JPS63500376A - ヒト内来性癌制御因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト内来性癌制御因子 本発明の分野 本発明は、新規な低分子ヒト内来性癌制御因子、その製造法およびそれらを含む 薬剤組成物に関する。

本発明の背景 本発明者等は、先にヒト単球系細胞またはそのクローン株を組織培養培地で培養 し、新規な生物学的活性物質であるヒト内来性癌制御因子（Ｋｒｅｂｓ　５ｔａ ｔｉｋａ；　ＫＢＳ）を単離した。このＫＢＳには２つのタイプ、即ち相対分子 量が８２，０００±１０，０００．等電点がｐＨ６，５±０．５のものと、相対 分子量が５０，０００以上７２，０００未満の範囲、等電点がｐＨ６，０〜８． ５の範囲のものとがあった（特願昭５８−１２８８９３号及び５９−９９３７０ 号）。後者のタイプのにＢＳは等電点の違いにより更にＫＢＳ−α（約ｐｉ（６ ，５）　、　ＫＢＳ−β（約ｐＨ７，０）及びＫＢＳ−γ（約ｐＨ８，０）の３ 種類に分けられた。このＫＢＳは、ヒト細胞由来の生物活性物質の一群であり、 ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏに於て多種の腫瘍に対し強力な抗腫瘍活性 を有することから、癌の自然治癒等の際に極く微量患者生体内に産生される物質 の１つであると考えられる。

本発明者等は、更に研究した結果、このＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変 性剤で処理すると予想外に新規な生理活性物質が得られることを見い出した。Ｋ ＢＳ由来のこの新規な生理活性物質は抗腫瘍活性物質であり相対分子量が１７， ０００〜３０，０００の範囲内にあるものである。相対分子量が２０，０００〜 ３０，０００の範囲、特に２２，５００±１，５００の範囲のフラクションが最 も好ましい。本発明の抗腫瘍活性物資はＫＢＳに比べて低分子量であることから 、低分子ヒト内来性癌制御因子（ｎｉｅｄｅｒ　Ｋｒｅｂｓ　５ｔａｔｉｋａ： 　ｎ−ＫＢＳ）と命名した。

本発明の開示 本発明の低分子ヒト内来性癌制御因子であるｎ−ＫＢＳは、にＢＳ（相対分子量 ５０，０００〜９２，０００、等電点ｐＨ６，０〜８．５）を還元剤及び／又は タンパク質変性剤で処理することにより製造される相対分子量が１７，０００〜 ３０，０００の範囲の抗腫瘍活性を有する新規なタンパク質である。それ故、本 発明のｎ−にＢＳは、ＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理するこ とにより分離されたもので、ＫＢＳのタンパク質高次構造（ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒ ｄｅｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ）の少なくとも一部が破壊さ れたり、ジスルフィッド結合の少なくとも一部が切断されたＫＢＳを構成するサ ブユニットの一つであると考えられる。かかる本発明のｎ−ＫＢＳは、ＫＢＳと 同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏに於て多種の腫瘍に対し強い抗腫瘍 活性を有し、その上ｉｎ　ｖｉｖｏで腫瘍憤死作用も示す。また、ＫＢＳと同様 ヒト細胞由来である本発明のｎ−ＫＢＳは、生体にとって異物とされず抗原抗体 反応を起こす可能性が、仮にあったとしても、著しく少ないものと考えられる。

なお、本発明のｎ−ＫＢＳは、タンパク質再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　あるいはジスルフィッド結合の再形成により、もとのに ＢＳとすることも可能である。

図面の簡単な説明 第１図はｎ−ＫＢＳの電気泳動後のＫＢＳ活性溶出パターンを示す（実施例１） 。図中縦軸は各ゲル切片から回収したＫＢＳ活性を、また横軸は各ゲル切片の分 取画分番号を示す。矢印は、標準蛋白質の泳動位置を示す。ＴＦはヒトトランス フェリン（分子量７６．０００）　ヲ、Ｈ５Ａハヒト血清アルフミン（分子量６ ７．０００）を、　ＯＶＡは卵白アルブミン（分子量４３，０００）を、　５Ｂ ＴＩはソイビーン　トリプシン　インヒビター（Ｓｏｙｂｅａｎ　ｔｒｙｐｓｉ ｎ　１ｎｈｉｂｉｊｏｒ　、分子量２１．５００）を、そしてＨＧはヘモグロビ ン（分子量１５，５００）をそれぞれ示す。

第２図は主断片ペプチド及びｎ−ＫＢＳの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（２−メルカプト エタノール存在下の５０５−ＰＡＧＥ）　の電気泳動図を示す（実施例１）。

またはそのクローン株を組織培養系で培養し、相対分子量が５０，０００〜９２ ，０００の範囲で、等電点がｐＨ６，０〜８．５の範囲のにＢＳを生成させ、次 いでこのＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理することによって製 造される。更に具体的には、ＫＢＳを産生ずるヒト由来の単球系細胞の正常細胞 若しくはその癌化細胞またはそれらのクローニング株を組織培養系で培養し、第 １刺激及び第２刺激を行フて相対分子量が５０，０００〜９２，０００で等電点 がｐＨ６，０〜８．５のにＢＳを生成させ、次いでこのＫＢＳを還元剤及び／又 はタンパク質変性剤で順次処理する。

