JPS6333103B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒトエリスロポエチン感作ラテツクス
に関する。さらに詳しくは、ヒトの精製エリスロ
ポエチンを感作させたエリスロポエチン感作ラテ
ツクス粒子を含有する感作ラテツクスおよびさら
に安定剤を含有するエリスロポエチン感作ラテツ
クスに関する。 ヒトの赤血球の寿命は約120日であり、毎日全
赤血球の1/120が細網内皮系で破壊されるが、同
時に同じ数の赤血球が産生されて常に一定の赤血
球数が保たれている。 赤血球は、骨髄において赤芽球の成熟脱核によ
つてつくられるが、エリスロポエチンは未分化の
骨髄幹細胞に作用して赤血球への分化を引き起こ
す因子であり、体組識の酸素分圧が低下して低酸
素状態になると分泌が促進される。 すなわち、エリスロポエチンは骨髄において生
産される赤血球数を制御する体液性ホルモンであ
る。 このエリスロポエチンは分子量27000〜66000程
度と推定されるシアリン酸を含む糖蛋白質で哺乳
動物ではその全部または大部分が腎臓で生産され
ている。 人の赤血球数の減少する疾患、すなわち「貧
血」はその成因からみて大きく３つの型に分けら
れる。第１の型は赤血球の素になる幹細胞に異常
があつて、エリスロポエチンの産生能が正常であ
つても赤血球を作ることができない場合、すなわ
ち「再生不良性貧血」である。この幹細胞の異常
を更に詳しく分けてみるならば、骨髄の低形成幹
細胞そのものの異常、赤血球の増殖する場の不
全、エリスロポエチンに対する反応性の低下など
である。この疾患の場合には、生体は赤血球数を
増加させようとする機構が働いてエリスロポエチ
ンは非常に高い値あるいは異常に高い値を示す。
第２の型は慢性腎不全などの場合のいわゆる「腎
性貧血」で、この場合、幹細胞は正常であつても
エリスロポエチン産生臓器である腎臓に器質的病
変があつてエリスロポエチンを生産することがで
きず、その為赤血球が増加せず貧血となる。この
場合は体液中には低濃度のエリスロポエチンが存
在するのみである。第３の型は幹細胞およびエリ
スロポエチン産生能が共に正常な場合で、鉄欠
乏、失血、ビタミンB₁₂欠乏、自己免疫による溶
血などに起因する貧血である。この場合、エリス
ロポエチンは高い値を示し、ヘモグロビン量と負
の相関を示す。 貧血そのものの診断は赤血球実数の計数、ある
いはヘマトクリツト法による血球容量の測定、ヘ
モグロビンの測定等により容易に診断することが
できるが、その病因が骨髄幹細胞の異常にあるの
か、腎の病変に基づくエリスロポエチンの産生不
全にあるのか、あるいは両者以外に原因があるの
かを診断することは治療方針の設定、予後の予測
等にとつて極めて重要であり、またこの為には体
液中のエリスロポエチンの定量が不可欠であるこ
とは自明である。 従来、エリスロポエチンの測定には、マウスあ
るいはラツトによるバイオアツセイ法が常用され
てきた。すなわち、多血マウスあるいは飢餓ラツ
トにエリスロポエチンを注射した後、 ⁵⁹Feを注
射してこの ⁵⁹Feの血球への取込み率からエリス
ロポエチン量を計算する方法である。この方法は
特異性において優れているが、多数の動物の長期
間の飼育、アイソトープの使用等に加えて非常に
手数と経費を要し、臨床検査に応用することは容
易ではない。この点を考慮してエリスロポエチン
を赤血球に感作しておき、試料中のエリスロポエ
チンで抗エリスロポエチン抗体を中和してからこ
の感作血球による凝集抑制反応により判定する方
法が開発されている。しかしこの方法では、人の
血清中に含まれている非特異的赤血球凝集素を除
去する必要がある為血球抗体の吸収処理をしなけ
ればならず、またその確認試験をさらに必要とす
るばかりか、生物学的活性と一致しないことも多
く、信頼性が確立されていない（臨床検査第22巻
第２号134〜140頁（1978年）参照）。更に他の文
献にも、赤血球凝集阻止反応
