JPS63500401A - 抗体の検出のための競合的エリザ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体の検出のための競合的エリザ 背景および概括的説明 本発明は、試験血清中の抗体を検出する特異的なおよび高感度の方法である。本 方法、競合的酵素結合イムノンルペント　アッセイ（エリザ（ＥＬＩＳＡ）　） は、特ニ後天性免疫不全症候群（エイズ）の推定上の病因であるヒトＴ−細胞白 血病−リンパ腫ウィルス　タイプＩｌｌ　（ＨＴＬＶ−■）の検出のために開発 された。しかしながらこの方法は、ＨＴＬＶ科のウィルス、並びに他の抗原およ びそれらの相当する抗体に一般に適用され得る。

多くのイムノアッセイ技術が、抗原および抗体の免疫監視のために存在する。間 接的エリザ　アッセイおよび１ウエスタン”エレクトロ　プロッティング　アッ セイは、非常に高感度のもののひとつである。しかしながら、これらの方法の短 所のひとつは、全ての正常な血清に存在する非免疫性免疫グロブリンおよびその 他の血清成分により引き起こされるバックグラウンド妨害である。このバックグ ラウンドは、低レベルの特異的な反応性免疫グロブリンと重なシそしてそれをあ いまいにする傾向により、試験の感度を低下させ、そして真の陽性を明確にする ための捕捉的な確認の必要を生じさせる。広範囲に使用されるその様な確認試験 の一つは、ウィルス蛋白に対して高感度で、より特異的でそして情報を提供する “ウェスタン１プロツテイング法であるが、この方法は非常に集中的な作業であ り、解釈が難しく、そして性質上（定量的というよシむしろ）定性的である。

本発明の競合的エリザ　イムノアッセイは、血清学的資料を得るため及びＨＴＬ Ｖ−ＩＩ抗体を検出するための感度、特異性、便利さを格段に高めている０本方 法は、正常な免疫グロブリンのバックグラウンドを減らすことによシ特異的な抗 体測定の感度を高めている。本方法は、あるウィルスに対して調製された異種抗 血清（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓａｎｔｉｓｅｒｕｍ　）の使用によシ特異性を 増加し、この様にして競合的にヒト特異抗体を阻止する。

本発明によると、試験血清と試験抗原及び基質との非特異的試験血清反応を減少 させるために、いくらかの緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ　）として若干量のヒトリンパ 球が使用される。さらに、エリザ試験の感受性及び特異性を高めるために、標的 抗原（ｔａｒｇｅｔ　ａｎｔｉｇｅｎ　）をグアニジン塩、好ましくは塩酸グア ニジンで処理する。

エリザ分析は、有効であることが証明されているが、試験基質と動物の抗血清と の間の反応によって制限される。そのような非特異的な反応を減少または縮少さ せる方法を提供することが本発明の一つの機能である。これは、一部では抗原純 度の向上、即ち標的抗原のグアニジン塩、例えば塩酸グアニジン、または相手イ オンが他のハロゲン、例えば臭素もしくはヨウ素、またはチオシアネートまたは 硝酸塩である同様の塩による処理によって達成される。これらの塩は、タンパク 質の変性をおこす濃度で使用される（約４〜８モル濃度溶液）。

本発明は、特にＨＴＬＶ−１１抗体の検出に適している。エイズおよびＨＴＬＶ −１１１は血液製剤によシ伝染することは会知であるから、そのような血液製剤 中へのＨＴＬＶ−１１１の混入を検出するための方法は、受答者の安全を保証す るために必要である。この様な方法は、可能な限夛高感度でそして特異的である べきであシ、通常の環境において容易に行なわれるべきでもある。ウィルスのマ ーカー例えば新鮮なまたは培養した血液細胞中の逆転写酵素、ウィルスの抗原ま たは核酸配列のための試験は、遅く、そして大規模のスクリーニングには現在の ところ適していない。一方、ウィルス抗体または抗原のための血清学的試験は、 　ＨＴＬＶ−ＩＨＫ感染した個体が、１ａ［ｔたはそれ以上のＨＴＬＶ−１１蛋 白に対する抗体に通常血清陽性でおるから、この目的のために適している。

