JPS63500006A

JPS63500006A - エキソヌクレア−ゼ阻害による核酸の塩基配列決定法

Info

Publication number: JPS63500006A
Application number: JP61503546A
Authority: JP
Inventors: マンディー，クリストファー; カニンガム，マーティン
Original assignee: アマ−シャム・インタ−ナショナル・ピ−エルシ−
Priority date: 1985-06-17
Filing date: 1986-06-17
Publication date: 1988-01-07
Also published as: GB8515276D0; EP0227772A1; DE3671918D1; WO1986007612A1; EP0227772B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】エキンヌクレアーゼ阻害による核酸の塩基配列決定法ＲＮＡおよびＤＮＡの現在の塩基配列決定法はすべて同一の基本的方法：すなわち共通の予め定められた一端をもつ数組の標識化一本領核酸フラグメント群のポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離に依存している。塩基特異的反応（化学反応または酵素反応）を使用することによシ、不特定末端が特定の既知種類の塩基にのみ現れるようにし、また上記反応を制御することによシ、すべての適当な終止位置が分子集団中に見出されるようにする。それぞれの種類の塩基の特定末端からの距離は、末端がその塩基で終る核酸フラグメントの長さから明らかになる。すべての塩基特異的反応を並列して行うとき、特定末端からの塩基配列は次第に増加する鎖長のフラグメントの末端に付いた塩基を同定することによシ読み取ることができる。

核酸の塩基配列を決定する慣用方法では次の３つのタイプの塩基特異的反応が用いられる：１）適当なポリメラーゼ酵素による核酸合成中に鎖伸長停止用のヌクレオチドを取シ込ませる；２）塩基特異的化学反応により核酸を切断する；３）塩基特異的エンド５ヌクレアーゼ酵素によシ核酸を切断する。

これらの方法はそれぞれいくつかの塩基配列決定の応用面においてその有用性を制限する特徴を有している。

サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）および共同研究者は塩基配列決定のために鎖伸長停止用ヌクレオチドを使用する途を開いた。彼らの方法は一本鎖鋳型ＤＮＡ、プライマー、適当なポリメラーゼ酵素、および普通のヌクレオチドと鎖伸長停止用ヌクレオチドの混合物（放射性標識を含む）を必要とする。

ＤＮＡ塩基配列決定用の一本鎖鋳型ＤＮＡは通常、一本領バクテリオファージＭ　１３に挿入物ＤＮＡをクローニングすることにより得られる。プライマーは一般に塩基配列を決めようとする挿入物に隣接するＭ　１３−＜フタ−の領域とハイブリダイズすることができる合成オリゴヌクレオチドである。ポリメラーゼ酵素は鎖伸長停止用ヌクレオチドが取シ込まれるまで、挿入物ＤＮＡを鋳型として用いてプライマーの３′末端にヌクレオチド（そのうちの１種は標識される）を付加する。

プライマーは混合物中のすべての標識フラグメントのための共通の５′末端を定め、そして鎖伸長停止用ヌクレオチドの性質はその停止位置の塩基を定める。

一本鎖鋳型ＤＮＡはまた線状二本鎖プラスミドＤＮＡを加熱することによっても得られるが、これらの二本のＤＮＡ鎖の再アニーリングのために塩基配列決定反応が妨害される。二本鎖プラスミドは最も日常的なりＮＡ操作法において使用されており、そしてその結果を塩基配列の決定によシ調べることが往々にして必要である。従って、対象となるフラグメントをＭ１３にクローニングすることは不利である。Ｍ１３によるサンガーの塩基配列決定法はまた、特別の措置を講じない限シ、もともと無方向性である。本発明は一本鎖または二本鎖の鋳型を使用することができ、且つどちらの方向にも等しく容易に二本鎖鋳型の塩基配列の決定を可能にする。

マクサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇ１１ｂｅｒｔ）はＤＮＡ塩基配列決定のだめの塩基特異的化学切断の使用を確立し、フラグメント群の分画化による塩基配列決定の原理を定めた。また、比較的最近になって、ＲＮＡの塩基特異的化学切断を可能にする諸条件が定められた。多くの化学的切断法が使用され、これらはすべて核酸修飾工程と鎖切断工程を含む。それぞれの修飾工程は１つの塩基または塩基の種類に対して特異的でちり、ある種の条件下において修飾塩基を不安定寿状態へ導く。

多くの応用に対してサンが一法をより好ましいものにしているいくつかの面がマクサム−ギルバート法には存在する。核酸と反応する化学薬剤は一般にきわめて毒性であり、発癌性がある。また、一般に使用されている数種の化学薬剤は非常に不安定である。それらは厳密に制御された条件下で貯蔵され、使用されねばならない。さらに、化学的に塩基配列を決めようとする分子は、予め定められた共通の一端をもつフラグメントのみが視覚化されるように、一端のみを標識することが必要である。