本発明で使用するヒト由来の単球系細胞の正常細胞またはその増殖し得るもので あれば更によい。

特に好ましいものは単球マｙアージ系の癌化細胞であり例えばＨＬ−６０、ある いはモノサイトロイケミャ（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　Ｌｅｕｋａｅｍｉａ）由来の末 梢血白血球の臨床分離確立株より　選択株化した単球系癌化細胞であるＹＫＢＳ −７−１５、ＹＫＢＳ−７−１６、ＹＫＢＳ−７−１７、更にこれらの細胞を選 択クローニング株化したクローン株が挙げられる。

クローン株としては、例えばＹＫＢＳ−７−１５のクローン２Ａ２．２Ａ６．２ ０６．３Ａ１．３Ｂ３．３Ｂ４．３Ｃ１，３０５，４Ｂ３等が挙げられる。

以下にクローニングの典型的な例として、既に分離確立したＹＫＢＳ−７−１５ （特願昭５８−２３９３５５号）からの所望のクローン株のクローニング方法を 示す。

希釈法により１−２個細胞／ウェルの濃度になるように、予め１ｘ１０６個のマ ウス胸腺細胞をフィーダー細胞として播いた９６穴マイクロプレートに入れ、３ ７℃、５！に−ＣＯ２，９５！！−ａｉｒ下で培養を重ね、コロニーが見えるよ うになったとき、順次２４六マイクロプレートに移して培養増殖した。次いでＫ ＢＳ産生能の高い細胞クローンを選択した。ついで、順次スケールアップしなが ら同様の操作を重ねてにＢＳ産生能の最も高いクローン株として２Ａ２．２Ａ６ ．２Ｃ６，３Ａｌ、３Ｂ３．３Ｂ４．３Ｃ１，３０５及び４Ｂ３等を得た。

上述の確立細胞株”／ＫＢＳ−７−１５、ＹＫＢＳ−７−１６、’ｆｆＢｓ−７ −１７は、東京大学医科学研究所と本発明者等がヒトモノサイトロイケミア（） ｌｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｌｅｕｋａｅｍｉａ）である急性単球性白血病 患者の末梢血軟層白血球より、常法により（塩化アンモニウム処理して混入赤血 球除去する処置を含む）培養株化した単球系の癌化細胞であって、ＹＫＢＳ−７ −１５はパスツール研究所のＣ，Ｎ、（：、Ｍ、に、１９８４年２月２９日にｌ −２５８として寄託されている。また、上述のＹＫＢＳ−７−１５から選択クロ ーニング株化したクローン株ＹＫＢＳ−４８３もＣ，Ｎ、ＣＪ、に、１９８４年 ７月２５日にｌ−３１９として寄託されている。

その他、単球マクロファージ系の癌化細胞としては、Ｍｏｎｏ−１及びＭｏｎｏ −１−２０７（Ｖｉｒｃｈｏｗ　Ａｒｃｈ、　Ａ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ａｎａｔ −Ｈｉｓｔｏｌ、　３７１．１５（１９７６）及び史、２６９　（１９７Ｂ）） が挙げられる。

更に、これら単球系細胞には単球細胞になり得る細胞も本発明で使用することが できる。そのような細胞は最終的に単球系白血病像を示すようになる細胞であり 、例えば骨髄性悪性細胞が挙げられる。

これらの細胞は、通常は牛脂児血清を含有する人工栄養培地中で組織培養される 。例えば、実施例１で用いた、ＹＫＢＳ−７−１５のクローン株ＹＫＢＳ−４８ ３は、１０％；ｌ’（：Ｓ　（Ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ、牛脂児血清 ）　、１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（和光純薬）、５０ｍｇ／ｊＺカナマイシン及び ２５ｍｇ／　ｆ）、ストレプトマイシンを含有する人工栄養培地であるＰＭＩ− １６４０培地（ＧＩＢ（：Ｏ社製）において良好に増殖する。ここに用いたカナ マイシン及びストレプトマイシンの代わりに、他の抗性物質ペニシリン、ゲンタ マイシン、シソミシン等を使用することもできる。また、該細胞は血清を含まな い無血清人工栄養培地、例えばＨＢＩＯＩ”　（Ｈａｎａ　Ｂｊｏｌｏｇｉｃｓ 　Ｉｎｃ、）またはＴＳＣＯＶＥ’Ｓ培地（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）に於ても組織培養することが可能であり、更に人以外の温血動物、例えばヌー ドマウスや幼若ハムスターの腹腔内、皮下に於ても充分増殖が可能である。本発 明で使用される組織培養系にはかかる　ｉｎ　ｖｉｖｏの増殖培地も含まれる。

本発明で使用する第１刺激物質としては、リンパ球系あるいはリンパ芽球系の条 件培養液（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）、　白血球を分化誘導する 化学物質あるいは自然抽出物やそれ等の組み合せが用いられる。更にある種の化 学物質例えばトリコテラセンマイコトキシンを投与した哨乳動物の免疫担当細胞 の培養上清も同様に第１刺激物質として用いられる。白血球を分化誘導する化学 物質あるいは自然抽出物としては、例えばフィトヘマグルニチン（ＰＨＡ）が挙 げられるがムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、１２−〇−テトラデカノイルフォル ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）、１２．１３−フォルホールブチレートキ シド ファージ活性化物質が更に好ましい。