寄託の表示 ＨＴＬＶ−１ｉｔ　ｉ′ｉ、アメリカ合衆国、２０８５２　マリーランドロック ヴイル　パークローンドライブ　１２３０１のアメリカン　タイプ　カルチャー 　コレクシ目ン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　）に、少なくとも３０年または最後の試料妥求後５年のどちらかより長 い方の期間寄託された。これらの寄託は下記の通シである：ＡＴＣＣＡ　ＣＲＬ 　８６０２　１９８４年８月１５日ＡＴＣＣＩｉ　４０１２５．４０１２６．４ ０１２７　１９８４年７月３０日ＡＴＣＣＡ　ＣＲＬ　８５４３　１９８４年４ 月１９日詳細な開示 酵素結合イムノソルベント　アッセイ（エリザ）は、関連試薬（抗原）を固相支 持体に結合させることによシ一般に行なわれる。試験血清は、標識された試薬と 混合し、次に結合させた関連試薬と反応させる。次に結合した試薬と遊離の試薬 を分離するために、試薬は一連の希釈、培養そして洗浄工程を行なう。この方法 は、使用した標識のタイプに合わせて、試験血清中の抗体（″ｔｆｃＦｉ抗原） の量を間接的に測定する様に計画された検出工程で終わる。

従来の慣用のエリザ系は、時おシ誤った陽性結果を生じる。一般的に、抗原また はウィルス断片は固体の支持体に結合されている。結合した断片を次にその結合 した断片に結合する異種抗血清と培養する。試験血清を次に結合した断片に添加 し、そして結合した断片上の吸光度を試験する。５０パーセントより高い吸光度 の抑制（正常なヒト血清に対して）は、陽性の試験結果と見なされる。下記の記 載は、抗原としてＨＴＬＶ−１１１を使用して、さらに本発明の詳細な説明する 。

ＨＴＬＶ−１ｉｔ抗原を速度−ゾーン超遠心によシ精製し、分離し、そして微量 滴定プレートのウェルに被覆する。試験血清を検査し、そして試験サンプルを抗 原被覆ウェルと共に培養する前に、付加的な２時間の培養期間を含む確認の中和 スクリーニングにより確かめる。この特別の２時間の培養の間、ウェルをウェル 上のＨＴＬＶ抗原部位と反応しそして該部位を飽和させるＨＴＬＶ−ＩＨＫ対す る未標識のヒツジ抗体（異種抗血清）にさらし、この様にしてひき続く工程でウ ェルに試験血清が付着するのを防いでいる。試験の対照として、付加的な培養期 間の間、隣シのウェルを正常なヒツジ血清にさらす、ヒツジ抗血清の好ましい希 釈はＩＣＬＯＯＯ４たはそれ以上の滴定濃度でに２である。微量滴定プレートウ ェルに被覆された植物凝集素（ＰＨＡ）−刺激性と）　ＩＪンバ球調製物からの 蛋白質と反応性を示すヒツジ抗血清は、反応性が除去されるまでＰＨＡリンパ球 調製物（または非感染細胞）に吸収される。好ましくけ、この方法で使用される ヒツジ抗血清は、３部の体積の血清あたシ１部の体積の細胞等側御を吸収しうる 。ＨＴＬＶ−［１に対する未標識ヒツジ抗血清にさらされた試料において、標準 の正常なヒト血清に対して５０パ一セント以上の吸光度の抑制は、ＨＴＬＶ−Ｉ ＩＩに対する抗体の存在に関して陽性と認められる結果とみなされる。

動物のＨＴＬＶ抗血清による“真の”陽性血清の反応性を抑制するために創案さ れた、非感染宿主細胞または異種の集団を含有する正常なヒ）　１７７７球の好 ましい配合物は、′緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒ　）”と命名される下記のものである ：ヒツジ血しょう４／８（所望によシ、１／８の免疫性ヒツジ血しょう及び３／ ８の正常ヒツジ血しょう）；２０チのヤギ血清溶液、２０チのウシ胎児血清、及 びリン酸塩緩衝液からなる溶液３／８；並びにリンパ球抽出物１／８゜リンパ球 抽出物（白血球の界面活性剤抽出物）は、５％ＮＰ４０（非イオン性界面活性剤 、ノニデット（ｎｏｎｉｄｅｔ　）ｐ４０）、５０ミリモルのトリス（Ｔｒｉｓ 　）　ｐＨ７，４（：Ｉ　ンファー（Ｃｏｎｆｅｒ　）　、メルク（Ｍｅｒｃｋ 　）　１０　、化合物９５７５　）、トラシロール（ｔｒａｓｙｌｏｌ　）　（ Ｆ　ＢＡファーマシュチヵルズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　）、メルク １０．化合物７８ｏ）、１０ミリモルの塩化マグネシウム及びα２５モルのグリ セロール３容量中に％［された１２の新鮮なリンパ球である。

