JPS6349019A - トウモロコシを再生する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） 本発明は再生系の生体外条件づけ段階を用いる、組織か
らのトウモロコシ再生法に関するものである。

（先行技術の説明） 培養中の細胞からの植物再生は、体細胞交雑の応用、体
細胞クローン変異による新品種の生産および新品種の生
産における遺伝学的技術の使用に際して必須である。ト
ウモロコシの数品種については組織培養から植物を再生
することができるが、同様の技術の使用では再生が達成
されなかった品種が多数ある。

最近、植物細胞培養の成功が、植物の生長および発生の
制御における細胞と生物体の各役割の理解に著しい影響
をもたらしている。分離した植物細胞が生体外培養によ
くなじむことが判明し、また完全な植物が体細胞発生物
から直接に、または器官形成物から間接に、体細胞組織
から誘導される培養物から再生されている。一般的に、
再生経路の選択は、外部の要因、特に生長調節因子の操
作により実験的に決定される。ある植物種の初期の研究
は、オーキシンの減少が胚形成の開始を導くというよう
に、外因性オーキシン濃度が体細胞発生物制御の主要な
因子であることを示唆している。他の種では、一定の平
衡状態のオーキシンおよびサイトカイニンにさらすこと
が器官形成（新芽、ついで根）の発生を導く。

トウモロコシの組織培養に対する標準方式になっている
方法は、グ、リーンら、クロップ・サイエンス（Ｃｒｏ
ｐ　　５ｃｉｅｎｃｅ）第１５巻、４ｍｇ７頁（−４ｍ
ｇ７５年）に記述されている。本方法において、未分化
胚はＭＳ無機塩類、シュドラウスのビタミン類およびア
ミノ酸類（グリシン、アスパラギン、ナイアシン、チア
ミン、ピリドキシンおよびパントテン酸）、２％蔗糖、
０６８％寒天および２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２，４−Ｄ）、ハラ−クロロフェノキシ酢酸（ＰＣＡ）
、アルファーナフタリン酢酸（ＮＡＡ）、２−イソペン
チルアデニン（２−ｉｐ）またはそれらの混合物から選
ばれるホルモンから成るカルス誘導培地上に置かれた。

苗は低いホルモン濃度をもった培地にカルスを継代して
して再生された。有効であったホルモン濃度は、３ｘｇ
／リットル２．４−Ｄおよびｌｕ／リットル２．４−Ｄ
、４３−４ｍｇ／リットルＮＡＡおよび０．０５−４ｍ
ｇ／リットル２−ｉｐの混合物であった。再生は次に０
．２５．ｏ／リットル２．４−Ｄまたは１ｍ９／リット
ルＮ　Ａ　Ａおよび０．０５ｘ９７リットル２−ｉｐの
混合物を含む培地で実施された。

全ての培養は、継代前に３−４週間の間隔で、照明下１
６時間／無照明下８時間の周期で行われた。本参考文献
はカルス誘導が試験された５つ遺伝子型の１つでは起こ
らなかったことを報告している。

種々の培地による同様の結果がフリリングら、メイデカ
（Ｍａｙｄｉｃａ）第２１巻、９７頁（−４ｍｇ７６年
）、バシルら、セオレティカル・アンド・アプライド・
ジュネティクス（Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅ
ｔ。

）第６６巻、２８５頁（−４ｍｇ８３年）、エダロら、
メイデカ（Ｍａｙｄｉｃａ）第２６巻、３９頁（−４ｍ
ｇ８１年）、ルーら、セオレティカル・アンド・アプラ
イド・ジェネティクス（Ｔｈｅｏｒ　　Ａｐｐｌ、　Ｇ
ｅｎｅｔ、　）第６２巻、１０９頁（−４ｍｇ８２年）
、ハイバードら、プロシージンゲス・才ブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐ
ｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）第７９巻
、５５９頁（−４ｍｇ８２年）、ゲゲンバら、プロシー
ジンゲス・オブ・ナシぢナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）第７４巻、５１１３
頁（−４ｍｇ７７年）およびグリーンら、クラブ・サイ
エンス（ＣｒｏｐＳ　ｃｉｅｎｃｅ）第１４巻、５４頁
（−４ｍｇ７４年）らによって論証された。後者の参考
文献はまたカルス誘導に対する遺伝子型の影響を論証し
ている。

本方法は一般的に全トウモロコシの遺伝子型から植物を
再生するために不成功であったが、大部分の遺伝子型の
再生は現在培地に２．４−Ｄの代わりにジカムバを用い
ることにより可能である。