更に、網内系賦活化作用を有する物質も本発明における第１刺激物質として使用 することができる。網内系賦活化作用を有する物質としては通常ダラム陽性菌、 カビ産生物質、原生動物または酵母が用いられ、生菌状態、死菌状態（例えば熱 処理やホルマリン処理後）または菌体抽出成分として用いられる。ダラム陽性菌 としては例えばＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｎｅｓ　（Ｃｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｉｕｍ 　ｇｒａｎｕｌｏｃｕｍ　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｒａｎｕｌｏ ｃｕ＋＋＋）のようなＰｒｏｐｉｏｒ＋ｉ　ｂａｃｔｅｒｉａ，　Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　にａ１ｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　（Ｂ．Ｃ．Ｇ．）、Ｍｙｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｓｅｇｏ＋ｅｎｔｉｓのようなＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ，および Ｎｏｃａｒｄｉａｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ，　Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｇａｒｄｎ ｅｒｉのようなＮｏｃａｒｄｉａが挙げられる。カビ産生物質としてはＦｕｓａ ｒｉｕｍ系の産出する毒素が挙げられる。原生動物としては、例えば、マラリア 原虫、トキソプラズマが挙げられる。酵母の場合は、通常、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどから抽出した２ｙｍｏｓａｎが用いられる 。また、ビランコーポリマーのような合成高分子を用いることもできる。

本発明で使用する第２刺激物質とはグラム陰性菌またはダラム陽性菌より得られ たエンドトキシンを意味する。かかるエンドトキシンとしては、例えば大腸菌、 緑膿菌、チフス菌由来のりポボリサッカライドが挙げられる。この他、ダラム陽 性菌のりボボリサッカライドも良好な成果で用いることができる。

ＫＢＳは、ヒト由来の単球系細胞の正常細胞またはその癌化細胞を人工栄養培地 、血清及び他の栄養素を含む通常の組織培養培地で培養し、その培養前、培養中 あるいは培養後に第１刺激物質を作用させ、次いで第２刺激物質を作用させるこ とによって誘導生成することができるのである。このように該細胞からＫＢＳを 誘導生成させるには、通常は２回の刺激によフて行われるが、いずれか一方のみ でもあるいはまったく刺激しなくとも生成するものと考えられる。しかし乍ら、 最も普通には該細胞を通常の組織培養系で充分培養した後、その培養系に第１刺 激物質（例えばＴＰＡの場合は０、１〜１００ｎｇ／ｍｊＺ）を加えて第１刺激 を行い、更に培養例えば１２時間〜３日培養後に第２刺激物質（例えば大腸菌由 来のりボポリサッカライドの場合は０．１〜１０μｇ／ｍＩＬ）を加えて第２刺 激を行い更に培養例えば８〜２４時間培養すると培養上滑中ににＢＳが誘導生成 される。

このようにして誘導生成したＫＢＳは、一旦採取しもしくは採取せずに還元剤及 び／又はタンパク質変性剤で処理することによって、本発明のｎ−ＫＢＳが製造 される。にＢＳを採取する場合は公知の精製、分離法、例えば透析、塩析、限外 濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを使用することによって行われる。更に高 度の特製を必要とする場合には、例えばイオン交換体への吸着、次いで溶出、ゲ ル濾過およびコンカナバリンＡセファローズあるいは適当な抗体などを用いたア フィニティークロマトグラフィー、等電点分画、高速液体クロマトグラフィー、 蛋白用高速液体クロマトグラフィーなどを用いたクロマトフオーカシング法及び イオン交換法（例えばＦＰＬＣＭｏｎｏ−Ｐ，　Ｍｏｎｏ−Ｑカラム、７フルマ シア社製）、又はポリアクリルアミドゲルを用いたスラブ若しくは調整用電気泳 動などの方法を組合わせることができる。通常は、ＫＢＳを含有する培養上清を 遠心分離等により培地から採取し、該上滑を陰イオン交換体を用いて精製した後 、他の方法を適宜組合わせて精製する。

陰イオン交換体としては例えばＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０、ＤＥＡＥ− セファロースＣＬ−６８，　ＤＥＡＥセファセル、ＱＡＥ−セファデックスＡ− ５０　（以上ファルマシア社製）、ＡＩＥＣＤＥ　５２　（ワットマン社製）、 Ｓｅｒｖａｃｅｌ　ＡＥ　（セルバ社製）、　Ｃｅｌｌｅｘ　ＱＡＥ　（バイオ ランド社製）が挙げられる。

次に、このように誘導生成したＫＢＳを還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処 理して本発明ｎ−ＫＢＳを製造する。これらの処理手段は、当該分野で通常採用 されている手段が採用される。

