JPS633792A - 改良された融合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は改良された融合生成物に間する。

［先行技術］ ケーラー（にｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）は１９７５年、免疫化されたハツカネズミのび
臓細胞にハツカネズミの骨髄腫（ミエロマ）細胞を初め
て融合させた［Ｎａｔｕｒｅ、　２５６巻（１９７５年
）４９５−４９７頁］。

これによって、均質な（いわゆる「モノクローナル」の
）抗体をつくる細胞系を得ることが可能なことが実証さ
れた。この未発達の研究以来、種々のハイブリッド細胞
（ハイブリドーマと呼ばれる）を製造する多くの努力が
なされ、またこれらのハイブリドーマによってつくられ
る抗体を種々の科学研究や医学上の診断目的に使用する
努力がなされてきた。ハイブリドーマをつくる方法は、
−般に以下の段階からなる。

（ａ）例えばハツカネズミ又はラットを免疫原性薬剤で
免疫化する。免疫化手順は、有用な量の適当に準備され
たひ臓細胞をつくるような手順とする。

（ｂ）免疫化された動物からひ臓を除き、適当な媒体中
のひ臓の懸濁液をつくる。

（Ｃ）適当な融合プロモーターの存在下に適当な細胞系
からの骨髄腫細胞に、懸濁したひ臓細胞を融合させる。

融合プロモーターはセンダイ・ウィルス、化学的融金属
、例えば約１０００〜約４０００の平均分子量をもつポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）（市販のＰＥＧ　１０
００など）でありうる。融合の実施に有用なもう一つの
手法は、ジンマーマン　（Ｚｉｍｍｅｒ−ｍａｎｎ）及
びショイリヒ（Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ）、　Ｐｌａｎｔａ
　１５１巻（１９８１年＞　２６−３２頁；ビーンケン
　（Ｖｉｅｎｋｅｎ）ら、Ｐｌａｎｔａ　１５７巻（１
９８３年）３３１頁；及びジエイコブ（Ｊａｃｏｂ）ら
、５ｂｕｄ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　９４巻（１９８３年
）９９頁、に利用されたような既知方法による電気的融
合である。使用の骨髄腫細胞系は、ハイブリッド細胞が
生存する一方で、選択培地中で未融合骨髄腫細胞が生存
しないように、いわゆる「薬剤耐性型」のものが好まし
い。最も一般的な部類は８−７ザグアニン耐性細胞系で
、これは酵素ハイポキサンチングアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼを欠き、従ってＨＡＴ（ハイポキサ
ンチン、アミノプテリン、及びチミジン）媒地に支持さ
れない。

（ｄ）未融合骨髄Ｍｉ細胞を支持しない選択培地中の未
融合ひ臓細胞、未融合骨髄腫細胞及び融合細胞の混合物
を、未融合細胞を死滅させるさせるのに十分な期間（約
１週間）、別個の容器に希釈して培養する。希釈は限定
的な形のものであって、希釈容量はある数の細胞（例え
ば微量滴定板の６穴（ウェル）の細胞数）を単離するた
めに統計的に計算されている。選択培地中で未融合骨髄
腫細胞は死滅する。未融合ひ臓細胞は悪性ではないから
、限定的な世代数しかない、このため、ある期間（約１
週間）後、これらのび臓細胞は増殖しなくなる。他方、
融合細胞は親骨髄腫の悪性の性質と、親ひ臓細胞の選択
培地中で生存する能力とをもっているため、増殖を続け
る。

（ｅ）ハイブリドーマを含有する各容器（穴）中の上澄
みを検査し、もともと使用した抗原に対して指向性のあ
る抗体がいるかどうかを見る。

（ｆ）所望の抗体を生産するハイブリドーマを、（限定
的希釈などによって）選択し、クローン化する。

所望のハイブリドーマが選択されクローン化されたら、
生ずる抗体は二通りのいずれかで生産できる。最も純粋
なモノクローナル抗体は、所望のハイブリドーマを適当
な媒地中で適当な期間に生体外で培養し、続いて所望の
抗体を上澄み液から回収することによって生産される。