公開されたヨーロッパ出願０１７７７３８およびダンカ
ンら、プリンタ（Ｐ　１ａｎｔａ）第１６５巻、３２２
頁（−４ｍｇ８５年）を参照。

先行技術のどれもまだ、大部分の遺伝子型が２゜４−Ｄ
を含む培地から再生され得るように、トウモロコシの組
織が条件づけられるような条件づけ段階を論証していな
い。

［発明の要旨］ 本発明はトウモロコシの組織から植物を再生する方法で
ある。本発明の方法は、トウモロコシの組織を生体外条
件づけし、カルスを誘導するためカルス誘導培地でトウ
モロコシの組織を培養し、およびカルスから植物を再生
する段階を含んでいる。カルスは所望により再生以前に
維持され得、植物は所望により土壌に移す以前に株立ち
培地で培養され得る。

Ｂ７３を包含するトウモロコシの大部分の遺伝子型は、
２．４−Ｄがカルス誘導培地でホルモンとして用いられ
る時でさえも本方法を用いて再生され１辱る。

［実施態様の説明］ 本発明は、カルス誘導以前にトウモロコシの組織を前条
件づけする段階を包含する細胞または組織培養によりト
ウモロコシ、ゼア・メイズ（Ｚｅａｍａｙｓ）を再生す
る方法である。末法により、土壌に植え、成熟するまで
生育され得る再生トウモロフン植物が得られる。一般的
に、方法は、（ａ）トウモロコシの組織を生体外条件づ
けし、（ｂ）カルスを生成するため、前条件づけされた
組織を培地で培養し、および（Ｃ）カルスから植物を再
生することを含む。再生以前に、カルスはまた、長期間
カルスを維持するため、培地で培養され得る。

植物はまた土壌に移す株立ちをさせるため培地で培養さ
れ得る。

生体外条件づけ段階が、以前は２．４−Ｄを含む培地で
の再生に不応性であった遺伝子型から植物を再生するの
に必要であることが見出された。

このような遺伝子型はとりわけＢ７３、Ｍｏ１７および
Ａ６３２を包含する。カルスが２．４−Ｄを含む培地で
誘導されるようにトウモロコシの組織を条件づける任意
の生体外条件づけ段階が用いられる。１つの具体例とし
て、生体外受精（ｆｅｒｔｉｚａｔ　１ｍｇｎ）が生体
外条件づけ段階として用いられる。

この具体例において、単一の胚珠はセクター／単一胚珠
を付着した毛（トウモロコシの絹糸）の上に単一または
多数の花粉粒を置くことにより受精される。生体外受精
された粒は成熟するまでおかれ、未分化胚が約１．０ｍ
ｍか約１．２ｍｍの長さになる１０−１７日後に移され
る。未分化胚は、次にカルス誘導培地上に置かれる。

第２の具体例として、生体外条件づけは受粉後約３日の
接合子を分離することにより達成される。

果皮は未分化の穀果を含む接合子から除去される。

この材料は、次に内胚乳発生および接合子成熟のため、
２５°−３０℃で、好ましくは３０℃で無照明下内胚乳
発生培地で培養される。未分化胚が約１．Ｏｎ＋ｍから
約１．２ｍｍの長さのサイズに伸びた時、未分化胚は分
離され、カルス誘導培地で培養される。

内胚乳発生培地は無機塩類、ビタミン類、Ｌ−グルタミ
ンおよび蔗糖を含む。無機塩類は多量要素および微量要
素を含む。誘導培地に用いられる多量要素は次の化合物
の組合せであり得る：硫酸マグネシウム、塩化カルシウ
ム、燐酸−カリウム、硝酸カリウム、および硝酸アンモ
ニウム。この培地に含まれる微量要素はニホウ酸、硫酸
マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸（Ｖ１）ナトリウム
、硫酸鋼（ＩＩ）、塩化コバルト、ヨウ化カリウム、硫
酸鉄（■）およびエチレンジアミン四酢酸（Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ）ジナトリウムである。無機塩類のこの組合せはＭ
Ｓ無機塩類として当技術で既知である。無機塩類の他の
組合せも、それらが内胚乳発生に悪影響かない限り用い
られ得る。無機塩類の多くの組合せは既知である。これ
らはＮ６、ヘルレル（Ｈｅｌｌｅｒ）、ニチェ（Ｎ　１
ｔｓｈ）およびニチェ、Ｂ５およびホヮイ）（Ｗｈｉｔ
ｅ）を包含するが、これらに限定されない。

