JPS63500593A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 又里座宣員 分析および診断の分野で最近関心を集めているのは、尿、血液、水、ミルク等の 標本中に抗原や種が存在しているか否かを調べるのにモノクローナル抗体を使用 することである。

より詳細に述べると、標本中に連鎖球菌（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）が存在 するか否かを手早く診断するのに、連鎖球菌の抗原や連鎖球菌種に特異的なモノ クローナル抗体を使用するのが好ましい。

連鎖球菌種は何種類かに分類されている。代表的なものには、ストレプトコッカ ス・ニューモニエ（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、 Ｓ、ピオゲネス（Ｓ　、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ、アガラクチ、：ｃ、（Ｓ　 、　ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ、ボビス（Ｓ、　ｂｏｖｉｓ）、Ｓ、タレモリ ス（Ｓ　、　ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｓ。

ディスガラクチェ（Ｓ　、　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ、フェカリス（Ｓ 、　ｆｅｃａｌｉｓ）、Ｓ、ファエシウム（Ｓ、　ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｓ、ラク チス（Ｓ、　１ａｃｔｉｓ）、Ｓ、ｘクイシミリス（Ｓ、　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌ ｉｓ）、Ｓ、ゾーエピデルミクス（Ｓ、　ｚｏｏｅｐｉｄｅｒｍｉｃｕｓ）、Ｓ 、Ｚクユイ（Ｓ、　ｅｑｕｉ）およびＳ、ウベリス（Ｓ、　ｕｂｅｒｆｓ）があ る。

更に連鎖球菌は、その溶血性に基づき分類別けされている。ランスフィールド（ Ｌ　ａｎｃｅｆ　１ｅｌｄ）の命名法では、β型連鎖球菌を基本的に免疫学的方 法によって分類している。詳細に言えば、ランスフィールドは溶血性連鎖球菌に おいて群特異性抗原と型特異性抗原の存在を確認するための沈降試験を利用した 。現在、免疫学的分類群の生化学的等質性と細菌の天然における生活環境とを関 連させ、β型連鎖球菌は約７つの分類群（Ａ−Ｇ）に分けられている。

Ｓ、ニューモニエは、β型溶血性連鎖球菌と非常に異なる疾患過程が関係してい るが、連鎖球菌の広い分類群に包含されている。Ｓ。

ニューモニエについては、多くの異なった分類法が行なわれている。

米国およびデンマークの分類法は、非常によく知られた方法であり、米国法は発 見の順序に基づくものであり、チンマーク法は科（ｆａｍｉｌｉｅｓ）による分 類法である。しかし、両方法とも、型数は同じで８３である。

連鎖球菌から産生される有毒物質は種々有り、それには、溶血素、フィブリン溶 解酵素、白血球前および発赤毒素が含まれる。発赤毒素はヒトに皮内注射すると 、顕著な局所的紅斑を誘発する物質である。この毒素は抗原性を有し、比較的熱 に耐性である。また連鎖球菌により、少なくとも２つの型の濾過性溶血素、即ち 熱および酸に感受性のストレプトリジンＳ１および酸素に感受性であり、熱およ び酸に耐性のストレプトリジンＯが産生される。連鎖球菌よりら広範な、または 様々な活性を有していると言える病原微生物は、はとんど存在せず、あったとし てもわずかである。β型ストレプトコッカスＡ群は、ヒトに対して最も有害かつ 致死的な微生物のひとつであるので、このＡ群を引用して直鎖球菌について記述 することにする。β型ストレプトコッカスＡ群は、血流に入り、血液前を誘発し 得る蜂巣炎を急速に拡大させる皮膚感染の主要な原因菌である。β型ストレプト コッカスＡ群により主として起こる、その他の疾病には、連鎖球菌性肺炎、扁頭 炎、連鎖球菌性肺炎および迅速？こ治療しなければ悲惨な結果になりかねない全 ゆる傷における感染症が含まれる。組織における連鎖球菌感染症において、その 微生物を同定することができないこともあるから、その診断が困難な場合がある 。

