JPS63500449A - ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウ　イ　ル　ス　ワ　り　チ　ン 発明の分野 本発明は血清学的に同定可能なウィルスワクチンに関する。本発明のワクチンは 該ワクチンに対して血清学的に異なるウィルスを利用することによって、ビルレ フト野生型ウィルスで感染した動物と、ワクチン接偽狂犬病ウィルス（ＰＲＶ） は全世界的に動物の多くの種に感染する病気である。ＰＲＶ感染は種々に呼ばれ る感染性延髄麻痺、アワジエスキー病、および仮性恐水病である。感染はブタ、 ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラットおよびミンクの如き重要な家畜において知ら れている。宿主の範囲は非常に広く、はとんどの哨乳類、および実験的には少く とも、多くの種類の鳥類も包含する（宿主の詳細なリストについては、ディー・ ピー・グスタフソン（Ｄ、Ｐ、Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ）、［シュードラビエス（Ｐ ｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）Ｊ、デイジージズ・オブ・スワイン（Ｄｉｓｅａｓｅ ｓ　ｏｆ　５ｗ１ｎｅ）、第５版、エイ・ディー・リーマンら（Ａ、Ｄ、Ｌｅｍ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、）編、（１９８１）を参照）。はとんどの感染動物について 、該病気は致命的である。しかし、成長したブタおよび恐らくラットは該病気に よっては死なず、従って該病気についての媒介者である。

ブタの集団は特にＰＲＶに罹り易い。成長したブタは稀：こしか徴候を示さずま たは該疾患で死なないが、子ブタは感染した場合すぐに病気となり、しばしば明 確な臨床的徴候を伴わずして２４ないし４８時間のうちに通常死ぬという結果と なる（ティー・シー・ジョーンズおよびアール・ディー・１１ント（Ｔ、Ｃ０Ｊ ｏｎｅｓａｎｄ　Ｒ，Ｄ、　Ｈｕｎｔ）、ベテリナリ・ノｆソロジー（Ｖｅｔｅ ｒｉｎａｒｙＰａｔｈｏｌｏｇｙ）　、第５版、リ−・アンド、７エビが−（Ｌ ｅａ　＆　Ｆｅｂｉｇｅｒ）　（１９８３）　）。

ＰＲＶワクチンはこれまで多種類の技術によって生産され、ヨーロッパの該病気 流行地方におけるワクチン接種は１５年間以上実施されてきた。損害はワクチン 接種によって減少されてきたが、ワクチン接種は該ウィルスを環境中に維持して きた。感染を防止するワクチンは生産されたことがない。ビルレントウイルスに 暴露された、ワクチン接種を受けた動物は感染しても生き残り、次いでさらにビ ルレント・ウィルスを放出する。従って、ワクチン接種した動物は再び発病する 可能性がある潜伏感染を有しうる（ディー・ピー・グスタフソン（Ｄ、Ｐ、Ｇｕ ｓｔａｆｓｏｎ）、前掲参照）。

ＰＲＶ用の生弱毒化および不活性化ワクチンが米国で商業的に入手可能であり、 ｔＪｓＤＡによって認可されてきた（シー・イー・アロンソン（Ｃ０Ｅ、Ａｒｏ ｎｓｏｎ）編、ベテリナリ・ファルマシューテイカルズ・アンド・バイオロジカ ルズ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　＆　Ｂｉｏ　 −ＬｏｇｉｃａＬｓ）、（１９８３）参照）。

成長したブタはＰＲＶの媒介者であるので、多くの州は感染動物を検知するため のスクリーニングプログラムラ制定している。ビルレントＰＲＶを持つ動物とワ クチン接種されたことのある動物とを区別するうえで問題が生じる。ピルレント ウイルスとワクチンで用いるウィルスの抗原特性は同一であり、従って感染した 動物とワクチン接種した動物とを区別するのＣよ不可能でありうる。そのため、 血清陽性のブタの移動に関する規定はワクチン接種したブタと以前にＰＲＶに感 染したブタの双方に適用される（シー・イー・アロンソン（Ｃ，Ｅ、Ａｒｏｎｓ ｏｎ）　、前掲）。

ＰＲＶはヘルペスウィルスである。一般に、ヘルペスウィルスは最も複雑、な動 物ウィルスの１っである。

それらのゲノムは少くとも５０個のウィルス特異的蛋白質をコード付けし、１５ ００００個までのヌクレオチドを含有する。ヘルペスウィルスの最も免疫学的に 反応性の蛋白質のうちには、とりわけピリオン膜および感染細胞の膜中に見い出 される糖蛋白質がある。ＰＲＶ糖蛋白質についての文献は少くとも４つのウィル ス性糖蛋白質に言及している（ティー・ベン−ボラートおよびエイ−ニス・カブ ラン（Ｔ、Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ　ａｎｄ　Ａ。

Ｓ、Ｋａｐｌａｎ）、パイロｏジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、４１．２６５〜７ ３頁（１９７０）：エイ・ニス・カブランおよびティー・ベン−ボラート（Ａ、 Ｓ、Ｋａｐｌａｎ　ａｎｄ　Ｔ、Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ）、プロシーデイングズ・ オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ　、Ｎａ　ｔ　 １　、Ａｃａｄ　、Ｓｃ　ｉ　、　）ＵＳＡ、６６．７９９−８０６頁（１９７ ０））。

イくツかのヘルペスウィルスは感染細胞の培地中に糖蛋白質を分泌すると報告さ れている。単純庖疹ウィルス（Ｈ３Ｖ）は糖蛋白質Ｃおよびいくつかの糖蛋白質 りの切断形を培地中に放出する（ビー・ノリルドおよびビー・エフ・ベステルガ ード（Ｂ、Ｎｏｒｒｉｌｄ　ａｎｄ　Ｂ、Ｆ。

Ｖｅｓｔｅｒｇａａｒｄ）　、インターパイロロジ−（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏ ｇｙ）、１１．１０４−１０頁（１９７９）：アール・イー・ランダルら（Ｒ， Ｅ、Ｒａｎｄａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、）、ジャーナル・オブ・ジェネラル・パイロ ロジー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）、４８．２９７〜３１０頁（１９８０）） 。マレク病ウィルスはピリオン糖蛋白ＴＥＡのかなりの量を培地中に放出しくデ ィー・パン・ツアーネら（Ｄ、Ｖａｎ　Ｚａａｎｅ、ｅｔ　ａｌ、）、パイロロ ジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、１２１．１１６〜３２頁（１９８２））：ヘルペ ス・サイミリ（Ｓａ　１ｍ１ｒ　ｉ　）・ウィルスもピリオン糖蛋白質を培地中 に放出する（アール・イー・ランダルおよびアール・ダブリュー・ホ不ス（Ｒ， Ｅ、　Ｒａｎｄａｌｌ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｈｏｎｅｓｓ）、ジャーナル・オブ・ ジェネラル・パイロロジー（Ｊ　、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）、５１．４４５−４ ９頁（１９８０））。ＰＲｖはウィルス粒子中に取り込まれないと報告されてい る糖蛋白質を培地中に放出する（ティー・ベン−ボラートおよびエイ・ニス・カ ブラン（Ｔ、Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ　ａｎｄ　Ａ、Ｓ、Ｋａｐ　−１ａｎ）、パイ ロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、４１．２６５−７３頁（１９７０））：テイ ー・ジエイ・リーら（Ｔ、Ｊ。

Ｒｅａ　、　ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナルーオブ・バイｏｏジー（１゜Ｖｉｒ ｏｌ、）、５４．２１−２９頁（１９８５））。

培地中に分泌されるＰＲＶ蛋白質はこれまで３ａと称され（ティー・ベン−ボラ ートおよびエイ・ニス・カブラン（Ｔ、Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ　ａｎｄ　Ａ、Ｓ、 　Ｋａｐｌａｎ）、前掲）、糖蛋白質Ｘ　（ｇＸ）　とも称されてきた（ティー ・ジェイ・リ−ら（Ｔ、Ｊ　、　Ｒｅａ　、　ｅｔ　ａｌ、）、前掲）。ｇＸ　 はＰＲ■感染細胞から単離された場合、以下の特徴を有する。

（１）それは培養中のＰＲＶ感染動物細胞の培地中での主要な蛋白質である。

（２）それは糖蛋白質である。

（３）それはＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で約９５ｋｃｌ　の分子量を有す る。

（４）それは硫酸化された蛋白質である。

（５）それは約１％過塩素酸に可溶である。およ゛び（６）それは標準的な実験 室のマウスにおいて免疫原性である。

本発明は野生型ウィルスから免疫学的に区別されるＰＲＶ株を提供し、かくして テストした動物を殺す必要なくしてワクチン接種した動物と感染した動物を区別 できるようにすることにより、例えばＰＲＶ感染についてのブタのスクリーニン グにおいて、前記した問題を解決する。

これらの抗原的差異は１つまたはそれ以上の検出可能な抗原ポリペプチドをワク チンウィルスがら欠失させる結果でありうる。これらの遺伝子的変化の結果、テ ストした動物を殺す必要なくしてそれらの血清学的特性に基づき感染した動物と ワクチン接種した動物とを免疫学的；こ区別することが可能となる。

エム・ダブリュー・ウェイセフおよびエル・ケイ・ウェイセフ　（Ｍ、Ｗ、　Ｗ ａｔｈｅｎ　ａｎｄ　Ｌ、に、　Ｗａｔｈｅｎ）［ジャーナル・オブ・パイロロ ジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ−）、５１．５７〜６２頁（１９８４））はウィルス性糖 匿白Ｘ　（ｇｐ５０）に突然変異を含有するＰＲＶ、およびｇｐ５０　に対する 単クローン抗体の中、ｆＯ，Ｅ利用する突然変異体を選択する方法について言及 している。ウェイセフおよびウェイセフ（Ｗａｔｈｅｎ　ａｎｄ　Ｗａｔｈｅｎ ）はこのウイルスノワクチンとしての使用を記載していない。さらに、このウィ ルスで免疫化した動物は感染した動物から血清学的に区別可能であろう。

ティー・シー・ホランドら（Ｔ、Ｃ，Ｈｏ１ｌａｎｄ　、　ｅｔ　ａｌ。

）〔ジャーナル・オブ・バイｏｏジー（Ｊ　、Ｖｉｒｏｌ　、）、４５．６７２ −６８２頁（１９８３）’：ｌは糖蛋白質特異単クローン抗体で選択したＨ５． Ｖの抗原変異体（こつぃて言及している。選択・された変異体のうちにはＨ５Ｖ 糖蛋白１　ｇＣを発現しない２種が包含される。ホランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ、 ｅｔ　ａｌ、）もこれらの変異体のワクチンについての使用を教示しおよび示唆 していない。

ヨーロッパ特許出願第０１３３２００号はＰＲＶの媒介者と非媒介者を区別する ために、あるレクチンと結合したＰＲＶ糖蛋白質サブユニットワクチンと共に用 いられるべき診断用抗原ファクターについて言及している。

ヨーロッハ特許出願第００７４８０８号はヘルペスウィルス・チミジン・キナー ゼ遺伝子より成る選択可能なりＮＡ配列の使用を通じて安定に生じる真核細胞ま たはウィルスのゲノムにおける特異的なりＮＡ配列の挿入、欠失および置換につ いて言及している。操作に感受性としてリストされているゲノムのうちにＰＲＶ がある。もう１つの関連した出願も同様の方法を開示している（エル・イー・ポ スト′およびビー・ロイラマン（Ｌ、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ　ａｎｄ　Ｂ、Ｒｏｉｚｍ ａｎ）、［大型ゲノムにおける特定遺伝子の欠失のための普遍技術：ヘルペス・ シンプレックスウィルス１のα遺伝子２２は増殖に必須ではない」、セル（Ｃｅ ｌｌ）、２５．２２７〜３２頁（１９８１））。これらの文献中に開示されてい る方法は本発明のＰＲＶを生産するのに用いられる（後記）。

エイ・ジエイ・エム・ベルンズおヨヒエイ・エル・ジエイ・ギールケンズ（Ａ、 Ｊ、Ｍ、　Ｂｅｒｎｓａｎｄ　ｋ、Ｌ−’Ｊ−Ｇｉｅｌｋｅｎｓ）、ヨーロッパ 特許出願第０１４１４５８号はＰＲＶの欠失突然変異体について言及している。