（Hemagglutination inhibition）はエリスロポエ
チンの測定方法として適当でないと記載されてい
る［日本臨床38巻・春季増刊号（1980）第656頁
左欄17〜26行目及び同43巻・秋季臨時増刊号
（1985）第1155頁右欄４〜８行目参照］。また、一
般にヒツジ赤血球に抗原を感作できたからといつ
て、該抗原をラテツクス粒子に担持できるとは限
らず、また担持できたとしても良好な結果が得ら
れるとは限らない。 本発明者らは、これら従来法の難点を解決し、
エリスロポエチンを容易に特異的に比較的短時間
で測定する方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結
果、精製エリスロポエチンをラテツクス粒子に感
作してエリスロポエチン感作ラテツクスを製造
し、これを用いて試料を何ら前処理することなく
体液中のエリスロポエチンを受身ラテツクス凝集
抑制反応により測定することに成功し、本発明を
完成するに至つた。 すなわち、本発明の目的はエリスロポエチン感
作ラテツクスおよびエリスロポエチン感作ラテツ
クス粒子組成物を提供することにある。 次に本発明をさらに詳細に説明する。 本発明の感作ラテツクスを製造するために用い
るラテツクスは、ポリスチレン、カルボキシル化
ポリスチレン、アミノ基を有するカルボキシル化
ポリスチレン、ポリビニルトルエン、スチレン―
ブタジエン共重合体、カルボキシル化スチレン―
ブタジエン共重合体、ステレン―ジビニルベンゼ
ン共重合体、ビニルトルエン―第三ブチルスチレ
ン共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポ
リメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリ
ロニトリル―ブタジエン―スチレン共重合体、ポ
リ酢酸ビニルアクリレート、ポリビニルピロリド
ン、塩化ビニル―アクリレート共重合体等の合成
高分子ラテツクス粒子からなるラテツクスであ
り、さらにこれらの合成高分子ラテツクス粒子の
表面を非イオン界面活性剤等で処理したものであ
つてもよい。上記した合成高分子ラテツクスのな
かでもポリスチレンラテツクスが好ましい。ラテ
ツクス粒子の粒径は、0.01〜10μであり、好まし
くは0.1〜1.0μであるが、分析試験結果の再現性
を良くするためには、粒径分布の幅が狭いもの、
例えば0.2±0.005μのものが望ましい。また、使
用されるラテツクス粒子の比重は0.9〜1.4であ
る。 エリスロポエチンは血液、尿等の体液中に見出
される。本発明において用いるエリスロポエチン
調製用の原料としては血液、尿ともに用いること
ができるが、尿は排泄物であり容易に入手できる
ことから特に適している。これらの原料からエリ
スロポエチンを調製する方法としては、「ジヤー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」
“Journal of Biological Chemistry”vol252，
5558〜5564（1977）に記載されているようにエタ
ノール沈澱、アセトン沈澱、タンニン酸沈澱、塩
化リチウム沈澱、硫安塩析、ゲル過、DEAE―
セルロ―スクロマトグラフ、ポリアクリルアミド
ゲルクロマトグラフ、カオリン吸着解離等が知ら
れている。また、エリスロポエチンは100℃，15
分の加熱に耐えるので、精製に先立つて加熱処理
を行ない、他の大部分の蛋白質及び糖蛋白質を熱
変性させておくことにより非特異的反応を抑える
ことができる。本発明で用いるエリスロポエチン
は上記方法のどのような組合せによつて得られた
ものでも用いることができるが純度が低いと副反
応を起こすことがあるので、高純度で単一の蛋白
質標品であることが望ましい。このようにして得
られた精製エリスロポエチンを抗原として、ヤ
ギ、ウサギ、モルモツト等の抗体産生能のある動
物に常法によつて免疫した後採血して抗原中和用
