JPS633600B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素反応によるステロイド配糖体の
製造法に関するものである。 ［従来の技術］ ジギタリス、ケジギタリス、チヨウセンアサガ
オ等の薬用植物類に含まれているステロイド配糖
体は、種々の循環器疾患、殊にうつ血性不全症の
特効薬として重用されており、寿命の延長に伴な
つてその重要性は益々増大していくものと期待さ
れている。しかしこれら配糖体は一般に高毒性で
あり、薬用量と中毒量が極めて接近しているとい
う欠点に加え、蓄積性に富むという問題があり、
患者への投与に当たつては細心の注意を払わなけ
ればならない。この様なところから、前記配糖体
における部分構造を変え、有効性を維持しつつ毒
性のみを軽減しようという試みがなされており、
これらの研究の中から、配糖体における糖部分、
特にステロイド骨格（アグリコン）に直接結合す
る糖部分が薬理効果及び毒性に対して特に重要な
関係を有することが明らかにされた。その為前記
配糖体における糖部分の入れ換えが検討され、ア
グリコンたるステロイドに色々な糖類を結合させ
る研究が展開されている。しかし従来の方法はス
テロイド骨格に対して糖を直接反応させる純化学
的方法であり、反応条件の下で置換基類の脱離や
分解、或はその他の化学的変化を招くという危険
が大きく、色々なステロイド配糖体を自由に製造
できるという域には至つていない。 ［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者等はこの様な状況を憂慮し、ステロイ
ド骨格のアルコール性水酸基に対して色々な糖類
を自由に置換させることのできる方法を提供すべ
く種々研究を重ねた結果、β―アリールグリコシ
ドを糖の供与体とし、アスペルギルス・オリゼー
（Asperigillus orizae）由来のβ―グリコシダー
ゼを触媒として遊離ステロイド（１級、２級或は
３級のアルコール性水酸基を有するステロイド）
を反応させたところ、極めて緩和な条件で反応が
進行し、前記ステロイドをアグリコンとする様々
な配糖体が得られることを知り、更に検討を重ね
本発明を完成するに至つた。 ［問題点を解決する為の手段］ 本発明は、有機溶媒を含有する水溶液中で、ア
スペルギルス・オリゼー由来のβ―グリコシダー
ゼの存在下に、β―アリールグリコシドと、アル
コール性水酸基を有するステロイド化合物との反
応を行なわせる点に要旨を有するステロイド配糖
体の製造法である。 ［作用］ 本発明の反応を化学式によつて例示的に説明す
ると、 と表わすことができる。但し上記化学式における
グルコース等は本発明の一例を示すものに過ぎな
い。 まず一方の原料物質たるβ―アリールグリコシ
ドとは、アリール基と糖類がβ―グリコシド結合
したものであり、該アリール基としては、フエニ
ル基、ナフチル基、アントリル基、フエナントリ
ル基等が例示され、これらはアルキル基（例えば
メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル
基、ブチル基等の低級アルキル基）、ニトロ基、
ハロゲン、アルコキシ基（例えばメトキシ基、エ
トキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブ
トキシ基等の低級アルコキシ基）、アシル基（例
えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等
の低級アルカノイル基）、アシルオキシ基（例え
ばアセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ブ
チリルオキシ基等の低級アルカノイルオキシ基）
等を置換基として有することができる。 一方糖類としては、単糖類、二糖類、三糖類或
はその他のオリゴ糖が利用され、又炭素数につい
ても、六炭糖、五炭糖等の別を問うものではない
が、代表的なものを例示しておくと、グルコー
ス、ガラクトース、ラムノース、フコース、マル
トース、ラクトース、ゲンチオビオース等を挙げ
ることができる。 そして本発明の原料物質として用いられる前記
アリールグリコシドとは、上記の如く例示した糖