該欠失は分泌された糖蛋白質をコード付けする遺伝子のウィルスと野生型ウィル スを血清学的に区別する該突然変異体を示唆も記載もしていない。

エイ・エル・ジエイ・ギールケンズラ（Ａ、Ｌ、Ｊ−Ｇｉｅｌｋｅｎｓ　、　ｅ ｔ　ａｌ、）（ｒ偽狂犬病ウィルスの野生単離体とワクチン株の間のゲノムの差 」、ジャーナル・オブ・パイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）、６６ ．６９−８２頁（１９８５）〕はＢａｍＨＩ制限マツピングによって異なる野生 単離体のゲノムと偽狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）の修飾生つ、イルスワクチン株と を比較することに言及している。彼らは変異の２つの型、＋１１　Ｐ　ＲＶゲノ ムのＴＲｓおよびＩＲｓ領域由来のフラグメントへのヌクレオチド配列の添加お よび／または欠失および（２）該ゲノムのＵＬ　領域内のＢａｍＨＩ切断部位の 損失または獲得の観察を報告した。彼らは制限エンドヌクレアーゼでのウィルス 性ＤＮＡの分析はＰＲＶの野生株を区別する方法を提供できうると推測している 。

現在商業的に利用可能なＰＲＶワクチンの１つが、メチンライターら（Ｍｅｔｔ ｅｎｌｅｉｔｅｒ　、　ｅｔ　ａｌ、）［ジャーナル・オブ・バイｏａジー（Ｊ 、　Ｖｉｒｏｌ、　）、５６．３０７〜１１頁（１９８５）：ｌが示した如く、 糖蛋白質重をコード付けする遺伝子についての欠失を含有することを発明者らは 決定した。発明者らはもう１つの商業的株（バルサ（Ｂａｒｔｈａ乃がｇｐ６３ 　を欠くことも示した。

これらのワクチンは後記の如く本発明のある具体例において有用であり得る。

ビー・ロムニックライら（Ｂ、Ｌ６ｍｎｉｃｚｉ　、　ｅｔ　ａｌ、）〔「偽狂 犬病ウィルスワクチン株のゲノムにおける欠失およびゲノムの４つの異性体の存 在」、ジャーナルーオブ・パイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、４９．９７０〜 ７９頁（１９８４）］は（バルサ（Ｂａｒｔｈａ）およびノルデン（Ｎｏｒｄｅ ｎ）からの）２種の商業的ＰＲＶのワクチン株が０．８５５と０．８８２の地図 単位間にＰＲＶゲノムの独特な短配列に欠失を有することを示す該株の特徴づけ について言及している。この領域はＰＲＶのＢａｍＨＩ７フラグメントの範囲内 である。これらの文献は分泌糖蛋白質を欠＜ＰＲＶ、かかる突然変異体より成る ワクチンまたはかかるＰＲＶ突然変異体を用いることによるワクチン接種した動 物と感染した動物とを区別する方法をどこにも記載または示唆していない。

米国特許第４５１４４９７号はＰＲＶｔｋ−欠失について言及している。それは ビルレフト野生型ウィルスで感染した動物とワクチン接種した動物とを血清学的 に区別することを可能とする欠失を有するＰＲＶについては言及していない。

発明の要約 本明細書中で用いる如く、「適当に不活性化したウィルス」なる表現およびその 表現の変形、および「アビルレント」は共に殺したウィルスおよび弱毒化したウ ィルスを言う。

本明細書中で用いる如く、「分泌糖蛋白質」は培養において感染細胞の培地内に 蓄積された糖蛋白質を言う。

本発明は少くとも１つの検出可能な野生型ウィルスの抗原を欠く適当に不活性化 されたウィルスより成るワクチンに関し、それはワクチン接種した動物と感染動 物との間の血清学、的区別を可能とする。

さらに詳しくは、本発明は野生型ＰＲＶの血清学的に検知可能なポリペプチドを 欠く偽狂犬病ウィルスに関する。

さらに詳しくは、本発明は野生型ＰＲＶの分泌糖蛋白質を欠く偽狂犬病ウィルス に関する。

さらに詳しくは、本発明は糖蛋白質Ｘを欠く偽狂犬病ウィルスに関する。

本発明は、また、ワクチン接種した動物と感染動物とを区別する方法および前記 ウィルスおよびワクチンより成る多価ワクチンを提供する。

発明の詳細な説明 本発明はテストした動物を殺す必要なくしてワクチン接種した動物と感染した動 物とを血清学的に区別することを可能とするワクチンに関する。該ワクチンは抗 原性ポリペプチド、好ましくは分泌ポリペプチド、およびさらに好ましくは分泌 糖蛋白質について欠失を有するウィルスより成る。

発明者らは組換え体ＤＮＡ法を用いることによって該ＰＲＶを生産した。もう１ つの公に入手可能なプラスミド（ｐＡｃＹｃｌ　ｓ　４　）と共に、発明者らが 欠失しようと望むｇＸ遺伝子を包含する容易に入手可能なプラスミド（ｐＰＲＸ ｈｌ、またｐｔｌｃ１４２９　としても公知）で出発して、発明者らは好都合な 操作についてサブクローンしたｇＸ遺伝子を担持するプラスミド（ｐＰＲＸＫ４ ）ヲ組立てた。次いで、発明者らはｐ　Ｐ　ＲＸＫ４からｇＸプロモーターを除 去し、プラスミドｐＰＧＸ１を組立てるためにそれをもう１つの公に入手可能な プラスミド、ｐＬｌｃ９にクローンした。次に、本発明者らはプラスミドｐＲＢ １０３からＨ５Ｖチミジンキナーゼ（ｔｋ）　の遺伝子を除去し、該ｇＸ　プロ モーターと融合してプラスミドｐＧＸＴＫ２を生産するようにそれをｐ　ＰＧＸ 　ｌ中の部位中に挿入した。次いで、本発明者らは該ｇＸ遺伝子のＣ末端コーデ ィング領域を含有するＰＲＶのＢａｍＨＩ７　フラグメントをｐＰＲＸｈｌから 除去し、それをｐＧＸＴＫＺ中のｔｋ遺伝子から下流に挿入して該Ｈ３Ｖ　ｔｋ 遺伝子がその中で該ＰＲＶ　ｇＸプロモーターおよび該ｇＸ遺伝子についてのＣ 末端コーディング領域によってフランキングされるプラスミド（ｐＧＸＴＫ３） を形成した。本発明者らは。

次にエル・イー・ポストおよびビー・ロイラマン（Ｌ、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ　ａｎｄ 　Ｂ、　Ｒｏｉｚｍａｎ）の方法（後記）によってウサギの皮膚細胞をｔｋ　ｇ Ｘ＋ｐＲＶｊ’；よびｐＧＸＴＫ３　（＋ ｔｋｇＸ）テ共トランスフェクトしテｔｋ　ｇＸ−ＰＲＶを生産した。最後に、 本発明者らは該ｔｋ十ｇＸ　ＰＲＶをｔｋ　ｇＸ　ＰＲＶに変換してワクチンと して用いるために該ウィルスを弱毒化した。本発明者らは、また、偽狂犬病に対 するワクチンとして該ｔｋ　ｇＸ−ＰＲＶの有効性を証明した。

チャートＡ　−には本発明の詳細な説明するために掲げた。プラスミドおよびＤ ＮＡフラグメントを説明するのにある約束を用いる。

（１）単一線の図は環状および直線状の二本鎖ＤＮＡを表わす。

（２）星印（勺は表わされた該分子が環状である′ことを表わす。星印が無いも のは該分子が直線状であることを示す。

（３）エンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上方に示している。

（４）遺伝子は直線の下方に示している。

（５）遺伝子と制限部位間の距離はスケール通りではない。図はそれらの相対的 な位置のみを示す。

プラスミドの組立てで用いる方法は当業者によく知られた標準的な組換え体ＤＮ Ａ法である。これらの方法は、例えば、ティー・マニアティスら（Ｔ、Ｍａｎ　 ｉａ　ｔ　ｉ　ｓ、ｅｔ　ａｔ、）モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）　、コウルド・スプリングＨハーバ−（ＣｏｌｄＳｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）研究所（１９８２）およびビー・ペルパル（Ｂ、　Ｐ ｅｒｂａｌ　）　、ア・プラクティカル・ガイド・トワ・モレキュラー・クロー ニング（Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ　ｔｏ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ ｎｉｎｇ）　、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆ 　５ｏｎｓ）中に記載されており、ここに参照のために挙げる。

本明細書中で用いる特定の方法の多くはエル・イー・ポストおよびビーーｏイツ マン（Ｌ、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ　ａｎｄ　Ｂ。

Ｒｏｉｚｍａｎ）　、ｒ大型ゲノムにおける特定遺伝子の欠失のための普遍技術 ：ヘルペス・シンプレックスウィルス１の工遺伝子２２は増殖に必須ではない」 、セル（Ｃｅ　１１　）、２５．２２７〜３２頁（１９８１）中に述べられてお り、ここに参照のために挙げる。特に、共トランスフェクションおよび選択方法 がそこに見い出される。

実施例１ １、　ｐＰＲＸＫ４の組立て 以下、チャートＡを参照し、完全なｇＸ遺伝子をすブクローンするプラスミドの 組立てを記載する。

ＰＲＶからのｇＸ遺伝子およびｇＸプロモーターを含有する（ｐＵｃ１１２９　 としても公知であってイリノイ州、ペオリア、米国農務省、ノーザン・リージョ ナル・リサーチ−ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）から寄託番号Ｂ−１５７７２として入手可能 な）プラスミドｐＰＲＸｈｌを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ で消化する。産生された４個のフラグメントのうち３番目に大きいもの（フラグ メント１、約２．６ｋｂ）をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離する 。フラグメント１をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＥｃｏＲＩ！Ｊン カーを加える。

（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　、１２３０１パークローン・ド ライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉ　１１ ｅ）、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）　２０８５２から寄託番号３７０３３ 　として入手可能な）ベクターｐＡＣＹＣ１８４をＥｃｏＲＩ　で消化し、細菌 アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理してフラグメント２を得る。Ｅｃ。

Ｒ１がＣｍｒ遺伝子を切断する。

次いでフラグメント１と２を結び、プラスミドｐＰＲＸＫ４を産生ずる。このプ ラスミドは完全なｇＸ遺伝子を含有し、を望なｇＸプロモーターを包含スる（リ −ら（Ｒｅａ　、　ｅｔ　ａｔ、）　、前掲参照）。

２、ｐＰＧＸｌ　の組立て 以下、チャートＢを参照し、ｇＸプロモーターのサブクローニングを記載する。

制限エンドヌクレアーゼＭｓ　ｔ　Ｉ　（ＴＧＣＧＣＡ）によって認識されるヌ クレオチド配列をｇＸ　ｍＲＮＡの５′−非翻訳領域をコード付けすると推定さ れるＤＮＡ配列中に位置させる（リーら（Ｒｅａ、　ｅｔ　ａｌ、）　、前掲） 。ｐ　Ｐ　ＲＸＫ４をＭｓｔｒで消化し、２番目に大きいフラグメント（フラグ メント３、約２．１　ｋｂ　）　を単離する。次いで、フラグメント３をＥｃｏ ＲＩで切断し、より小さな切断片（フラグメント４、約４００　ｂｐ）を単離す る。（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　Ｐ／Ｉ、社、ビス力タワエイ（Ｐ ｉｓｃａｔ−ａｗａｙ）、ニューシャーシー州、米国から入手可能な）プラスミ ドｐＵＣ９をＥｃｏＲＩ　およびＳｍａｌ　で消化し、より大きなフラグメント （フラグメント５、約２．６ｋｂ）を単離する。次いでフラグメント４と５をＥ ｃｏＲＩ　部位で結び、ＭｓｔＩ／ＳｍａＩ融合によってｐＰＧＸｌを産生する 。