一本領ＤＮＡの場合は、５′末端または３′末端のどちらかを標識して、共通の５′末端または３′末端をもつフラグメント群を視覚化することは困難でない。

しかしながら、一方の鎖の一端のみを標識した二本鎖ＤＮＡを得るためには、いくつかの操作好ましくは特殊なベクターの使用が必要になる。均一標識化ではなく末端標識化を使用すると、標識密度が低下し、また結果が出るのに要する時間も増加する。本発明は危険でしかも不安定な化学薬剤の使用を避け、塩基配列情報を得るために視覚化されるフラグメント群の容易な均一標識化を可能にする。

塩基特異的エンドヌクレアーゼ酵素は、適当なエンドデオキシリボヌクレアーゼがまだ発見されていないので、ＲＮＡの塩基配列決定に対してのみ使用できる。

一端で標識された一本鎖ＲＮＡが必要となる。

近年、ＤＮＡの塩基配列決定法に大きな進歩が見られた。ゲル分画化された非標識ＤＮＡ塩基配列決定反応物をポリアクリルアミドケルから膜へ移行させ、ハイズリダイゼーション用ノ標識プローブを用いて関係するＤＮＡバンドを視覚化し得ることが証明された。チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）およびギルバー）　（Ｇｉ’ １−ｂｅｒｔｌこの方法を使用して、全マウスＤＮＡの化学的部分切断、ゲル電気泳動、ナイロン膜への移行、および標識Ｒ，Ｎ　Ａプローブとのハイブリダイゼーションを行うことにより、クローン化フラグメントを単離することなく直接にマウスＤＮＡの特定領域の塩基配列を決定した。同様に、ワー）”（Ｗａｒｄ）は開側までのプラスミドクローンの混合物をマクサム−ギルバート化学的切断法にかけ、クローンに特異的な標識ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて個々のクローンの塩基配列パターンを視覚化した。標識プローグは視覚化のあとで除かれる。

連続するプローグは非常に都合よく作られ、そして−組の塩基配列決定反応のあとに大多数のクローンの塩基配列パターンを視覚化すべく使用される。従って、単一ゲルから収集される情報量は、標識ハイブリダイゼーションプローブを用いて塩基配列ノミターンを視覚化することにより非常に増加する。さらに、この方法は塩基配列決定反応物の標識化に当てはまる制限がハイブリダイゼーションプローブの標識化には当てはまらないので、非放射性標識法を含めたいろいろな標識法を使用することができる・完全に自動化された大規模塩基配列決定はこの方法を使用して開発されるかもしれない。

ハイブリダイゼーションに基づく塩基配列決定法には、慣用のフラグメント群形成法の使用を制限する１つの特徴が存在する。この方法のための標識ハイブリダイゼーションプローブは、プラスミ）″イタター上のプロモーターから短鎖挿入物をＲＮＡに転写することにより作られる。ＲＮＡ（およびＤＮＡ）は５１→３ ′の方向に合成される必要がある。ハイブリッド−視覚化塩基配列決定を行うために、フィルター上の相補的配列は予め定められた共通の５′末端ではなく、予め定められた共通の３′末端を共有しなければならない。サンガー法は多くの複雑な実際的でない操作を行わない限シこの方法に使用することができない。

マクサム−ギルバート法は、ハイブリダイゼーションプローブに相補的である共通の３′末端をもつフラグメント群を生じさせる条件を用いることができたので使用された。しかしながら、化学的塩基配列決定法の前記欠点はこの方法に依然として残されたままである。

本発明は予め定められた共通の３′末端または５′末端をもつ数組のフラグメント群を迅速な一試験管反応（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ　ｒｅａｃ−ｔｉｏｎ）　で等しく容易に製造することを可能にする。従って、二本鎖鋳型、酵素反応および均一標識化を使用し得るという前記利点を提供するばかりでなく、本発明はハイブリダイゼーションに基づく塩基配列決定に難なく応用することもできる。

文献サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、）＋　＝ツクＬ／７　（Ｎｉｃｋｌｅｎ　Ｓ、　）およびカールンｙ（Ｃｏｕｌｓｏｎ　Ａ、Ｒ，）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、Ｍｏ１．７４，１９７７．５４６３〜７頁。

マクサム（Ｍａｘａｍ　Ａ、　Ｍ、　）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ　Ｗ、　）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、’　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、７４．　１９７７．　５６０〜４頁。

チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ　Ｇ、　Ｍ、　）　およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ　。

Ｗ、　）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、、Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　Ｖｏ’１．　’ｓ　１゜１９８４．１９９１〜５頁。

発明の開示本発明は塩基配列を決定しようとする核酸鎖に特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を導入し、次に特定条件下でその核酸鎖を消化して予め定められた共通の一端をもつ数組のフラグメント群を得るという概念に基づいている。