具体的には、還元剤としては２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、 ジチオエリスリトール、チオグリコール酸、モノチオリン酸、システィン、Ｎ− アセチルシスティン、還元型グルタチオン等のチオール系化合物ニトリ−〇ーブ チルホスフィン、トリスジエチルアミノエチルホスフィン等の第３級ホスフィン ：亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩等のばか水素化ホウ素ナトリウム等が挙げられ る。タンパク質変性剤としては、尿素、塩酸グアニジン、硫酸グアニジン、界面 活性剤等が挙げられる。界面活性剤は陰イオン性、陽イオン性及び両性のイオン 性界面活性剤だけでなく、非イオン性界面活性剤が挙げられる。具体的な界面活 性剤としては例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、ソルビタン脂肪酸 エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエー テル、ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ジー２−エチルへキシルス ルホコハク酸ナトリウム、ドデシルトリメチルアンモニウムプロミド、デオキシ リゾレシチン等が挙げられる。

処理は穏和な条件下に行われる。例えばＫＢＳを水又は適当な緩衝液に溶解した もの、あるいはＫＢＳを含有する画分に還元剤及び／又はタンパク質変性剤を添 加することによって行われる。

処理の条件例えば、還元剤及び／又はタンパク質変性剤の濃度、処理温度（通常 は室温）、処理時間、処理ｐ）Ｉ等は、用いるＫＢＳの濃度等により適宜選択さ れる。また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、還元剤及び／又 はタンパク質変性剤の存在下に行うことによってにＢＳからｎ−ＫＢＳを製造す ることができる。更に、還元剤及び／又はタンパク質変性剤の共存下にデキスト ラン、ポリアクリルアミド、アガロースなどのゲル粒子（例えばセファデックス Ｇ−５０、Ｇ−７５、セファクリルＳ−２００、バイオゲル製造することができ る。

このようにして製造し、回収し、精製した本発明のｎ−にＢＳは次の特性を有す る： （１）　分子量 ２−メルカプトエタノール及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）の存在下でデ ィスクポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により測定すると、ｎ−Ｋ ＢＳ　（１）相対分子量は１７，０００〜３０，０００テある。

（２）主断片ペプチド ｎ−ＫＢＳの臭化シアン分解による主断片ペプチドの相対分子量は約１８，５０ ０でる。

（３）部分アミノ酸配列 ｎ−ＫＢＳは以下の部分アミノ酸配列を有する。

ＧＩｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ＡＩａ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｘ　１− Ｐｒｏ−ＡＩａ−Ｘｚ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ （式中Ｘ、と×２とは各々１個のアミノ酸残基を示す。）（４）　アミノ酸組成 ｎ−ＫＢＳはＣｙｓ及びＴｒｐに加え以下のアミノ酸を含有する：Ｌま１酸　金 １３〕ソに莢Ｌ Ａｓｐ／Ａｓｎ　９．９ Ｇｌｕ／Ｇｌｎ　Ｉｌ、３ （上記アミノ酸含量は、Ｃｙｓ及びＴｒｐを除く全アミノ酸残基に対する各アミ ノ酸残基数の割合をモル％で表わしたものである。変動係数は通常±１５％であ るが、この範囲をこえる場合もある。） （５）高速液体クロマトグラフィーでの保持時間ＴＳＫゲルＧ２０００　ＳＷカ ラム（７−５ｎ＋ｍ　ＴＤＸ６０ｃｍ）を用い、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ Ｈ６，０）　／　５．５Ｍ塩酸グアニジンを溶出液とし、流速０．５ｍ４７ｍ１ ｎ室温で溶出させるとき、ｎ−ＫＢＳは２８分の位置に一本のピークとして認め られた。

以下に本発明のｎ−にＢＳの抗腫瘍作用を示す。

３ａｌｂ／［、マウスで縫代維持したマウス由来Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｒａｎｔｈ ｒｅｎｅ　Ａ誘発肉腫（Ｍｅｔｈ　Ａ）の５Ｘ１０５個細胞をＢａ１ｂ／Ｃマウ ス（♀、７週令）背部皮肉に移植し、７日後に腫瘍径を測定した。次いで段階希 釈した実施例１で製造した分子量２２，５００のｎ−ＫＢＳを０．５ｎ＋Ｍ静脈 注射した。

投与９日後に腫瘍径を測定した結果、全試験群で完治が認められた。更に腫瘍の 退縮が認められた全マウス例で、その後も腫瘍の退縮化が進行し、完全な退縮、 即ち移植したＭｅｔｈ　Ａは完全に脱落し、完治した。これに反して、対照群で は１９日日目は移植した腫瘍の直径は１．５ｃ［１１以上に増大し、４０日０以 降にはほぼ金側が死亡した。

本実験から明らかな様に、本発明のｎ−ＫＢＳに強力な抗腫瘍作用が認められた 。

また、本発明のｎ−ＫＢＳは、ヌードマウスで継代維持したヒト由来胃癌細朧株 ＭＫＮ−４５を移植したヌードマウスの実験腫瘍系に於て原生等の方法［日本臨 床４０巻（８号）　１８６−１９３頁（１９８２年）］に従い腫瘍壊死効果を検 討すると、強い腫瘍壊死効果を示した。更に本発明のｎ−ＫＢＳは、Ｓａｒｃｏ ｍａ　１８０、Ｅｈｒｌｉｃｈ固定癌、Ｐ３８８固型癌、Ｌｅｗｉｓ　Ｌｕｎｇ 　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ等の腫瘍に対し強力な抗腫瘍作用を有していた。