に対して同じく上記の如く例示したアリール基を
置換させたものであり、その組合わせは任意であ
るが、特に代表的なものを例示すると、フエニル
―β―Ｄ―ガラクトシド、フエニル―β―Ｄ―グ
ルコシド、トルイル―β―Ｄ―ガラクトシド等を
示すことができる。 他方の反応試剤である、遊離の水酸基を有する
ステロイド化合物としては、ステロイド骨格の３
位にβ―水酸基を有する天然ステリンや合成ステ
リンをはじめとして、任意の位置に１級、２級或
は３級の遊離水酸基を有するステロイド化合物が
利用される。該ステロイド化合物の選択範囲は極
めて広く、天然又は合成の如何を問うものではな
いことは前述の通りであるが、生理的乃至薬理的
作用面から分類される各種ステロイド、例えば前
述のステリンの他、ビタミンＤ、胆汁酸、男性ホ
ルモン、女性ホルモン、副腎皮質ホルモン、植物
心臓毒、ガマ毒、ステロイドサポニン、ステロイ
ドアルカロイド、トリメチルステロイド等の全て
が本発明の対象になる。 反応に用いられるβ―グリコシダーゼとして
は、上述したアスペルギルス・オリゼー由来のも
のである。一般に反応を有機溶媒の存在下に行な
う場合には、酵素の活性が若干抑制されるのであ
るが、上記酵素は水溶液中での酵素活性に対して
５％以上の相対活性を残留している。尚酵素の相
対活性が低いときには、酵素使用量を増やして補
う様にすることが望まれる。 上記反応試剤からなる反応は溶媒中で行なわれ
るがβ―グリコシダーゼ、並びにβ―アリールグ
リコシドは、いずれも一般に水溶性が高いので、
他方の反応試剤たるステロイド化合物が水溶性で
あるとき、例えばコハク酸ブレドニゾロン、デキ
サメタゾン硫酸エステル、デキサメタゾンリン酸
エステル、ベタメサゾンリン酸エステルなどを用
いるときは水溶液中で反応を行なうこともでき
る。尚ここに言う水溶液とは、単に水溶液である
場合の他、酸又は塩基によつてPHを調整したも
の、緩衝能のある物質を加えてPHを調整したも
の、或は適当な塩類を含むもの等を包含する。尚
PHの上記調整に当たつては、通常PH３〜９の中か
ら選択するが、アスペルギルス・オリゼー由来の
グリコシダーゼを用いる時はPH５という様に、酵
素に応じた最適のPHを選択しなければならない。 しかしながら上記水溶性ステロイド化合物以外
の一般ステロイド化合物は、例えばジトキシゲニ
ン（Gitoxigenin）の様に程度の差こそあれ水に
対して難溶性であるから、この場合は上記水溶液
に適当な有機溶媒（好ましくは親水性有機溶媒）
を加えることが必要である。該有機溶媒として
は、酢酸エチル等のアルキルエステル類；アセト
ンやメチルエチルケトン等のアルキルケトン類；
アセトニトリル；ジオキサン；ジメチルホルムア
ミド；ジメチルスルホキサイド；ジクロロメタン
やクロロホルム等のハロメタン類；ピリジンやピ
リミジン等の塩基；酢酸やプロピオン酸等の酸類
等を例示することができる。即ちステロイドの溶
解性を高めはするが、グリコシダーゼを失活させ
ず適度の活性を前記程度に維持するものであれ
ば、単独又は併用の如何を問わず自由に利用でき
る。尚有機溶媒の混合量は、親水性及び上記諸効
果を考慮して定めれば良く、（水―有機溶媒）混
合溶媒全量に対して５〜80重量％、好ましくは10
〜60重量％の範囲で配合する。 ステロイド化合物の溶解が不十分なときは、β
―アリールグリコシド及び酵素を前記水溶液とし
て準備すると共に、ステロイド化合物を有機溶媒
に溶解し、これらを２相系で反応させることが推
奨される。ここで用いられる溶媒として前記例示
の有機溶媒であつて配合比を大きくすることによ
つて２相となるものの他、ヘキサンやペンタン等
の鎖状炭化水素類；シクロヘキサンやシクロペン
タン等の環状炭化水素類；シクロヘキサノンやシ
クロペンタン等の環状ケトン類；クロルベンゼン
やニトロベンゼン等の芳香族溶媒が例示される。
これらについてもステロイド化合物を溶解し、且
つ酵素類の活性を前記程度に維持し得るという限
度において自由に使用できるが、水相と有機溶媒
相の混合比（Ｖ／Ｖ）は、（１：10）〜（10：１）
であることが望ましい。 反応温度やその他の条件については本発明を制
限するものではないが、一般的な条件を述べる
と、反応温度としては４〜50℃程度、反応時間と