適当な媒体及び適当な培養期間の長さは既知であり、容
易に決定される。この生体外手法は、本質的に他の特異
的抗ヒト免疫グロブリンを含まない本質的に単一特異的
なモノクローナル抗体を生産する。媒地は異種発生性血
清（例えば牛胎児血清）を含有するため、少量の池の免
疫グロブリンが存在する。しかし、モノクローナル抗体
の濃度は約５０μｇ／ｍ　Ｉ程度であるので、この生体
外方法は何かの目的に十分な量又は濃度の抗体をつくれ
ないこともある。

純度はやや劣るがもっと高濃度のモノクローナル抗体を
つくるには、所望のハイブリドーマをハッカネズミ、好
ましくは同質遺伝子型又は半同質遺伝子型のハツカネズ
ミに注射できる。ハイブリドーマは適当な培養期間後、
抗体生産性腫瘍の形成をもたらす。その結果、ホストハ
ツカネズミの血流及び腹膜浸出液（腹水）中に高濃度（
約５−２０ｏ＋８／ｎ＋Ｉ）の所望抗体ができる。

［発明が解決しようとする問題点］ この方法は文献中に広く明らかにされている。

同法は特定的かつ重大な欠点をもっている。ＰＥＧは純
粋な形で、所望の分子量範囲で入手できるため、またセ
ンダイウィルスに比べて取り扱いが容易なため、融合層
として次第に受は入れられるようになった。しかし、Ｐ
ＥＧにとって有効な濃度範囲は非常に狭い、最適濃度範
囲は５０±５％（ｗ／ｖ）である。この濃度でＰＥＧは
融合しようとする全細胞に対して、また融合ハイブリッ
ド細胞に対して著しい細胞毒性効果を示す。その結果生
きたハイブリッド細胞の数が減少する。他方、最適水準
を下回る濃度のＰＥＧを使用すると、中程度の細胞毒性
のみが観察されるが、融合効率が低く、そのためハイブ
リドーマの形成率も低い。センダイウィルスとは対照的
に、ＰＥＧのような既知の化学的融合環や電気的融合は
、融合させようとする細胞の凝集を起こさないため、細
胞膜が融合にとって効率的な近接度にない。

［問題点を解決する手段］ 従って、本発明の一つの目的は、有用な生成物を生産で
きる、哺乳類細胞又は植物細胞、例えば免疫化されたひ
臓細胞を、連続的に増殖できる適当な融合相手、例えば
骨髄！ｉ■胞又は他の相手になる細胞と、融合しようと
する細胞の凝集を可能とする上に議論した方法に従って
融合させることによって融合細胞をつくる方法を開発す
ることにある。

発明のもう一つの目的は、ＰＥＧ、リソレシチン、デキ
ストラン、ＤＭＳＯ，ポリビニルアルコール、ポリ−し
一オルニチン、及び硝酸ナトリウムのような有用である
ことが知られた塩類、又はそれらの組合わせなどの慣用
の化学的融合環の細胞毒性効果を低下させることにある
。融合過程でこれが所望のハイブリッド細胞の収量を高
める結果となる。

もう一つの目的は、電気的融合手法で融合させるための
凝集細胞をつくることにある。

これらとその他の目的は、以下の説明から明らかになろ
う。本発明はその一般的概念において、先ず融合させよ
うとする細胞を凝集層の作用によって凝集させることに
よる融合ハイブリッド細胞の製法に間する。より詳しく
は、本発明は有用な生成物を生産できる哺乳類細胞を、
連続的に増殖できる哺乳類細胞と選択的条件下に融合さ
せることによって、融合ハイブリッド細胞をつくる方法
の改良に間し、この方法は、融合させようとする細胞混
合物を有効量の凝集層と接触させ、次に凝集細胞を融合
させることからなる。

もう一つの面で、本発明はその一般的概念において、有
用な生成物を生産できるハイブリッド細胞をつくるため
の植物細胞の凝集と融合に間する。

従って本発明は更に融合ハイブリッド細胞の製法に関し
ており、この製法は有用な生成物を生産できる植物細胞
及び連続的に増殖できる植物細胞を有効量の凝集層と接
触させ、次に凝集細胞を融合させることからなる。