このような事情から、連鎖球菌を検定するための迅速かつ特異的な診断薬を利用 することは、極めて有用なことである。更に、リウマチ熱は、連鎖球菌感染症に 常に随伴する症状である。これは、微生物に対する免疫反応である。心臓弁膜症 の最も主要な原因は、結局β型ストレプトコッカスＡ群である。β型ストレプト コッカスＡ群には、その表面の異なる特性、例えばランスフィールドの分類にお ける炭化水素、タンパク質、Ｔ抗原およびＲ抗原によって区別され得る数十個の 型がある。これらのうちのいくつかは、糸球体腎炎と呼ばれる重大な腎臓病を起 こし得るものである。また、かなりのものがリウマチ熱と関連していた。学齢の 子供では、年に平均６または７回の咽喉炎または上気道呼吸器感染症にかかるの で、咽喉感染症における診断用キットの製品は頻繁に利用されるだろう。治療す る前に２〜３日待つよりも、診断日１こ治療できる早期診断が、これらの症例の 管理を改善し、より有効な治療につながる。

モノクローナル抗体は、連鎖球菌の抗原に特異的に結合し得るので、診断と治療 の為の多くの機会が与えられる。この様な特異性は、適切な、そして正確な分析 および／または診断に非常に重要な要件であり、特に、迅速な治療を必要とする 連鎖球菌などによる疾病の診断には特に重要な要件である。

抗原性物質の存在を調べる為に、アイソトープを使用した、あるいは使用しない 各種の免疫検定法が、モノクローナル抗体との関連で用いられている。現在、モ ノクローナル抗体について最も普及している方法は、凝集、免疫蛍光、化学発光 または蛍光免疫検定、免疫電子顕微鏡、放射分析系、放射免疫検定、および酵素 −結合免疫検定である。その他の方法として、動物発光、蛍光偏光、および光子 計数免疫検定がある。

酵素−結合免疫検定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）を使用する場合、この検定法で機能し得る 酵素、例えばアルカリホスファターゼを、モノクローナル抗体と結合、またコン ジュゲートさせる必要がある。

この酵素−結合モノクローナル抗体を、既知の酵素−結合免疫吸着検定法に使用 し、抗原性物質の存在を調べることができる。

特定の抗原を同定したら、その感染微生物の血清型を決めることができ、素早く 、そして効率的に疾病を治癒するための適切な治療を開始することができる。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン （Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎ）によって初めて報告された。今ではよく知られている手 段である［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、　）６．　２９２（１９７５）］。ハハイブリドマを作成する一般的 な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく知られてい るが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造することは、主とし て特定のハイブリドーマを作成するのに必要なバリエーションおよび特異性の程 度のために、難しいことであることがわかっている。

且豆９１枚 本発明は、連鎖球菌の抗原および／または微生物が試料中に存在するかどうかを 正確に、かつ迅速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を提供 するものである。

簡潔に述べると、本発明は連鎖球菌の抗原または種、特にストレプトコッカス・ ニューモニエ、Ｓ、ピオゲネス、Ｓ、アラガクチェ、Ｓ、ボビス、Ｓ、クレモリ ス、Ｓ、ディスガラクチェ、Ｓ、ファカリス、Ｓ、ファエシウム、Ｓ、ラクチス 、Ｓ、エクイシミリス、Ｓ。

ゾーエピデルミクス、Ｓ、エクユイおよびＳ、ウベリスの抗原または種、β型ス トレプトコッカス（特にＡ−Ｇ群）の抗原または種、並びに発赤毒素およびスト レプトリジンＯおよびＳなどの連鎖球菌における毒素の抗原または抗原群に特異 的なモノクローナル抗体、および連鎖球菌に属するいずれかの菌種の抗原と広く 交叉反応するモノクローナル抗体に関するものである。