本発明の低分子ヒト内来性癌制御因子（ｎ−にＢＳ）の生物活性（にＢＳ活性） は、哨乳動物由来の正常または癌化細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏによる細胞障害試験 による評価によった。すなわち、Ｃａｒｓｗｅｌ　１氏らの方法プロシーデイン ダス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブサイエンシズ　オブ　ザ　ユナイ テッド　ステイッ　オブ　アメリカ［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　］　７２巻　（Ｎｏ、９）　３６６６〜３６７０頁（１９７５年 ）に基づき行った。試験はヌンク社製（デンマークノの９６穴マイクロプレート を使用し、１０％の牛胎児血清、さらにカナマイシン５０μｇ／ｍＩｌ、ストレ プトマイシン２５μｇ／　ｍｆｆ１、ゲンタマイシンあるいはシソミシン５０単 位／ｒｎｆＬを含むイーグルの最少必須培地（ＭＥＭ培地）とＬ　ｃｅｌｌ　（ Ｓ）を用いて行った。２．５　Ｘ　１０’個のし細胞および同容量の希釈試料を ５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で培養し、培養４８時間後、顕微鏡下で細胞に 対する致死変性効果を観察し、力価の表示はＬ　ｃｅｌｌの５０％を殺すために 必要な生物活性量を１単位（Ｕ）とし、試料の力価はその希釈度から算出した。

本発明によって得られた癌制御因子を医薬として使用するには、抗腫瘍効果を完 全に発現するのに都合のよい形で投与する。本発明の癌制御因子はそのままの状 態で投与することもできるが、製薬上の慣習に従って製薬的に許容し得る希釈剤 及び／又は他の薬理作用物質との混合物として組成された状態でも提供され得る 。従って本発明の癌制御因子は、経口的又は非経口的に投与するための形態を適 宜に採り得る。例えば散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル、ビル、生薬、懸濁 剤、液剤、乳剤、注射剤、エアゾール剤である。

通常は本発明の癌制御因子を予め凍結乾燥し、使用に先立ち生理食塩水、滅菌水 、無菌の注射用等張渡等により溶解し、静脈、皮下または筋肉注射などにより患 者に投与される。この製剤化は、先の凍結乾燥に先立ち各種安定化剤例えばマン ニトール、ヒト血清アルブミンなどを添加し、溶解補助剤例えばグリシンを添加 することも可能である。

本発明の癌制御因子の投薬量は、患者の感受性差、年令、性別、体重、投与方法 、投与の時期、間隔、病状、体調、医薬製゛剤の性質、調剤の種類等種々の原因 によって変動する。従って下記に示す投薬量は目安であり最小値より少ない量で 十分な場合もあり、又ある場合には下記投薬量をこえて投与する必要の生ずるこ ともある。しかし乍ら、通常、成人の患者に対する投薬量は１日当り１万年位以 上である。

以下に処方例および実施例を示し本発明をより具体的に述べるが、本発明はこれ らの例示に限定されるものではない。

処方例（注射剤） 本発明のｎ−ＫＢＳ１００万単位を１００ｍ　ｆｔの生理食塩水に溶解し、無菌 的に濾過し、濾液を減菌したバイアル１ｍｕずつ充填し、凍結乾燥する。

なお、本発明において、アミノ酸を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生 化学命名委員会（Ｃ：ＢＮ）による略号あるいは当該分野における慣用略号に基 づくものとする。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合は、特に明示 しなければＬ一体を示すものとする。

Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｇｌｕ　グルタミン酸 Ｇｌｎ　グルタミン ｃｉｙ　グリシン Ａｌａ　アラニン Ｍｅｔ　メチオニン Ａｓｐ／Ａｓｎ　アルバラギン酸およびアスパラギンＧｌｕ／Ｇｉｎ　グルタミ ン酸およびグルタミン実施例１ ａ）　ヒト白血病患者の末梢血軟層白血球由来の確立細胞株であ？）　ＹＫＢＳ −７−１５（単球系癌化細胞）ツクローン株ＹＫＢＳ−４８３を無血清培地ＨＢ ＩＯＩ”　（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　Ｉｎｃ、）　（８１）中、３７℃ で充分な期間攪拌培養後、ＴＰＡを５Ｎｇ／ｍｕ添加して第１刺激を行い、培養 ３６時間後にエンドトキシン（大腸菌０１１１：　Ｂ　４由来のりボポリサッカ ライド）１μｇ／ｍｕを加えて第２刺激を行い、培養１６時間後遠心分離により 培養上清を採取した。

該上清をベリコン限外濾過濃縮装置で約２０倍に濃縮後、４℃で最終５０％濃度 （Ｖ／Ｖ）になるように飽和硫酸アンモニウム水溶液を徐々に添加した。次いで ４℃で充分沈殿を熟成せしめた後、遠心分離する。得られる沈殿を０．０４　Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）の少量で溶解 した後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で充分透析した。透析後、０ ．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−セフ ァデックスＡ−５０陰イオン交換樹脂を充填したブフナー濾過器に付し、０．０ ８Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐｌ＋　７．８）で溶出した。溶出画分を 更にペリコン限外瀘Ａ濃縮装置で濃縮し、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液 にて充分透析した後凍結乾燥した。次いで乾燥粉末を少量の０．０４Ｍ塩化ナト リウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）に溶解し、ウルトロゲル　へＣへ４４カラ ムに付し、ゲルクロマトグラフィーを行い相対分子量が６０，０００±１０．０ ００の活性画分を得た。