このプラスミドはｇＸプロモーターから直ぐ下流のＢａｒｒＩＨＩ　切断部位と 共にｇＸプロモーターを含有する。

３、　ｐＧＸＴＫ２の組立て 以下、チャートＣを参照し、ｇＸプロモーターがＨＳＴｔｋ遺伝子と融合される プラスミドの組立てを記載する。

前記からのプラスミドｐＰＧＸ１　をＢａｍＨＩで消化し、ＢＡＰで処理してフ ラグメント６を得る。プラスミドｐＲＢ１０３はＨ５Ｖ−１株ＦからのＢａｍＨ ＩＱ　７ラグメントを含有する（エル・イー・ポストら（Ｌ、　Ｅ、　Ｐｏ５ｔ 、ａｔ　ａｔ、）　、プロシーデイングズ°オブ・ナショナル・アカデミ−・オ プ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ、７７．４２０１−０５頁（１９８０）　）。

（別法としてベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）［ガイセルズブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒ ｓｂｕｒｇ）　、メリーランド州、米国〕から商業的に入手可能なプラスミドｐ Ｈ５Ｖ１０６　もＢａｍＨＩ　Ｑフラグメントを含有し、この組立てにおいて用 いることができる。）　ｐＲＢ１０３をＢａｍＨＩとＢｇｌ！ＩＩで消化し、２ 番目に大きいフラグメント（フラグメント７、約２．９ｋｂ）を単離する。この フラグメントはそのプロモーターが無いＨ５Ｖ　ｔｋ遺伝子を含有する。消化し たｐＰＧＸｌ（フラグメント６）とＢａｍＨＩ　部位にｔｋ遺伝子（フラグメン ト７）を含有するフラグメントとのｉ　％およびＢｇｌ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩ融 合によって反対に配位するｔｋフラグメントを含有する２個のプラスミドを得る 。ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの消化パターンの調査によって、ｇＸプロモーターか ら直ぐ下流にｔｋ遺伝子を有するプラスミドを選択し、これをｐＧＸＴＫ２と命 名する。

４、　ｐＧＸＴＫ３の組立て 以下、チャートＤを参照し、Ｈ３Ｖ　ｔｋ遺伝子およびそれをフランキングする ＰＲＶ配列より成るプラスミドを記載する。

ｐＰＲＸｈｌ　（前記１参照）をＢａｍＨＩ　で消化し、フラグメント８（約６ ．９ｋｂ）を単離する。（このフラグメントはＢａｍＨＩ７として文献で公知で ある（リ−ら（Ｒｅａ　、　ｅｔ　ａｌ、）参照、前掲）。）　ｐＧＸ、ＴＫ２ をＢａｍＨＩで消化し、ＢＡＰで処理してフラグメント９を産生する。

フラグメント８を結合してｐＧＸＴＫ２のＢａｍＨＩ　部位（フラグメント９） 中に入れる。ｇＸプロモーターと同一の配位であるフラグメント８を有する得ら れたプラスミドをｐＧＸＴＫ３と命名する。このプラスミドはｇＸプロモーター から直ぐの下流にあってｇＸのＮ末端アミノ酸をコーディングするＤＮＡを置換 するｔｋ遺伝子を有する。

５、共トランスフェクション 以下、チャートＥを参照して、ｐＧＸＴＫ３をＣ１ａｌで切断する。ｇｘ（効果 的にはｇＸ’−）のＣ宋端領域を含有する得られたＤＮＡフラグメントおよびｇ Ｘプロモーターに融合した全Ｈ３Ｖｔｋ遺伝子を用いてタタロブ（Ｔａｔａｒｏ ｖ）（ツエントラルブラト・ベーターイン不−ル〆デイツイン（Ｚｅｎｔｒａｔ ｂｌａｕ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｍｅｄｉｚｉｎ）　、１５．８４７−５３頁（１ ９６８）］の方法に従い、ヨードデオキシウリジンの存在においてＰＲＶの増殖 によって選択された（発明者らがＰＲＶ　ＨＲと命名する）ＰＲＶのｔｋ　ｇＸ ＋突然変異体からのＤＮＡと共にウサギの皮膚細胞を共トランスフェクトする。

（適当な不活性化の後、ワクチンに用いることができる）　ｔｋ＋ｇＸ−組換え 体ウィルスはＨＡＴ培地（エル・イー・ポストおよびビー・ロイラマン（Ｌ、Ｅ 、Ｐｏ５ｔ　ａｎｄＢ、Ｒｏｉｚｍａｎ）、前掲）におけるｔｋ−ヒト１４３細 胞における増殖によって選択される（ジエイ・ピー・ウニイルら（］、Ｐ、　Ｗ ｅｉｒ　％ｅｔ　ａｌ、）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、 ７９．１２１０−１４頁（１９８２）：バニカリおよびバオレツテイ（Ｐａｎ− ｉｃａｌｉ　ａｎｄ　Ｐａｏｌｅｔｔｉ）、プロシーデイングズ、オブ。

ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ｔＪ　Ｓ　Ａ　、　７９．４９２７−３ １頁（１９８２）：カンピオネーピツカルドら（ＣａｍｐｉｏｎｅＰｉｃｃａｒ ｄｏ、ｅｔ　ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・パイａｃｔジ（−ＬＶｉｒｏｌ、 ）、３１．２８１−８７頁（１９８２）：ケイー１ルーポフエンベルガーら（Ｋ 、Ｆ、　Ｐｏｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ　＋　ｅｔ　ａｔ、）、プロシーデイングズ ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＩＪ　Ｓ　Ａ、８０．２６９０−９４頁（１９８３） ：エム・エフ・スティンスキーら（Ｍ、Ｆ、　５ｔｉｎ−ｓｋｉ　、ｅｔ　ａｌ 、）ジャーナル・オブ・へ′４０ロジ−（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）、５５．４３１−４１頁（１９８５））。本発明者らは得られた ウィルスをＰＲＶΔｇＸ１またはＤＴ−Ａと命名した。ＤＴ−Ａはｔｋ十であっ て十分にマウスを殺す能力がある。

３５Ｓ−メチオニンまたは１４（−グルコサミンでウィルス性蛋白質をラベルし 、ひき続く抗ｇＸ血清での免疫沈降により、ＨＡＴ（例えば、ＤＴ−Ａ）中での 増殖により選択したウィルスをｇＸの合成について分析する。

ｇＸ　は検出されない。

抗ｇＸ血清でのウェスタン・プロッティング法によりｔｋ＋ｇＸ−ウィルスで感 染した細胞からの蛋白質も分析したが、突然変異体ウィルスで感染した細胞にお いてｇＸ　は検出されない。

全ｇＸ遺伝子を除去するのも可能である。例えば、フラグメント８をＮａ　ｒ　 Ｉ　で消化することによって、全ｇＸ遺伝子が欠失されたフラグメントが産生さ れる（チャー）Ｄ参照）。次いで、このフラグメントをフラグメント８の代りに 用いてｇＸ遺伝子を全く欠＜　ｇＸ　ＰＲＶを産生できる。

ｔｋ　ＰＲＶはアビルレントであって良好なワク′チンが製造されることは少し 前から知られていた。従って、ＤＴ−Ａを適当に不活性化してワクチンとして有 用なｔｋ−ウィルスを製造するには、タタロブの方法（例えば、ジー・タタロブ （Ｇ、Ｔａｔａｒｏｖ　）、「５−ヨード−２−デオキシワリジン（ＩｔＪＤＲ ）によって誘導されたアウジエスキー・ウィルスの非病原性変異株」、ツエント ラルブラト・ベテリナルメデイツイン（ＺｅｎｔｒａｌｂｌａｔｔＶｅｔｅｒｉ ｎａｒｍｅｄｉｚｉｎ）、１５．８’４７−５３頁（１９６８）ニジ−・タタロ ブら（Ｇ、Ｔａｔａｒｏｖ　、　ｅｔ　ａｔ、）　、ｒアウジエスキー・ウィル スＭＫ株の無害性および免疫原曲の調査」、ベト・ナウキ（Ｖｅｔ、　Ｎａｕｋ ｉ）　、６．４９−５４頁（１９６９）　ニジ−・タタロブ（Ｇ、Ｔａｔａｒｏ ｖ　）、「アウジエスキー病に対する生ワクチンＭＫ−２５の使用結果」、ベト ・シビルカ（Ｖｅｔ、　５ｂｉｒｋａ）、７．１０〜１２頁（１９７４）ニジ− ・タタロブ（Ｇ、　Ｔ３ｔａｒｏｖ）。

「アワジエスキー病に対するプルガリアンＭＫ−２５ワクチン」、カー・メト・ ベト（Ｃａｈ、　Ｍｅｄ、　Ｖｅｔ、）、４３．３４７〜５２頁（１９７４）； ジー・タタロブら（Ｇ、Ｔａｔａｒｏｖ、　ｅｔ　ａｌ、）ｒ　５−ブロモデオ キシウリジンの影響下におけるアウジエスキー病ウィルスのアビルレント変異株 の開発」、ベテリナリ・サイエンス（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ） 、１８．３〜１２頁（１９８１）；ブイークリストーバら（Ｖ、Ｋｈｒｉｓｔｏ ｖａ　、ｅｔ　ａｔ、）、「アワジエスキー病ウィルスのビルレントおよびワク チン株のチミジンキナーゼ活性」、ベテリナリ・サイエンス（Ｖｅｔｅｒｉｎａ ｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ）　、２２．１５−２２頁（１９８５）参照）によって二 または同様の技術（ダブリュー・シー・トップ（Ｗ、Ｃ，Ｔｏｐｐ）、パ１イロ ロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１１３．４０８−１１頁（１９８１）：ニス・キ ットら（Ｓ、　Ｋｉｔ　、　ｅｔ　ａｌ、）、イクスペリメンタル・セル−リサ ーチ（Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、３１．２９７〜３１２頁（１９６３）： ニス・キットら（Ｓ、　Ｋｉｔｅｔ　ａｌ、）　、バ′イロロジー（Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ）　、１３０．３８１〜８９頁（１９ｓ３））によって突然変異を起こさ せｔｋ　ＰＲＶについて選択できる。

エル・イー・ポストおよびビー・ロイラマン（Ｌ、Ｅ。

Ｐｏ５ｔ　ａｎｄ　Ｂ、Ｒｏｉｚｍａｎ）　（前掲）の以下の方法に従い、この ｔｋ”　ｇＸ　ＰＲＶおよびｇＸ欠失を持つプラスミドでウサギの皮膚細胞を共 トランスフェクトし、ａｒａＴでｔｋ７組換え体について選択することによる） （ＳＶｔｋ遺伝子を除去する組換えの結果によって、Ｈ５Ｖｔｋ遺伝子を含むＰ ＲＶΔｇＸ１もｔｋ　ＰＲＶ　に変換できる。

以下、チャートＦを参照して、チャートＣ１工程ｔａ＋に示した如くプラスミド ｐＰＧＸ１をＢａｍＨＩ　で消化し、ＢＡＰで処理してｇＸプロモーターより成 るフラグメント６を産生する。前記およびチャートＤ、工程ｔａ＋に示した如く 、プラスミドｐＰＲＸｈｌをＢａｍＨＩ　で消化してｇＸのＣ末端コーディング 領域より成るフラグメント８を産生する。このフラグメントもＰ　ＲＶ　Ｂａｍ ＨＩ　７　フラグメントとして公知である。次いでフラグメント６と８を一緒に 軸素し、イー・コリ中に形質転換し、Ｅｃ。

ＲＩ　とＰｖｕＩＩ　での消化によって該クローンをＢａｍＨ１７フラグメント の所望する配化についてスクリーニングを行う。過当な配位は消化による２、Ｏ ｋｂフラグメントの生成によって示される。得られたプラスミドをｐ△ＧＸＢ７ と命名する。