１リットルの培地を調製するために用いられる多量要素
および微量要素の好ましい量は：硫酸マグネシウム７水
化物３７０ＪＩｇ、塩化カルシウム２水和物４４０ｒｔ
ｔｇ、燐酸−カリウム１７ｈ９、硝酸カリウム−４ｍｇ
００ｔｙ、硝酸アンモニウム・１６５０巧、ホウ酸６．
２ｍｇ、硫酸マンガンｌ水化物１６゜９１に９、硫酸亜
鉛７水化物８．６ｍｇｇ、モリブデン酸（Ｖｒ）ナトリ
ウム２水化物０．２５３Ｉ９、硫酸銅（ＩＩ）５水化物
０．０２５Ｒｇ、塩化コバルト６水化物０゜０２５＋９
、ヨウ化カリウム０．８３ｘｇ、硫酸鉄（■）７水化物
２７．８ｍｇおよびエヂレンジアミン四酢酸ジナトリウ
ム３７．３ｍｇである。

内胚乳発生培地は別にビタミン類を含む。用いられるビ
タミンは、葉酸、ニコチン酸、チアミン、ピリドキシン
、グリシンおよびビオチンである。

ビタミン類のこの組合せはニチェのビタミン類として当
技術で既知である。ビタミン類の他の組合せも、それら
が内胚乳発生に影響がない限り用いられ得る。１リット
ルの培地を調製するために用いられるビタミン類の好ま
しい量は；葉酸０．５０ｍｇ、ニコチン酸５巧、塩酸チ
アミン０．９０！９、塩酸ピリドキシン０．５０ｘｇ、
グリシン２１１ｇおよびビオチン０．０５℃ｇである。

この特定の組合せは、この明細書では改良されたエチェ
のビタミンＡと称する。

内胚乳発生培地は、５−１θ％、好ましくは７％蔗糖、
１００−３００Ｒ９／リットル、好ましくは２００！９
／リットルＬ−グルタミンおよび寒天またはゲルライト
（商標、ケルコ・コマーシャル・デベロプメント、Ｐ、
０．ボックス２３０７６、サンディエゴ、カルフォルニ
ア）のようなゲル化剤を含む。０．１％の濃度でゲルラ
イトを用いることが好ましい。培地はｐＨ５，５−５，
８であり、ｐＨ５，８が好ましく、加圧滅菌により滅菌
される。

第３の具体例として、接合子は受粉後約４−４５日の胚
嚢から分離される。接合子は接合子成熟培地で培養され
る。接合子は成熟し、次にカルス誘導を受は得る。接合
子成熟培地は無機塩類、ビタミン類および蔗糖を含む。

無機塩類は内胚乳発生培地で記述したのと同様である。

接合子成熟培地は別にビタミン類を含む。用いられるビ
タミン類はミオイノシトールおよびチアミンである。１
リットルの培地を調製するために用いられるビタミン類
の好ましい量は塩酸チアミン０．４ｍｇおよびミオイノ
シトールｌＯ「１である。

接合子成熟培地は１−３％、好ましくは２％蔗糖および
寒天またはゲルライトのようなゲル化剤を含む。０．２
％の濃度でゲルライトを用いることが好ましい。培地は
ｐＨ５，５−５，８であり、ｐＨ５，８が好ましく、加
圧滅菌により滅菌される。

上記の化合物のほかに、接合子成熟培地はまたホルモン
も含む。この明細書では、ホルモンとは、植物または植
物組織に調節効果がある任意の天然または合成化合物お
よび上記の化合物と配合され得る任意の添加物を意味す
る。植物ホルモンはオーキシンおよびサイトキニンを包
含している。オーキシンおよびサイトキニンと配合され
得る添加物はココナツミルクおよびカゼイン酵素氷解物
を包含する。

接合子成熟に有用なホルモンは２．４−Ｄおよびココナ
ツミルクの混合物であることが見出された。一般的に、
０．７−ＩＪＩグ／リットル２．４−Ｄおよび５−１５
％ココナツミルクが存在する。

！−４ｍｇ／リットル２．４−Ｄおよび１０％ココナツ
ミルクを用いることが好ましい。

接合子は接合子成熟培地上に置かれ、好ましくは、脱水
を防ぐためパラフィン油で表面をおおイっれる。接合子
は２５°−３０℃、好ましくは３０℃で無照明下培養さ
れる。

−たん未分化胚が約１．０から約１．２ｍｍの適当なサ
イズに伸びた時、未分化胚はカルス誘導に用いるために
準備される。カルス誘導は接合子成熟培地で未分化胚を
連続培養することにより起こり得る。この場合には、未
分化胚は接合子成熟培地で、約４週間培養後説分化およ
びカルス形成を受ける。

別法として、特に生体外条件づけについての第１または
第２の具体例が用いられたならば、未分化胚はカルスの
形成のためカルス誘導培地で培毘される。カルス誘導培
地は無機塩類、ビタミン類、蔗糖およびホルモンを含む
。無機塩類、ビタミン類および蔗糖は接合子成熟培地に
ついて前述されたのと同様である。カルス誘導培地はゲ
ル化剤として、寒天またはゲルライト、好ましくは０．
２％ゲルライトを用いて固化される。培地はｐ！−１５
。

