
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、ビタミンB12(以下B1゜と略す)活性物
質の微生物定量法及び同定量に使用する試薬に関するも
のであり、更に詳しくは生育にB12を要求し、メタノ
ールを資化しうる海洋メタノール資化細菌を使用する、
B12活性物質を簡便迅速に定量する方法及びその定量
に使用するB12を要求する海洋メタノール資化性細菌
の接種用生菌体乾燥組成物、メタノールを含有し、かつ
ピロロキノリンキノン及びポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステルを含有する定量用液体培地及びB1゜
標準液から成るB12活性物質定量用試薬に関するもの
である。
(従来の技術) 従来よりB、2活性物質の定量法には物理化学的方法と
微生物的方法が知られて−る。et生物的方法の中でも
B12要求性を有する海洋メタノール貴化性細菌による
B12活性物質を定量する方法は優れた方法として知ら
れている。(特開昭55−しかし、この方法でB、2活
性物質を定量しようとすると、菌の生育が必ずしも安定
でなく精度よく迅速にB12活性物質を定量できないと
いう欠点を有していた。
(本発明が解決しようとする間蹟点) 本発明が解決しようとする問題点は、従来のB12要求
性を有する海洋メタノール資化性菌によるB、2活性物
質の定量法が有していた欠点、即ち、安定かつ精度よく
迅速にB、2活性物質を定量できないという欠点を改良
したB、2活性物質の定量法及びB1゜定量試薬を開発
することにある。
(問題点を解決する為の手段) 本発明者らは上記の問題点を解決する為に種々研究を行
った結果、従来より知られて込るB12要求性を有する
海洋メタノール資化細菌の定量用培地[ピロロキノリン
キノン及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ
ルを添加することにより、安定かつ精度よく迅速にB1
2活性物質を定量できることを発見した。本発明にこの
発見に基いてなされたものである。
本発明に使用する微生物としては、既にメタノールを咋
−の炭素源として良く資化、高速度に生育することがで
き、又海水を培地用水洗利用できるなどのt¥f徴から
海洋メタノール資化細菌として分離されたアルテロモナ
ス サランメタノリカYK 4007 、 FERM 
P−3621(菌学的性質はJ、 Ferment、 
Technol、、 58.99406(1980)に
記載されている。)などがある。いずれも生育にB12
を要求する特徴を有している。
本発明にお込て用いるB12活性物質の定量用培地はピ
ロロキノリンキノン及びポリオキシエチレンソルビタン
脂肪酸エステルを含有する以外は従来より用いられてい
るB、2要求性を有する海洋メタノール資化細菌用の定
量用培地が使用できる。
更に上記の組成の定量用培地に硫酸鉄、硫飯亜鉛、チオ
硫酸ソーダ、チオグリコール酸などを含有させると良好
な定量結果が得られることがある。
ピロロキノリンキノンの添加量は定量用培地100 r
nl当り10 ngないし60 ngの範囲が望ましく
 75 ng以上になると微生物の生育が阻害される念
めに、良好な定量結果が得られなり場合がある。又、1
0 ng以下の場合は微生物の生育にばらつきが認めら
れるようKな9、良好な定量結果が得られなくなること
がある。
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの添加量
は定量用培地100−当り1m9ないし20m9の範囲
が望ましく、20rn9以上になると微生物の生育が阻
害さ几る場合があり、1■以下になると生育にばらつき
が認められ良好な結果が得られなくなる場合がある。
本発明に使用する接穐菌は従来の微生物法と同様に、使
用菌を液体培地に前培養し、集菌、洗浄して使用する事
も可能であるが、前培養する事なく、寒天上に生育せる
菌体を通常の方法によシ集菌し、洗浄して使用してもよ
く、より簡便に定量を行う事ができる事も本発明の特徴
である。
本発明の定量法に於いてはB12活性を有しなり各種の
物質、例えばアミノ酸であるDL−メナオニン、核酸成
分の一種であるチミジン、B12の生合成における先駆
体であるδ−アミルプリン酸、B12の構成要素である
コバルト塩、各種のアミノ酸、ペグタイド類、ビタミン
類、核酸類を含有するが、B12を含有しない酵母エキ
スなどによっては菌の増殖は見られず、B12を含有す
る肉エキスによって菌の増殖が見られる。この事から本
発明の定量法によれば”12活性物質を特異的に定量で
きる事が明らかである。
本発明に使用する微生物は生存状態を保ちながら乾燥す
る事が可能であり、その乾燥組成物は微生物の生存状態
を保ちながら長期間保存する事ができる。従って生菌体
を乾燥保存すればB12活性物質を定量する際その乾燥
組成物を厘ちに培地溶液や滅菌水に懸濁し、その菌体懸
濁液を直接定量用接種菌液として使用する事ができる。
又、定量用液体培養液は無菌的に長期間保存する事がで
き、これを例えばアンプル、ガラス瓶などに入れ、保存
し、必要に応じて解封し、上記接種用乾燥菌体−=− 組成物とともに組のキットとして測定江使用する事がで
きる。この為、接種用菌体組成物と所定量ノヒロロキノ
リンキノン及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステル定量用培地を測定装置として組み合わせて供給す
る事が出来、定量者がこの試薬をm−B12活性物質を
定量する場合、菌株の保存管理の必要がなく、極めて簡
便に定量できるものである。又、本発明の菌体組成物及
び定量用培地をそnぞn組み込んで自動バイオアッセイ
装置を構成し自動的にBj2活性物質を定量することも
できる。生菌体を乾燥するには例えば、M/30 F)
ん酸緩衝液11に食塩10g、グルタミン酸ソーダ20
g、硫酸マグネシウム0.21’を溶解したものを分散
媒とし、これに洗浄した生菌体を懸濁し、凍結乾燥する
。定量用培地はアンプルとして保存、供給すればメタノ
ールの蒸発、逸散がなく都合が良い。菌が耐塩性である