該抽出物を製造するためには、細胞はポルテックス（ｖｏｒｔ６ｘ　）またはル ーズ　フィッティング　ホモジナイザー（１ｏｏｓｅ　ｆｉｔｔｉｎｇ　ｈｏｍ ｏｇｅｎｉｚｅｒ　）　にょシ崩壊され、核は低速遠心分離（２０分間に２００ ０ＲＰＭ）によシ除去される。残った上清液がリンパ球抽出物である。マクヵッ チェオンズ　エマルジファイアー　アンド　デタージェンツ（ＭｃＣｕｔｃｈｅ ｏｎ’ｓ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　）、ノース　 アメリカン　エディタ１ン（Ｎｏｒｔｈ　ＡｍｅｒｉｃａｎＥｄｉｔｉｏｎ　） 、　１９８３に挙げられている非イオン性界面活性剤（即ち、細胞壁を破壊し、 核を放出させる試薬）のいずれも使用しうるが、好ましい非イオン性界面活性剤 は、ＮＰ４０及びトリドア　（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ１００　（オクチル　フェ ノキシ　ポリエトキシ　エタノール型化合物）である。

白血球の界面活性剤抽出物 １ｆの新鮮な（生存可能な）リンパ球を、３容量の５４ＮＰ４０．５０ミリモル のトリス（Ｔｒｉｓ　）　ｐＨ７，４（）リメチロール　アミノメタン；メルク １０．化合物９５７５　）、１ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオライ ド（ＰＭＳＦ、ブロティナーゼ抑制剤）、及びトラシロール（ｔｒａｓｙｌｏｌ ）（ブロティナーゼ抑制剤）、１０ミリモルの塩化マグネシウム及び［１２５モ ルのグリセロール中に懸濁する。

ＨＴＬＶＩ、Ｉｔ及び■の検出及び識別のためのエリザにおける付加的な改良は 、有効量の塩酸グアニジンのようなグアニジン塩の抗原への添加である。他の使 用しうるグアニジン塩は、他のハロゲン相手イオン、例えば臭化物及びヨウ化物 、並びにチオシアネートである。グアニジン塩酸塩の使用、例えばＨＴＬＶ−Ｉ ｌｌ標的抗原の処理における使用により、この競合的エリザ抗体分析において、 試験感度及び特異性が増加する。試験感度は現在の市販されているスクリーニン グ試験の３〜１０倍であシ、誤まって反応する血清の少量のサブセットで処理し た場合、界面活性剤塩で製造した試験抗原に比べて、より特異的である。ある使 用においては、競合的エリザ抗体分析は現在の市販のスクリーニング試験に比べ て３００ないし１０００倍の感度である。上記の方法に従うことにより、ある種 の細胞抗原はＨＴＬＶ抗原の免疫反応性を保持した寸まで破壊されることが信じ られる。この効果により、現存のスフＩＪ　ＩＪソング験に比べて増加した特異 性及び感度を有する標識抗原が製造される。４〜８モルのモル範囲でグアニジン 塩を使用すると特に有用であり、６モルではさらに好ましい。

ヒツジ抗ＨＴＬＶ−Ｉ１１の調整 ヒツジの内皮に完全７０インド　アジュバント中のウィルス蛋白１ｗ９を接種す る（不完全フロイントをその後に使用する）。蛋白画分を、非イオン性界面活性 剤およびαｂＭＮａＣＬ中のシ叢糖濃度勾配置製されたＨＴＬＶ−ｍ／Ｈ９ピリ オンの破壊によシ得る。同時に（１−０４％パラホルムアルデヒド中に固定され た１■の精製ピリオンを内皮に注入する。滴定濃度が十分に高くなるまで、１ケ 月の間をおいて追加免疫接種を内皮に、筋肉内にまたは静脈内に行なう。試験に 施用する材料を血漿交換法により１回に１リツトル得る。非免疫ヒツジからの血 漿を同じ方法により得る。