「凝集層」は、融合させようとする細胞を凝集させるこ
とができる任意の薬剤を記述するために使用される用語
である。すべての凝集層が包含されるが、典型的な凝集
層はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリン
Ａ及び落花生凝集素である。大発明による好ましい凝集
層はＰＨＡでみる。

凝集層濃度を調整して、細胞毒性が見られず、凝集が有
意の程度に起こるようにすべきである。

凝集層Ｐ１（Ａの適当な範囲は２５−４００μ８／１で
ある。

好＊　Ｌ／　イＰＨＡｉ！ＬＩ　ｉ１約１５０−２００
μｓ／ｍｌテ＆　’０．２００μｇ／ｌが最も好ましい
。他の凝集層の適当な濃度はこの技術で周知の標準的手
法によって容易に決定できる。凝集処理は生理学的温度
、例えば３７℃で十分な時間、例えば５−１５分間実施
される。十分な凝集が起きた後、細胞を融合にかける。

一つのＢ掻で、慣用の化学的融金属、好ましくはＰＥＧ
を添加し、混合物を生理的条件下に培養して、凝集細胞
の融合を行なわせる。ＰＥＧを使用する時は、濃度は約
３３０−５０Ｘ（／ｖ）である、　ＰＥＧの好ましい濃
度は約４０±５１（ｗ／ｖ）である。最適融合時間は約
１分である。それより長い時間を使用できるが、特に２
分を超えた時、時間の増加につれて細胞毒性が高まる危
険がある。もう一つの態様で、凝集細胞の融合は電気的
融合によって行なわれる。

本発明の新規な融合手法は、先行技術の結果に比べて著
しく増加した生育可能なハイブリッド細胞の形成をもた
らした。

用語「有用な生成物」は、融合させようとする哺乳類細
胞又は植物細胞がつくりだせるすべての生成物を包含し
ている。典型的な例は生物学的に活性のあるタンパク類
、グリコタンパク類、ポリペプチド類、酵素類、及びア
ルカロイド、ステロイド、ジオスゲニン、アントラキノ
ン、ピレトリン、精油、多糖類、強心配糖体、香水及び
化粧品成分のような非タンパク性化合物類である。