従って、本発明は１）一方の鎖が標的類であり且つ他方の鎖が１つまたはそれ以上の位置に特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含む合成鎖である二本鎖部分を有する核酸鎖を準備し；ｎ）上記の特定条件下でエキソヌクレアーゼを用いて合成鎖を消化し、それにより上記ヌクレオチド誘導体によって占められる位置での消化を阻止し；１１１）また存在しない場合には、合成鎖のすべてのフラグメントに共通の予め定められた末端をつくり、工程１１１）は工程１）の前または後に行い：そしてｉｖ）得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する；ことから成るホＩＪヌクレオチドの塩基配列決定法を提供する。

工程１）で使用するヌクレオチド誘導体は本発明にとってきわめて重要である。

そのヌクレオチド誘導体は原理的には糖、塩基またはリン酸基（ホスホジエステル結合に含まれる）において修飾されたヌクレオチドでありうる。多数のこのような修飾ヌクレオチドは文献中に開示されている。多くの場合に適するヌクレオチド誘導体は、アルファーリン原子に結合した酸素原子が硫黄原子によって置換されたものであり、例えば次のものである：アルファーＳ−デオキシチミジン三リン酸（α−３ａＴＴＰ）アルファーＳ−デオキシアデノシン三リン酸（α−３ａＡＴＰ）アルファーＳ−デオキシシチジン三リン酸（α−３ａＣＴＰ）アルファーＳ−デオキシグアノシン三リン酸（α− ８ａＧＴＰ）ヌクレオチド誘導体は工程１１）で使用する特定消化条件（実際にはしばしば特定のエキソヌクレアーゼを意味する）と関連して選ばれる必要がある。１つの適当な酵素は二本鎖ＤＮＡを３′末端からだけ消化してデオキシヌクレオシ）’−５′−−リン酸を遊離させる大腸菌（Ｆ２．ｃｏｌｉ）由来のエキソヌクレアーゼ■である。この酵素はリン原子が硫黄に結合しているとホスホ− エステル結合を切断できない。異なる情況下において適する別の酵素は、二本鎖ＤＮＡを５′末端からだけ消化してデオキシヌクレオシ）’−５’−−リン酸を遊離させるファージラムダ−感染大腸菌由来のラムダエキソヌクレアーゼである。それはリン原子が硫黄に結合しているとホスホジエステル結合を切断することができない。エキソヌクレアーゼ■は二本鎖に対して特異的であり、それ故に突出する３′末端からは二本鎖ＤＮＡを分解しないでちろう。しかしながら、ラムダニキンヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡよりも遅い速度であるが一本鎖ＤＮＡを分解するであろう。従ってそれは二本鎖ＤＮＡを平滑末端または突出末端から分解するだろう。二本鎖ＤＮＡを５′末端から消化し、異なる情況下において有用な別の酵素はファージＴ７遺伝子６エキンヌクレアーゼである。

工程ｉｖ）におけるフラグメント混合物の大きさによる分画化は、例えば変性ホリアクリルアミドゲルの電気泳動により行われる。共通の予め定められた末端を共有し且つ上記のようなヌクレオチド誘導体によって終止したフラグメントの視覚化は、合成鎖の合成中に取り込まれた放射性標識またはその他の標識によって行われる。また別法として、例えばチャーチおよびギルバートによって教示されたように、標識プローグとのハイブリダイゼーションにより視覚化することもできる。

本発明は主として（もつとも限定するものではないが）一本領または二本鎖ＤＮＡの塩基配列決定に応用することができる。

ＲＮＡの塩基配列決定のためには、（１）逆転写酵素により相補的ＤＮＡ鎖を合成し、そして（１１）エキソヌクレアーゼ消化を阻止させる塩基特異的反応でＲＮＡを修飾することが必要であるだろう。

本発明はＡ、Ｈに示した８つの好適な実施態様と関連させてさらに説明するであろう。この点について、添付の図面を参照されたい（ここで第１．　２．　３．　４．　５．　６．　７および８図はそれぞれ実施態様Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、Ｆ、　ＧおよびＨに関係する）。

第１〜６図において、ＤＮＡは適宜に環状の一本鎖または二本鎖として示されており、塩基配列を決定すべき部分は１０時から２時まで伸長している。制限部位はローマ数字Ｉ、Ｉ［および■で示す。ダッシュで示した線は伸長もしくは分解の結果としてのＤＮＡ鎖の不確定な広がシを示す。

第７および８図において、ＤＮＡは線状として示されており、プライマーは３′ 方向に伸びる合成鎖とプライマーとを区別するために太い線で示される。

記号（Ｓｌはヌクレオチドまたはチオヌクレオチドのようなヌクレオチド誘導体である単位を示す。実施態様ＥおよびＦにおいて、ニックはニラキング反応直後にはギャップによって示し、どは以下で説明するような対応する工程を意味する。