５−５．８で、５．８が好ましく、加圧滅菌により滅菌
される。

カルス誘導に有用なホルモンは２．４−Ｄ、ＮＡＡおよ
びアルファーインドール酪酸（ＩＢＡ）の混合物である
ことが見出された。一般的に、１−４ｍｇ／リットル２
．４−ＤＳ　１−２．Ｑ／リゾトルＮＡＡおよび１−２
−４ｍｇ／リットルＩＢＡがホルモンとして用いられろ
。３巧／リットル２．４　　Ｄ。

２部ｇ／リットルＮＡＡおよび２部ｇ／リットルＩＢＡ
を用いることが好ましい。

未分化胚はカルス誘導培地上に置かれ、約３−４週間２
０°−３０℃で、１６時間の光周期で拡散光下に培養さ
れる。この期間に、未分化胚は脱分化およびカルス形成
を受ける。

カルス誘導培地で培養後、カルスは再生培地に移し、縫
代培養される。再生培地での培養は２−３週間の期間に
カルス誘導として記述されたように行なわれる。第３の
具体例として、接合子成熟培地はまた接合子成熟培地で
のカルスの連続培養において、カルス誘導培地および再
生培地として作用する。植物はカルス形成後２−３週間
で生成する。

再生培地は無機塩類、ビタミン類、蔗糖およびホルモン
を含む。これらの材料は接合子成熟培地として前述され
たのと同様である。培地は前述のように、寒天またはゲ
ルライトを用いて固化され、ｐＨ５，５−５，８で、５
．８が好ましい。

再生培地から再生される植物は土壌に直接に移し、成熟
するまで生育され得る。別法として、植物は先ず株立ち
（ｅｓｔａｂｌ　ｉｓｈｍｅｎｔ）培地で培養され得る
。株立ち培地はカルス誘導培地と同じ無機塩類およびビ
タミン類を含む。株立ち培地は別にカルス誘導培地と同
じ量、すなわち！−３％好ましくは２％の蔗糖を含む。

株化培地はｐＨ５，５−５，８で、５．８が好ましく、
上述のように滅菌される。ゲルライト、好ましくは０．
２％または寒天が培地を固化するために用いられる。

１日当たり１６時間の光周期で拡散光下、７−２１日好
ましくは１０−１５日間株立ち培地で苗を培養後、苗は
土壌に移される。苗は取り出され、ゲルライトが洗い落
とされる。苗は次に鉢植用土壌１部とパーライト２部の
混合物に植えられる。

３週間後、植物は鉢植用土壌１部とパーライト１部の混
合物に植えられる。

植物を生成するため、再生培地でカルスを培養する以外
に、カルスは先ずカルス維持するため培養され得る。こ
の方法を用いる場合、カルスはカルス誘導培地から前維
持培地に移され、約７日間２４”−３０℃で、好ましく
は２８℃で無照明下培養される。

前維持培地は無機塩類、ビタミン類、蔗糖およびホルモ
ンを含む。無機塩類、ビタミン類および蔗糖は０．８ｍ
ｇ／リットルの塩酸チアミンを用いることを除けばカル
ス誘導培地に記述されたのと同じである。ホルモンは１
−４３−４ｍｇ／リットル好ましくは２ス９／リットル
２．４−Ｄまたはｉ５肩９／リットル好ましくは２幻／
リットルジカムバであり得ろ。前維持培地は別にアミノ
酸類を含み、Ｌ−プロリンおよびカザミノ酸が用いられ
る。５−５０μＭＬ−プロリンおよび１００−５００３
−４ｍｇ／リットルカザミノ酸が用いられる。好ましい
量はＩＯｍＭＬ−プロリンおよび１００Ｍ９／リットル
カザミノ酸である。前維持培地はゲル化剤として、寒天
またはゲルライト、好ましくは０．２％ゲルライトを用
いて固化される。培地はｐＨ５。

５−５．８で、５．８が好ましく、加圧滅菌により滅菌
される。

前維持培地で培養後、カルスは維持培地に移され、継代
培養される。維持培地に移すため、カルスの胚形成の脆
いセクターも選択することが重要である。カルスのこの
型は通常前維持培地での培養の１０−２０日以内に発現
する。カルスはｌ〇−１４日おきに作られる新鮮な培地
に移すことにより、望む限り維持培地で培養される。カ
ルスは１８ケ月以上維持されたことがある。維持培地で
の培養は２４°−３０℃、好ましくは２８℃で、無照明
下で行われる。