上に記載した蛋白画分はＨＴＬＶ−ＩＮＩ／Ｈ９ピリオンの破壊によシ得られる が、この分野の当業者は本発明がｎＩ製ウィルス蛋白、コア抗原、およびクロー ン化亜属の断片誘導体の使用をも含む（これには限定されない）ことを理解する であろう。これらは、１（ＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−１１、）（ＴＬＶ−ＩＩＩ、 それらの断片、及び分子りｔ’−ンＢＨ１０、ＨＸＢ−２、ＨＸＢ−３、ＢＮ８ 、ＢＮ２、並ヒニコレラノクローンから誘導されるプラスミド、タンパク質もし くは断片を含む（これらに限定されることはない）。開示に基づいて、多くの他 の変更および派生は、この分野の熟練した人々にはそれ自体自然に示唆されるで あろう。これらの変法は、本発明の範囲内であることを意図されている。

本発明は、好ましくは微量滴定ウェルを含む限定されない不溶性の多孔性表面ま たは固体基質；不溶性表面または基質に結合されるべき抗原または抗体を含む試 薬：試験血清；表面に結合した抗原または抗体に特異的に結合して飽和させる異 種抗血清；およびこの分野の熟練した人には公知である生物学的に適当な洗浄、 培養および精製試薬を含む試験キットの使用によシ行なわれても良い。

本方法の１ｇコンポーネントはＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ、　ＩｇＧ及びＩｇ Ｍのような可能な全てのＩｇ抗体から選択される。

本方法のために好ましい温度は低温であり、最も好ましくは４℃もしくはその付 近である。１〜４５℃の範囲が許容されうる。好ましい酵素はワリビーバーオキ シダーゼである。パーオキシダーゼとＩｇまたはガンマ−グロブリンとの好まし い比率は１：１ないし５：１である。

免疫グロブリン、抗ヒトＩｇＧ、　ＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＴｇＥ、またはＩｇＭ は好ましくはヤギから得られる。他の動物、例えばうさぎ、ハムスター、ニワト リ、ラット、テンジクネズミ、ヒツジ、馬またはマウスの抗ヒト免疫グロブリン も使用しうる。これらの免疫グロブリンは市販されている。

本発明において使用される免疫ソルベントは、不溶性であシ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ 抗原を付けることができる。この免疫プルベントは、不溶性の表面として存在し 、ビーズ型のアガロース、テキストラン、セルロース、モジくはニトロセルロー スのような炭水化物、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ホト アミドもしくはポリビニルのようなプラスチック、またはガラスもしくにシリカ ゲルのような無機材料でありうる。ＨＴＬＶ−ｉ１１抗原は、化学的に免疫フル ベントに結合されるか、または免疫ソルベント上に被覆されるか、または該表面 上に被覆された抗体によシ捕促されてもよい。

ウェル〔例えば、ダイナチック　ラボラトリーズ　インコーホレイテッド（Ｄｙ ｎａｔｅｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　）から購入しうるイ ミエロン１微量滴定プレート（Ｉｍｍｕ　１　ｏｎｌ　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　 ｐｌａｔｅ　）に、粉砕した抗原、（希釈物または界面活性剤を含まないＨＴＬ Ｖタンパク質５ｆ／ｄ）を含有する５　０　ｍＭ　ＮａＨＣＯｘ　（ｐＨ９，６ ）　ｌ　１−を満たし、４℃で一晩培養する。プレートは直ちに使用されるか、 または湿度調節箱中に４℃で貯蔵するか、または使用されるまで乾燥され、水分 を排除し々から貯蔵される。

ウェスタン　プロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　）比較分析 は三層免疫パーオキシダーゼ方法（ｔｈｒｅｅ−１ａｙｅｒｉｍｍｕｎｏｐｅｒ ｏｘｉｄａｓｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　）によシ行なわれる。

実施例１ エイズ血漿を実験的に接種したチンパンジーの特異抗体の検出 ５匹のチンパンジー（ＣＨ１３２、ＣＨ１１４、ＣＨ１３３）にエイズ血漿を、 そして１匹（ＣＨ１４０）に正常なヒト血漿だけを接種した。各々の動物から隔 週に血液を採取し、そして血清をＨＴＬＶ−Ｉ［１抗体の標準間接エリザ試験に おいて分析した。５以上のＰ／Ｎ値に多くによシ陽性の反応性を示すこととみな す。この規準によシ４匹全ての動物は、受動的に移動した１（ＴＬＶ−Ｉ［１抗 体反応性に陽性だった。