融合させようとする細胞から生産できる生物学的に活性
のある物質の典型的な例を、以下の第１−５表に示す。

１土１ アルカロイド類　　　　　殺虫剤 アレルゲン類　　　　　　ラテックス アントラキノン類　　　　脂質 抗白血病薬　　　　　　　ナフトキノン類抗腫瘍剤　　
　　　　　　核酸 抗ウィルス剤　　　　　　ヌクレオチド類芳香剤　　　
　　　　　　油類 ベンゾキノン類　　　　　アヘン剤 炭水化物（多糖類を含む）有機酸類 強心配糖体　　　　　　　ペプチド類 チ＋ルコン類　　　　　　香水 ジアンスレン類　　　　　フェノール類酵素　　　　　
　　　　　顔料 酵素阻害剤　　　　　　　植物成長調整剤フラバノイド
、フラボン類　タンパク類凰味料（甘み料を含む）　　
ステロイド及び誘導体フルラックマリン類　　　ｗ類 ホルモン類　　　　　　　タニス テルペン、テルペノイ ド類 ビタミン類 イン９】リン　　　　　　　　ラン＋７−ルハンス島細
胞　　抗糖尿病薬り１カコ゛ン　　　　　　　ラシケー
Ｓハシス島細胞　　インシュリン生産ｙＪ！２ソマトス
タチシ　　　　　　　ランケールハンス島細胞　　イン
９】リン生産調整ＡＣＴＨ下垂体前葉細胞　抗炎症 黄体形成ホルモン　下垂体細胞　　　生殖調整卵胞刺激
本ｎ＋ン　　下垂体細胞　　　生殖調整成長ホルモン　
　　下垂体細胞　　　成長促進黄体形成ホルモン　下垂
体細胞　　　受精力の調整放出ホルモン ７”［＋５クチン　　　下垂体細胞　　　乳生産の刺激
７０４Ｏｔカ（ＴＳＨ）　　下垂体細胞　　　甲状腺低
下胸腺本ｉｔン　　　胸腺細胞　　　　免疫変調因子ｘ
Ｑｌａ＊”４ｘｆン　　　腎臓　　　　　　赤血球形成
刺激表皮成長因子　顎下線　　　　　細胞増殖刺激と胃
酸分泌の抑制 ｔ４シトシン　　　　下垂体後葉　　　子宮収縮と乳生
産の制御 ハーソフ０レフシン　　　　　下垂体後葉　　　　　　
抗利尿１μシエシケフアリン　　　副腎クロム親和　鎮
痛性細胞 心房ｔ　）　１７ウム排泄心臓細胞　　　　血管拡張剤
増加因子（ＡＮＦ） β−１シト−ルフィン　脳、下垂体　　　鎮痛４：ｔヒ
ヒ”ｔ　　　　　顆粒膜細胞　　　受精調節（卵巣） ｈルシトニン　　　　甲状腺細胞　　　骨Ｃａ”＋沈着
増加傍甲状腺ホルモン　傍甲吠腺（主細胞）骨吸収の発
生イン９−０４４シー１　　　　大食細胞　　　　　　
　　抗腫瘍インターロイ鳥ンー２　　Ｔヘルパー細胞　
抗腫瘍インターロイ壽ンー３　　Ｔヘルパー細胞　幹細
胞増殖α　−インターフェロン　　　白血球　　　　　
　　　　　抗ウィルス、　抗腫瘍コ０ニー刺激因子２Ｔ
ｍＦ＆ＭＱと顆粒球増殖Ｃ３Ｆ−１線維芽細胞　　　Ｍ
Ｑ成長と活性化８ｍ胞成長因千Ｔヘルパー細胞　免疫不
全腫瘍壊死因子　大食細胞　　　　抗腫瘍γ　−インタ
ーフェロン　　　大食細胞　　　　　　　　抗ウィルス
、　抗腫瘍Ｔヘルパー細胞 β　−インターフェロン　　　線維芽細胞　　　　　　
抗ウィルス、　抗腫瘍大食細胞活性　大食細胞　　　　
抗腫瘍、抗ウイルス化因子 ７ン’ｆｉケ覧ン　　癌細胞　　　　　傷治癒、血管新
生 ステ０イ）”類　　　副腎皮質　　　　生殖神経成長因
子　唾液腺細胞　　　神経細胞再生血小板由来の　（エ
ンドチン血　僅の治癒成長因子　　　小板） ｊ５刀細胞刺激　松果体細胞　　　色素形成の制御ホル
モン及びメラトニン 気≦Ｌ表 化８塁　　　種１文夏」Ｌ廻 薬品　　　　アルカロイド、ステロイド、アントラキノ
ン 酵素　　　　プロテアーゼ（例えば、パパイン）ラテッ
クス　イソプレノイドく例えばゴム）ワックス　　ワッ
クスエステル（例えばジョジョバ） 顔料　　　　スティン及び染料 油　　　　　脂肪酸（例えば種油） 農薬　　　　殺虫剤（例えばピレトリン）化粧品材料　
精油（例えばモノテルペン）食品添加物　風味化合物、
非栄養性甘味料（例えばタウマチン） ガム　　　　多糖類（例えばアラビアゴム）適」Ｌ表 鼠ｌ」口重１　植」Ｅ種　　　　　　　　　産１１途薬