当該工程の収率は約２５％であった。［この活性画分をタンパク用高速液体クロ マトグラフィーを用いたクトマトフォーカシング（ＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　Ｐカラ ム、ファルマシア社製）に付し、直線的濃度勾配法により等電点分画すると、等 電点約６．５（ＫＢＳ−α）、約７．０（ＫＢＳ−β）及び約８．０　（ＫＢＳ −γ）の位置にそれぞれにＢＳ活性が認められた。］ ｂ）　次いで当該活性画分（相対分子量６０，０００±１０，０００）を透析脱 塩濃縮後、Ｌａｅｍｍｌｉの方法［ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｕムロ８０ （１９７０）］により２２ｍＭ２−メルカプトエタノール及び０．１％ドデシル 硫酸ナトリウム　（ＳＤＳ）の存在下でディスクポリアクリルアミドゲル電気泳 動（ＰＡＧＥ）　［ゲル強度１２．５％ディスク８ｃｍ］に付した。電気泳動後 、ゲルを１ｍｍ間隔に切断し、各切片からタンパクを溶出させＫＢＳ活性を測定 した結果、相対分子量が２２，５００±１，５００に相当するフラクションでＫ ＢＳ活性が回復された。その結果を第１図に示す。かくして得られたｎ−ＫＢＳ の収率は約２５％であった。

該ｎ−ＫＢＳを用いて次の検討を行った。

（１）　アミノ酸組成： 該ｎ　−Ｋ　Ｂ　Ｓ　０．５〜１．Ｏｔｔｇを６Ｎ−塩酸０．１　ｍｊＺに溶解 し、減圧封管中で１１０℃２４．４８．７２時間加水分解した。加水分解後減圧 下に塩酸を除去し、０．３０〜０．３５　ａ＋ＩＬの０．０２Ｎ−塩酸を加えた ものを分析用試料とした。アミノ酸分析は日立８３５型アミノ酸分析機（日立製 作断裂）を使用しオルトフタールアルデヒドを用いる螢光法で行フた。２回の実 験結果に基づくアミノ酸組成を下記第１表に示す。

Ａｓｐ／Ａｓｎ　９．９±１．１ Ｔｈｒ　５．６±０．３ Ｓｅｒ　８．３　±　１．３ Ｇｌｕ／Ｇｉｎ　１１．３　±　０．７Ｐｒｏ　７．３　±　０．６ ｃｉｙ　９．８　±　０．８ Ａｌａ　７．６　±　０．１ Ｖａ１　６．１　±　０．６ Ｍｅｔ　１．５　±　０．５ １ｉｅ　３．６　±　０．６ Ｌｅｕ　９．０　±　０．７ Ｔｙｒ　３．１　±　０．３ Ｐｈｅ　３．４　±　０．８ Ｈｉｓ　３．５　±　０．３ Ｌｙｓ　７．１　±　０．５ Ａｒｇ　３．１　±　０．１ （表中の含量はＣｙｓ及びＴｒｐを除く全アミノ酸残基数に対する各アミノ酸残 基数の割合をモル％で表わしたものである。変動係数は士で表示した。） （２）　部分アミノ酸配列： ■　臭化シアン分解及び断片ペプチドの単離該ｎ−ＫＢＳの臭化シアン分解反応 を行った。即ち、８８％ギ酸中で１部の該ｎ−ＫＢＳと１０部の臭化シアンとを 使用し室温で２４時間処理した。分解反応終了後、反応液を蒸留水で希釈し、真 空下に乾固した。この乾固した標品の一部をスラブＳＤＳ／ＰＡＧＥに付し銀染 色法により蛋白質バンドを確認した。その結果、分子量２２，５００に相当する バンドは消失し、分子量約１８，５００に相当する部分を主バンドとし、その他 若干のバンドが前者より薄く検出された。

次いで上記乾固した標品を２ｍＭの２−メルカプトエタノール及び０．１％　Ｓ Ｏ５の存在下でＰＡＧＥ　［ゲル強度１５％、ディスク１５ｃｍ］に付し、電気 泳動後、分子量約１８，５００に相当する主バンドを切り出した。切り出したゲ ルからタンパクを電気泳動溶出法により溶出させて主断片ペプチドを単離した。

該主断片ペプチド及び該ｎ−ＫＢＳの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（２−メルカプトエタ ノール存在下）の電気泳動図を第２図に示す。

なお、バイオラッド社製の標準分子量マーカーも図で示される。

■　部分アミノ酸配列の決定 該主断片ペプチドのアミノ酸配列を、気相プロテインシークエネーター（アプラ イドバイオシステムズ社製４７０Ａ型）を用いる自動エドマン分解法を適用して 、分析した。