こととメタノールを唯一の炭素源として増殖するためと
、B12以外の他の成分に殆ど感受性がないため、極め
てラフに操作を行っても正確な分析値が得られる。
次に実施例を用Aて説明する。
実施例1 菌株保存用培地は次の如く調整した。水11に硫安21
.(iliI酸マグネシウム0.3g、りん酸1カリI
I、りん酸2カリ55I1食塩30.?、陶工を加え、
滅菌した試験管に分注し、斜面にして固化せしめスラン
トとした。測定用培地は第1表に示した組成の定量用培
地11を120℃5分間殺菌後2,5 rnlのメタノ
ールを加え、この定量用培地をL字管に9WLlずつ分
注して調整した。
第  1  表 硫酸マグネシウム   0.3.9      0.3
.99ん酸1カリ     2  g     2.V
りんtR2カリ      7 g      79食
塩   30.!i’   30.9ピロロキノリンキ
ノン  −3007v[yイー780J       
   100  Tn9分析用試料としては、味の素(
□□□製経製経型栄養剤レンタール」、イワシ肉、サバ
肉を使用し、これらの試料それぞnlN%各10個を1
0dの脱イオン水に浸漬、ホモジナイズした後、腸溶上
100℃で30分熱処理し、処理液の遠心分離上澄を適
宜稀釈し、被験試料液とした。
前記スラントにアルテロモナス サラソメタノリカ Y
K 4007 FgRM P−3621を接種し、30
℃で1日培養後5℃で保存した。使用に際してスラント
上に生育し之菌体を前記のメタノールを含有するA培地
及びB培地に懸濁し、同培地で一度洗滌した後、610
nmの吸光i (OD)が0.3になるように同培地液
に懸濁し、接種菌液とした。前記のメタノールを含有す
るA培地及びB培地9 mlの入っfcL字管に標準ジ
アノコバラミン醪液及び被験試料液をそれぞれIM加え
、更に上記接種菌液0.2Mを加え、55℃で15時間
振盪培養した。
この培養液の吸光度を610nmOOD値として測定し
、標準白線を作り、被験試料のOD値に相当するシアノ
フパラミン量を求めた。この結果を第2表に示した。
実施例2 第3表に示した店地を基礎培地とし、第4表に示した濃
度のピロロキノリンキノン及び「ツイーン80」を添加
した定量用培地を用い、実施例1で使用した経腸栄養剤
「エレンタール」を胴込、実施例1と同じ操作により、
「エレンタール」中のジアノコバラミンを定量した。
第  3  表 定量培地 KH2PO41,Q、!i’ に2HP043.O,!7 (NH4)2So4      1.0.9MgSO4
・7H200,3g NaCt30.0F NaS203” 5H201o、o呼 ZnSO4’ 7H2030μg FeSO4−7H205rru2 methanot5  ml Water       1000  NpH6,8 その結果を第4衣に示した。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)ビタミンB_1_2要求性を有する海洋メタノール
    資化細菌をピロロキノリンキノン及びポリオキシエチレ
    ンソルビタン脂肪酸エステルを含有する当該細菌の定量
    用培地に培養して、その増殖度によってビタミンB_1
    _2を定量することを特徴とするビタミンB_1_2活
    性物質の定量法。 2)ビタミンB_1_2要求性を有する海洋メタノール
    資化細菌の接種用生菌体乾燥組成物封入のアンプル又は
    バイアル、当該細菌のピロロキノリンキノン及びポリオ
    キシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する定量
    用培地封入のアンプル又はバイアルを組合せ、又はこれ
    らにビタミンB_1_2の一連の稀釈濃度の標準液封入
    のアンプル又はバイアルを組合わせて、組合わせセット
    とした特許請求の範囲第1項記載のビタミンB_1_2
    活性物質の微生物定量法に使用する定量用試薬。
JP61175332A 1986-07-25 1986-07-25 ビタミンb↓1↓2の定量法及びビタミンb↓1↓2定量用試薬 Pending JPS6332497A (ja)

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US07/074,745 US4918005A (en) 1986-07-25 1987-07-17 Method of quantitative assay for vitamin B12 and reagent for assaying vitamin B12
DE8787110705T DE3775649D1 (de) 1986-07-25 1987-07-23 Verfahren zur quantitativen bestimmung der vitamin-b12 und reagenz zur bestimmung von vitamin-b12.
EP87110705A EP0254319B1 (en) 1986-07-25 1987-07-23 Method of quantitative assay for vitamin b12 and reagent for assaying vitamin b12

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2413940C2 (ru) * 2009-02-02 2011-03-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Воронежская государственная технологическая академия Способ определения витамина b12 в водных растворах

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DE3775649D1 (de) 1992-02-13
EP0254319B1 (en) 1992-01-02

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