Ａ、この実施態様は塩基配列を決定しようとする部分を含む二本鎖ＤＮＡから出発し、次の工程：１）ａ）塩基配列を決定しようとする部分の一端に近接した位置でＤＮＡを切断して、二本鎖ＤＮＡの３′末端に特異的なエキソヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩ）により消化される１つのＤＮＡ鎖の３′末端をつくシ；１）ｂ）塩基配列決定部分を一本鎖にするのに十分な時間特異的エキソヌクレアーゼでその切断ＤＮＡを消化し；＋）Ｃ）その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行わせて工程ｂ）で除かれたＤＮＡを再合成し且つ１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含む合成鎖を形成し；ｔｉｌａ）ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化が阻止されるような特定条件下で、ＤＮＡ鎖の３′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼによりその合成鎖を消化し；１ｉｉ）ｅ）そのＤＮＡを切断して合成鎖の全フラグメントに共通する所定の５′末端をつくり；そして１ｖ）ｆ）工程ｅ）から得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する；ことから成る。

工程ａ）において、制限酵素は一本鎖末端が工程ｂ）でのエキソヌクレアーゼ■ 消化に抵抗するので３′突出部分を残さないべきである。

工程Ｃ）において、標的を含む反応混合物は好ましくは４つの部分に分割し、それぞれの部分にヌクレオチド類および異なるヌクレオチド誘導体を添加する。４種類すべてのヌクレオチドが１種類のヌクレオチド誘導体と共にそれぞれの部分に加えられる。関係するヌクレオチド（例えばａＡＴＰ）に対するヌクレオチド誘導体（例えばα−３ａＡＴＰ）の割合は、合成鎖のいくつか（全部でなくてもよい）のＡ位置がその誘導体によって占められるようにすべく選ばれる。また工程Ｃ）では、添加されるヌクレオチドの１種は好ましくは工程で）から生ずる分画化フラグメントを視覚化する手段を提供するように、例えば３２−Ｐで標識される。これとは別に、３５−８−標識チオヌクレオチドをヌクレオチド誘導体として使用することもできる。

工程ｄ）では、ヌクレオチド誘導体がチオ−ヌクレオチドである場合、合成りＮＡ鎖を例えばエキソヌクレアーゼ■で消化する。消化後、４種類のチオ−ヌクレオチドのうちの１種類を含む合成鎖はすべてこの種のチオ−ヌクレオチドを有するそれらの３′末端で終止する。

工程θ）では、好ましくは塩基配列決定部分の他端〔工程ａ）における一端に対して〕に近接した位置でＤＮＡを切断するように選ばれた制限酵素で消化することにより、共通の予め定められた５′末端が生成する。

Ｂ、この実施態様は塩基配列決定部分を含む二本＠ＤＮＡから出発する。実施態様Ａと同様に、これも共通の予め定められた３′末端をもつフラグメント群を生ずる。これはワード（Ｗａｒｄ）の方法によるフラグメントと標識プローブとのその後のハイブリダイゼーションを容易にするという利点を有している。この方法は次の工程：１）ａ）塩基配列決定部分の一端に近接した位置でＤＮＡを切断して、二本鎖ＤＮＡの３′末端に特異的なエキソヌクレアーゼ（例えばエキソヌクレアーゼ■）により消化される１つのＤＮＡ鎖の３′末端をつくり；１）ｂ）塩基配列決定部分を一本鎖にするのに十分な時間特異的エキソヌクレアーゼでその切断ＤＮＡを消化し；１）ｅ）その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行わせて工程ｂ）で除かれたＤＮ八を再合成し且つ１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含む合成鎖を形成し；１ｆ）ｄ）例えば制限酵素で消化することによシ、塩基配列決定部分の両末端に近接した位置でそのＤＮＡを切断し；１ｉｉ）ｅ）ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特定条件下で、ＤＮＡ鎖の５′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼ（例えばラムダエキソヌクレアーゼ）によりその合成鎖を消化し；１ν）ｆ＞工程ｅ）から得られたフラグメント混合物を大きさによシ分画化する：ことから成る。

この場合も工程ａ）で使用する制限酵素は３′突出部分を残さないようにすべきである。

工程Ｃ）では、実施態様Ａで説明したように、好ましくは反応混合物が４つの部分に分けられる。この工程で使用するヌクレオチドの１種は標識されるか、あるいは工程ｆ）からのフラグメントが標識プローブにより視覚化される。ヌクレオチド誘導体は好ましくはチオ−ヌクレオチドであシ、エキソヌクレアーゼは好ましくはラムダエキソヌクレアーゼである。この場合に、４種のチオヌクレオチドのうちの１種を含む合成鎖はすべてチオヌクレオチドから正確に１ヌクレオチド離れたそれらの５′末端で終止する。■程Ｃ）での再合成が完了した場合、あるいは任意に工程ｅ）の後に制限酵素でさらに消化した後、合成鎖の全フラグメントは共通の予め定められた３′末端を有する。

チオヌクレオチドの位置は消化フラグメントの長さによって示される。

Ｃ０この実施態様において、塩基配列を決定しようとする鋳型は一本鎖ＤＮＡであって、例えばＭ１３にクローニングされた挿入物である。この方法は次の工程：１）ａ）挿入物の３′末端に近接した（フタ−にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし：１）ｂ）その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、そして１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含み且つ挿入物に相補的である合成鎖を形成すべく重合反応を行わせｉｉｉ）ｃ）ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特定条件下で、ＤＮＡ鎖の３′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼによりその合成鎖を消化し：そしてｔｖ）ｄ）工程Ｃ）から得られたフラグメント混合物を大きさによυ分画化する；ことから成る。