維持培地は無機塩類、ビタミン類、アミノ酸類、蔗糖お
よびホルモンを含む。無機塩類およびビタミン類は０．
８部ｇ／リットル塩酸チアミンを用いることを除いて、
カルス誘導培地で記述されたのと同じである。ビタミン
類のこの組合せは、本明細書では改良されたニチェのビ
タミンＢと称する。

１−３％好ましくは２％蔗糖が用いられる。培地は好ま
しくは約０．２％ゲルライトを含み、ｐ）！５．５−６
．０で、５．８が好ましい。推持培地はまた、アミノ酸
を含む。用いられるアミノ酸類はＬ−プロリンおよびカ
ザミノ酸である。５−５ＯｍＭＬ−プロリンおよび１０
０−５００−４ｍｇ／リットルカザミノ酸が用いられる
。好ましい量は１０ｍＭ　Ｌ−プロリンおよび１００ｚ
９／リットルカザミノ酸である。最後に、培地はホルモ
ンを含む。

１−３ｍｇ／リットルカザミノ酸、好ましくは２ｍｇ／
リットル２．４−Ｄが用いられる。別法として、１−４
　ｏ／リットル、好ましくは２ｍｇ／リットルジカムバ
またはｒ　−４ｍｇ／リットル、好ましくは３ｘｇ／リ
ットルクロラムベンが用いられる。

所望の期間、維持培地でカルスを培養後、カルスは再生
培地に移され、継代培養される。再生培地は上述と同じ
再生培地であり得る。別法として、再生培地はまたホル
モン類が不足している、すなわち任意のホルモンを含ん
でいないものでもよい。

再生培地での培養は拡散光１６時間／無照明８時間の周
期で、２４°−３０℃好ましくは２８℃で行われる。苗
がさらに生育して１〜３ｃｍのサイズに伸びた時、新鮮
な再生培地を含んでいる培養管に移される。苗が１０−
１５ｃｍのサイズに伸びた時、苗は土壌に移され、温室
で生育される。

別法として、推持後のカルスは再生培地に移して継代培
養する前に、最初に前再生培地に移され、継代培養され
る。前再生培地での培養は再生培地に移す前に、拡散光
１６時間／無照明８時間の周期で、２４°−３０℃好ま
しくは２８°Ｃで行イつれる。再生培地は無機塩類、ビ
タミン類、アミノ酸類、蔗糖およびホルモンを含む。こ
の培地はホルモンの濃度が低いことを除いて、維持培地
と同じである。一般的に、ホルモン濃度は０．０５−０
゜５μＭで、より０．１μＭが好ましい。

方法は２．４−Ｄを用いるトウモロコツの多くの栽培変
種の未分化胚から植物を再生するのに宵用である。他の
ホルモン類もまた、本明細書に記述されたように、２．
４−Ｄに加えて用いられ得る。本方法は、先行技術の方
法によって、以萌は２．４−Ｄを含む培地では再生でき
なかったトウモロコンの栽培変種を２．４−Ｄをもつ培
地を用いて再生することができる。これらの栽培変種の
例はＢ７３、Ａ６３２およびＭ０１７を含む。

以下、本発明をさらに次の実施例によって説明するが、
これらは本発明を制限するものではない。

本明細書に用いるトウモロコシの全ての栽培変種は市販
されている。

実施例１ 溶液の調製 次の原液または溶液は、以下さらに詳細に記述される培
地作製用に調製した。

１、無機塩類およびビタミン類 溶液は蒸留イオン交換水８００酎中に蔗糖を欠くムラシ
ゲ最小有機培地（ギブコ研究所カタログ番号５１０−３
１１８）の１パツクを溶解して使用直前に調製した。少
量の水をパックを洗い落とすために用いた。パックはｐ
Ｈ緩衝剤を包含する。

２、ホルモン類 （Ａ）０．１ｍｇ／ｘ（２２，４−Ｄ原液は７０％エタ
ノール１ＯｘＱに２．４−ＤＩＯ貢りを溶解し、蒸留イ
オン交換水で１００ｘＣに希釈して調製した。

（Ｂ）Ｏ，ｌｘ９／肩ｉ２Ｉ　ＢＡ原液は２．４−Ｄで
記述したのと同様に調製した。

（Ｃ）０．　１Ｍ９／ｙ、ＱＮＡＡ原液は２．４−Ｄで
記述したのと同様に調製した。

（Ｄ）ココナツミルクは、ココナツから内胚乳液を傾瀉
して調製した。液はたんばく質を沈澱させるため、３−
５分間９０℃に加熱し、室温に冷却した。液は次にワッ
トマン３番の濾紙を通して濾過し、４７ｍｍのゲルマン
のガラス繊維濾過管を通して吸引濾過した。ｉｌ！ｉｄ
は用いるまで凍結貯蔵した。