の抗体を得ることができる。この場合に用いる動
物は大量の抗体が得やすければ何を用いてもよ
く、特定の動物に限定されるものではない。 次に、抗原として精製エリスロポエチンをラテ
ツクス粒子に感作させる為には、当該ラテツクス
粒子と抗原とを水、生理食塩水、PH5.5〜10、好
ましくはPH6.4〜7.6の各種緩衝液等の中で、濃度
0.05〜３％のラテツクス粒子と濃度50〜
1000miu／mlの抗原とを４〜40℃において30分〜
24時間ゆるやかに撹拌しながら接触させることに
よつて行なう。緩衝液としては、例えばリン酸塩
緩衝食塩水、グリシン緩衝食塩水などある。感作
終了後は水性溶媒、例えばこれら緩衝液で洗浄す
ることにより、ラテツクス粒子に吸着されない抗
原を完全に除去する。さらにこのラテツクスは希
釈液に懸濁させてラテツクス粒子の抗原未感作部
分を蛋白質で飽和しておくとよい。 稀釈液としては、グリシン緩衝食塩水、リン酸
塩緩衝食塩水等に牛血清アルブミン（以下BSA
と略す）約0.1％を加えたものを用い、0.01〜0.5
％のナトリウムアジド（NaN₃）を加えておく。 このようにして得られた感作ラテツクスは0.25
重量％程度に希釈液に懸濁させた状態で氷室に保
存してもよいし、凍結乾燥しておいてもよい。凍
結乾燥する為には希釈液に安定剤として各種アミ
ノ酸類、特にグリシン、グルタミン酸ナトリウム
およびデキストランをそれぞれ0.2〜２重量％お
よび0.3〜３重量％を加えて液体窒素あるいは液
体空気中などで急速凍結してから凍結乾燥する。
凍結乾燥により保存期間はさらに延長され、通常
２年以上安定である。 本発明のエリスロポエチン感作ラテツクスは抗
エリスロポエチン抗体により凝集されるので、ま
ず人の体液もしくはその希釈液と抗エリスロポエ
チン抗体を接触させてエリスロポエチンが存在す
るなら、この抗原によつて抗体を中和させ、しか
る後エリスロポエチン感作ラテツクスを接触させ
ると、体液中またはその希釈液中にエリスロポエ
チンが存在する場合には抗体は中和されて感作ラ
テツクスは凝集せず、逆に体液中にエリスロポエ
チンが存在しない場合には、抗体は中和されず、
この抗体によつて感作ラテツクスは凝集する。こ
の反応をマイクロタイター法で行なう場合、マイ
クロプレート上に管底凝集像として認めることが
できる。すなわち、プレートに一定量の希釈液を
滴下分注し、次いで第１穴目に一定量の体液を加
え、ダイリユーターで順次希釈する。これに抗エ
リスロポエチン抗体を一定量滴下分注して一定時
間反応させてから抗原感作ラテツクスを滴下分注
し、一定時間後に管底凝集像を判定する。この場
合、正確に濃度既知の標準エリスロポエチンを併
用するならば、この標準物質についての凝集阻止
値から比例計算することにより未知の体液濃度を
計算することが容易であり、未知体液中のエリス
ロポエチンの濃度を求めることができる。 本発明の感作ラテツクスは次の点で極めて大き
な利点を有している。すなわち、体液中にはラテ
ツクスそのものに対する非特異的凝集素、すなわ
ち担体に対する抗体が全く存在しえず、また実際
に発見されていないので被検体液を何等前処理す
る必要がなく、またその為の確認試験も必要とし
ない。マイクロプレートのウエルに体液もしくは
その希釈液を入れ、これに抗体を滴下した後、感
作ラテツクスを滴下するだけでよい。すなわちエ
リスロポエチンの定量は極めて容易かつ簡便であ
り、特別の技術を全く要しない。しかも抗原が精
製されているので極めて特異的であり、しかも感
度は人体液中の測定に全く不足はないし、同時に
多数の検体の定性およびまたは定量を行なうこと
ができる。 本発明の感作ラテツクスを用いれば、従来極め
て複雑なバイオアツセイ法に頼つていた体液中の
エリスロポエチン濃度を短時間に容易かつ簡便に
定量することができ、貧血患者の病因解析を正確
に行なうことができるほか治療結果の判定、予後
の予測を行なうこともできる。又、エリスロポエ