リン酸力ルシワムトランスフエクション法（モカルスキーら（Ｍｏｃａｒｓｋｉ 、　ｅｔ　ａｌ、）、セル（Ｃｅｌｌ）、２２：２４３（１９８０））を用い、 ＰＲＶΔｇＸ１　から（７）’フィルス性ＤＮＡでプラスミドｐΔＧＸＢ７を共 トランスフェクトしてウサギの皮膚細胞に入れる。モカルスキーら（Ｍｏｃａｒ ｓｋｉ、　ｅｔ　ａｌ、）　（前掲）によって記載された如く、１００μｇ／！ ｔのａｒａＴの存在下、このトランスフェクション由来のウィルスをベロ（ｖｅ ｒＯ）細胞上で平板培養スル。モカルスキーら（Ｍｏｃａｒｓｋｉ　、ｅｔ　ａ ｌ、）（前掲）によって記載された如く、ＤＮＡの制限酵素消化によって、個々 のプラークを選択して所望するｔｋ−組換え体ウィルスについて分析する。この ワイルレスは命名し？、：　ＰＲＶΔＧＸＴＫ−またはＤＴ−Ｂである（チャー トＧ）。

以下の実施例２に示す如く、これらのｔｋ　ＰＲＶはワクチンに対して有用な弱 毒化ウィルスである。

これらのウィルスを用いて感染した動物とワクチン接種した動物とを区別するに は、例えばエライザ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いることができる。一般に、例 えば組換え体ＤＮＡ法（リーら（Ｒｅａ　、　ｅｔ　ａｌ、　）、前掲）によっ てイー・コリ中で産生されたｇＸ蛋白質を適当なプラスチック板のウェルに加え 、十分な時間放置して該プラスチックに吸収させる（−晩、２０〜２５℃）。

該プレートを洗浄し、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ）を加えて該プラスチッ ク表面上の未反応部位を中和する。ひき続いて洗浄し、次いでブタの血清を該ウ ェルに加える。２０〜２５℃での約１時間のインキュベーションの後、該ウェル を洗浄し、蛋白質Ａ−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体を２０−２５℃での１ 時間のインキュベーションの間に各ウェルに加える。ひき続いてもう一度洗浄し 、酵素基質（Ｏ−フェニレンジアミン）を該ウェルに加え、酸で反応を停止する 。

４９２ナノメーターで吸光度を測定して血清中に存在するｇＸ抗体の量を定量す る。ｇＸ抗体の不存在は動物が感染していないことを示す。他の抗原についてテ ストすることによって与えられた動物がワクチン接種されているか否かを決定で きる。

ＰＲＶムＧＸＴＫ−は効果的なワクチンではあるが、ヨードデオキシウリジン中 の増殖によって選択されたＰＲＶ　ｔｋ−突然変異は点突然変異である可能性が ある。もしそれが点突然変異だとすると、それはｔｋ＋に復帰し、しかも恐らく ビルレントである可能性がある。従って、欠失を有するｔｋ　ＰＲＶが好ましい 。米国特許第４５１４４９７号はＰＲＶｔｋ−欠失について言及している。

ｔｋ　ＰＲＶヲつくるのにそこで用いるマーカー救済法は単純庖疹ウィルスにお いてｔｋ−欠失をつくるのに初メて用いられた（ジエイ・アール・スマイリー（ Ｊ、Ｒ，Ｓｍ−１１ｅｙ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２８５：３３３−３ ５（１９８０）およびエル・イー・ポストら（Ｌ−Ｅ、Ｐｏ５ｔ、ｅｔ　ａｌ、 ）、セル（Ｃｅ　Ｉ　１　）、２４　：５５５−６５（１９８１））。

以下、チャートＨを参照して、ＰＲＶのＢａｍＨ１１１フラグメントに対してＰ ＲＶ　ｔｋ−遺伝子の地図が作成さレテイル（ティー・ベン−ボラートら（Ｔ、 Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ、ｅｔ　ａｌ、）　、ハ’イロロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ） 、１２７：１９４−２０４（１９８３））。ＰＲＶライス（Ｒ４ｃｅ）株からの ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動にヨッテＢａｍＨ１１１ フラグメントを単離し、クローンシてｐＢＲ３２２に入れてプラスミドｐＴＫ１ １　を産生ずる。

ｐＴＫｌ　１　はｔｋ遺伝子内に単一のＸｈｏＩ＋；ｒ１断部位を有する。ｐＴ ＫｌｌをＸｈｏｌ・で切断し、エキソヌクレアーゼＢａ１３１で種々の時間消化 し、リガーゼで再環化し、イー・コリＤＨＩ中に形質転換した（マニアティス（ Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前掲、５０５頁）。これによりｔｋ遺伝子中に種々の欠失 を有する一連のプラスミドが産生された。

これらのプラスミドのうち２つを選択し、ＣｓＣ１密度勾配遠心法によって精製 し、マクシマムおよびギルベルト（Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）　Ｉ ：メソッズ・イア　−ｘ　７ザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ ｏｌｏｇｙ）、６５（パート１）、４９７−５５９頁（１９８０）’）の方法に よって配列付けした。プラスミドｐ△ｔｋ−３はｔｋ遺伝子内からの３２９個の 塩基対の欠失を有しており、プラスミドｐΔｔｋ−４は２７５個の塩基対の欠失 を有していた。

ｔｋ　欠失がｇＸ−ウィルス中に交差できる前に、ｔｋ−欠失組換え体を選択で きるように、まずウィルスｔｋ＋をつくる必要があった。ＰＲＶΔＧＸｉ″Ｋ　 ＤＮＡ　をプラスミドｐＴＫ１１　で共トランスフェクトしてウサギの皮膚細胞 中に入れた。得られた組換え体ウィルスを単離し、ＨＡＴ培地中の１４３紀胞中 で増殖させて本発明者らがＰＲＶΔｇＸｔｋ＋ＰＲＶと命名したｔｋ＋ウィルス を選択した。次いでこのウィルスからのＤＮＡをｐ△ｔｋ−４ＤＮＡで共トラン スフェクトしてウサギの皮膚細胞中に入れた。ａｒａ　Ｔの存在において、得ら れたウィルスをベロ（ｖｅｒｏ）細胞上で平板培養してｔｋ−組換え体について 選択した。ＤＮＡの調製および制限洋素分析によって、得られたウィルスＸ適当 な粗換え体についてスクリーニングした。これらの組換え体はｔｋ　欠失を一体 化した。本発明者らがＰＲＶΔｇＸΔｔｋまたはＤＴ−Ｃと命名したこれらのウ ィルスのうちの１つは予期されたｔｋ欠失２よびｇＸ欠失を含有していた。本発 明者らはＤＴ−ＣのＬＤ５ｏはマワスに２ける１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ ）よりも大きいと決定した。比較のため、ＰＲＶΔｇＸ　Ｐ　ＲＶＴＫ　のＬＤ ５ｏ　は３　ｐｆｕであった。

本明細書中に記載した特定の具体例はＰＲＶに関するものであって組換え体ＤＮ Ａ法を利用するものであるが、分泌糖蛋白質について欠失を含有する同様のワク チンは他の技術、およびマレク病ウィルスおよび感染性ウシ鼻気管炎ウィルスの 如き他のウィルスを利用することによっても産生ずることができる。

本明細書中の開示は主としてＰＲＶに関するものであるが、本明細書中で用いる 該技術はＰＲＶに関する場合の如くワクチン接種した動物と感染した動物とを区 別するのに有利ないずれの状況におし１ても血清学的に区別されるヘルペスウィ ルスを産生ずるのに用いることができる。例えば、マレク病ワイルスおよび感染 性ウシ鼻気管炎ウィルスが包含される。

本発明者らはＨ３Ｖｔｋ遺伝子をｇｘプロモーターの制御下に置いたが、ｔｋを 含有するＤＮＡフラグメントはそれがもう１つのＰＲＹプロモーター、またはｔ ｋ遺伝子の発現について機能できるいずれの池のプロモーターの制御下にあるよ うにも挿入できる。ＰＲＶ感染細胞中に表現できる、例えば、他のＨＳＶプロモ ーター、例えば、Ｈ３ＶＩＣＰ４　プロモーターも用いることができる。例えば 、ＰＲＶ感染細見己中に発現できるプロモーターの制御下、ＰＲＶ　ｔｋ遺伝子 をｇＸ遺伝子中に挿入でき、またはいずれの他のｔｋ遺伝子も挿入できる。

本発明者らはｔｋ遺伝子を標識遺伝子の挿入として用いたが、標識がそれを欠く ウィルスからのその標識を持つウィルスの選択を許す限り、いずれの標識遺伝子 もｇＸ遺伝子中に挿入してそれを不活性化できる。例えば、抗生物質耐性遺伝子 はＧ４１８またはハイグロマイシンに対する耐性の如き標識遺伝子として用いる ことができる。

選択可能な標識以外の遺伝子をｇＸ遺伝子中に挿入することも可能である。かか るウィルスを組立てるには、ｔｋ　配列を置換する外来性遺伝子を用いて外来性 遺伝子をｐＧＸＴＫ３の如きプラスミド中に入れることができる。次いでこのプ ラスミドをチャートＥで説明したｔｋ＋ｇＸ−ウィルスからのＤＮＡで共トラン スフェクトできる。ａｒａＴでの選択により外来性遺伝子が挿入され１発現され た組換え体ウィルスが得られる。かかる遺伝子は、例えば、もう１つのタイプの ウィルス、例えば伝播性胃腸炎ウィルスまたはブタのパルボウイルス、あるいは イー・コリの如き細菌の抗原をコード付けすることができ、それにより次いでそ の他のウィルスに対する免疫応答を生ぜしめる。従って本発明のこの具体例にお いて、２つまたはそれ以上のタイプのウィルスまたは他の病原体についての抗原 より成る「多価」ワクチンが産生できる。

前記の例として、本発明者らは組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰＡ） 　遺伝子を以下の如くにしてｇＸ　遺伝子中に挿入した。

ｐＰｓＡ１８はコープ・会ング領域の５７−非翻訳領域における独特のＢａｍＨ Ｉ　切断部位と共にｔＰＡについての全コーディング領域を含有するプラスミド である。それは１９８５年７月２６日に出願された同時係属の米国特許出願第７ ５８５１７号に示されている如く組立てられる。以下、チャートＩを参照すると 、Ｉ）ＰＳＡＩ　８をＢａｆＩで切断し、ＢａｍＨＩ　！Ｊンカーを加えてフラ グメント１１を産生する。次いでフラグメン）１１ヲＢａｍＨ１で消化してｔＰ Ａの全コーディング領域を含有する１、９５ｋｂフラグメント（フラグメント１ ２）を産生する。次いでプラスミドＩ）ＰＧＸＩ　（チャートＢ）をＢａｍＨＩ 　で切断してフラグメント６を産生する。次いでフラグメント１２と６を結び、 プラスミドｐＧＸＴＰＡを産生する。ｇＸ　プロモーターに関するｔＦ’Ａ　ｃ ＤＮＡの配位が適当な場合、該適当な配位を１．１ｋｂ　フラグメントを産生す るＥｃｏＲＩ　での消化によって決定する。

以下、チャートＪを参照して、プラスミドｐＧＸＴＰＡをＨｉｎｄＩ［Ｉ　で消 化してフラグメント１３を産生する０ＰＲＶ　ＤＮＡのＢａｍＨＩ７フラグメン トを前記（フラグメント８）の如く単離し、Ｈｉｎｄ　ｍ　りンカーを加えてフ ラグメント１４を産生ずる。次いでフラグメント１３と１４を一緒に箱び、ｐＧ ＸＴＰＡ−Ｂ７を産生する。このプラスミド中に挿入されたＢａｍＨＩ７フラグ メントの適当な配位をＥｃｏＲＩと５ｐｈＩでの消化によって決定する。

該配位が適当な場合、それにより５．８ｋｂ　フラグメントが産生される。

次いてプラスミドｐＧＸＴＰＡ−Ｂ７をＰＲＶΔＧＸＩ　からのウィルス性ＤＮ Ａで共トランスフェクトしてウサギの皮膚細胞に入れる。ａｒａＴの存在下で、 得られたウィルスをベロ（ｖｅｒｏｌ胞上で平板培養してｔｋ−組換え体を選択 する。本発明者らはかく選択したウィルスの１つをＰＲＶ−ＧＸＴＰＡと命名し た。このウィルスが細胞に感染した場合、抗ｔＰＡ抗血清での免疫沈降によって 検知される如く、該細胞はｔＰＡを産生じかつそれを分泌する。２　Ｃｎｇ／ｒ ｎｌのｔＰＡ活性をフィブリン可溶化アッセイによって検出した（ウンケレスら （ＩＪｎｋｅｌｅｓｓ、ｅｔ　ａｌ−）、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタ ル・メデイシン（Ｊ　、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　、１．３７．８５−１１１頁（ １９７３）：ルスクトフら（Ｌｕｓｋｕｔｏｆ　ｆ　、　ｅｔ　ａｌ　、）、プ ロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　Ｕ　Ｓ　Ａ。