−迅 ］チーイン　　　　　　　ハ０ハ０へ゛ルΦソムニフＩ
ルム　　　　　　鎮痛く？ルカａイトー）　　　　（Ｐ
ａｐａｖｅｒ　　ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）シ゛オスケ゛
ニン　　　　シーオスコリア＠テ゛ルトイシ”７　　　
　　抗受精剤（ステ０イト−）　　　　　（Ｄｉｏｓｃ
ｏｒｅａ　　ｄｅｌｔｏｉｄｉａ）キニン　　　　　　
　　　夷シチョナ命レジーエリアす　　　　　　　　抗
マラリア（アルカロイド）　　　　（Ｃｉｎｃｈｏｎａ
　　ＩｅｄＨｅｒｉａｎａ）シ“コ］シン　　　　　シ
ーキータリス争うナタ　　　　　　　　　　強心（強心
配糖体）（ＤｉＨｉｔａｌｉｓ　Ｉａｎａｔａ）１３本
９ラミン　　　　　ターフラ・ストラモニウム　　　　
　　　　　抗高血圧（アルカロイド−）　　　　（Ｄａ
ｔｕｒａ　　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）ヒーンクリスチン
　　　　力９ランブス・ａセーウス　　　　　　　　　
抗白血病（１ルカ０イド）　　　　（Ｃａｔｈａｒａｎ
ｔｈｕｓ　　ｒｏｓｅｕｓ）農」褒 七″ムトリン　　　　　　クリ夛ンセマム・冬ネラリ１
フオリウム　　　殺虫剤（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕａ
＋ ｃｉｎｅｒａｒｉａｅｆｏｌ　ｉｕｍ）食」Ｌ二」【料 Ａニン　　　　　　　　　Ａフチ３す弓シーエリ１ｆ　
　　　　　　　苦み剤（アルカロイド−）　　　　（Ｃ
ｉｎｃｈｏｎａ　　Ｉｅｄｇｅｒｉａｎａ）タウマチン
　　　　　　　タウマド〕ツカスータ゛二１リ　　　　
　　　非栄養性（デ＋ルコン）　　　　　　（Ｔｈａｕ
ｉａｔｏｃｏｃｃｕｓ　　　　　　　甘味料ｄａｎｉｅ
ｌｌｉ） シー・ヤスミン　　　　　　シーヤスミナム種香水シー
オスケ゛ニンか　　抗受精剤　　　　シ“オスフリ７拳
テ″ルチオテーアらのステロイド　　　　　　　　　　
　　　（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　　ｄｅｌｔｉｏｄｅａ）
］チーイン　　　　　　　鎮痛　　　　　　　　　ハ０
ハ０へ゛ルΦソムニフエルム（Ｐａｐａｖｅｒ　　ｓｏ
ｍｎｉｆｏｒｕｍ）７ト０１シ　　　　　　抗〕リシ作
用　　　７ト０ノビ◆ヘーラトーンナ（Ａｔｒｏｐａ　
　ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）トセルヒ０ン　　　　　　抗
高血圧　　　　ラウウォルフィ７・セルへ０シチナ（Ｒ
ａｕｗｏｌｆｉａ　　ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）とョスシ
１ミシ　　　　　抗コリン作用　　　　ヒコスシ７ムス
？ニジーエール（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　　ｎｉｇｅｒ
）シーコ゛鳥シン　　　　　強心作用　　　　シ゛１゛
タリス・ラナタスコ本０ラミシ　　　　　抗コリシ作用
　　　　ターフラ・メタル（Ｄａｔｕｒａ　　ｍｅｔｅ
ｌ） シ”４”）４シン　　　　心臓血管　　　　シ］゛タリ
ス・フ″ルフ＠Ｌ７（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ　　ｐｕｒｐ
ｕｒｅａ）七〇Ｄｈルヒ０シ　　　　コリン作用　　　
　　　ヒ加７Ｊルフ０ス・シ゛ヤ本゛ナシシ゛（Ｐｉｌ
ｏｃａｒｐｕｓ　　ｊａｂｏｎａｎｄｉ）キニシ゛ン　
　　　　　　抗マラリア　　　　　　鳥シチョナ◆Ｌ：
ｌ−ｘす？す（Ｃｉｎｃｈｏｎａ　　Ｉｅｄｇｅｒｉａ
ｎａ）哺乳類及び植物起源の真核細胞を使用でき、植物
細胞はプロトプラストの形のものが好ましい。