チンの尿などからの生産工程における濃度の測定
にも応用できる。 現在までにエリスロポエチンをラテツクスに感
作した例を記載した文献は全くなく、抗原感作ラ
テツクスを用いる凝集抑制反応は全く新規であ
る。 また、この感作ラテツクスは抗エリスロポエチ
ン抗体にのみ反応し、これ以外の抗体、あるいは
血漿蛋白に全く反応しないこと、未感作ラテツク
スは抗エリスロポエチン抗体、これ以外の抗体、
血漿蛋白に全く反応しないことから、この感作ラ
テツクスはエリスロポエチンが結合しているもの
であるといえる。 次に本発明を調製例および実施例によつてさら
に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えな
い限りこれらによつて限定されるものではない。 調製例 １ エリスロポエチンの調製 貧血患者尿にフエノールを0.1％加え、これに
エチルアルコール４容を加え、氷室に一夜放置し
た。3000rpmで30分間遠心分離して沈渣を集め、
これを生理食塩水に溶解し、生理食塩水に対し一
夜透析した。これを小試験管に分注し、沸騰水中
に15分間浸漬して加熱し、高速遠心分離した上清
についてカオリン吸着解離操作をした。すなわ
ち、生理食塩水で５回洗浄したカオリン〔フイツ
シヤー社製「アシツド・ウオツシユト・カオリ
ン」Fisher Scientific Company“Acid Washed
Kaolin”〕を10％加え、PHを4.8にし、４℃で24時
間ゆつくり撹拌した。このカオリンを3000rpmで
遠心分離して集めPH4.8の酢酸塩緩衝液で洗浄し
た後、1M，NH₄OHに懸濁させて１時間室温で
ゆつくり撹拌し、3000rpmで30分間遠心分離して
上清を分離した。この解離操作を３回繰り返して
上清を合わせた。この試料を0.029M，NaH₂PO₄
及び0.029M，NaClを含む溶液に対して透析し
た。次いで0.029M，NaH₂PO₄及び0.029M，
NaClを含む溶液にて平衡化したDEAE―セルロ
ース中にこの試料を加え、室温で１時間ゆつくり
撹拌して吸着させ、2000rpmの遠心によつて
DEAE―セルロースを集め、同液で２回洗浄した
後、0.05M，Na₂HPO₄及び0.15M，NaClを含む
溶液で３回溶出を行なつた。これをライフオゲル
（Lyphogel：登録商標）（米国，Gelman
Instrument Co.，製ポリアクリルアミド・ゲル
の商品名）で濃縮した後、セフアデツクスＧ―
100でゲル過し、活性部分を分取した。これを
再度エタノール沈澱させ、エタノールで洗浄後、
生理食塩水に溶解し、生理食塩水に対して透析し
てエリスロポエチン試料とした。 調製例 ２ 抗エリスロポエチン抗体の調製 上記の調製法のうち、加熱処理のみを除いて調
製した試料を免疫用抗原とした。この抗原をフロ
インド・コンプリート・アジユバンド
（Freund′s Complete adjuvant）と混和し、２〜
３Kgのウサギ皮下に７日おきに３回注射した後、
筋肉内に１回注射し、３週後生理食塩水に溶解し
た試料を静脈内に注射し、最後の注射から１週間
後に頚動脈から全採血を行ない、常法通り血清を
遠心分離し、56℃、30分間加熱し、抗エリスロポ
エチン抗体とした。これは窒化ソーダを0.1％加
えて４℃に保存した。得られた抗血清は抗原とオ
クターローニー法および免疫電気泳動法によつて
一本の沈降線のみを形成し、単一の抗体であるこ
とが確認された。 実施例 １ エリスロポエチン感作ラテツクスの調製 1/15Ｍ燐酸塩緩衝液（PH7.2）１容と生理食塩
液３容との混合液（以下PBSと略す）にラテツ
クス〔武田薬品工業(株)製、SDL59（比重1.18，粒
径0.9μ）〕をその粒子濃度が0.25％になるように
懸濁し、これに、更にPBSを用いて250miu（milli
immuno chemical unit）／mlになるように希釈
したエリスロポエチンを等量加え、室温に３時間
保ち、3000rpmで10分遠心分離してラテツクス粒