工程Ｃ）で生じたフラグメントは共通の予め定められた５′末端を有するので、 −７エ程Ｃ）およびｄ）の間で切断を行う必要がない。

ラベイト（Ｓ、　Ｌａｂｅｉ　ｔ　）ら（ＤＮＡ、　Ｍｏｌ　５．　陥２．　１９８６゜１７３〜７頁）はこの実施態様に関する情報をさらに提供するだろう。

Ｄ、この実施態様は一本鎖ＤＮＡ、例えばＭ１３にクローニングされた挿入物から出発する。実施態様Ｃと異なって、これは共通の予め定められた３′末端をもつフラグメント群を生成する。

この方法はその工程：１）ａ）挿入物の３′末端に近接したベクターにオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし；１）ｂ）その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、そして１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含み且つ挿入物に相補的である合成鎖を形成すべく重合反応を行わせ；１ｉｆｅ）ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特定条件下で、ＤＮＡ鎖の５′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼでその合成鎖を消化し；ｊｉｌ　）　ｄ　）挿入物の５′末端に近接した位置で、例えば制限酵素で消化することにより、そのＤＮＡ１切断し、それにより合成鎖の全フラグメントに共通した所定の３′末端をつくり；そして１ｖ）ｅ）工程ｄ）から得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する；ことから成る。

工程ｂ）における鎖伸長は、挿入物を越えて伸びる標識フラグメントが塩基配列パターンを妨害しないように十分長くするべきである。

Ｅ、この実施態様は二本鎖ＤＮＡから出発し、次の工程：１）ａ）塩基配列を決定しようとする部分の一端に近接した、例えばファージｆ１タンパク質Ａの認識配列によって定められる位置で該タンパク質を用いて、一方のＤＮＡ鎖にニックを形成し；１）ｂ）その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、そして塩基配列決定部分の鎖長を伸ばし且つ１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含む合成鎖を形成すべくニックトランスレーションを行わせ；１）Ｃ）工程ａ）でニックが形成された位置に近接した位置で、例えば制限酵素で消化することによシ、そのＤＮＡを切断し：１ｉ）ｄ）ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特定条件下で、５′末端を攻撃する酵素（例えばラムダエキソヌクレアーゼ）によりその合成鎖を消化し；ｉｉｉ　）　ｅ　）塩基配列決定部分の他端（工程ａ）における一端に対して）に近接した位置でそのＤＮＡを切断し；そして１ｖ）ｆ）工程ｅ）から得られた共通の予め定められた３′末端工程ｂ）は好ましくは大部分のニックが塩基配列決定部分を完全に越えるまで継続すべきである。ちるいは、工程ｅ）が工程ａ）に先立って行われるだろう。

Ｆ、この実施態様は二本鎖ＤＮＡから出発する。実施態様Ｅと異なり、共通した所定の５′末端をもつフラグメント混合物が生成する。この実施態様は次の工程：１）ａ）塩基配列を決定しようとする部分の一端に隣接した、例えばファージｆ１タンパク質Ａの認識配列によって定められる位置でそのタン・ξり質を用いることにより、一方のＤＮＡ鎖にニックを形成し；１）ｂ）その反応混合物に特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、ニックトランスレーションを行わせて塩基配列決定部分の鎖長を伸ばし且つ１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含む合成鎖を形成し；１）Ｃ）ニックトランスレーション後にヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化ｔｍ止する特定条件下で、ニックの３′末端を攻撃する酵素（例えばエキソヌクレアーゼ■）でその合成鎖を消化し；ｔｉｔ）ｄ）工程ａ）でニックが形成された位置に近接した位置でそのＤＮＡを切断し；そして１ｖ）ｅ）工程ｄ）から得られた共通の所定５′末端を有するフラグメント混合物を大きさにより分画化する；ことから成る。

Ｇ、この実施態様は標的領域を含む二本鎖ＤＮＡから出発する。この方法は上記Ｃの方法と似ており、次の工程：１）ａ）二本鎖出発ＤＮＡを変性し；１）ｂ）１つのＤＮＡ鎖の標的領域の３′末端に近接してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし；１）Ｃ）その反応混合物に、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行わせて１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含み且つ標的領域に相補的である合成鎖を形成し；＋ｔ１ｄｌヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特定条件下で、ＤＮＡ鎖の３′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼで合成鎖を消化し；そして１ｖ）ｅ）工程ｄ）から得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する；ことから成る。

