JPS6348452A - クロマトグラフイ−用吸着担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 倉呈上皇肌■立互 本発明は、アフィニティークロマトグラフィーに利用す
ることのできるクロマトグラフィー用吸着担体に関する
。

従米鬼及専 クロマトグラフィー技術の１つとして、アフィニティー
クロマトグラフィーは互いに特異的に相互作用を及ぼし
合う物質対の親和性を利用して分離・精製を行なうもの
であり、例えば生体物質をその生物学的特性即ち分子上
のある特定の化学構造を識別して精製する場合に有用で
ある。

アフィニティークロマトグラフィー用吸着担体（アフィ
ニティーゲル）は、例えば不溶性の担体（マトリックス
）に結合基（スペーサー）を結合させて得られる活性支
持体の前記スペーサーにリガンドを結合させたものであ
り、このリガンドと互いに相互作用を及ぼし合う物質の
組合せを選択して吸着操作を行なう。

リガンドの１つとして、レクチンはある一定の構造の糖
と特異的に結合するという特性をもつ一種の糖結合蛋白
であるが、近年細胞表面の糖蛋白質あるいは糖脂質が細
胞の自他認識や細胞間情報伝達に重要な役割を果すこと
が分りつつありレクチンをリガンドとする吸着担体がこ
れらの研究の手段の一つとして盛んに用いられている。

例えばレクチンをリガンドとし、糖を吸着目的物質とす
るようなアフィニティーク口マトグラフイーによる分離
・精製や分析において、前記アフィニティークロマトグ
ラフィー用吸着担体の主構成分である活性支持体に望ま
れる性質としては、非特異的吸着が少ないこと、高い多
孔性を有すること、リガンドの結合が容易であり固定化
可能容量が大きいこと、化学的に安定でｐＨ域、塩濃度
、温度の広範な条件下で十分安定であり体積変化がない
こと、十分な機械的強度と安定性を有し流動特性が良い
こと、生物学的汚染に耐えること、などが挙げられる。

従来よりアフィニティークロマトグラフィー用吸着担体
の基材として用いられているセルロース、デキストラン
、ポリアクリルアミド、アガロース等は、必ずしもこれ
ら望まれる性質を具有していない、とりわけ、硬さが不
足した所謂ソフトゲルであるため流動特性が悪く、分離
特性が良くないという重大な欠陥を有し、また寿命も短
い。

更に、近年用いられているシリカビーズは、硬さの点で
は満足できるものの、アルカリ性条件下では使用出来な
いため、分離条件や溶出・洗浄の条件の選択に大きな制
約が加わるという問題点を有していた。

■が”決しようとするＷ点 本発明の目的は、前記従来のクロマトグラフィー用吸着
担体の欠点を克服して、アフィニティークロマトグラフ
ィー用吸着担体に望まれる前述した諸性質を十全に具有
するクロマトグラフィー用吸着担体を提供することにあ
る。

口、占をＷ′するための 本発明によって上記目的を達成し得るクロマトグラフィ
ー用吸着担体が提供される。

即ち、本発明は、キトサン多孔性ビーズであって、該キ
トサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基に、また
はキトサン多孔性ビーズを架橋処理したものであって、
該キトサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基及び
／または架橋処理剤に基くアミノ基に結合基を介して共
有結合により結合したレクチンを含有するキトサン多孔
性ビーズから成ることを特徴とするクロマトグラフィー
用吸着担体に関する。

以下、本発明のクロマトグラフィー用吸着担体について
説明する。

本発明に係るキトサン多孔性ビーズは、甲殻類や昆虫類
などの甲皮に含まれるキチンを脱アセチル化処理して得
られるポリグルコサミンより成るものであり、耐酸性を
持たせる為、二官能性試薬、例えばジカルボン酸および
その誘導体、ジアルデヒド、ジイソシアナート等を用い
て架橋処理を施したものも製造されており、例えば粒径
０．１〜３．０鶴、孔径５００〜３０００人の多孔性ビ
ーズとして入手が可能である。このキトサン多孔性ビー
ズは、一般に数μ〜数数１０上モル当量ｇのグルコサミ
ンに基くアミノ基または架橋処理を施したものについて
は架橋処理剤に基くものも含めてアミノ基を有しており
、これらのアミノ基はアルカンジカルボン酸無水物を作
用させることにより、カルボキシル基を有する活性支持
基に変換することができる。

反応の溶媒としては通常水が用いられるが、その他テト
ラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、酢酸な
どのカルボン酸類、ピリジンなども用いられる。また、
特に触媒は用いないでもよいが、塩酸、硫酸などの酸や
、水酸化ナトリウムや炭酸カリウムなどのアルカリの添
加により反応液のｐｔ＋を調整することもできる。

反応に用いられるアルカンジカルボン酸無水物としては
、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水
物、ピメリン酸無水物、スペリン酸、無水物、アゼライ
ン酸無水物、セバシン酸無水物、１．１０−デカンジカ
ルボン酸無水物、１，１２−ドデカンジカルボン酸無水
物、１，１４−テトラデカンジカルボン酸無水物などを
例示することができる。