子を分取し、PBS、次いで希釈液で洗浄した後、
希釈液に0.25％になるように懸濁してエリスロポ
エチン感作ラテツクスを得た。この感作ラテツク
スは、抗エリスロポエチン抗体とマイクロプレー
ト上で凝集したが、抗ヒトアルブミン、抗ヒト
IgG、抗ヒトトランスフエリン、抗ヒトハプトグ
ロビン、抗ヒトβ₂ミクログロブリンの各抗体を加
えても凝集しなかつた。また抗エリスロポエチン
抗体にエリスロポエチンを加えて中和した後エリ
スロポエチン感作ラテツクスを加えても凝集しな
かつた。またエリスロポエチンを感作しないラテ
ツクスは同一の条件で抗エリスロポエチン抗体を
加えても凝集しなかつた。すなわち、この感作ラ
テツクスは抗エリスロポエチンに特異的に反応し
て凝集することが確認できた。 希釈液は1/60Ｍ，PH7.2のリン酸塩緩衝食塩水
にBSAを0.1％になるように加えたものである。 実施例 ２ エリスロポエチン感作ラテツクスの凍結乾燥 実施例１で調製した感作ラテツクスを、グリシ
ン0.5重量％、デキストランＴ―10、0.7重量％含
有した希釈液に2.5％に浮遊させ、液体窒素中に
浸漬して急速凍結させてから凍結乾燥した。 実施例 ３ エリスロポエチンの測定 Ｖ型マイクロプレートの各穴に希釈液を0.025
mlずつ分注し、第１穴目に血清または尿を0.025
ml加える。他方、標準エリスロポエチン75miu／
mlを別の列の第１穴目に同じく0.025ml加える。
ダイリユーターで順次倍数希釈する。これに予め
標準エリスロポエチンで６管目に終末点がくるよ
うに希釈した抗エリスロポエチン抗体を0.025ml
ずつ全部の穴に分注し、混和する。室温に30分保
つた後、実施例１で得られたエリスロポエチン感
作ラテツクスを0.025mlずつ分注し、マイクロミ
キサーでよく混和した後、室温に10時間以上静置
し、凝集抑制の終末点を測定し、標準エリスロポ
エチンと比較してエリスロポエチン濃度を計算す
る。 この方法によつてヒト血清中エリスロポエチン
濃度を測定した結果は表の通りであつた。

【表】

【表】 実施例 ４ 実施例２で得られたエリスロポエチン感作ラテ
ツクスにラテツクス粒子が0.25％になるように希
釈液を加えた後実施例３と同様に操作して血清中
および尿中エリスロポエチンを測定したが、その
結果は同様であつた。 以上の結果から明らかな如く、血中エリスロポ
エチンは鉄欠乏性貧血で高値、再生不良性貧血で
異常高値を示したのに対し、腎性貧血では異常低
値を示した。すなわち、貧血患者のエリスロポエ
チン濃度を測定することは貧血の成因の診断に極
めて有用であるといえる。また病変の程度を知る
ことにも応用できる。 本発明の感作ラテツクスを用いれば0.025ml程
度の微量の試料で、しかも何の前処理も要せずに
極めて容易にエリスロポエチンを定量することが
でき、その結果が生物学的活性と一致するので臨
床診断に特に適していると云える。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 表面に加熱処理したヒトエリスロポエチンを
   担持したラテツクス粒子を含有するヒトエリスロ
   ポエチン定量用エリスロポエチン感作ラテツク
   ス。 ２ ラテツクス粒子が平均粒径0.01〜10μのラテ
   ツクス粒子である特許請求の範囲第１項記載の感
   作ラテツクス。 ３ ラテツクス粒子の比重が0.9〜1.4である特許
   請求の範囲第１項記載の感作ラテツクス。 ４ 表面に加熱処理したヒトエリスロポエチンを
   担持したラテツクス粒子を含有するラテツクスに
   さらに安定剤を加えた特許請求の範囲第１項記載
   の感作ラテツクス。 ５ 安定剤がグリシンおよびデキストランである
   特許請求の範囲第４項記載の感作ラテツクス。 ６ 希釈液に対するグリシンおよびデキストラン
   の濃度が0.2〜２重量％および0.3〜３重量％であ
   る特許請求の範囲第５項記載の感作ラテツクス。