７４．３９０３−〇７（１９７７））。

実施例２ 本実施例（こおいて、本発明者らはＰＲＶのチミジンキナーゼ欠乏糖蛋白質Ｘ欠 失突然変異体（ｔｋ−ｇＸ−）でワクチン接種することによるマウスとブタのＰ 　’ＲＶ誘発死からの防御を示す。

１、動物 ５週令の雌のＣＦ−１マウスをチャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅ ｒ）［から得た。

５〜６週令で雌雄混合である交雑育種したブタ１８頭をジエイ・ギルモア・エン ターフライス（Ｊ、Ｇｉ　１ｍｏｒｅＥｎｔｅｒｐｒｉｓｅ）より入手した。１ 室当たり６頭のブタとなるようにブタをランダムに３部屋に割当てた。

ブタおよびマウスには適宜薬品を含まない飼料および水を与えた。

２、ウィルスおよび細胞 前記の如く、親ＰＲＶ（ＨＲ株：　ｔｋｇＸ＋）からＰＲＶ欠失突然変異体Ｄ　 Ｔ　−Ａ　（Ｈ３Ｖ　ｔｋ＋ｇＸ−）オヨＵ　Ｄ　Ｔ　−Ｂ　（ｔｋ−ｇＸ−） を組立てた。ＤＴ−Ｂはチミジンキナーゼを合成せず、かつそれはｇＸ遺伝子の 欠失のためにｇＸを合成しない。全ての防御試験において、ビルレン）ＰＲＶ（ ライス（Ｒｉｃｅ雇）を攻撃ウィルスとして用いた。

ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞またはブタ腎＠−１５（ＰＫ−１５）細胞のいずれかの中 でウィルスを増殖させた。

３、ミクロ中和アッセイ ティー・シー・ホランドら（Ｔ、Ｃ，Ｈｏ１ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、）〔ジャー ナル・オプ・パイロロジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ−）　、　４５．６７２〜８２頁（ １９８３））によって記載されている如くミクロ中和アッセイを行った。マウス 血清をウィルスおよび１０％ウサギ補体と共に３７℃にて３おいてウィルスと共 に３７℃にて１時間インキュベートした。中和滴定量は細胞変性効果から細胞の ５０％以上を防御する血清の最大希釈の逆数として表わした。

４、免疫酵素法（ＥＩｊＳＡ） ｇｘ＠合蛋白質（１）６０−１１　、１９８６年４月１７日出願の河時係属の米 国特許出願第８５３０８７号に示されている如く産生じたもの）をボラ−の（Ｖ ｏｌｌｅｒ’ｓ）緩衝液（５０ｍＭ　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３，０，０３％Ｎ　ａ　Ｎ 　３、ＮａＯＨでｐ　Ｈ９，６に調整）中で２０μｇ／ｒｎｌまで希釈すること によって抗原溶液を調製した。０４５ミクロンの滅菌フィルター（サルトリウス （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）　Ｓ　Ｍ　１６５５５Ｋ）を通してこれを濾過した。要 すれば、使用前に該濾過した溶液をボラ−の緩衝液でさらに希釈した。

ボラ−の緩衝液中のｐ６０−１１蛋白、１ｌｏｏμで（濃度的２μｇ／ｎｌ）を ９６ウエルプレート（コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）３５９０　ＥＩＡ）の各ウェル に加えた。−晩の室温でのインキュベーションの間に吸着が起った。ダルベツコ （Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）　ＰＢＳ　（８ｆ／ｌ　ＮａＣ１、０，２ダ／ｌ　Ｋ Ｃ１！、０．２９／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、および１．１４　ｇ／ｌ　Ｎａ２ＨＰ○ ４；得られたｐＨは７．３〜７．４であった）３００μｌで該ウェルを３度洗浄 した。プラスチック表面上の未反応部位を２時間の３７℃でのインキュベーショ ン間にダルベツコＰＢＳ（ウェル当たり２００μｌり中の３％ＢｓＡで中和した 。ひき続いて、ダルベツコのＰＢＳ３００１１１！で各ウェルを１回洗浄した。

次いで吸着した抗原を希釈した（ＰＲＶに暴露したブタから得た）血清１００μ で中の抗体と反応させ、４℃で一晩インキユベートした。ダルベツコのＰ　Ｂ　 Ｓ　−（３００ｍｅｌワエル）で３回洗浄することによって未反応抗体を除去し た。次いで蛋白質Ａ−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（マウス血清には１／ ８００およびブタ血清には１／１５０００に希釈；５０　ｍＭ　）リス、０．０ ５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２０，１％ＢＳＡ、０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３ 中に希釈、ｐＨ８，０）１００ｍｅヲ２時間の３７℃でのインキュベーション中 に各ウェルに加えた。再度該ウェルをダルベツコのＰ　Ｂ　Ｓ　（３００＝Ｉ（ ／ウェル）で３回洗浄した。基質溶液１００μｌを各ウェルに加えた。（あらか じめＣＨ３０Ｈ０，５ａｙ／中に溶解した）０−フェニレンジアミン１０η３よ び３ｏ％（ｗ／”）　Ｈ２Ｏ２２５ｐｉ：を緩衝液（ＮａＯＨでｐ　Ｈ６，３に 調整した１　７　ｍＭクエン酸、６５ｍＭ　リン酸塩および０．０１チマーシオ レート）４９．５μｌに加えることによってこの溶液を調製した。酵素反応は室 温で１０分間継続し、その後４．５ＭＦ（２Ｓ○４１００μｌを各ウェルに加え た。

タイターチック−？　ルチスカン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）を 用いて発色団の吸光度を４９２ナノメーターで測定した。

５、真綿球からのウィルスの単離 ブタから収集した真綿球を３％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および抗生物質を補足し たイーグルの基礎培地（ＢＭＥ：エム・エイ・バイオプロダクツ（Ｍ、Ａ、　Ｂ ｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））ｌ　ａｔ中に各々置いた。ウィルスの存在についてア ッセイを行うまで綿球を一７０℃で保存した。ウィルス単離アッセイについては 、ＢＭＥ中の真綿球を解かし、個々の綿球を捨てた。試料（０，１ｍｌ　）をブ タ腎臓（ＰＫ−１５：　ＡＴＣＣＣＣＬ３３）細胞単層上でｎ＝２で接種し、３ ７℃にて１時間インキュベートしてウィルスを吸着させる。４％ＦＢＳ、抗生物 質、および１％寒天を補足した培地−１９９（フロラ・ラボラトリーズ（Ｆｌｏ ｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））Ｏ重層を該細胞培養物上に置いた。３日後、細 胞単層をニュートラルレッドで染色し、プラークを数えた。

６、マウス研究についての実験計画 各法の５０％致死量（ＬＤ５ｏ）を決定することによって４種のＰＲＶ株の毒性 をマウスにおいて評価した。

４種のＰ　ＲＶ　ｉｉ　は１）野生型（ライス（Ｒｉｃｅ准）、２）ＤＴ−Ａ、 ３）ＤＴ−Ｂ、および４）ＨＲであった。各ウィルス株をマウスの５つまたは６ つの群（マウス１０匹／群）に種々の投与量で投与した。マウスを足肉址経路に より各ウィルス５０μで　でインキュベートした（第０日）。ウィルスの投与の １４日後（第１４日）にＬＤ５ｏの決定を行い、各ウィルスの最高投与量を与え られた群の生存するマウスから血清を得た。スペアマン−カーバー（Ｓｐｅａｒ ｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）法によって各ウィルス株についてのしＤ５ｏを計算した 。

第１４日に、ＰＲＶライス（Ｒｉｃｅ准について（腹腔内経路で決定した）ＬＤ ５ｏの約１０倍量（１０ＬＤ５０＝５．４Ｘ１０　ｐｆｕ／７ウス）にて、ＬＤ ５ｏ毒性試験がら生き残ったマウスをＰＲＶライス（Ｒｉｃの株で腹腔内攻撃し た。該試験は攻撃の１４日後（第２８日）に結果を得た。

７、ブタの実験についての実験計画 第０日にＤＴ−Ｂ株（約１．５Ｘ１０７ｐｆｕ／ｊり）２ｔｕｌ、製造者によっ て推奨された如きノルデン（ＮｏｒｄｅｎＸワクチン（Ｐ　Ｒ−Ｖａｃ　）　２ ｒｒｔｌ、または食塩水をブタに筋肉内注射した。第２０日に、ビルレッドＰＲ Ｖ（ライス（Ｒｉｃｅ珠）のしＤ５ｏの約４０倍量（４０ＬＤ５０＝１．ｌＸｌ ０”ｐｆｕ／ブタ）で全てのブタを攻撃した。該実験は第３４日に終了した。

第１日、第２０日および第３４日に血清試料を得、各ブタの体重を測った。第１ ９日ないし第３４日に真綿球を毎日採取した。

８、有効性評価の基準 ＰＲＶ　ＤＴ−Ｂ　株（ｔｋ　ｇＸ　）（７）　ワクチンとシテノ有効性をＰＲ Ｖ誘発死に対する防御およびＰＲＶ　ＤＴ−Ｂ　処理ブタと野生型ウィルスに暴 露したブタとを血清学的；こ区別する能力に基づいて評価した。

第１表は各ＬＤ５ｏの決定の見地からマウスの４種のＰＲＶ株の相対的毒性を示 す。野生型株およびＤＴ−Ａに比してＤＴ−ＢおよびＨＲは大いに低い毒性を有 し、少くとも１／１０００以下の毒性である。

ひき続いて第１４日に、各種ＰＲＶ株の投与に対しテ生キ残ッタマウスヲＬＤ５ ｏノ１０倍（５，４Ｘ　１０”ｐｆＶマウス）の投与量にてビルレット野生型Ｐ ＲＶでの腹腔内径路によって攻撃した。第２表に示す如く、Ｉ　Ｘ　１０３ｐｆ ｕまたはそれ以上のＤＴ−Ｂの投与量を与えられたマウスおよび２．３　Ｘ　１ ０３ｐｆｕまたはそれ以上の攻撃から防御された。加えて、ＤＴ−Ｂを与えられ たマウスから攻撃に先立って採取した血清は高力価の中和抗体（中和力価＝１０ ２４）を含有しており、一方、エライザデータに基づくとｇＸ　抗原決定基との 反応は相対的に有意ではなかった（　ＥＬＩＳＡ吸光度＝０．０５）。ＨＲを与 えられたマウスから攻撃に先立って採取した血清は高力価の中和抗体（中和力価 −２０４８）を含有しており、一方ｇＸ抗ぷ決定基との反応は十分であった（Ｅ Ｌ　Ｉ　ＳＡ吸光度＝０．６０）。

ＰＲＶ　ＤＴ−Ｂ株の防御効果および診断的関係を評価するために、第０日に筋 肉内経路によりＤＴ−７３、ノルデン（Ｎｏｒｄｅｎ）生ワクチン（ＰＲ−Ｖａ ｃ）またハ食塩水をブタに接種し、第１４日に野生型ライス（Ｒｉｃｅ）株で鼻 腔内攻撃した。第３表に示す結果により、有意な中和抗体応答を惹起することお よびビルレントライス（Ｒｉｃｅ殊の攻撃からの防（至）を提供することにおい て、ＤＴ−Ｂ株はノルデン（Ｎｏｒｄｅｎ刈ワクチン（ＰＲ−Ｖａｃ）に匹敵す ることが証明される。ｇＸ融合蛋白質を用いてＥＬＩＳＡ法から得られたデータ により、野生型ライス（Ｒｉｃｅ）株への暴露に対して生き残った回復期のブタ から採取した血清はｇＸに対する抗体を有するがＤＴ−Ｂで免疫化したブタはｇ Ｘに対する抗体を有さないことが示唆される。この実験においてノルデン（Ｎｏ ｒｄｅｎ）生ワクチン（ＰＲ−Ｖａｃ）を与えられたブタから採取した血清はｇ Ｘ抗原決定基と統計的に有意な程度（ｐ＞０．０５）に反応しなかったが、従来 の研究に基づくと、ノルデン（ＮｏｒｄｅｎｎはｇＸをコード付けする遺伝子を 有しているのでノルデン（Ｎｏｒｄｅｎ）％ワクチン（ＰＲ−Ｖａｃ）を与えら れたブタはｇＸに対する抗体を形成するかも知れない。従って、ノルデン（Ｎｏ ’ｒｄｅｎ）生ワクチン（ＰＲＶａｃ）でワクチン接種したブタから採取した血 清はｇＸ抗原決定基との反応性の点で異なるかも知れない。