ＣＥ）１ｘ９／ＩＱ２．４−Ｄジカムバまたはクロラム
ベン原液は、無菌イオン交換水５０＋ｆ２にホルモン５
０１ｇを溶解して調製した。

３、ニチェのビタミン類 ニチェのビタミン類の１００ｘ原液は、蒸留イオン交換
水１００ｘ（に葉酸５ｙｇ、ニコチン酸５０所、塩酸ピ
リドキシン５ｍｇ、塩酸チアミン５ｍ９、グリシン２０
ｒｉｇおよびビオチン０．５ｍ９を溶解して調製した。

実施例２ 培地の調製 ！、内胚乳発生培地 内胚乳発生培地は、無機塩類およびビタミン類溶液に蔗
糖７０ｇ、ニチェのビタミン類の１００×原液１０雇お
よびＬ−グルタミン２００ｍｇを添加して調製した。ゲ
ルライト１ｇを添加し、容量を蒸留イオン交換水でｌリ
ットルにした。培地は、次に加圧滅菌し、ベトリー皿に
注いだ。

２、接合子成熟培地 接合子成熟培地は、無機塩類およびビタミン類溶液ニ蔗
糖２０ｇ、０．１ｗ９／ｘ（１２，４−Ｄ原液１０πＱ
およびココナツミルク１００ｘＱを添加して調製した。

ゲルライト２ｇを添加し、容量を蒸留イオン交換水で１
リットルにした。培地は加圧滅菌し、ペトリー皿に注い
だ。

３、カルス誘導培地 カルス誘導培地は、無機塩類およびビタミン類溶液に蔗
糖２０９、Ｏ，１所ＩＲＱ２．４−Ｄ原液３０２Ｑ、Ｎ
ＡＡ原液２０ｍ＋２．ＩＢＡ原液２０ｍＱＪｆ：添加し
て調製した。ゲルライト２ｇを添加し、容量を蒸留イオ
ン交換水で１リットルにした。培地は加圧滅菌し、ペト
リー皿に注いだ。

４、再生培地Ａ 再生培地Ａは接合子成熟培地で記述したのと同様に調製
した。

５、再生培地Ｂ 再生培地Ｂは２．４−Ｄおよびココナツミルクを添加し
なかったことを除いて、接合子成熟培地で記述したのと
同様に調製した。

６、前維持培地 前維持培地は、ｐＨ緩衝剤（ギブコ・カタログ番号５０
０−３１１８）、蔗糖２０ｇ、塩酸チアミン０．４ｘ凱
力ザミノ酸１００ｍｇ、Ｌ−プロリン１．１５１１ｇお
よび１ｉＳｊ／１ｆＪ２．４−Ｄ原’ｔｔｔ２ｍＱを含
むムラシゲ最小有機培地に蔗糖を欠く１パツクを無菌イ
オン交換水８００婦に溶解して調製した。少量の水をパ
ックを洗い落とすために用いた。ゲルライト２ｇを添加
し、容量をイオン交換水で１リットルにした。培地は加
圧滅菌し、ペトリー皿に注いだ。

７、維持培地 維持培地は、適量のホルモン原液を用いて前維持培地で
記述したのと同様に調製した。

８、前再生培地 前再生培地は、適量のホルモン原液を用いて前維持培地
で記述したのと同様に調製した。

９、株化培地 株化培地は再生培地Ｂで記述したのと同様に調製した。

実施例３ トウモロコシの再生 単一または多数の花粉粒を、トウモロコシの毛を付着し
ているセクタ／単一の胚珠の上に置いた。

未分化胚が約１．０−１．２ｍｍの長さになった時、未
分化胚は生体外受精したＢ７３の粒から分離した。粒は
２０分間２％漂白液で表面滅菌し、無菌水５００ＪＩＱ
で２度洗い落とした。胚を各位から除去し、胚軸が培乳
と接触するようにカザミノ誘導培地上に置いた。培養は
４週間約２４℃で、拡散光１６時間／無照明８時間の周
期で行った。カルスは次に再生培地Ａに移し、拡散光１
６時間／無照明８時間の周期で、２週間培養した。再生
した植物は２週間法化培地で培養して成熟し、次に土壌
し、温室で成熟した。

実施例４ トウモロコシの再生 受粉後３日の無傷の８７３の接合子を分離し、果皮を注
射針で除去した。未分化穀果中の接合子は内坏乳発生培
地上に角度をなして置いた。内胚乳は、３０℃で無照明
下の培養の間に、未分化胚を増大し、むき出しにした。