ＣＨ１１４およびＣＨ１３３は、エイズ血漿注入後６ないし８週目に始まるＨＴ ＬＶ−ｎｌ抗体の活発な製造をも示した。ヒツジ抗ＨＴＬＶ−ＩＩを使用する抗 体ブロッキング法を行った場合には、正常なヒト血漿を注入した動物（ＣＨ１４ ０）が誤まった陽性反応（免疫または非免疫ヒツジ抗血清でのブロッキングに相 違はない）を示し、そしてＨＴＬＶ−Ｉ［１に対スる抗体には陰性であることが 解った。確認試験は、残りの試料の全てが受動的に移動されたか、または能動的 に製造されたかのどちらかであるＨＴＬＶ−１１１抗体に特異的に陽性であるこ とを示した。付加的な陽性および陰性のヒト対照血清もまた試験し妥当な予期し た結果を得た（表１）。

表　１ 抗ＨＴＬＶ−１１１血清のヒツジ抗ＨＴＩ、Ｖ−１１１異種抗血清での確認ブロ ッキング エイズ接種後のチノパンツ−１３２ 受動抗体　１４３１　＆９６ 工イズ接種後のチノパンツ−１１４ 受動抗体　１ａ２５　７．８４ 能動抗体　）２ｇ　４５１ 工イズ接種後のチノパンツ−１３３ 受動抗体　１２．３４　ＳＯ７ 能動抗体　）２０　１２．１１ 対照物接種後のチノパンツ−１４０ 受動抗体　？、１６　９．１６ 陽性対照血清　）２０　９．１６ 陽性対照血清　１１．２５　五５９ 陰性対照血清　、９０　ｔ０５ 実施例２ 間接的エリザ、ウェスタン　プロッティングおよび競合的エリザ法による抗体検 出の感度の比較２つの陽性エイズ血清を正常な陰性血清中に順次６倍に希釈した 。希釈剤として陰性血清の使用は、一定の陰性のバックグラウンドを与えた。各 々の陽性の一組中の陽性抗体の出発濃度がほぼ等しくなる様に条件を調整した。

さらに誤まった陽性の血清が、正常の限界を越えて３倍および１０倍のＩｇＧ濃 度を与える正常な陰性ヒトＩｇＧを有する正常な陰性血清をスパイキング（ｓｐ ｉｋｉｎｇ　）することによシ生じた。表２中の結果は、５よシ大きいＰ／Ｎの 普通の規準を用いて、゛ウェスタン″プロッティングは標準間接的エリザよシお およそ１０倍高感度である一方、本試験は”ウェスタン”プロッティング法よシ おおよそ１０倍高感度であることを示す。１誤まった陽性′血清は、間接的エリ ザ法により陽性と測定されたが、１ウエスタン１プロツテイング法およびこの競 合的エリザ法の両方により陰性と測定された。

表　２ 間接的エリザ、競合的エリザおよびウェスタンプロ。

ト法によるＨＴＬＶ−１１１抗体検出の感度の比較５１４２１　誤、９＋　１２ ．６０　＋　ＩＪＯ−−３１４２２誤ｔ）＋　１１２３　＋　ｔ７ｏ　−一実施 例３ 正常な供血者およびエイズ危険性供血者の血清中のＨＴＬＶ−１ｉｔ抗体の検出 のだめの間接的エリザ、“ウェスタン”プロッティングおよび競合的エリザ法の 比較平均＋ｔ５標準偏差以上のＰ／Ｎ　（３以上のＰ／Ｎ　）のＨＴＬＶ−ＩＩ Ｉ抗体反応性を有する血清の間接的エリザ　スクリーニングによシ血清を試験し た。これらの試料を、確認されたＨＴＬＶ−ＩＩ蛋白バンドと反応性の血清を確 認するために１ウエスタン”プロッティング法により次に確認した。同じ群の血 清を本発明の競合的エリザ法を使用して再試験した。陰性の正常供血者および陽 性の徴候同性愛男性（エイズ−危険性）の２８の試験の間には完全な一致があっ た。さらに１ウエスタン”プロッティングによる疑わしい５人の供血者は、競合 的エリザ試験によシ陽性２人および陰性３人にわけられた。２４８人の“ウェス タン″プロット陰性エイズー危険性血清の２人がわずかに陽性であり、セして１ ウエスタン”プロットによシ疑わしかった１０試料は競合的エリザ試験により全 て陰性だった。表３を参照。