本発明はまた、連鎖球菌、あるいはその特定の菌種の上記の抗原の１つに対する モノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）と結合した、連鎖球菌の抗 原の存在を診断するために使用される標識されたモノクローナル抗体を提供する ものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光性化合物、化学的 発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子などとすることが できる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中の連鎖球菌抗原または微生物の存在を診断す る方法を提供するものである。

更に、本発明は連鎖法菌属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体または希釈 剤を含有している治療用組成物、およびある種のクロストリジウムの抗原に対す る少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキットを提供 するものである。

詳細な説明 本発明に係るモノクローナル抗体は、特定の連鎖球菌の抗原で免疫した哺乳動物 の膵臓細胞を、適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮ５Ｏ（非クローン化）、 Ｐ３Ｎ５ｌ−Ａｇ　４／１またはＳｐ２１０Ａｇ１４と融合させることにより製 造される。得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリン およびチミジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリーニン グテストするには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げっ肉類（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの について述べることにする。まず、通常約１１週間の間選択した特定の連鎖球菌 抗原をマウスに注射する。

常套の検定法により、マウスが抗原に対して十分な抗体を産生じたことがわかっ たら、適当な連鎖球菌抗原をブースター注射し、マウスを殺して免疫された膵臓 を摘出する。次いで、この免疫された膵臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使っ て融合を行なうことができる。

特定の連鎖球菌抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞を取り 出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗体を標 準的な抗原に対して試験し、特定の連鎖球菌抗原に対する特異性を有するか否か を調べる。特定の連鎖球菌抗原または連鎖法菌種に対して特異的であるモノクロ ーナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体は、バッチ式また は連続的組織培養、あるいはマウスの様な晴乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、各種の標識剤、例えば酵素、蛍光化合物、発光化合物、 放射活性化合物、強磁性ラベルなどで標識することができる。本発明では、酵素 で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる。標識剤として使用 される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、 ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼまたはウレアーゼなどが挙げられる。

酵素との結合は、メタフィロコツカルプロティンＡ法、グルタルアルデヒド法、 ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの通常の既知の方法のいずれかで行なう ことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（Ｅ　Ｉ　Ａ）である。ＥＸＡは、デ ザインが放射分析と類似している固相検定法である。しがしＥＸＡで（」、免疫 グロブリンマーカーとして放射活性同位元素の代わりに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の飛は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、または基質−標識化蛍光免疫検定の様な均− 系がある。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１ つはフルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいこ とがあるが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用する ことに上り感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。蛍光分極は簡単、迅速、正確で ある。しカル現時点では、その感度はマイクロモル／リットルの範囲に限定され ており、生物学的試料中の抗原については、上限がナノモル／リットルの範囲で ある。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。次いで衰微して基底状態に戻る時に 光が放射される。生物学的発光は、生物系にみられる化学的発光の特別の形態に 与えられた名称であり、ここでは、触媒作用を有するタンパク質または酵素、例 えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大させる。

最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定の連鎖球菌抗原または連鎖球菌種に対する１種また はそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担体または希釈 剤を含有する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物は、なんらか の連鎖球菌感染症に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治療するのに使用す ることができ、治療に有効な量が使用される。この量は、処置を受けるヒトおよ び感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中に連鎖球菌の抗原、抗原群または連鎖球菌種が存在するかどうかを診 断するために使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル 抗体を組み合わせることができる。連鎖法菌属のみを同定し得る広い交叉反応性 のモノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌属あるいは連鎖球菌種お よび／または他の細菌を同定することができる抗体を含んでいるキットの一部と して用いることもできる。

過去に於いては、検体と抗血清との望ましくない交叉反応のために、迅速なキッ トを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用することによって 、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な試験ができ る様になった。迅速で正確なキットは現在の試験法にとって代わり、あるいは普 及し、正確な抗体を使った早期の直接治療を可能とするであろう。多数の抗生物 質や高価なそして危険な抗生物質を避けることは、実質的に患者の、そして病院 の節約となろう。更に、キットは外来患者に使用することができる。現在、即日 結果が得られる迅速試験がないので、治療の開始が遅れることがあり、患者がも っと重篤な症状を呈するに至ったり、病気の患者にもっと費用のかかる治療を施 す必要が生じたりすることがある。１〜２時間以内に結果の出る試験があれば、 患者にとって非常に都合の良いものとなろう。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、連鎖球菌の菌種や血清 型を検出するために、委託検査室に売り込まれる、相溶性のある免疫検定試薬類 の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定の連鎖球菌抗原または種に対する少なくと も１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対比染色剤または試 薬を含んでいる診断用キットである。