この方法は原則としてクローニングによって精製されたＤＮＡよりもむしろゲノムＤＮＡの塩基配列決定に適している。この反応中に放射性標識を組み込むことは、この種の標識が折シ返された反復配列のアニーリングのために多くの位置に挿入されるので、はとんど実行できないだろう。しかしながら、フラグメント群は電気泳動、固体支持体へのプロッティング、およびプライマーに相補的な標識プローブとのハイブリダイゼーションにより視覚化されるだろう。上記のＷａｒｄ　プロット塩基配列決定法と相違して、同一クローンから塩基配列を決定する必要がなく、また同一クローンからプローブを作る必要もない。プライマーの向きとプローブの向きとの不一致は存在せず、５′−３′エキソヌクレアーゼを必要としない。５Ｐ５−またはＴ７プロモーターを含むはフタ−中の適当なりローンを使用することにより、プライマーに相補的な高い比活性のＲＮＡプローブを作ることができる。

Ｈ，サイキ（Ｒ，Ｋ、　５ａｉｋｉ　）らはゲノムＤＮＡの特定領域の増幅方法について開示した（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２３０　（４７３２）。

１９８５年１２月、１３５０〜１３５４頁参照）。標的配列の両末端で相対するＤＮＡ鎖にアニーリングする２つのプライマーを用いて、ａＮＴＰおよび１クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）’　＃？リメラーゼの存在下に、変性ゲノムＤＮＡ上でＤＮＡ合成を開始する。

この反応後、混合物を加熱して新しいＩ）ＨＡを変性し、同じプライマーをもとの２つのＤＮＡ鎖と新しいＤＮＡ鎖の両方にアニーリングさせ、より多くの酊素を加えて、再び標的配列の量を２倍にする（第２図参照）。この変性−合成サイクルは所望によシ燥り返し行われ、１０５以上の増幅へ導くことができる。

第１の伸長反応後、多か九少なかれ完全に再合成される分子（次回の合成のための開始部位がコピーされねばならない）のみがさらに増幅されることに注意すべきである。

本実施態様はこの増幅方法を利用する上記Ｇの変法である。

この方法は次の工程：１）ａ）二本鎖出発ＤＮＡを変性し；１）ｂ）両方のＤＮＡ鎖の標的領域の３′末端に近接してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせ；１）Ｃ）その反応混合物、特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を含めたヌクレオチド類を添加し、重合反応を行わせて１つまたはそれ以上の位置にヌクレオチド誘導体を含み且つ測鎖の標的領域に相補的である合成鎖を形成し；１）ｄ）得られた二本鎖ＤＮＡを変性し；１）ｅ）必要に応じて工程１）ｂ）および１）　Ｃ）および１）ｄ）を燥シ返し行って標的領域の所望濃度を達成し；１ｔ）ｆ）ヌクレオチド誘導体によって占められた位置での消化を阻止する特定条件下に、ＤＮＡ鎖の３′末端を攻撃するエキソヌクレアーゼでその合成鎖を消化し；ｉｖ）ｇ）工程ｆ）から得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する；ことから成る。

このような増幅反応中に適当なレベルの特定５ａＮＴＰを組み入れて、その後エキソヌクレアーゼ■で消化すると、増幅反応において用いた２つのプライマーにより定められる５′末端と特定５ａＮＴＰにより定められる３′末端をもつ高度に増幅された分子集団が形成される。大量の標的ＤＮ八は、電気泳動およびプロッティング後に、プライマーの一方または他方に相補的な末端標識化オリゴヌクレオチド・・イズリダイゼーションプローブによるフラグメント群の視覚化を可能にする。別法として、標識された（恐らくは非放射性標識によシ）プライマーの一方または他方を増幅反応中番で使用して、プロッティングおよびハイブリダイゼーション工程を省くことが可能である。

要約すると、チオシーフェンシング法は増幅なしでゲノムの塩基配列決定に利用できる（実施態様Ｇ）が、その利用可能性は増幅により大いに高められるだろう（実施態様Ｈ）。とりわけ、増幅はゲノムの非放射性塩基配列決定を可能にする。

多くの場合に、これらの方法は反応を同時に行うことにより単純化することができる。

８つの実施態様において説明したこれらの方法の多くの変法が本発明に従って可能であり、当業者には容易に考えつくであろう。

実施例１０．５　μ９のｐ　Ａ　Ｔ　１５３　を４単位のＢａｍＨ１および１０　単位のエキソヌクレアーゼ■と共に（９）μＥの１２５　ｍＭ　ＮａＣｌ、　５０　ｍＭトリスＨ（Ｊ（ｐＨ７，５）　、１０　ｍＭ　Ｍ９Ｃ７１！２および５ｍＭジチオトレイトール中で混合し、室温で４５分間インキュベートした。この試験管ヲ７０℃で１００間加熱した。１５μｅを別の試験管に移し、ヌクレオチド類を加えて１８μｅの最終容量中で次の最終濃度とした：　２００μＭ　ａＧＴＰ、２００μＭ　ａＴＴＰ、２００μＭ　ｄＡＴＰ。