表　３ ウェスタンプロットおよび競合的エリザの比較試験結果：正常供血者および徴候 性同性愛男性正常　供血者 ウェスタン　プロット　陰性　５５２５５２　０　０陽性　ＯＮＡ　ＮＡ　ＮＡ 徴候性同性愛男性 ウェスタン　プロット　陰性　２４８２４６　０　２陽性　６５　０　６５　０ Ｔ　１０　１０　０　０ 実施例４ アフリカの供血者の間のＩ（ＴＬＶ−１抗体の分布血清抗体を検出するために間 接的エリザ微量試験が使用された。手短かに、ＨＴＬＶ−１を速度ゾーン超遠心 によシ精製し、破壊しそして微量滴定プレートのウェルに被覆した。試験血清、 対照陽性血清および対照陰性ヒト血清の部分（５μｔ）を２０％熱不活性化正常 ヤギ血清１００μＬを含むウェル中４℃で一晩培養し、ヒト■ｇＧに対するパー オキシダーゼ標識したヤギ抗血清との反応後４９Ｑｆｉｆｎで吸光度の測定によ シ定量した。

正常対照レベルの２倍の吸光度を有する血清を、スクリーニング試験と同じ手順 を含むが試験試料を抗原被覆ウェルと培養する前に付加的な２時間の培養期間を 含む確認中和によシまず確認した。この特別な２時間の培養の間中、ウェルをウ ェル上のＨＴＬＶ抗原部位と反応しおよび該部位を飽和させたＨＴＬＶ−１に対 する未標識ヒツジ抗体にさらし、この様に試験血清が引き続く工程においてウェ ルに付着することを防止している。試験の対照として、隣りのウェルを付加的培 養期間中正常なヒツジ血清にさらした。ヒツジ抗血清を１：２の希釈で使用し、 該抗血清は１０（１，０００またはそれ以上の滴定濃度を有していた。微量滴定 プレートウェルに被覆された植物凝集素（ＰＨＡ）−刺激性ヒトリンパ球調製物 からの蛋白質と反応性を示すヒツジ抗血清は、反応性が除去されるまでＰＨＡＩ Ｊンパ球調製物に吸収された。これらの試験で使用されたヒツジ抗血清は、終点 に到達するまで３部の体積の血清あたり１部の体積の細胞当量での吸収を必要と した。ＨＴＬＶ−１に対する未標識ヒツジ抗血清にさらされた試料中の５０パ一 セント以上の吸光度の抑制は、標単正常ヒト血清に対して、ＨＴＬＶ−１に対す る抗体が存在する陽性の確認結果とみなされた。

確認試験を誤った血清をＰＨＡ−刺激性正常ヒトリンパ球から調製した界面活性 剤分離性細胞質ゾルに、およびＨＴＬＶ−１産生細胞に吸収し、そしてＨＴＬＶ −１への結合を再試験した。ウィルス陽性および陰性細胞調製物の間の違いが５ ０パ一セント以上だった場合には、試料を陽性と測定した。陽性血清の滴定濃度 を連続希釈、滴定曲線の退行分析および同じプレートのウェル中で試験した１： ２０希釈液の参照の陰性対照血清に対して同等の結果を与える希釈液に溶解する ことによシ決定した。表４において、Ｒは陰性対照に対する試料の比率である； 全ての群はＲの対数−正常分布に従った・ 実施例５ ＨＴＬＶ−１［［を精製し、破壊し、そして微量滴定プレートのウェルに被覆し た。精製方法は、ＨＴＬＶ−Ｉ１１抗原をグアニジン塩酸塩（４ないし８モル） で処理することを含む。