しては５〜300分（時によれば24時間近く）程度
で反応を遂行させることが望ましい。 本発明で得られるステロイド配糖体は、公知物
質及び新規物質を含むが、夫々の生理的乃至薬理
的作用に基づき、医薬品として使用することがで
きる。 次に本発明を実施例によつて説明する。 ［実施例］ 実施例 １ フエニル―β―Ｄ―ガラクトシドとジトキシゲ
ニン（Gitoxigenin）よりジトキシゲニン―β
―ガラクトシド（3β―Ｏ―galactosyl―14，16
β―dihydroxy―5β―Card―20（22）―
enolide）の合成 フエニル―β―Ｄ―ガラクトシド1.28ｇ（５ｍ
mol）とジトキシゲニン0.50ｇ（1.28ｍ mol）
とを25mlのアセトニトリルと15mlの0.1Mリン酸
緩衝液（PH５）に懸濁し、さらに、アスペルギル
ス・オリゼーのβ―ガラクトシダーゼ360mgを
12mlのリン酸緩衝液（PH５）に溶かした液10ml
を加え、20℃で20分間インキユベート後沸とう浴
中に５分間置き、次いで濾過する。沈殿を洗浄
し、濾液と洗液を合してエバポレータで溶媒を除
去したのち水30mlを加え、この液よりクロロホ
ルム200ml数回にてジトキシゲニンを抽出する。
水層を濃縮し、セフアデツクスＧ―25を水飽和ｎ
―ブタノールで平衡化させたカラムにかけ、水飽
和ｎ―ブタノールで展開する。反応生成物の分画
を集め溶媒を留去する。残渣は、シリカゲルの中
圧カラムにかけ、クロロホルム100ml、次いでメ
タノール―クロロホルム混液で順次溶出する。反
応生成物の分画を集め、溶媒を留去する。残渣
は、シリカゲル薄層に展開する。溶媒は、クロロ
ホルム―メタノール混液である。反応生成物の分
画を集め、溶媒を留去し、目的物を得る。mp
218〜220℃、収量18.7mg（26％） 実施例 ２ フエニル―β―Ｄ―ガラクトシドと16β，17β
―エポキシ―17―α―ジギトキシゲニンより
16β，17β―エポキシ―17α―ジギトキシゲニン
―β―ガラクトシド（3β―Ｏ―β―galactosy
―14―hydroxy―16β，17β―epoxy―5β，17α
―Card―20（22）enolideの合成 フエニル―β―Ｄ―ガラクトシド1.28ｇと16β，
17β―エポキシ―17α―ジギトキシゲニン500mg
とを実施例１の条件で反応させる。ここのあとも
同様にゲニンの除去、セフアデツクスＧ―25カラ
ムクロマトグラフイー、シリカゲルカラムクロマ
トグラフイー、薄層クロマトグラフイーを行なつ
て精製する。mp 197〜199℃、収量16.1mg（2.3
％） 実施例 ３ 合成配糖体にNa⁺，K⁺―ATPase活性阻害効
果 ジギタリス配糖体の標的は、各種の細胞膜に存
在するNa⁺，K⁺―ATPaseであつて、特に心筋
細胞のATPaseを阻害することによつて、強心効
果をあらわすと言われている。この為、強心配糖
体のスクリーニングの手段として、Na⁺，K⁺―
ATPaseの阻害作用を調べることは、一般に受け
入れられている。本発明者らは、本発明において
合成した各種配糖体のNa⁺，K⁺―ATPase阻害
作用を検討し、これら物質が強心作用を有する可
能性を検討した。Na⁺，K⁺―ATPase活性は、
アーメド及びトーマスの方法［Ｋ・Ahmed and
B.S.Thmas J.Biol.Chem.246，103〜109（1971）］
を多少改良して測定した。阻害活性は、阻害剤濃
度を種々変えて得られる阻害曲線より50％阻害濃
度（I₅₀）を求め、これで表示した。結果を第１
表に示す。これらから明らかなように、合成した
配糖体は、そのゲニンとほぼ同程度のI₅₀を示し、
強心作用を保持している可能性が強く示唆され
た。

【表】 ［発明の効果］ 以上述べた如く本発明によれば、化学的方法で
は入手不可能である様なステロイド配糖体の製造
が可能となつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 有機溶媒を含有する水溶液中で、アスペルギ
   ルス・オリゼー由来のβ―グリコシダーゼの存在
   下に、β―アリールグリコシドと、アルコール性
   水酸基を有するステロイド化合物との反応を行な
   わせることを特徴とするステロイド配糖体の製造
   法。