５０μＭ　ｃｔＳｄＡＴＰ、この容量はまた１０マイクロキユリーのα３２Ｐ− ｄＣＴＰ（比活性的３０００　Ｃ１／ｍｍｏ６　）　オよび４単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■１クレノウ１フラグメントを含んでいた。

この混合物を室温で１０分間インキュベートした。１μｌの５ｍＭ　ａＣＴＰを加え、この混合物を室温でさらに１５分間インキュベートした。

この試験管を７０℃で１０５＋間加熱し、１０単位のエキソヌクレアーゼ■を１ μｌの容量中に加えた。この混合物を室温で１時間インキュベートした。熱失活工程（７０℃、１０分）の後５単位を含むＣ１ａ１溶液１Ａｇを加え、この混合物を３７℃で１５分間インキュベートした。

加μｌの次の溶液：３■ブロモフエノールブルー、３ｍ７キシＬ／７シ７／　− ル、　２Ｄｔｔｌ　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐ）ｆ８）、１ｗｔ１脱イオンホルムアミビを加えた。

１μｌアリコートは７Ｍ尿素を含む５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、富士Ｘ線フィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。得られたオートラジオグラフはゲルの最下部に存在するｐ　Ａ　Ｔ　１５３のＣ６ａ１　部位に近いところからＢａｍＨ１部位の方へ伸びる１Ａ−トラック”を表し、この部分の既知塩基配列を正確に示していた。

実施例２ＳａＮＴＰおよびエキソヌクレアーゼ■を使用するスーパーコイルプラスミド□ ＢＲ３２２のＢａｍＪ部位とＨｉｎａｌＩ［部位の間の部分的塩基配列を次の方法により決定した。

１．３μ９のｐＢＲ３２２を６単位の制限エンドヌクレアーゼＢ　ａ　ｍ　ＨＩおよび加単位の大腸菌エキソヌクレアーゼ■と共に加ｐｇの５０ｍＭ）すｘＨＣｌ（ＰＨ７，５）、７５ｍＭＮａＣｊｉ’、１０ｍＭＭｇＣＪｚおよび５ｍＭジチオトレイトールの存在下に混合した。この混合物’ｅ３７℃　で４５分間インキュベートした。

２、反応を停止させ、７０℃で１０分間加熱することによシ酵素を失活させた。

３、工程２からの混合物１０μｇを６μｌの１００ｍＭ　）リスＨＣ６（ｐＨｓ、ｏ　）　、５０　ｍＭ　ＭｇＣ６２、４ｊｆＬ位ノ大ｋＭ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｄ” 　！ｊ　メラーゼ１クレノウ１フラグメントと混合し、水を加えて６０μｌとした。

４、工程３からの混合物をＡ、Ｇ、ＣおよびＴと指定した１５μｇずつの４つの部分に分けた。各反応混合物に１５マイクロキュリーノα３２Ｐ−＋１ｃＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏ＃）を加え、続いて下記の適当なヌクレオチド混合物２ μｌを加えた：１ｍＭａＧＴＰ　’　１ｍＭｄＡＴＰ　１ｍＭｄＡＴＰ　１ｍＭｄＡＴＰｉ　ｍＭＴＴＰ　１　ｍＭＴＴＰ　１　ｍＭａＧＴＰ　１　ｍＭａＧＴＰ５０　μＭａｃＴＰ　５０Ａ１ＭｄＣＴＰ　１　ｍＭＴＴＰ　５０　ＢＭｄｃＴＰ８５０μＭｄＡＴＰ　８５０μＭｄＧＴＰ　４２．５ｍＭｄＣＴＰ　９５０ μＭＴＴＰ１５０μＭａＡＴＰαＳ　１５０μＭｄＧＴＰαＳ　７．５ｍＭａＣＴＰａＳ５０μＭＴＴＰαＳこれらの混合物を室温で１０分間インキュベートした。

５、Ａ、ＧおよびＴの反応混合物に１Ａｇの２ｍＭｄＣＴＰを加え、そしてＣ反応混合物に１Ａｇの１．４ｍＭ　ａＣＴＰおよび０．６ｍＭ　ａＣＴＰαＳ　を加えた。これらの混合物を室温でさらに１０分間インキュベートＬｉ。

６、反応を停止させ、７０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素を失活させた。

７、Ｌ５μｌＪの７５０ｍＭ　ＮａＣｊｌ！、５００ｍＭ　）すｙ、　Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）　。

１００　ｒｒＭ　ＭｇＣｌ２　、５０　ｍＭジチオトレイトールおよび２単位のエキソヌクレアーゼ■を加えた。これらの混合物ヲ３７℃でＩ分間インキユイートシた。

８、工程７からの反応混合物は酵素を失活させるために７０℃で１０分間インキユベートシた。

９、工程８からの各反応混合物に５単位の制限エンドヌクレアーゼＨｉｎａ　［１を加え、３７℃で１５分間インキュベートした。

１０、その後各試験管にホルムアミド含有泳動用染料を加え、アリコートを変性条件下に６％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。