これによシ、ある種の細胞性抗原は、ＨＴＬＶ抗原の免疫反応性を保持したまま 破壊される。

その後、反応緩衝液を微量滴定プレートのウェルに添加する。これらの緩衝液は ヒツジ血漿４／８（正常または免疫性）の混合物；２０チのウシ胎児血清、及び リン酸塩緩衝液３／８；並びにリンパ球抽出物１７８を含む。リンパ球抽出物（ または非感染細胞）を製造するためには、白血球の界面活性剤抽出物を、５％Ｎ Ｐ４０．５０ミリモルのトリスｐＨ７，４及び１ミリモルのＰＭＳＦ　５容量中 に懸濁した新鮮なリンパ球１ｆから製造する。抽出物は、さらに、トラシロール 、１０ミリモルの塩化マグネシウム及び（１２５モルのグリセロールを含有する 。この混合物は、ルーズフィッティングホモジナイザーにより崩解され、核は低 速遠心分離によシ除去され、そして残った上清液がリンパ球抽出物である。精製 された抗原を含むｇｌ量滴定プレートは、上記の緩衝液で２時間培養される。従 ってプレート上の抗原は、それと反応する非標識ヒツジ抗体にさらされ、ウェル 上のＨＴＬＶ−Ｉｌｌ抗原部位は飽和され、これによシ試験血清が次の段階でウ ェルに付くのが防止される。

試験血清、対照用陽性血清及び対照用陰性血清の一部（５μｔ）を、２０チの熱 不活性化正常ヤギ血清１００μｔを含有するウェル中で、４℃で一晩培養した。

その後、試験血清を抗原被覆ウェルで培養した。ＨＴＬＶ−Ｉｌｌに対する非標 識ヒツジ抗体血清にさらした検体において、標準正常ヒト血清に対して５０％よ う多い吸光度の抑制が、ＨＴＬＶ−Ｉ［１に対する抗体の存在に関する陽性の確 認結果とみなされる。

上記の競合的エリザ方法は、現在購入しうるエリザ系では陽性と記録されるが、 本発明の競合的エリザ及び他の競合的エリザ系では誤って記録されるという問題 のある血清中におけるＨＴＬＶの検出に特に有用である。これらの問題のある血 清には、ＨＬＡ　（％に経産婦における）が含まれ、血清中において抗ミトコン ドリア活性を示す。

国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒツジ血しよう約４／８、２０％ヤギ血清、２０％ウシ胎児血清及びリン酸 塩緩衝液からなる溶液約３／８、並びにリンパ球抽出物約１／８を含有する反応 緩衝液を使用することを特徴とし、さらに、酵素結合イムノソルベント分析で使 用される標的抗原を、グアニジン塩で処理することを特徴とする、検体中のヒト Ｔ−細胞リンパ球ウイルスの検出のための酵素待合イムノソルベント分析法。
2. ２．さらに、リンパ球抽出物が、非イオン性界面活性剤、２−アミノ−２−ヒド ロキツメチル−１，３−プロパンジオール、フェニルメチルスルホニルフルオラ イド、塩化マグネシウム及びグリセロール中に懸濁した新鮮なリンパ球からなる ことを特徴とする請求の範囲第１項記載の分析法。
3. ３．ヒト−Ｔ細胞リンパ球ウイルス標的抗原を、可溶性対イオンを有するグアニ ジン塩で処理し、その後、該標的抗原を、ヒツジ血しょう、異種動物抗血清及び リンパ球抽出物の溶液で処理することを特徴とする、検体中のヒトＴ−細胞リン パ球ウイルスの検出のための、改良された酵素待合イムノソルベント分析法。
4. ４．さらに、該リンパ球抽出物が、非イオン性界面活性剤、２−アミノ−２−ヒ ドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、フェニルメチルスルホニルフルオ ライド、塩化マグネシウム及びグリセロール中に懸濁した新鮮なリンパ球からな る白血球抽出物であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の分析法。
5. ５．さらに、上記の異種動物抗血清が、正常ヤギ血清２０％、ウシ胎児血清２０ ％及びリン酸塩緩衝液からなることを特徴とする請求の範囲第３項記載の分析法 。
6. ６．さらに、上記のグアニジン塩が塩酸グアニジンであることを特徴とすろ請求 の範囲第３項記載の分析法。
7. ７．試験抗原を、塩酸グアニジン、硝酸グアニジン及びグアニジンチオシアネー トからなる群より選ばれるグアニジン塩で処理することを特徴とする、検体中の ヒトＴ−細胞リンパ球ウイルスタイプＩＩＩの検出のための分析方法。