胚が約１．０−１．２ｍｍの長さになった時、分離し、
胚軸が培地と接触するようにカルス誘導培地上に置いた
。培養は上述のように照明下４週間行った。植物は実施
例３で記述したのと同様にカルスから再生し、温室で成
熟するまで生育した。

実施例５ トウモロコシの再生 受粉後４日の８７３の接合子をとり出し、内胚乳から分
離した。他の生物組織を含まない接合子を接合子成熟培
地上に置いた。脱水を防ぐためパラフィン浦で各接合子
の表面をおおった。３０℃で無照明下４週間培養後、未
分化径は成熟し、カルスを形成した。植物は照明下連続
培養して再生し、実施例３で記述したのと同様に株化培
地および土壌に移した。再生した植物は温室で成熟する
まで生育した。

実施例６ トウモロコシの再生 Ｂ７３のカルスを実施例３で記述したのと同様に得、２
所／リットル２．４−Ｄを含む前維持培地に移した。カ
ルスは２７℃で１週間無照明下培養した。胚形成の可能
性をもつ脆いカルスを視覚的に選び、２πｇ／リットル
２．４−Ｄを含む維持培地に移した。カルス１０−１４
日毎に新鮮な維持培地に移すことにより、２７℃で無照
明下培養した。いくつかの脆い胚形成の急生長の培養細
胞株は３代の継代培養後分離した。培養細胞株は品質の
減退を示すことなく、はぼ１年間維持した。

再生のため、カルスは再生培地Ｂに移し、２７℃で拡散
光１６時間／無照明８時間の周期で培養した。再生培地
Ｂに継代後ｔｏ−３０日の、１１−３ａの植物は新鮮な
再生培地Ｂを含む培養管に移した。植物は１０−１５ｃ
ｍの高さになった時、土壌に移し、温室で成熟した。

実施例７ 受粉後４日の八６３２の接合子を分離し、接合子を成熟
させ、カルスを形成させるため、実施例５で記述したの
と同様に接合子接合子培地上に置いた。カルスは１週間
２８℃で無照明下培養した。

胚形成の可能性をもつ脆いカルスを視覚的に選び、２肩
９／リットル２．４−Ｄを含む維持培地に移し、植物を
再生するため実施例６におけると同様に処理した。

実施例８ 受粉後４日のＭｏ１７の接合子を分離し、接合子を成熟
させ、カルスを形成させるため実施例５で記述したのと
同様に接合子成熟培地上に置いた。

カルスは１０−２０日間２８℃で無照明下培養した。胚
形成の可能性をもつ脆いカルスは視覚的に選び、２ス９
／リットルジカムバを含む維持培地２に移し、植物を再
生するため実施例６におけると同様に処理した。

以上、発明を具体例に基づいて記載したか、発明をさら
に修正することが可能であることはいうまでしない。本
発明は本発明の原理に基づくあらゆる変形、用途および
適応を包含することを意図するものであり、当技術範囲
内の既知および常用実施形格の範囲内にある、あらゆる
変更方法を包含するものである。