その結果次の１５個のアミノ酸が以下の通り配列していることが確認された。

Ｈ−Ｇｉｎ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ　−Ａｓｎ　 −Ｌｅｕ−Ｘ、−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−Ｘ２−１１．ｅ　−Ｐｒｏ　−Ｔｙｒ［ 式中×１と×２とは各々１個のアミノ酸残基を示す。］（３）高速液体クロマト グラフィーでの保持時間ＴＳにゲルＧ　２０００　ＳＷカラム　（７，５ｍｍ　 ＩＤＸ６０ｃｍ）を用い、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ＰＨ６，０）　−５，５ Ｍ塩酸グアニジンを溶出液とし、流速０．５　ｍｕ／ｍ１Ｌｎ室温で溶出すると 本物質は２８分の位置に一本のピークとして認められた。

実施例２ ａ　）　ＹＫＢＳ−７−１５を選択クローニング株化したクローン株ＹＫＢＳ− ４８３を、通常の人工栄養培地である１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０ 培地（ＧＩＢＣＯ社製）　（８Ｊ２）中で３７℃、充分な期間攪拌培養後、１２ −０−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテート　（ＴＰＡ）を５部ｇ ／　ｍｕ添加することにより第１刺激を行い、培養３６時間後にエンドトキシン （大腸菌０１１１：　８４由来のりポボリサッカライド）１μｇ／ｍｆＬを加え て第２刺激を行い、培養１６時間後、遠心分離により培養上清を採取した。

該上滑を最終塩濃度が０．０４　Ｍ以下となるように２０ｍＭ　トリス−塩酸緩 衝液（ｐｉ　７．８）で希釈した後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液 （ｐ＋＋　７．８）であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０ 陰イオン交換樹脂を充填したブフナー濾過器にバッチ方式で流し、非吸着画分を 得た。

ａ）−ｉ　このＤＥＡＥ−セファデックスへ−５０非吸着画分をペリコン限該濾 過濃縮装置を用いて濃縮した後、塩濃度を０．５Ｍ塩化ナトリウムに調整した。

次いで、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）であらかじめ平 衡化したコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）セファローズ樹脂カラムを用いたア フィニティークロマトグラフィーに付した。同緩衝液で充分洗浄し、非吸着画分 を除去した後、Ｃｏｎ　Ａ吸着画分をα−メチルマンノシド及び０．５Ｍ塩化ナ トリウムを含む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出させた。

このＣｏｎ　Ａ吸着画分を濃縮後２５ｍＭ　トリエタノールアミンーイミノ二酢 酸緩衝液（ｐ）！　８．１）で−夜透析した。その後、蛋白用高速液体クロマト グラフィーを用いたクロマトフオーカシング（ＦＰＬＣ，Ｍｏｎ。

Ｐカラム、ファルマシア社製）に付し、ｐＨ８，１からｐ）１５．０の直線的濃 度勾配法により等電点分画すると等電点が約ｐ）Ｉ　７．０　（ＫＢＳ−β）と 約ｐＨ８，０以上の位置にＫＢＳ活性のピークが分離した。

次いで、各々のＫＢＳ活性画分を集めた。ＫＢＳ−βの画分については、２５ｍ Ｍ　トリエタノールアミンーイミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ８，１）で−夜透析後、 再度上記と同様にＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　Ｐカラムによるクロマトフオーカシング に付すと、約ｐＨ７，０に一本のシャープなピークとして活性画分（にＢＳ−β ）か回収された。また、約ｐＨ８，０以上の位置にＫＢＳ活性を有する画分につ いては、２５ｍＭジェタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）で−夜透析後 、再度ＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　ＰカラムでｐＨ９，５からｐＨ６，８の直線的濃度 勾配法によりクロマトフオーカシングに付すと、約ｐＨ８，０に一本のシャープ なピークとして活性画分（にＢＳ−γ）が回収された。各々の活性画分のＬ　ｃ ｅｌｌに対する細胞障害活性としては、ＫＢＳ−βは合計４．０×１０’単位、 ＫＢＳ−γは合計１．ＯＸ　１０部単位であった。

更に、このＫＢＳ−βの画分とＫＢＳ−γの画分の各々の一部をセファデックス Ｇ−２００（ファルマシア社製）のカラム　（φ５×１．４００ｍｍ）に付し、 分子篩法で分析したところにＢＳ−βは相対分子量６０，０００±１０，０００ 、　ＫＢＳ−γの相対分子量は６２，０００±１０．０００であった。

ａ−ｉ　ｉ）一方、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０吸着画分は、０．１　Ｍ 塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出させ た。この吸着画分を濃縮した後、塩濃度を０．５Ｍ塩化ナトリカラムを用いたア フィニティークロマトグラフィーに付した。得られた（：ｏｎ　Ａ吸着画分を濃 縮し、−夜透析後、ＦＰＬＣ，Ｍｏｎｏ　ＰカラムでｐＨ８，１〜５．０の直線 的濃度勾配法によりクロマトフオーカシングに付し等電点分画すると、等電点が 約ｐＨ６，５（ＫＢＳ−α）の位置ににＢＳ活性がありだ。本活性画分のＬ　ｃ ｅｌｌに対するＫＢＳ−αの総細胞隙害活性は２．５ｘｌＯ’単位であった。