その他のキットとしては、連鎖球菌抗原の少なくとも１種の対照試料および／ま たは特定の試料中の特定の連鎖球菌微生物の存在を検出する交叉反応性の標識さ れたモノクローナル抗体を含んでいるキットがある。このキットで検出される特 定の抗原は、連鎖球菌における通常の抗原、ストレプトコッカス・ニューモニエ 、Ｓ、ピオゲネス、Ｓ、アガラクチェ、Ｓ、ボビス、Ｓ、クレモリス、Ｓ、ディ スガラクチェ、Ｓ、ファカリス、Ｓ、ファエシウム、Ｓ、ラクチス、Ｓ、エクイ シミリス、Ｓ、ゾーエピデルミクス、Ｓ、エクユイおよびＳ、ウベリスの抗原、 β型ストレプトコッカスの抗原、および連鎖球菌の毒素に対する抗原が挙げられ る。

連鎖球菌の抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物源および 食品加工操作を定期的に検査するにも使うことができる。この様に、本発明は、 標準的な抗原の存在を調べるための標識したモノクローナル抗体の使用について 記載しているが、本発明は尿、血液、糞便、水およびミルクなどの検体が特定の 連鎖球菌抗原を含んでいるかどうかを調べることにより、抗原の存在を診断する という多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと、本発明は公衆の衛生およ び安全の診断補助に利用することができ、水や食品の様な検体の汚染の有無につ いて検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。

本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタイン（同上）の方法に従 って調製した。

実施例において、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス［エールスト（Ａ　ｙｅ ｒｓｔ）研究所リファレンス］ＤＭＥＭ＝デュルベツコの改良イーグル培地ＦＣ Ｓ＝ウシ胎仔血清 ％Ｔ＝１ｃｍ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢＳ−燐酸緩衝生理食塩水 ＴＳＢ＝　トリプトン・ソイ・ブロス ＣＦＡ−フロイント完全アジュバント 抗原（連鎖球菌）を得（試料はナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カル チャーから得られる）、標準的な微生物同定の為の生化学的手法を用いて同定し た（ＡＰＩプロファイルを使用）。親液物質（リオファイル）からこの抗原を除 き、血液寒天上で増殖させ、ＡＰＩで検査してその同定を行ない、純度を確認し た。次いで細菌をＴＳＨに移して増殖させ、収穫し、抗原の供給源として使用し た。

得られた微生物を沸騰させ、食塩水に入れて遠心をくり返すことにより洗浄し、 １％ホルモール食塩水に再懸濁した。

Ｂ、動物の免疫 調製した抗原をＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。上記の如く調製したワクチンを 週１回にて３週間、腹腔内に注射した（８０％Ｔワクチン０，０５ｘＣ）後、１ 週および２週の期間の後１．静脈内注射した。

最後の注射から約６日日にマウスから採血し、血清を検査して抗体を検定した。

この血清の力価測定に使用する常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法であっ た。このやり方でマウスが抗体産生を示したら（通常、正の力価が少なくとも１ ０，０００）、融合供与動物として１匹を選び、絆臓切除の３日前に静脈からブ ースタ注射した（８０％ワクチン０．０２１）。

Ｃ１細胞融合 常法により、ブースタ注射の３日後に免疫マウスから絆臓細胞をとり出した。ま ず、選択された供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅 菌した。次いで、絆臓を摘出し、３０％のＦｅ２を加えたＤＭＥＭ約２．５１ρ に浸漬した。次に、全ての細胞が膜から離れるまでＬＵＸホモジナイズ管で膵臓 を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣ９ＤＭＥＭ５１１２中で洗浄し た。