特許出願人　サンジエン・チクノロシーズ・コーポレイ
ション

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の段階を含む細胞または組織培養により、２
   ，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）抵抗性遺
   伝子型からトウモロコシ植物を再生する方法 （ａ）条件づけられた未分化胚を得るため、接合子を生
   体外条件づけし、 （ｂ）カルス形成のため、無機塩類、ビタミン類、蔗糖
   および（１）２，４−Ｄ、アルファーナフタリン酢酸（
   ＮＡＡ）およびアルファーインドール酪酸（ＩＢＡ）の
   混合物および（２）２，４−Ｄおよびココナツミルクの
   混合物から成る群から選ばれるホルモンを含むカルス誘
   導培地で条件づけられた未分化胚を培養し、 （ｃ）植物形成のため、無機塩類、ビタミン類および蔗
   糖を含む再生培地で上記のカルスを継代培養すること。
2. （２）上記の再生培地がさらにホルモンとして２，４−
   Ｄおよびココナツミルクの混合物を含む特許請求の範囲
   第１項記載の方法。
3. （３）さらに、下記の段階を含む特許請求の範囲第１項
   または第２項記載の方法 （ｄ）植物を株立ちさせるため、無機塩類、ビタミン類
   および蔗糖を含む株立ち培地で植物を継代培養すること
   。
4. （４）さらに、下記の段階を含む特許請求の範囲第１−
   ３項の何れか１項記載の方法 （ｂ１）２４°−３０℃で、無照明下、無機塩類、ビタ
   ミン類、蔗糖、Ｌ−プロリン、カザミノ酸並びに２，４
   −Ｄおよびジカムバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ
   安息香酸）から成る群から選ばれるホルモンを含む前維
   持培地で上記のカルスを培養すること、 （ｂ２）生成したカルスを、カルス維持のため、２４°
   −３０℃で無照明下、無機塩類、ビタミン類、蔗糖、Ｌ
   −プロリン、カザミノ酸並びに２，４−Ｄ、ジカムバお
   よびクロラムベン（３−アミノ−２，５−ジクロロ安息
   香酸）から成る群から選ばれるホルモンを含む維持培地
   で培養すること。
5. （５）さらに、下記の段階を含む特許請求の範囲第４項
   記載の方法 （ｂ３）維持されているカルスを、２４°−３０℃で照
   明下、無機塩類、ビタミン類、蔗糖、Ｌ−プロリン、カ
   ザミノ酸並びに０．０５−０．５μＭの量の２，４−Ｄ
   ）ジカムバおよびクロラムベンから成る群から選ばれる
   ホルモンを含む前再生培地で培養すること。
6. （６）段階（ａ）が生体外受精により実施される特許請
   求の範囲第１−５項の何か１項記載の方法。
7. （７）受粉後約３日の無傷の接合子を分離すること、果
   皮を除去することおよび残った材料を無機塩類、ビタミ
   ン類、Ｌ−グルタミンおよび蔗糖を含む内胚乳発生培地
   で培養することにより実施される特許請求の範囲第１−
   ５項の何か１項記載の方法。
8. （８）段階（ａ）が受粉後約４−４、５日の胚嚢から個
   々の接合子を分離すること及び無機塩類、ビタミン類、
   蔗糖並びにホルモンとして２，４−Ｄおよびココナツミ
   ルクの混合物を含む接合子成熟培地で接合子を培養する
   ことにより、実施される特許請求の範囲第１−５項の何
   れか１項記載の方法。
9. （９）カルス誘導培地のホルモン濃度が（１）１−４ｍ
   ｇ／リットル２，４−Ｄ、１−２ｍｇ／リットルＮＡＡ
   および１−２ｍｇ／リットルＩＢＡまたは（２）０．７
   −１ｍｇ／リットル２，４−Ｄおよび５−１５％ココナ
   ツミルクである特許請求の範囲第１−３項の何れか１項
   記載の方法。
10. （１０）ホルモン類の濃度が （ｉ）カルス誘導培地中、（１）１−４ｍｇ／リットル
    ２，４−Ｄ、１−２ｍｇ／リットルＮＡＡおよび１−２
    ｍｇ／リットルＩＢＡまたは（２）０．７−１ｍｇ／リ
    ットル２，４−Ｄおよび５−１５％ココナツミルク、 （ｉｉ）再生培地中、０．７−１ｍｇ／リットル２，４
    −Ｄおよび５−１５％ココナツミルク である特許請求な範囲第２−８項の何か１項記載の方法
    。
11. （１１）ホルモン類の濃度が （ｉ）カルス誘導培地中、（１）１−４ｍｇ／リットル
    ２，４−Ｄ、１−２ｍｇ／リットルＮＡＡおよび１−２
    ｍｇ／リットルＩＢＡまたは（２）０．７−１ｍｇ／リ
    ットル２，４−Ｄおよび５−１５％ココナツミルク、 （ｉｉ）前維持培地中、（１）１−４ｍｇ／リットル２
    ，４−Ｄまたは（２）１−５ｍｇ／リットルジカムバ、 （ｉｉｉ）維持培地中、（１）１−３ｍｇ／リットル２
    ，４−Ｄ、（２）１−４ｍｇ／リットルジカムバまたは
    （３）１−４ｍｇ／リットルクロラムベン である特許請求の範囲第４−８項の何れか１項記載の方
    法。
12. （１２）Ｌ−プロリンの濃度が５−５０ｍＭで、カザミ
    ノ酸の濃度が１００−５００ｍｇ／リットルである特許
    請求の範囲第４−１１項の何れか１項記載の方法。
13. （１３）グルタミン濃度が２００ｍｇ／リットルである
    特許請求の範囲第７項記載の方法。
14. （１４）ホルモン類の濃度が （ｉ）接合子維持培地中、０．７−１ｍｇ／リットル２
    ，４−Ｄおよび５−１５％ココナツミルク、（ｉｉ）カ
    ルス誘導培地中、（１）１−４ｍｇ／リットル２，４−
    Ｄ、１−２ｍｇ／リットルＮＡＡおよび１−２ｍｇ／リ
    ットルＩＢＡまたは（２）０．７−１ｍｇ／リットル２
    ，４−Ｄおよび５−１５％ココナツミルク、 である特許請求の範囲第８項記載の方法。