反応条件については必ずしも制限はないが、−般に次の
ような条件を選択して反応を行なうのが好ましい。

キトサン多孔質ビーズの重ｉｔ　（ａ）とアルカンジカ
ルボン酸無水物の重量Ｃｂ）の比； ａ　：　ｂ＝１　：０．０５〜ＩＯ１ より好ましくは、 ａ　：　ｂ−１：０．１〜３、 反応温度：０〜１５０℃、より好ましくは室温〜１００
℃ 反応時間：１〜６０時間、より好ましくは１〜３０時間
。

反応圧カニ常圧〜ｌＱａｔｍ、より好ましくは常圧。

反応後の後処理についても特別な要件は無く、濾別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

以上により得られたカルボキシル基を有するキトサン多
孔性ビーズは、次いでモノカルボン酸無水物またはハロ
ゲン化アシルを作用させることにより、残余のアミノ基
をアシル化することができる。

このときの反応の条件は、前述のアルカンジカルボン酸
無水物の場合と同様にして行うことができるが、アシル
化剤としてハロゲン化アシルを用いる場合は溶媒として
は水辺外のものを用いた方がよく、また触媒としてはア
ルカリが好ましい。

反応に用いられるモノカルボン酸無水物とじては、無水
酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸などが例示され、ま
たハロゲン化アシルとしては、塩化アセチル、臭化アセ
チル、塩化プロピオニル、塩化ブチリルなどを例示する
ことができる。

カルボキシル基にレクチンを共有結合させるに際しては
、適宜縮合剤や反応試薬などを用いて適当な溶媒下で行
なうことができる。縮合剤や反応試薬としては、例えば
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ジシクロへキシルカル
ボジイミド、または１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド等々を例示することがで
きる。また溶媒としては通常水が用いられるが必要に応
じてリン酸や酢酸緩衝液として用いることもでき、また
塩化ナトリウムなどの無機塩類を添加して用いることも
可能である。

結合されるレクチンの種類については特に制限は無いが
、例えばコンカナバリンＡ、　　トウアズキレクチン、
小麦胚芽レクチン、ヒママメレクチン、ダイズレクチン
、ハリエニシダレクチン、インゲンマメレクチン、ミヤ
コグサレクチン、バンプリアマメレクチン、レンズマメ
レクチン、エントウマメレクチン、ビーナツツレクチン
等の植物レクチンやカブトガニレクチン、ウナギレクチ
ン、カタツムリレクチン等の動物レクチンなどを例示す
ることができる。

レクチンとの反応条件については必ずしも制限は無いが
、一般に次のような範囲で行なうことが適当である。

カルボキシル基を結合させた本発明に係るキ・トサン多
孔賞ビーズとレクチルの重量比：　１　：　０．０３〜
０．３、好ましくは１：０．０５〜０．２；反応温度：
０℃〜室温、好ましくは４℃〜室温；反応時間：１ニア
２時間、好ましくは２〜１２時間。

反応後の後処理についても特別な要件は無く、濾別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

溌ｙ坏と九栗 本発明により提供されるクロマトグラフィー用吸着担体
は、前述のアフィニティークロマトグラフィー用吸着担
体として望まれる性質を具備する基剤を用い、これに適
当な結合基を介してレクチンを共有結合させたものであ
る為、本発明の吸着担体を用いることにより、従来のフ
ットゲルを用いた吸着担体と同じようなアフィニティー
クロマトグラフィー用充填剤として使用できるばかりで
なく、特に耐圧カラムに充填し、加圧下でも充分使用す
ることができるということは、作業時間を大巾に短縮さ
せる為、従って分離精製の能率を大きく向上させ得ると
いう最大の利点が得られるものであり、この利点が例え
ば高速液体クロマトグラフィーへの応用や工業用の分離
精製設備への応用を計るには不可欠であることは言を俟
たない。

また、本発明により提供されるクロマトグラフィー用吸
着担体は、キトサン多孔質ビーズの有するアミノ基を完
全にアシル化することにより、例えば蛋白質等と接触す
る際のイオン的な非特異的吸着をも排除している為、リ
ガンドと吸着目的物質の選択性を更に高めたものとする
ことができる。

更に、特に、キトサン多孔質ビーズに対し、化学的に中
性で安定な共有結合を介してレクチンを結合させた吸着
担体は、例えば、一般に用いられている臭化シアンやグ
ルタルアルデヒドを介したアフィニティークロマトグラ
フィー用吸着担体などに比して、使用時のりガントの脱
落が無く、また結合基の長さを任意に調整することが可
能である為、リガンドの目的物質に対する吸着能が優れ
ており、更に非特異的吸着も少ないこと等も併せて本発
明により提供されるクロマトグラフィー用吸着担体の効
果は大きい。