１１、ゲル上の標識ＤＮＡフラグメントを視覚化するためにオートラジオグラフィーを行った。プラスミド’ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄ　Ｉ［［部位の間にある領域の大部分の塩基配列を正確に読み取ることができた。

実施例３ＳａＮＴＰおよびエキソヌクレアーゼ■を使用するこの実験方法は実施例２と同様であったが、実施例２の工程４および５の代わりに次の工程を行った。

４．５．工程３からの混合物ｔ−Ａ、、　Ｇ、ＣおよびＴと指定した１５μｇずつの４つの反応混合物に分けた。１５マイクロキユリーの（（Ｉ−５）ａＡＴＰ　Ｓ　（比活性１０００　Ｃ１／ｍｍｏｌ）るＡ反応混合物に加え、そして同量の〔α−３５Ｓ）ａＧＴＰ　Ｓ、（α−３５Ｓ〕ａＣＴＰ　Ｓおよび〔α−３５Ｓ）ＴＴＰ　ＳをそれぞれＧ、ＣおよびＴ反応混合物に加えた。また、２μｌの次の混合物を添加した（Ａ混合物はＡ反応混合物へ）。

１　ｍＭ　ｄＧＴＰ　１　ｍＭｄ　ＡＴＰ　１　ｍＭａ　ＡＴＰ　１　ｍＭｄ　ＡＴＰｌｍＭＴＴＰ　１ｍＭＴＴＰ　１ｍＭＴＴＰ　１ｍＭｄＧＴＰ１　ｍＭｄＣＴＰ　１　ｍＭｄｃＴＰ　１　ｍＭｄＧＴＰ　１　ｍＭｄＣＴＰ４０μＭａＡＴＰ　８０μＭａＧＴＰ　２０μＭａＣＴＰ　２００μＭＴＴＰこれらの反応混合物は室温で１０分間インキュベートした。

実施例２の工程１１のようにオートラジオグラフィーを行った後、プラスミド＃ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ工　部位とＨｉｎｄ［［部位の間にある領域の大部分の塩基配列を正確に解読することができた。

坤Ｘ句神＼カ国際調査報告一４智Ｉ西ｔ−り１１１１ム帥噂會−ｘＮｏ、ＰＣＴ／ＧＢ８６１００３４９

Claims

【特許請求の範囲】

１．１）一方の鎖が標的であり且つ他方の鎖が特定条件下で消化に抵抗するヌクレオチド誘導体を１つ以上の位置に含む合成鎖である塩基配列を決定しようとする二本鎖部分を有する核酸鎖を準備し；ｉｉ）上記ヌクレオチド誘導体によって占められる位置での消化を阻止する特定条件下でエキソヌクレアーゼにより該合成鎖を消化し；ｉｉｉ）まだ存在しない場合には、合成鎖のすべてのフラグメントに共通する予め定められた末端をつくり、工程ｉｉｉ）は工程ｉｉ）の前または後に行い；ｉｖ）得られたフラグメント混合物を大きさにより分画化する；ことから成るポリヌクレオチドの塩基配列決定法。
２．ヌクレオチド誘導体はチオーヌクレオチドである、請求の範囲第１項記載の方法。
３．エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはラムダエキソヌクレアーゼである、請求の範囲第２項記載の方法。
４．合成鎖は重合条件下でヌクレオチド誘導体を含むヌクレオチド類を使用することにより形成される、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
５．標的を含む反応混合物を４つの部分に分け、それぞれの部分にヌクレオチド類および異なるヌクレオチド誘導体を加える請求の範囲第４項記載の方法。
６．塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは二本鎖Ｄ　Ａであり、その二本鎖ＤＮＡをエキソヌクレアーゼ酵素で消化して標的を得る、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
７．塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡであり、その３′末端に近接してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
８．塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡであり、合成鎖はヌクレオチド誘導体を含むヌクレオチド類の存在下でニックトランスレーションを行うことにより導入する、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
９．塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドは標的領域を含む二本鎖ＤＮＡであり、その二本鎖ＤＮＡを変性して、一方の鎖またはそれぞれの鎖の３′末端に近接してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする、請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載の方法。
１０．オリゴヌクレオチドプライマーを両鎖の３′末端に近接してアニーリングし、重合条件下でヌクレオチド誘導体を含むヌクレオチド類を使用することにより合成鎖を形成し、得られた二本鎖ＤＮＡを変性し、アニーリング、重合および変性の各工程を繰り返し行って標的領域を増幅する、請求の範囲第９項記載の方法。
１１．塩基配列を決定しようとするポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡである、請求の範囲第９項または第１０項記載の方法。
１２．工程ｉｖ）におけるフラグメント混合物の大きさによる分画化は変性ゲル電気泳動により行う、請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項に記載の方法。
１３．フラグメントの視覚化は合成鎖の合成中に取り込まれた標識を用いて行う、請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．フラグメントの視覚化は標識プローブとのハイブリダイゼーシヨンにより行う、請求の範囲第１２項記載の方法。