食塩水で処理したブタはほとんどの場合死に至るまで継続的にウィルスを放出し たが、ＤＴ−Ｂとノルデン（Ｎｏｒｄｅｎ）！ワクチンで処理したブタは攻撃後 ウィルスを散発的に放出した。ＤＴ−Ｂで処理した１頭のブタ８よびノルデン（ Ｎｏｒｄｅｎ逓ワクチン（Ｐ　Ｒ−Ｖａｃ　）で処理した１頭のブタの鼻分泌物 中でウィルスは検出されなかった。これらの結果よりワクチン接種したブタはワ クチン接種しないブタと同じくらい容易；こはウィルスを放出しないことが示唆 される。

ＤＴ−Ｂで処理したブタの（攻撃に先立つ）第２０日における平均体重は食塩水 で処理した対照ブタの平均体重と有意には差がなく（ｐｒｏ−ａｓ）、ＤＴ−Ｂ でのワクチン接種は逆にブタの発育に影響を及さないことが示される。

これらの結果よりＤＴ−ＢはビルレットＰＲＶ攻撃からブタを防御し、ワクチン 接種したブタと以前にビルレン）ＰＲＶに暴露されて回復期ｊこあるブタとの血 清学的区別を可能とすることが示される。ＤＴ−Ｂは処理したブタの発育を低下 させなかった。加えて、マウスにおける毒性試験によりＤＴ−Ｂはブタ以外の種 においてｔｋ＋ＰＲＶよりも弱い毒性であることが証明さウィルス株　遺伝子の 特徴　ＬＤ５゜ ライス（Ｒｉｃｅ珠　ＰＲＶ　ｔｋ＋ｇＸ＋　４０ｐｆｕ／マワスＤ　Ｔ　−Ａ 　Ｈ３Ｖ　ｔｋ　ｇＸ　３４ｐｆｕ／マワスＤ　Ｔ　−Ｂ　ｔｋ　ｇＸ　９．４ Ｘ１０４ｐｆｕ／マウスＨＲｔｋ　ｇＸ士　＞２．３Ｘ１０６ｐｆｕ／７ウス第 　２　表 弱毒化ＰＲＶ株でＶクチン接種したマウスの防御ウィルス　遺伝子　投与量　攻 撃後　中和　ＥＬＩＳＡ法の株　の特徴　（ｐｆｕ７マウス）の死　力価８　吸 光度５ＤＴ−Ｂ　ｔｋ−ｇＸ　１．０Ｘ１０５　０／６　１０２４　０．０５Ｈ Ｒｔｋ−ｇＸ＋　２．３Ｘｌ（］６０／１０　２０４８　０．６０２．３Ｘ１０ 　２／１０ 対照　−−−１０／１０　０．００ ａ中和力価＝細胞変性効果がら細胞の５０％以上が防御される（ＰＲＶライス（ Ｒｉｃｅ株での攻撃に先立ち）生残者から採取した血清の最高希釈の逆数す吸光 度値は１／１晴駅の血清を用いて得られたＥＬ　Ｉ　ＳＡ反応を表わす。血清は 中和アッセイで用いたものと同一であった。

第　３　表 弱毒化ＰＲＶ　ＤＴ−Ｂでワクチン接種したブタの防御幾何平均　ＥＬＩＳＡ吸 光度４ 調製　死　力　価５　の算術平均 ８以前の実験でライス（Ｒｉｃｅ准”の暴露に対して生き残った回復期のブタ５ 頭から採血した。それらをここに含めてＥＬ　Ｉ　ＳＡ法において用し）る対照 としてｇＸ反応性血清を提供する。

ｂ幾何平均力価は攻撃に先立ち各群における６頭のブタ各々について得られた中 和力価の幾何平均である。

各中和力価は細胞変性効果から細胞の〉５０％が防御される最高希釈の逆数であ る。

Ｃ検出可能な抗体は無しっ ｄＥＬＩＳＡ吸光度の算術平均は、最後の債を除き、攻撃に先立って６頭のブタ ／群の各々から採取した血清について得られたＥＬ　Ｉ　ＳＡ吸光度値（１／４ ０　希釈の血清）の算術平均である（前記の注記参照）。

０食塩水で処理したブタと有意に差は無い（＋）＞０．０５；トウーティルト（ ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ）スチューデントのｔ検定）。

１食塩水で処理したブタと有意に差がある（ｐ＜ｏ、ｏｓ：）ウーテイルド・ス チューデントのｔ検定）。

実施例３ 実施例２に示したのと実質的に同一の方法に従って、本発明者らはＰＲＶのＤＴ −Ｃ株についても同様の実験を行った。ＤＴ−ＣはＰＲＶ　ｔｋ遺伝子について 欠失を有し、それ故に本発明の好ましい具体例である。これらの実験の預果を第 ４表〜第８表に示す。第４表と第８表はブタ、ヒツジ、およびウシにおいてＤＴ −Ｃの囲域化された毒性を示す。第５表と第６表はＤＴ−Ｃの防御能力を示す。

第７表はブタにおけるＤＴ−Ｃについて投与量の滴定を示す。

第　４　表 ウィルス株　遺伝子の特徴　ＬＤ５゜ ライス（Ｒｉｃｅ）株　ＰＲＶ　ｔｋ＋ｇｘ＋　９ｐｆｕ／マウスＤ　Ｔ−Ｃｔ ｋ　ｇＸ　）１．０刈０７ｐｆｕ／マウスＨＲｔｋ　ｇＸ士　、＞１．５Ｘ１０ ７ｐｆｕ／？ウス第５表 弱毒化したＰＲＶ株でワクチン接種したマウスの防御ウィルス　遺伝子　投与量 　攻撃後　中和　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法　の特徴　（ｐ　ｆ　ｕ／１７７−）　の死 　力価８　吸光度５ＤＴ−Ｃｔｋ　ｇＸ　１．０Ｘ１０　０／８　５１２０　０ ．０５１対照　・・・　７／８　＜２ｏ　ｏ、ｏｏ。

ａ中和力価＝細胞変性効果から細胞の５０％以上が防御される（ＰＲＶう、イス （Ｒｌｃｅ雇での攻撃に先立ち）生残者から採取した最高宿駅の逆数 ５吸光度値は１／１０希釈の血清を用いて得られたＥＬ　Ｉ　ＳＡ反応を表わす 。血清は中和アッセイについて用いたものと同一であった。

第　６　表 弱毒化ＰＲＶ　ＤＴ−Ｃでワクチン接種したブタの防御調製１　死　幾何平均　 ＥＬＩＳＡ吸光度Ｃ力価５　の算術平均 ＤＴ−ＣＯ／６　２６　０．０７２ｄＯ，３８８８ＰＲ−Ｖａｃ　Ｏ／６　１６ 　０．１０５ｅ　０．６４５ｅＢＭＥ　３／６　＜８　００５９ｄ　０．２５０ ｅａＤＴ−Ｃ，ＰＲ−Ｖａｃ、およびＢＭＥを摂取したブタはテストの第０日か ら第３５日にかけて生残者について各々８．１から２７．１．６．５から２３． ０、およヒ６．０から１１．４に９の体重増加があった。

ｂ攻撃に先立ち各群における６頭のブタの各々について得られた中和力価の幾何 平均。各中和力価は細胞変換効果から細胞の＞５０％を防御する最高血清希釈の 逆数である。

Ｃ攻撃に先立ち６頭のブタ／群の各々から採取した血清から得られたＥＬ　Ｉ　 ＳＡ　吸光度値（１／４０　希釈の血清）の算術平均。異なる上付き添字の平均 は第２０日のＢＭＥ　（イーグルの基礎培地）対照値と有意に異なっていた（Ｐ （０，０５）。最初の数字は攻撃前、第２の数字は攻撃後である。

第　７　表 ブタにおけるＤＴ−Ｃの投与量力価 投与量　死３　幾何平均 （ｐｆｕ／ブタ）　（ライス攻撃）　力価す対照　５／６ 内 ａ第０日に筋肉注射により示された投与量で各調製物へ ２　ｍｌをブタに投与し、第２１日にＰＲＶライス（Ｒｌｃｅ）株のしＤ５ｏの ８０倍量（２，２Ｘ　１０　ｐｆｕ／ブタ）で攻撃した。

ｂ第６表注記す参照。

第　８　表 ヒツジとワシについてのＤＴ−Ｃの毒性動物　接種物　経路８　死／テスト　陽 性（＋）ｆｕ／ｌｔ物）　真綿球ｂ ヒツジ４Ｘ１０　鼻腔内　１／３ＣＯ／３４Ｘ１０７　筋肉内　ｏ／３　ｏ／３ ４×１０７　筋肉内　０／３　０／３ ａ鼻腔内（鼻孔当たり１　ｍｌ！　）または筋肉内経路により２　ｍｌの全容量 でウィルス懸濁液を投与した。投与後２１日間、アウジニスキー病の徴候につい て動物を観察した。

ｂ実験の終了時に鼻の粘膜の綿球を各動物がら採取し、これらを前記の如＜　Ｐ ＲＶについてテストした。

Ｃアウジニスキー病またはウィルスの放出の徴挨を示さない１頭のヒツジが下１ ４日：こ死んだ。この動物における死の可能な原因はコクシジウム症であった。

この疾患は両群における他のヒツジで診断された。

本発明のもう１つの態様において、本発明のｇＸ　ｔｋ−ＰＲＶと該野生におけ る野生型ＰＲＶ間の理論的に可能な組換えからｇＸ７ｔｋ＋　ビルレン）　ＰＲ Ｖが生じないことを保証するために、さらにｇＸ　ｔｋ　ＰＲＶを作成する。前 記で示した一般法に従うことにより、そのもとの座のＰＲＶｇｐ５０遺伝子にお いて欠失を作成し、ｇｐ５０遺伝子のコピーを密接リンケージ中に挿入するがま たはｔｋ遺伝子内部に挿入する。もとのｇｐ５０遺伝子を欠失するには、フラグ メント８（チャートＤ参照）のＰｖｕＩＩ／ＢａｍＨ１フラグメントを用いて前 記の如くマーカー救済実験を行う。産生物ウィルスはｇＸ−ｔｋ−であり、ｔｋ 遺伝子配列の残存体に密接に連結した、あるいはその内部にあるｇｐ５０遺伝子 のコピーを有する。ｇｐｓｏはウィルスの活性にとって必要欠くべからざるもの であるので、組換えから生じるいずれのｇＸ−ウィルスもｇｐｓｏ−であって非 活性である。従って、該野生における組換えによってｇＸ−とｔｋ−の欠失を分 離してビルレットｇＸ　ＰＲＶを産生するのは不可能である。

さらに詳しくは、以下、チャートＫを参照して、前記からのｐ△ＴＫ−４を５ｐ ｈＩとＢａｍＨＩで消化してｔｋ欠失を含有するフラグメントを産生じ、次いで 該フラグメントを単離する。（ファルマシア（Ｐ　ｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ 　）／ＰＩｊＪ”１入手可能な）ｐｔＪｃ１９．をＢａｍＨＩと５ｐｈｌで消化 し、かく産生されたより大きいフラグメントを単離する。次いで、これらの２個 のフラグメントを結び、ｔｋ欠失に隣接する単一のＳａｇｌ　ＦＩＪ位を含有す るプラスミドｐＵｃΔＴＫ４　Ｖｆ産生する。次イテ、Ｓａ／Ｉ　テｐＬＪｃΔ ＴＫ４−Ｖを切断し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑としてフラグメン トＡを産生する。