プロトプラスト形成は当業者に周知である。

更に、ステロイドホルモンのようなタンパク以外の生物
活性物質を生産する細胞を使用できる。

植物細胞の場合、キニン、レセルピン、コカイン、アト
ロビン、スコポラミン、ジギタリス、モルヒネ様物質の
ようなアルカロイド類を生産する細胞を使用できる。

更に、ムスコン、シベトン、ゲラニオール、及び香水業
界に有用な他のテルペン様物質なとの精油及び香料を生
産する細胞を使用できる。

融合相手として、モして哺乳類及び植物細胞の永続化の
ために使用される継続的に増殖する（永久的な）細胞の
例は、ハッカネズミ、ラット又はヒト起源などの種々の
起源の骨髄腫細胞である。

永久的に成長する細胞の典型的な例は腫瘍細胞であり、
例えば骨髄腫細胞、ＨｅＬａ細胞を含めたヒトの腫瘍形
成から誘導される細胞、咽頭がんから誘導されろ）ＩＥ
　ｐ−２、及び鼻−咽頭がん細胞、リンパ芽球様細胞、
エプスタイン：バーウィルス形質転換細胞、高度増殖す
る胎児細胞、肝がん細胞、腎臓がん細胞から誘導される
にＢである。本発明に特に重要なものは、ねずみ及びヒ
ト骨髄腫細胞を含めた薬剤耐性骨髄腫細胞である。使用
骨髄腫細胞がいわゆる「非分泌」型であるのが一般的に
好ましいが、分泌型も使用できる。

連続成長する典型的な植物細胞は腫瘍性植物えい瘤細胞
、すなわちアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
の毒性菌株によって形質転換された植物細胞、及びその
プロトプラストである。

融合細胞は、慣用の炭素、窒素及びミネラル塩類の給源
を含有する慣用的な栄養培地中で生育又は増殖する。増
殖は好気的条件下に、すなわち９５２酸素と５χ炭酸ガ
スとの混合物の存在下に実施される。増殖とすべての前
段階が無菌条件下に実施されることは自明である。より
多量のハイブリッド細胞は、慣用方法により、同質遺伝
子型又は無胸腺型のヌードマウスで生産できる。細胞を
腹水又は腫蕩塊の形で取入れ、慣用の細胞培養基として
増殖させることができる。より多量の所望生成物をつく
るために、このような細胞培養基を誘発できる。典型的
な例で、ランゲルハンス島細胞に由来するハイブリッド
細胞をグルコースで誘発し、インシュリンの生成量を高
めている。

同様な方法で、ウロキナーゼを生産するハイブリッド細
胞にグリシンを添加することにより、ウロキナーゼの生
産を刺激できる。

ハイブリッド細胞で生産される有用生成物の単離は、任
意慣用の方法で、例えばハイブリッド細胞から栄養培地
を除くことによって、また抽出、向流分配、親和性クロ
マトグラフィ、沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグ
ラフィ、）ＩＰＬＣ等、及びそれらの組合わせによって
実施される。

生成物は一般に周知のもので確認されており、従ってそ
の用途も周知である。

本発明は以下の実施例に詳細に説明されている。

実施例１ バルブ（８ａｌｂ）／ｃマウスの２個の牌臓からのｌＸ
ｌ０６個の牌臓細胞を１ｘｌＯ？個のマウスの骨髄！！
細胞（Ｆａｘ−ＮＹ）と混合した。細胞集団を１５１の
試験管中で無菌バンク液で１回洗浄しそして遠心分離し
た。

こうして得られたペレットを残った溶液中に穏やかに再
懸濁しく渦）　、０．２１１（７）ＰＨＡ液（２００μ
ｓ／ｍｌ）を加えそして３７℃で１０分間培養した。培
養の終りに試験管に　０．８１のポリエチレングリコー
ル５０重量／容量Ｘ　（平均分−７−１ｉ　１０００）
溶渣を加え最終濃度４０％ポリエチレングリコールを得
た。１分培養後に１０１の完全培地（１ｏｚ胎児牛血清
のＭＥＭ）を加え更に　ＣＯ２培養器中で３７℃で１時
間培養した。

培養の終りに細胞を遠心分離しモしてＰ）ＩＡ及びポリ
エチレングリコールを含む培養基を吸出した。

ペレットを２０１の）ＩＡＴ培地に懸濁した。こうして
得られた細胞懸濁液を０．０２ｎ＋Ｉ／ウエルて９６ウ
エル板（１０平板）に分配しそして平板をＣＯ２培養器
で３７℃で培養した。ＨＡＴ培地を週に１度取り替えた
。

約２週間で生育しているハイブリッド細胞が顕微鏡下で
ウェルのうち幾つかに観察出来た。

実施例２ 実施例１０手順に従って、米国特許第４２７１１４５号
にワンス及びツラウスキー・ジュニアによって開示され
た方法によって、予めＢ型肝炎ウィルスで免疫性を付与
されたバルブ（Ｂａｌｂ）／ｃマウスの膵臓細胞を用い
た。ハイブリッド細胞が単離されそれはＢ型肝炎ウィル
スの抗原決定基に対するモノクローナル抗体を作った。

実施例３ コリネバクテリウムパルビュウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｎ＋　ｐａｒｖｕａ）で処理して得られたマ
ウスから得られた活性化膜腔内大食細胞（マクロファー
ジ）を実施例１の手順に従ってマウスの骨髄腫細胞と融
合させた。得られたハイブリッド細胞をインターロイキ
ンＩ、γ・インターフェロン、腫瘍壊死因子、及び大食
細胞活性化因子についてスクリーニングした。

実施例４ ハツカネズミのび臓から得られるＴリンパ球を潅合リン
パ球反応によって活性化し、次いで実施例１に記載のと
おりに融合させる。得られるハイブリッド細胞をインタ
ーロイキン２，３及びＢ細胞成長因子についてスクリー
ニングする。

実施例５ 下垂体からの細胞を実施例１に記載のとおりに融合させ
、得られるハイブリッド細胞を成長ホルモン及びプロラ
クチン利用ホルモンについてスクリーニングする。

実施例６ 植物えい瘤腫瘍（タバコ苗でアグロバクテリウム・ツメ
ファシェンス毒性菌株によって誘発したもの）からのプ
ロトプラストを、実施例１の手順により、ラウウォルフ
ィア・サーペンチナから得られるプロトプラストと融合
させ、急激に分裂するハイブリッド細胞を確立された手
順によって抽出すると、レセルピンが得られる。

実施例７ タバコ苗の植物えい瘤腫瘍からのプロトプラストを、実
施例１の手順により、ジギタリス・ブルブレアから得ら
れるプロトプラストと融合させ、こうして得られるハイ
ブリッド細胞を抽出するとジギタリス・グリコシド混合
物が得られる。

実施例８ タバコ苗の植物えい瘤ｍ瘍のプロトプラストを、実施例
１の手順により、アトロバ・ベラドンナから得られるプ
ロトプラストと融合させ、こうして得られるハイブリッ
ド細胞を抽出すると、アトロビンが得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有益な生成物を製造可能な哺乳動物の細胞と連続増
   殖可能な哺乳動物の細胞とを、又は有益な生成物を製造
   可能な植物細胞と連続増殖可能な植物細胞とを、選ばれ
   た条件の下で融合してハイブリッド細胞を製造する方法
   に於いて、融合しようとする細胞の混合物を凝集原の有
   効量と接触させ、その後凝集反応した細胞を融合させる
   ことからなる方法。 ２、有益な生成物を製造可能な哺乳動物の細胞と連続増
   殖可能な哺乳動物の細胞とを選ばれた条件の下で融合し
   てハイブリッド細胞を製造する方法に於いて、融合しよ
   うとする細胞の混合物を凝集原の有効量と接触させ、そ
   の後凝集反応した細胞を融合させることからなる特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ３、有益な生成物を製造可能な植物細胞および連続増殖
   可能な植物細胞とを凝集原の有効量と接触させその後凝
   集反応した細胞を融合することからなる融合ハイブリッ
   ド細胞を製造する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、凝集原がフィトヘマグルチニンであることを特徴と
   する特許請求の範囲第２項又は第３項に記載の方法。 ５、融合が化学融合によって実施されることを特徴とす
   る特許請求の範囲第２項又は第３項に記載の方法。 ６、融合が電気融合によって実施されることを特徴とす
   る特許請求の範囲第２項又は第３項に記載の方法。 ７、化学融合原が約１０００から約４０００の範囲内の
   平均分子量を有するポリエチレングリコールであること
   を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ８、有益な生成物を製造可能な哺乳動物の細胞と連続増
   殖可能な哺乳動物の細胞とを、又は有益な生成物を製造
   可能な植物細胞と連続増殖可能な植物細胞とを、選ばれ
   た条件の下で融合してハイブリッド細胞を製造する方法
   に於いて、融合しようとする細胞の混合物を凝集原の有
   効量と接触させ、その後凝集反応した細胞を融合させる
   ことからなる方法によって製造された融合されたハイブ
   リッド細胞。