次いで、細胞残骸を沈澱させて、膵臓細胞懸濁液を１０３１７２の遠心管に入れ た。次にこの残骸を３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭ５吋中で再び洗浄した。その後、３％ ＦＣＳ　ＤＭＥＭに入れて懸濁液を５０贋ρにしノこ。

使用した骨髄腫（ミエローマ）セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・オブ・モレ キュラー・バイオロジー（Ｍ　ＲＣＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ （非クローン化）であった。骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂してい たものであった。各セルラインを、組織培養培地として、３％ＦＣ８を含有して いるＤＭＥＭで洗浄した。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に膵臓細胞を取り出しく室温、６ ００ｇで７分間）、得られた各ベレットを個別に３％ＦＣ８ＤＭＥＭ１０好に再 懸濁した。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０．１ｘｆ！を１１１１１２に希釈 し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用した。膵臓細胞を数えるために、懸 濁液０．ＩｍＱをメチルバイオレット−クエン酸溶液でＩｍＱに希釈し、血球計 算器および光学顕微鏡を使用して染色されている細胞核を数えた。

次に、ｌＸｌ０”の膵臓細胞と５ＸＩＯ’の骨髄腫細胞を混合し、この混合物を 、グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除去した 。得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れた。５０　（ｗ／　ｖ）のヘベス （Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ポリエチレングリコールｌ　５００（ＰＥＧ ）溶液（ｐＨ約７．５）１酎を加え、この混合物を約１．５分間穏やかに攪拌し た。次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭ１０ｘ１２を徐々に加え、次に、 この培養培地を加えて５０峠にし、遠心して上清を全て除去した後、細胞ペレッ トを１８重量％のＦｅ２を含有しているＤＭＥＭＩＯｍｆｆに再懸濁した。

混合物ｌＯμσを標準マルチウェル組織培養プレートの４．８０ウエルそれぞれ に入れた。各ウェルは、標準ＨＡ　Ｔ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンお よびチミジン）１．Ｏｘ（！および５Ｘ１０’マクロフアージ／ウエルの濃度で Ｂａ１ｂ／ｃマクロフアージの支持細胞層を含んでいた。

Ｄ、クローニング 抗原に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出し、希釈法を使用してクロ ーン化した。制限希釈に於いて、■８％ＦＣ５−ＤＭ　Ｅ　Ｍ　＋　Ｂ　ａｌｂ ／　ｃマウスマクロファージへの細胞懸濁液の希釈を行なって９６ウエルのマイ クロタイタープレートに１細胞／ウエルおよび半細胞／ウェルを完成した。半分 生長になるまで、このプレートを３７℃、９５％ＲＨ１７−９％ＣＯ！で７〜１ ４日間インキュベートした。その上清を、標準的酵素免疫吸着分析により、特異 抗体について分析した。

クローンを酵素免疫検定し、抗体産生を調べた。

Ｅ、モノクローナルの選別 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫において調製された抗原への結合、 および種々の抗原を持っている連鎖法菌種およびその関連属の試験バッテリーに おける特異性について標準的な方法でスクリーニングした。具体的には、連鎖球 菌微生物の代表的な選択菌を含んでいる微量滴定プレートのグリッドを調製し、 煮沸した後、母集団の特異性を調べるためのテンプレートとして使用した。前記 のＥＩＡ免疫検定法を使用してもよい。

Ｆ、抗体産生および精製 Ｂａ１ｂ／ｃマウスを少なくとも７日間、ブリスタンでプライム（初回抗原刺激 ）し、次いで抗原に特異的なモノクローナル抗体−産生ラインの細胞１０７個を 腹腔内に注射した。このマウスが体液で膨満し、それでもなお生存している時に 、腹水症体液を採取した。この体液を１２００９で約１０分間遠心し、細胞を除 去し、抗体に富む腹水を集め、−２０℃にて保存した。