前記（ＢａｍＨＩ７）からのフラグメント８をＮｄｅＩで消化し、それによりｇ Ｘとｇｐ５０遺伝子間を切断し、次いでＳ　ｔｕｌで消化し、それによりｇｐ６ ３遺伝子内で切断してｇｐ５０遺伝子を含有するＮｄｅＩ／５ｔｕＩフラグメン ト（フラグメン）Ｂ、約１．８ｋｂ）ｐ産生ずる。これをＴ４ＤＮＡポリメラー ゼと共に充填し、次いでフラグメントＡとＢを結んで°プラスミドｐΔＴＫ４ｇ ｐ５０−８を産生いでＰＲＶ　ＤＮＡで共トランスフェクトしてウサギの皮膚細 胞に入れる。得られたウィルスをａｒａＴを含有する還択培地上で増殖させてチ ャー）Ｋ（ｃ）に示す構造を有するｔｋ−組換え体を単離する。本発朋者らはこ のウィルスをＰＲＶΔＴＫｇｐ５０　と命名した。

次イテ、ＰＲＶ△ＴＫｇｐ５０　＠前記からノｐＧＸＴＫ３　テ共トランスフェ クトし、ｔｋ＋ワイルスをＨＡＴ培地中の１４３細胞上で選択する。ｐ　ＲＶΔ ＴＫｇ　Ｉ）　５０　ｕｃ”（ＨｓＶ）　と命名したこのウィルスはｇＸ−であ る。

次に、ＢａｍＨＩ　７　をこれらの酵素で消化することによって作成したｇｐ６ ３　およびｇＩ遺伝子を含有するＰｖｕＩＩ／ＢａｍＨＩ　フラグメントをサブ クローンしてｐＢＲ３２２のＰｖｕＬＩ／ＢａｍＨＩフラグメント中に入れてプ ラスミドｐＰＲ２８−１を産生ずる（１９８６年３月２６日出願の同時係属の米 国特許出願第８４４１１３号参照）。

プラスミドｐＰＲ２８−１をｐｖｕＩＩで切断し、ＢａｍＨＩリンカ−を加え、 かく産生されたフラグメントをＢａｍＨＩで消化して５　ｋｂ　のＰｖｕｌＩ／ ＢａｍＨＩフラグメントヲ変換してＢａｍＨＩ　フラグメント中に入れる。次い で、このフラグメントをクローンして（前記で産生された）ｐＰＧＸｌのＢａｍ ＨＩ部位中に入れる。得られたプラスミドをＰＲＶ△ＴＫｇｐ５０ｔｋ＋（Ｈ３ Ｖ）　テ共トランスフェクトする。得られたウィルスをａｒａＴ　上の増殖によ ってｔｋ−表現型について選択する。選択したウィルスはｔｋ遺伝子の残存部中 に挿入され並びにその正常塵から欠失されたｇｐ５０　遺伝子を有する。それら もまたｇＸ−である。

従って、ｔｋ’ｇＸ　ウィルスを与える野生ウィルスとのいずれの組換えもｇｐ ５０　遺伝子を欠くウィルスを産生する。　ｇｐ５０　は必要欠くべからざる遺 伝子なので、かかるウィルスは不活性である。

本発明者らの実施例はＰＲＶに関するものであるが、他のへルペスワイルスにお いて同様の組換え無しのワクチンウィルスを産生するのに同一の技術が有用であ ることは当業者にとって明らかであろう。一般に、該工程は１）無毒性を与える 突然変異に隣接する必要欠くべからざる遺伝子の挿入、および２）分泌蛋白質に ついての欠失した遺伝子に連結したその正常塵からのその必要欠くべからざる遺 伝子の欠失を包含する。さらに一般には、それらの正常位置から必要欠くべから ざる遺伝子を移動させることにより野生型ウィルスとの組換えの確率が低下され よう。ｇＸを欠＜　ＰＲＶを組立てるには選択可能な標識の挿入は必ずしも必要 とされない。

例えば、ｇＸ　コーディング領域において欠失を含むプラスミドはｇＸ遺伝子内 から塩基対ＢａｍＨＩ　フラグメントを欠失することによって作成できる。次い で、このプラスミドをＰＲＶ　ＤＮＡで共トランスフェクトし、ひき続いて核酸 交雑によるＤＮＡの欠失片のいずれかの欠損についてそのトランスフェクション に由来するウィルスをスクリーニングするか、あるいは抗体スクリーンによるｇ Ｘの欠損についてスクリーニングする（ホランドら（Ｈｏ　１１ａｎｄ％ｅｔ　 ａｌ、）　、ジャーナル・オブ・バイｏｏジー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　）、４６ ．６４９−５２頁（１９８３））。

本発明のワクチンで用いるポリペプチド（例えば、ｇＸ　）　欠失ウィルスは突 然変異を誹発しひき続いてポリペプチド（例えば、ｇＸ　）を欠くウィルスにつ いてスクリーニングを行う他の技術、あるいはワクチンウィルスを野生型ウィル スから血清学的に区別させしめる欠失を有するウィルスを産生ずるのに用いられ るいずれの他の技術によっても産生できる。例えば、ｇＸ−ＰＲＶを選択するこ とはできないが（抗ｇＸ抗体はＰＲＶを中和しない）、ティー・シー・ホランド ら（Ｔ、Ｃ。

Ｈｏ１ｌａｎｄ　、　ｅｔ　ａｌ、）　（前掲）の方法を用いてＰＲＶにおける ｇＸまたはｇ■（ウェイセン（ｗａｔｈｅｎ）　、ジャーナル・オブ・パイロロ ジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、５８．１７３−７８（１９８６））欠失について選 択でき、これは本発明のワクチンにおいて有用である。

ｔｋ　遺伝子を不活性化するかまたは欠失することによる弱毒化（タタロブ（Ｔ ａｔａｒｏｖ）、前掲：ポストおよび０イツマン（Ｐｏｓｔ　ａｎｄ　Ｒｏｉｚ ｍａｎ）　、前掲）は好まシイ方法であるが、本発明のｇＸ−ウィルスは、それ によってウィルスが無毒性とされるがなおその抗原特性を保持する連窓の化学的 または物理的不活性化処理に付すことができる。これらの不活性化ワクチンは適 当なアジュバント、例えばミョウバンと共に処方してもよい。

各種ワクチンの調製技術の一般的記載については、ジエイ・アイ・ドウフイ（Ｊ −１，Ｄｕｆｆｙ　）、バクシーン・プレバレイジョン・テクニックス（Ｖａｃ ｃｉｎｅ　Ｐｒｅｐａｒａ　−ｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）　、ノイニス ・ディグ（Ｎｏｙｅｓ　Ｄａｔａ）？ｆ（１９８０）、およびジー・ダブリュー ・ワール（Ｇ。

Ｗ　、Ｗａ　ｒ　ｒ　）、「抗原の調製および免疫の原理」、ジエイ・ジエイ・ マル力ロニスおよびジー・ダブリュー・ワール（Ｊ−Ｊ、　Ｍａｒｃｈａｌｏｎ ｉｓ　ａｎｄ　Ｇ、Ｗ、Ｗａｒｒ）編、［道具としての抗体−免疫化学の応用」 、２１〜５８頁、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊ’ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ 　＆　５ｏｎｓ）（１９８２）を参照。

レット ごルＰＲＶウィルスを動物の組織培養物中で増殖させ八 て該ウィルスを非病原性、すなわち無毒とすることができる。例えば、ひよこ胎 児、アヒル胎児、ブタ腎臓、ブタ精巣、ウシ胎児腎臓、ネコ腎臓、イヌ腎臓およ びサル腎臓を包含する多種類の組織培養系ζこおいて、および例えば、マシン・ ジービイ（Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ　）、およびマシン・ ジービイ（Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）の如き株化細胞系に おいてＰＲＶを増殖できる。

ＰＲＶの弱毒化は罹患組織培養において十分な数の継代を用いてウィルスが免疫 原性を喪失することなく非病原性とされる末端希釈継代法を包含する標準的な系 列ｉ迷代によって達成できる。

継代時間間隔はウィルスを継代間に十分複製させしめるようなものとするべきで あり、インキュベーション温度は好ましくは約３０〜３８℃である。最適継代時 間は用いる特定のウィルス、培養系および温度に依存する。

最終的なワクチン産生物は罹患動物において免疫応答を刺激し、しかもなお非病 原性であるに十分な丁ピ”ルレ外ＰＲＶ量を含有させるべきである。罹患動物に 投与されるべき推奨滴定量は約１０３〜１０５　プラーク形成単位、好ましくは 約１０４プラーク形成単位である。

本発明のウィルス調製物は水で希釈してその能力を調奎してもよく、デキストロ ースおよびラクトースの如き安定剤、または他の無毒性物質を加えてもよい。

該ウィルス調製物は、また、貯蔵の目的またはひき続いての液体ワクチンへの処 方用には、例えば凍結乾燥法により乾燥してもよい。

該ワクチンは筋肉内、静脈内、皮下、気道内および鼻腔内を包含する種々の経路 によって動物に投与できる。好ましい投与経路は筋肉内である。

雌ブタのワクチン接種については２回投与法２用いることができる。１回目の投 与は分娩の約数ケ月前から約５ないし７週間前に行うことができる。次いで、ワ クチンの２回目の投与は１回目の投与の数週間後、例えば約２ないし４週間後に 行うべきてあり、次いでワクチンを分娩前であって分娩に至るまでに与えること ができる。別法として、単一の２　ｍｌ投与量として、例えば分娩の約５ないし ７週間前にワクチンを投与できる。しかし２回投与法は生後まもないブタの最も 効果的な免疫化としては好ましいものであると考えられている。半年後の再ワク チン接種は飼育動物に対して推奨される。雄ブタはいつ再ワクチン接種してもよ い。

また、雌ブタは飼育前に再ワクチン接種することができる。ワクチン接種してい ない雌ブタから生まれた子ブタは約３白目にワクチン接種してもよい。

該ワクチンを他の疾患用の池のワクチンと組合せて前記のし１ずれの経路によっ て投与してもよい多価ワクチンを生産することができる。それは、また、他の薬 剤、例えば抗生物質と組合せてもよい。

よってひき起こされる臨床的徴候をいずれの有意な程度まで生じさせることなく 疾患にかかった動物において免疫応答を刺激する。該ワクチンの医薬的有効量を 医薬上許容される担体または希釈剤と共に用いてブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、お よび他の捕乳動物の如き動物をワクチン接種できる。

チャートＡ、　ｐＰＲＸＫ４の組立て １ａ）ｐＰＲＸｈｌをＸｈｏ　ＬとＫｐｎＩで消化してフラグメン）１（２，６ ｋｂ）を得る。

ＸｈｏＩ　ＫｐｎＩ　ＫｐｎＩ　Ｘｈｏ工ＰｇＸ−÷χｘｘｘｘｘｘ ＰｇＸ−−−＋　ｘｘｘｘｘｘ フラグメント】 ｔｂ＋フラグメント１をＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＥｃｏＲＩ リンカ−を加える。

ＥｃｏＲｒ　ＥｃｏＲＩ Ｌ−一一一一一一−ユ ｐｇｘ−−−＋　ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ Ｉｃ１　Ｉ）　ＡＣＹＣ１８４をＥｃｏＲＩで消化し、ＢＡＰで処理してフラグ メント２を得る。

ＥｃｏＲＩ　ＥｃｏＲＩ ｔｄ）７ラグメント１と２を結び、ｐ　Ｐ　ＲＸＫ４　を産生する。

ＭｓｔＩ　ＥｃｏＲＩ　ＭｓｔＩ　ＥｃｏＲＩ　ＭｓｔＩＸ＝糖蛋白質Ｘ遺伝子 、Ｃｍγ＝クロラムフェニコール耐性遺伝子Ｔｅｔ’−テトラサイクリン耐性遺 伝子Ｐｇｘ　＝　ｇＸ　プロモーター チャー１−　Ｂ、ｐＰＧＸｌ　の組立てＬａ１ｐＰＲＸＫ４をＭｓｔＩで消化し てフラグメント３　（２，１ｋｂ）を得る。