更に、このＫＢＳ−αの画分の一部をセファデックスＧ−２００（ファルマシア 社製）のカラム（φ５　Ｘ　１．４００ｍｍ）に付し、分子篩法で分析したとこ ろにＢＳ−αの相対分子量は６０，０００±１０，０００であった。

ｂ）　ＫＢＳ−βの画分を用いて、実施例１−ｂ）と同様に処理して相対分子量 が２２，５００±１，５００のｎ−ＫＢＳを得た。当該工程の収率は約２８％で あった。

また、ＫＢＳ−αの両分を用いて同様に処理しても同様にｎ−ＫＢＳを得た。

実施例３ ａ　）　ＹＫＢＳ−７−１５のクローン株ＹＫＢＳ−４８３を無血清培地、ＨＢ 　１０１”（８１）中で３７℃、充分な期間攪拌培養後、ＴＰＡを５ｎｇ／ｍＪ Ｚ添加することにより第１刺激を行い、培養３６時間後にエンドトキシン（大腸 菌０１１１；　Ｂ４由来リポポリサッカライド）１μｇ／　ｍμを加えて第２刺 激を行い、培養１６時間後遠心分離により培養上清を採取した。

該上滑をペリコン限外源Ａ濃縮装置で約２０倍に濃縮後、最終濃度５０％；　（ ｖ／ｖ）になるように飽和硫酸アンモニウム水溶液を徐々に添加した０次いで、 ４℃で充分沈殿を熟成せしめた後、遠心分離した２得られた沈殿を０．０４Ｍ塩 化ナトリウムを含む２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）の少量で溶解 した後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液で上記したようにした。透析 後、０．０４Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ −セファデックスＡ−５０陰イオン交換樹脂を充填したブフナー濾過器に付し、 ０．０８Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）で溶出した。

このＤＥＡＥ−セファデックスへ−５０溶出画分もベリコン限外！？。

濃縮装置を用いて濃縮した後、塩濃度を０．５Ｍ塩化ナトリウムに調整した。次 いで０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液（ｐＨ７，８）であらかじめ平衡化 したコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）セファローズ柑脂カラムを用いたアフィ ニティークロマトグラフィーに付した。

同緩衝液で洗浄し非吸着画分を得た。この（：ｏｎ　Ａ非吸着画分を濃縮後２５ ｍＭ　トリエタノールアミンーイミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ８−１）で−夜透析し てＫＢＳ−β及びＫＢＳ−γを含む両分を得た。これらの両分をクロマトフオー カシング（ＦＰＬ（：、Ｍｏｎｏ　Ｐカラム、ファルマシア社製）に付し、直線 的濃度勾配法により等電点分画すると、等電点的７．０（ＫＢＳ−β）′Ｅ１． び約８．０（ＫＢＳ−γ）の位置にＫＢＳ活性が認められた。

ｂ）　ＫＢＳ−β及びＫＢＳ−γを含む画分を用いて実施例１−ｂ）と同様に処 理して相対分子量２２．５００±１，５００のｎ−ＫＢＳを得た。

溪　１　目 碇１はＩゴ）３ 写Ｌω 国際調査報告 −〜［有］−＾−一（峠ψＩＩＩＩ・ＰＣＴ／、ｆｆＰ　８６１０００１１ＡＮ ＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮτＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＥｌ”、ＲＣＨＲＥＰ ＯＲτ０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　Ｐ ＣＴ／ＪＰ　８６１０００１１　（ＳＡ　１１８１８）頁の続き １■ｎｔ、Ｃ１，４識別記号　庁内整理番号明　者　里　見　信　子　東京都目 黒区大橋１−詩表１１胚３−５００３７Ｇ　（９） −１−１１−１１０３パラスト上目黒

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量が１７，０００〜３０，０００の範囲の低分子ヒト内来性癌制御因 子。
2. （２）分子量が２２，５００±１，５００の範囲である請求の範囲第（１）項に 記載の低分子ヒト内来性癌制御因子。
3. （３）臭化シアン分解で分子量約１８，５００を主断片ペプチドとし、且つ下記 の部分アミノ酸配列を有する請求の範囲第（１）項又は第（２）項に記載の低分 子ヒト内来性癌制御因子。 部分アミノ酸配列：【配列があります】（式中Ｘ１とＸ２とは各々１個のアミノ 酸残基を示す）。
4. （４）ヒト内来性癌制御因子を産生するヒト由来の単球系細胞またはそのクロー ン株を組織培養系で培養し、分子量が５０，０００〜９２，０００の範囲で等電 点がｐＨ６．０〜８．５の範囲のヒト内来性癌制御因子を生成させ、次いでこの ヒト内来性癌制御因子を還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理することを特 徴とする低分子ヒト内来性癌制御因子の製造法。
5. （５）分子量が５０，０００〜９２，０００の範囲で等電点がｐＨ６．０〜８． ５の範囲のヒト内来性癌制御因子を還元剤及び／又はタンパク質変性剤で処理す ることを特徴とする低分子ヒト内来性癌制御因子の製造法。
6. （６）請求の範囲（１）、（２）又は（３）に記載の低分子ヒト内来性癌制御因 子を含む薬剤組成物。