抗体の精製を硫酸アンモニウム／ＤＥＡＥ法を用いて行なった。

詳細には、腹水をガラスウールで濾過し、３０．０００９で１０分間遠心した。

次いで、腹水を＋４℃で攪拌し、等容量の冷却飽和硫酸アンモニウムを徐々に加 えた。添加終了後、混合物をさらに３０分間攪拌した。１０，０００９で１０分 間遠心して沈澱を集めた。この沈澱を最少量の冷却リン酸塩／Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａｉ ｆｌ衝液［２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ＩＩ）８７．５） 、＋０．０２％アジ化ナトリウム］に溶解した。この溶液を、同一の緩衝液２Ｘ ｔ０００＋＋＋Ｑに対して、４℃で透析した。透析し、再溶解した沈澱を３０． ０００９で１０分間遠心し、予めリン酸／Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液で平衡化してお いた１０＊ＱのＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけた。モノクローナル抗体は、 リン酸／ＥＤＴＡ緩衝液で溶出させた。

Ｇ、酵素−モノクローナル抗体 上で調製した、抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を酵素、即ち高純度の アルカリホスファターゼと１段階グルタルアルデヒド法により結合させた。モノ クローナル抗体をアルカリホスファターゼ（シグマ　タイプ■−Ｔ）を用い、Ｐ ＢＳ（１）Ｈ７，４）１０００ｉｆｆに対して２回、４℃で透析した。透析の後 、容量をＰＢＳで２，５ＲＱにし、ＰＢＳ中の２０％グルタルアルデヒド溶液２ ５μＱを加えた。このコンジュゲーション混合物を室温で１．５時間放置した。

次いで、グルタルアルデヒドを、予めＰ　Ｂ　Ｓで平衡化しておいた、ファーマ シアＰＨ−１０（セファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲル濾過して除去した。

このコンジュゲート体をＰＢＳ３．５ｘＱで溶出し、次いでこのコンジュゲート 体をトリス緩衝液［５０ｍＭトリス、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ８，０）、 ＋０．０２％アジ化ナトリウム］２Ｘ２０００ｘＱに対して、４℃で透析した。

この透析フンシュゲート体に、）・リス緩衝液中の１０％ＵＳＡ溶液を１／１０ 容量を加えた。次いで、このコンジュゲート体を、０．２２μｍのメンブランフ ィルタ−で滅菌濾過し、滅菌した褐色バイアルに入れ、４℃で保存した。

Ｈ，モノクローナル抗体コンジュゲート試験試験には酵素免疫検定法を使用した 。この検定法は、標準ポリビニルクロリド（ｐｖｃ）微量滴定トレーのウェルを 抗原で被覆した後、モノクローナル抗体酵素コンジュゲートを加え、次いで、酵 素基質、パラ−ニトロフェニルフォスフェートを加えることからなる。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的なエピトープ部位も調べることがで きる。尿、血液、糞便、水または乳のような診断用検体が抗原が含んでいるかど うかを調べるために、同じ酵素免疫検定法を使用することもできる。この場合、 まず抗体をプレートに結実流側１の一般的方法に従い、連鎖法菌属の全ての種の 抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体を製造した。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる＝（１）精度が高い；（ｉｉ）即日、１，２時間以内に結果が得られる；　 （ｉｉｉ　）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少 させることができ、労働コストが下がる；（ｉｖ）試験に関して使用される労働 時間および空間を減少させることができ、総経費を下げることになる：（Ｖ）迅 速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行なうことができる。

本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定 義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含す るものである。

国際調査報告 ＋１１１１”ＮｌＮ１１＊ｌｌ工１．。ｗｓ　ＩＩウ　ＰＣＴ／ＧＢ　８６１０ ０４１２−２−第１貝の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号＠発明者　コックス、ピータ−・ ジョン　イボ９０発　明　者　ノイス、アリス・マーガレット　イギリー、つ ０発　明　者　ウイドウズ、ダニ−イギリボーン ス国アイ・ビー１９５キユー・エイチ、サフォーク、バリ″ト・エドモンズ、チ ェピントン、チャーチ・ロード、チャーテイジ（番地の表示なし） ス国シー・ビー４５イー曇ニス、ケンブリッジシャイアイリンアム、ハイ・スト リート６幡 ス国シー・ビー４１アール・ティ、ケンブリッジ、シャー・クロウズ１４番