実施斑 以下に、本発明のクロマトグラフィー用吸着担体の製造
法について代表的な例を示し、更に具体的に説明する。

但し、これらは説明の為の単なる例示であって、本発明
はこれらに何ら制限されないのは言うまでもない。

実施例１ 粒径０．１　ｔｍのキトサン多孔性ビーズ（商品名ショ
ウデックスキレパール、芳香族架橋品）に無水グルタル
酸を反応させた後、残アミノ基をアセチル化して得たビ
ーズ（カルボキシル基：乾燥ゲル１ｇ当り０．３５ミリ
モル）１．０ｇを無水ジオキサンで充分洗浄した後無水
ジオキサン４ｍｌ中に加え、更にＮ−ヒドロキシコハク
酸イミド８０ｍｇ及びジシクロへキシルカルボジイミド
１４４ｓ＋ｇを加えて室温で２時間振盪した０次いでビ
ーズを演歌し無水ジオキサン２０ｍｊ！、メタノール６
■１１冷水３ＩｌｌＶの順で素早く洗浄した。このビー
ズをコンカナバリンＡ３０ｍｇ及びメチル−α−マンノ
ピラノシド４０Ｂの０．１ミリモル塩化カルシウム、０
、１ミリモル塩化マンガン及び０．０１モル炭酸水素ナ
トリウムの水２ｙａｌによる溶液に加え、室温で２時間
振盪後、４℃で１夜放置した。ビーズを演歌し、１モル
塩化ナトリウム水溶液及び水で洗浄した後、１モルトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）２Ｉｌｌに加え室温で１
時間振盪した後、再びビーズを演歌して水洗した。こう
して得られた吸着担体は乾燥ビーズＩｇ当りのコンカナ
バリンＡを１５ｍｇ担持させていることが未反応による
回収コンカンナバリンＡの量から確かめられた。

実施例２ 実施例１におけるコンカナバリンＡ３０Ｂの溶液の代り
に、小麦胚芽レクチン５．０　ｍｇ及びＮ−アセチル−
α−グルコサミン１０ｍｇを含む０．０５モルリン酸カ
リウム、０．１５モル塩化ナトリウム及び０．０１モル
炭酸水素ナトリウムの水３ｍ１ｔにおける溶液を用い、
その他は同様の操作を行うことにより乾燥ビーズ１ｇ当
り小麦胚芽レクチン３．２ｍｇ担持させている吸着担体
を得ることができた。

試験例１ 実施例１で得られた吸着担体を８φ×５０Ｍのステンレ
ス製カラムに充填し、高速液体クロマトグラフ装置を用
いてｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド
（化合物１）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピ
ラノシド（化合物２）を分析したところ、次の表の如く
良い結果が得られた。

溶離液　　　０．０２モル）　ＩＪス塩酸緩衝液、０．
５モル塩化ナトリウム、 ０、５ミリモル塩化カルシウム、 ０．５ミリモル塩化マンガン （ｐＨ７，４） 溶離速度　　１．Ｏｍｌ／分 検出器　　　紫外分光光度計　２６０ｎｍ試験例２ アシル化されていないアミノ基を含む吸着体を用い、試
験例１と同様な方法で卵白アルブミンを分析した。

溶離液■：０．０１モルリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７
，０ ■：■＋０．０５モルα−メチルグルコシド ｔ？！離速変速度、Ｏｍｊ２／分、検出器紫外分光光度
計２８０ｎｒ＠ 溶離液■を用いると卵白アルブミンの大部分が吸着し、
溶離液■に切替えたところので吸着したものの一部が溶
出してきたが、未だかなりの部分が吸着されたままであ
った（図３）。

次に実施例１で得られた吸着体を用い同じ卵白アルブミ
ンについて分析したところ、溶離液■で吸着した卵白ア
ルブミンの大部分が溶離液■で溶出されてきた（図４）
。同量の卵白アルブミンを分析した場合、図３と図４に
おいて溶出量に明らシ かな差があり、ア憂ル化されていないアミノ基の影響に
依るものと思われた。

【図面の簡単な説明】

図１及び図２はいずれも本発明によるコンカナバリンＡ
吸着体を用いてそれぞれｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−
ガラクトピラノシド及びｐ−二トベ ロフェニルーα−Ｄ−？’ンノビラシノドの溶出を調べ
たものである。 図３及び図４は試験例２においてアそル化されていない
アミノ基を含む吸着体と本発明の吸着体を用いた時の卵
白アルブミンの吸着及び溶出を調べた時のパターンを示
す図である。 図１　　　　　　図２ 図３ 図４

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キトサン多孔性ビーズであって、該キトサンを構成する
   グルコサミンに基くアミノ基に、またはキトサン多孔性
   ビーズを架橋処理したものであって、該キトサンを構成
   するグルコサミンに基くアミノ基及び／または架橋処理
   剤に基アミノ基に結合基を介して共有結合により結合し
   たレクチンを含有するキトサン多孔性ビーズから成るこ
   とを特徴とするクロマトグラフィー用吸着担体。