Ｍｓｔ工ＥｃｏＲＩ　Ｍｓｔ１ ＰｇＸ ｔｂ＋フラグメント３をＥｃｏＲＩで切断してフラグメント４　（４ｏｏｂｐ） を産生ずる。

１−−一→ ＰｇＸ （Ｃ）ｐＴＪｃ９をＥｃｏＲＩとＳｍａＩで消化してフラグメント５　（ｚ、６ ｋｂ）を得る。

ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ　Ｓｍａ１ ｔｄ）フラグメント４と５を結び、ｐ　ＰＧＸ　１を得る。

ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ 簀　養 ＰｇＸ チャー）　Ｃ，ｐＧＸＴＫ２の組立て ｔａｌｐＰＧＸｌをＢａｍＨＩで消化し、ＢＡＰで処理してフラグメント６を得 る。

ＢａｍＨＩ　ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ ｇｘ （ｂ）ｐＲＢ１０３をＢａｍＨＩ　（！：　ＢｇＪＩＩで消化してフラグメＢｇ ｌ工Ｉ　ＢａｍＨ工 ｔｃ＋フラグメント６と７を結び、ｐＧＸＴＫ２を産生する。

ＰｇＸ Ｐｔｋ　＝チミジン・キナーゼ・プロモーターｔ　＝チミジン・キナーゼ遺伝子 チャートＤ、ｐＧＸＴＫ３の組立て （ａｌｐＰＲＸｈｌをＢ　ａ　ｍＨ，Ｉ　で消化してフラグメント８（６，９ｋ 　ｂ　）ｉ産生ずる。

ＸＸＸＸＸＸＸＸ　５０５０５０５０５０６３６３６３６３６３　ＩＩＩＩＩＩ １１エエエＸ−Ｃｔ ｔｂｌ　ｐＧＸＴＫ２をＢａｍＨＩて消化し、ＢＡＰで処理してフラグメント９ を得る。

ＢａｍＨＩ　ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ ｇＸ ｔｅｌフラグメント８と９を結び、ｐＧＸＴＫ３を産生する。

ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ　ＢａｍＨＩ ｇＸ−Ｃｔ＝＝ｇＸ遺伝子のＣ末端コーディング領域５０＝糖蛋白質５０遺伝子 ６３＝糖蛋白質６３遺伝子 ■　＝糖蛋白質Ｉ遺伝子 チャートＥ、ｐＧＸＴＫ３およびｔｋ　ＰＲＶとノ共トランスフェクション ｔａ＋　ｐＧＸＴＫ３とｔｋ　ｇＸ−ＰＲＶの共トランスフェクションによりｔ ｋ＋ｇＸ　’ＩＩ生物ＰＲＶΔｇＸ１　（またはＤＴ−Ａ　）を産生ずる。

ＢａｍＨＩ　ＢａｍＨよりａｍＨよりａｍＨＩ−り一一一一一一 １−−−−−＞１ｔｔｔｔｔｔｔ　ｌｘｘｘｘｘＰｇＸ　ｇＸ−Ｃｔ チャートＦ、ｐΔＧＸＢ７の組立て （ａｌｐＰＧＸｌをＢａｍＨＩで消化し、ＢＡＰて処理してフラグメント６を得 る。

ＢａｍＨ工ＥｃｏＲよりａｍＨＩ ｇＸ ｌｂ）　ｐＰＲＸｈｌ　’ａ　ＢａｍＨＩ　で消化してフラグメント８（６，９ ｋｂ　）を産生ずる。

ｇＸ−Ｃｔ ｔｃ）フラグメント６と８を結ｑ、プラスミドｐΔＧＸＢ７を産生する。

チャートＧ０組換えによるＰＲＶΔＧＸＴＫ−の組立て（ａｊＰＲＶΔＧＸＩと ｐΔＧＸＢ７の共トランスフェクション２よび組換えによりＰＲＶΔＧＸＴＫ− を産生する。

ＢａｍＨＩ　ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩ　ＢａｍＨよりａｍＨＩられている） チャートＨ，ｔｋ欠矢プラスミドの組立てｔａ）　ＢａｍＨＩ　１１をクロ７ン してＩ）ＢＲ３２２に入れてプラスミドｐＴＫ１１を産生する。

ＢａｍＨＩ　ＸｈｏＩ　ＢａｍＨＩ ｌｂ）　ｐＴＫｌ　１をＸｈｏＩで消化してフラグメント１０を産生する。

ＸｈｏＩ　ＢａｒｒＭＸ　ＢａｍＨＩ　Ｘｈｏ工Ｌｃ）フラグメン）１０をＢａ ｅ３１で消化し、次いで再環化してｔｋｉ伝子中子中々の長さの欠失を有するプ ラスミド、例えばｐ△ｔｋ−３およびｐ△ｔｋ−４を産生ずる。

ＢａｍＨＩ　ＢａｍＨ工 ＩＩ　畳 ｔｋｔｋｔｋｔｋｄｄｄｄｄｄｔｋＩ＋ｋｔｋｊｋｔｋｔｋ＝チミジン・キナー ゼ遺伝子 ｄ　−チミジン・キナーゼ遺伝子中の欠失チャート１．　ｐＧＸＴＰＡの組立て ｌａｌプラスミドｐＰｓＡ１８をＢａｌ！Ｉで切断し、１３ａｍＨＩリンカーを 加えてフラグメント１１を産生する。

ｐＰｓＡｌＢ　＝ Ｂａｍ）（よりａＬＩ しｐｔｐｔｐｔｐｔｐｔ−ｐｔｐｔｐ フラグメント１１： ＢａｍＨＩ ｔｂ）フラグメント１１　ｆ　ＢａｍＨＩで消化してフラグメン）　１２　（１ ，９ｓｋｂ　）を産生する。

Ｂ　ａ　ｍＨＸ　Ｂ　ａ　ｍＨ工 ｔｐｔｐＩ−ｐｔ、ｐｔｐｔｐｔｐｔ、ｐｔｐｔｐｔ、ｐｔｐ（ｃ）プラスミド ｐＰＧＸ１（チャートＢ）をＢａｍＨＩで切断してフラグメント６を産生する。

ＢａｍＨＩ　Ｈ１ｎｄＩ工Ｉ　ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨ工ｇＸ ｔｄ）フラグメント６と１２を結び、プラスミドｐＧＸＴＰＡを産生ずる。

ＢａｍＨＩ　ＢａｍＨＩ　ＨｉｎｄＩＩＸ畳　簀 １−−−−◆　ｔｐｔｐｔｐｔｐｔｐｔｐｔｐｔ、ｐｇｘ ｔｐ＝組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子Ｌ　＝　ＢａｍＨＩリンカ− チャートＪ、プラスミドｐＧＸＴＰＡ−８７の組立てｔａ）プラスミドｐＧＸＴ ＰＡをＨｉｎｄＩ［Ｉで消化してフラグメント１３を産生する。

ＨｌｎｄＩＩＩＥｃｏＲＩ　Ｂａｎ）（よりａｍＨ工Ｈ１ｎｄ工ｌ１１−−〜− ＋　ｔｐｔｐｔｐｔｐ ｇＸ （ｂ）Ｈ４ｎｄｎＩ　りンカーをフラグメント８（チャートＤＸ−Ｃｔ ｔｃ）次いでフラグメント１３と１４を一緒に結びｐｄｘＴＰＡ−Ｂ７を産生す る。

ＥｃｏＲＩ　ＢａｍＨＩ　ＢａｍＨＩ　Ｈ１ｎｄエエＩ　Ｈ１ｎｄＩＩＩｇＸ ＨＬ　＝ＨｉｎｄＩＩＩリンカ− チャートに、ａ換え無しのウィルスの産生（ａ）　ｐΔＴＫ−１１ ＢａｍＨＩ　５ａｌＩ　５ｐｈＩ　５ａｌＩ　ＢａｍＨＩ（ｂ）　ＢａｍＨＸ　 ７ ＢａｍＨ工ＮｄｅＩ　ＰｖｕＩＩ　５ｔｕＩ　ＢａｍＨＩＬ−ｍ−Ｌ−Ｌ ＸＸＸＸＸＸＸＸ　５０５０５０５０５０６３６３６３６３６３１１１１エエＩ ＩエエＩＸ−Ｃｔ （ｃ）　ＰＲＶΔＴＫｇｌ）５０ ＢａｍＨＩ　５ａｌＩ／Ｎｄｅｌ　５ａｌＩ／５ｔｕＩ　５ｐｈＩ蒼　畳 ｔｋｔｋｔｋｔｋ　５０５０５０５０５０５０５０５０５０５０　ｔｋｔｋｔｋ ｔｋ国際調を報告 ＋ｍｓ−ｍｓｍａ＊ｅｂａ＋ｉｅ＊ｍ、　ＰＣＴ／ＬＩＳ　８６１０１３２２− ２−ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡτｌ０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲ Ｅ？ＯＲＴ　ＯＮ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ワクチンウイルスとその野生型祖先ウイルスとの血清学的区別を可能とする 分泌糖蛋白質をコード付けする遺伝子についての欠失を有する適当に不活性化し たウイルスより成るヘルペスウイルスワクチン。
2. ２．該ウイルスが偽狂犬病ウイルス、マレク病ウイルス、および感染性ウシ鼻気 管炎ウイルスより成る群から選択される前記第１項のワクチン。
3. ３．該ウイルスが偽狂犬病ウイルスである前記第１項のワクチン。
4. ４．該ウイルスが偽狂犬病ウイルスであり、該分泌糖蛋白質が糖蛋白質Ｘである 前記第１項のワクチン。
5. ５．分泌糖蛋白質をコード付けする少くとも１つの遺伝子について欠失を有する ヘルペスウイルス。
6. ６．偽狂犬病ウイルス．マレク病ウイルス、および感染性ウシ鼻気管炎ウイルス から選択される前記第５項のヘルペスウイルス。
7. ７．該ヘルペスウイルスが偽狂犬病ウイルスである前記第５項のヘルペスウイル ス。
8. ８．該分泌糖蛋白質が糖蛋白質Ｘである前記第７項のヘルペスウイルス。
9. ９．該ウイルスが機能性チミジンキナーゼを産生しない前記第８項のヘルペスウ イルス。
10. １０．野生型祖先ウイルスの抗原をコード付けする少くとも１の遺伝子について 欠失を有するウイルスより成るワクチンで該ウイルスに罹患した動物をワクチン 接種し、次いでかかるワクチン接種した動物とビルレントウイルスに感染した動 物を該動物を殺すことなく血清学的に区別することより成る該ウイルスに感染し た動物と該ウイルスに対するワクチン接種した動物とを区別する方法。
11. １１．該ウイルスがヘルペスウイルスである前記第１０項の方法。
12. １２．該ウイルスが偽狂犬病ウイルス、マレク病ウイルス、および感染性ウシ鼻 気管炎ウイルスより成る群から選択される前記第１０項の方法。
13. １３．該ウイルスが偽狂犬病ウイルスである前記第１０項の方法。
14. １４．該抗原が糖蛋白質である前記第１０項の方法。
15. １５．該抗原が分泌糖蛋白質である前記第１０項の方法。
16. １６．該ウイルスが偽狂犬病ウイルスであり、該糖蛋白質が糖蛋白質Ｘである前 記第１０の方法。
17. １７．抗原をコード付けする遺伝子内に免疫応答を生ぜしめることができる異種 ポリペプチドをコード付けするＤＮＡ配列を挿入された適当に不活性化されたウ イルスより成る多価ワクチン。
18. １８．該ウイルスがヘルペスウイルスであって該抗原が分泌された糖蛋白質であ る前記第１７項のワクチン。
19. １９．該ウイルスが偽狂犬病ウイルス、マレク病ウイルス、および感染性鼻気管 炎ウイルスより成る群から選択される前記第１７項のワクチン。
20. ２０．該ヘルペスウイルスが偽狂犬病ウイルスであって該分泌された糖蛋白質が 糖蛋白質Ｘである前記第１８項のワクチン。
21. ２１．免疫応答を生ぜしめることができる該ポリペプチドが伝播性胃腸炎または ブタパルボウイルスからのポリペプチドより成る群から選択される前記第２０項 のワクチン。