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．ストレプトコッカス・アガラクチエの抗原または抗原群に特異的なモノクロ ーナル抗体。
2. ２．ストレプトコッカス・ボビスの抗原または抗原群に特異的なモノクローナル 抗体。
3. ３．ストレプトコッカス・クレモリスの抗原または抗原群に特異的なモノクロー ナル抗体。
4. ４．ストレプトコッカス・ディスガラクチエの抗原または抗原群に特異的なモノ クローナル抗体。
5. ５．ストレプトコッカス・ファカリスの抗原または抗原群に特異的なモノクロー ナル抗体。
6. ６．ストレプトコッカス・ファエシウムの抗原または抗原群に特異的なモノクロ ーナル抗体。
7. ７．ストレプトコッカス・ラクチスの抗原または抗原群に特異的なモノクローナ ル抗体。
8. ８．ストレプトコッカス・エクィシミリスの抗原または抗原群に特異的なモノク ローナル抗体。
9. ９．ストレプトコッカス・ゾーエピデルミクスの抗原または抗原群に特異的なモ ノクローナル抗体。
10. １０．ストレプトコッカス・エクュイの抗原または抗原群に特異的なモノクロー ナル抗体。
11. １１．ストレプトコッカス・ウベリスの抗原または抗原群に特異的なモノクロー ナル抗体。
12. １２．β型ストレプトコッカス・Ｅ、Ｆおよび／またはＧ群の抗原または抗原群 に特異的なモノクローナル抗体。
13. １３．連鎖球菌の通常の抗原群に特異的なモノクローナル抗体。
14. １４．連鎖球菌の毒素の抗原または抗原群に特異的なモノクローナル抗体。
15. １５．連鎖球菌の発赤毒素の抗原または抗原群に特異的なモノクローナル抗体。
16. １６．連鎖球菌のストレプトリジンＳ毒素の抗原または抗原群に特異的なモノク ローナル抗体。
17. １７．連鎖球菌のストレプトリジンＯの毒素の抗原または抗原群に特異的なモノ クローナル抗体。
18. １８．連鎖球菌属の全ての種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体。
19. １９．標識された、第１項〜第１８項のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
20. ２０．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、 化学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つであ る第１９項に記載のモノクローナル抗体。
21. ２１．標識剤が酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素であるか、あるいは免疫 −蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定法、蛍光分極免疫検定法 または光子計数免疫検定法に使用し得る蛍光性化合物またはプローブであるか、 あるいは発光免疫検定法または酵素−結合免疫検定法に使用し得る化学的発光性 化合物であるか、あるいは生物的発光免疫検定法に使用し得る生物的発光性化合 物である第２０項に記載のモノクローナル抗体。
22. ２２．標識剤が、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクト シダーゼおよびペルオキシダーゼから選ばれる酵素、あるいはフルオレセイン、 あるいはルミノールおよびルミノール誘導体から選ばれる化学的発光性化合物、 あるいはルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体から選ばれる生物的発光性 化合物である第２０項に記載のモノクローナル抗体。
23. ２３．連鎖球菌感染症の治療に使用するための前項のいずれかに記載のモノクロ ーナル抗体。
24. ２４．検体を、第２０項〜第２３項のいずれかに記載のモノクローナル抗体と、 標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中の連鎖球菌抗原 の存在を診断する方法。
25. ２５．第１項〜第２３項のいずれかに記載のモノクローナル抗体と薬学的に許容 し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
26. ２６．第１項〜第２３項のいずれかに記載のモノクローナル抗体、および対照と して既知の連鎖球菌抗原を含有する、グラム陰性細菌感染の存在を診断するため のキット。