JPS63501332A - 人抹消血液中における白血球を回収するための単クロ−ン性抗体およびかかる単クロ−ン性抗体を用いる回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２、　細胞を生ずる前記抗体はマウス膵臓細胞である請求の範囲第１項記載の細 胞系。

３、　前記細胞は人がん腫細胞で免疫したマウスから誘導した請求の範囲第１項 記載の細胞系。

４、　細胞を生ずる抗体はＢａ１ｂ／ｃマウスから誘導した請求の範囲第２項記 載の細胞系。

５、　７メリカン　タイプ　カルテュア　コレクションＮｎ　ＣＲＬ　８９９４ で寄託された試料の確認特性を有する雑種細胞系。

６、　大赤血球細胞の膜の表面にあられれるグリコホリンＡのエピトープに特定 の単クローン性抗体。

７、　単クローン性抗体はアメリカン　タイプ　カルテュアコレクションＮａ　 ＣＲＬ　８９９４の特性を有する雑種細胞系により生成した請求の範囲第６項記 載の単クローン性抗体み ８、　人末梢血液試料の赤血球集団を溶解することなくかかる試料中の白血球集 団を検定する方法１．：おいて、１、　前記血液の含有試料に、該試料において 所望の微小球対細胞比を有する請求の範囲第７項に記載する単クローン性抗体で 被覆した一定量の実質的に単分散微小球を導入し； ２、　被覆微小球を前記血液が：料、！７、殆どすべての赤血球が単クロ・−ン 性抗体被覆に白血球集団を不都合な度合いに消耗させることなく結合するのに十 分な時間にわたって接触させ： ３、　抗体−結合微小球を残留血液試料から分離し：および ４、　回収血液試料の白血球集団を検定することを特徴とする白血球集団の検定 方法。

９、　微小球は特性において磁性であり、抗体−結合微小球を残留血液試料から 容器の外部から前記微小球の近くに磁界を作用させて分離して凝集させる請求の 範囲第８項記載の方法。

１０、微小球を非磁性高分子支持体とし、抗体−結合微小球を残留血液試料から 、試料を傾瀉する際に前記微小球を捕える大きさの機械的メツシュまたはスクリ ーンによって分離する請求の範囲第８項記載の方法。

１１、前記微小球は殆ど均一な４．５ミクロン直径を有する請求の範囲第９項記 載の方法。

１２．血液試料に導入する微小球対赤血球比を約７＝１〜２０：１の範囲内にす る請求の範囲第９項記載の方法。

１３、前記比を約１４：１にする請求の範囲第１２項記載の方法。

１４、前記比を約７：１にする請求の範囲第１２項記載の方法。

１５、前記微小球は殆ど均一な１．０ミクロンの直径を有する請求の範囲第９項 記載の方法。

明　細　書 人末梢血液中における白血球を回収するための単クローン性抗体およびかかる単 クローン性抗体を用いる回収方法 本発明は赤血球を溶解する（ｌｙｓｉｎｇ）ことなく循環末梢血液における白血 球サブセットを検定するのに特に有用なマウス単クローン性抗体に関する。また 、本発明は上記単クローン性抗体を被覆した適当な単分散微小球を用いて人血液 から白血球を回収するための上記単クローン性抗体を用いる改良検定方法学（ａ ｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を提供することを包含している。

検出および診断適用のために細胞または組織の抗原決定基に特異な単クローン性 抗体で被覆した支持体または微小球を一般に使用することは従来技術において知 られている。

また、不均一細胞集団から選定細胞集団を選別および分離するための抗体を被覆 した磁気粒子または微小球の使用はよく知られている。センエイ（ｓａｎｙｅｉ ）氏らの特許第４、２３０．６８５号、グラバ−（Ｇｒａｖｅｒ）氏の特許第３ ．９７０．５１８号、４、０１８．８８６号および４．１１５．５３５号、ディ ビス（Ｄａｖｉｓ）氏の特許第４．１７７、２５３号、モリティ（Ｍｏｌｄａｙ ）氏の特許第４、４５２．７７３号、ゲルリンスキー（Ｇｅｒ　１１ｎｓｋ　ｉ ）氏の特許第４゜４５４、２３４号およびレムバウム（Ｒｅｍｂａｕｍ）氏の特 許第４、２６７、２３４号はこの特許のある例にすぎない。スミス（Ｓｍｉｔｈ ）氏らの特許第４．２７２．５１０号およびフオレスト（Ｐｏｒｒｅｓｔ）氏ら の特許第４．１４１．６８７号には磁気粒子を用いる検定目的に適当な装置が記 載されている。細胞分離のために磁気微小球を用いることはＰＣＴ出願Ｎα８３ １０００１４（１９８３年４月２２日出願）による特許強力条約の下でノルウェ ー国オスロ市のスミス氏により出願された国際公開特許出願明細書筒ＷＯ８３１ ０３９２０（１９８３年１１月１０日公開）、オヨびＰＣＴ出願Ｎα８３１００ ０１６　（１９８３年４月２７日）、国際公開特許出願明細書筒ＷＯ８４１０２ ０３１（１９８４年５月２４日公開）に記載されている。しかしながら、出願人 は人末梢血液試料から白血球サブセットを分離するために単クローン性抗体を首 尾よく正確に使用することに気づいていない。

循環人血液は細胞および液体成分からなる。細胞成分は赤血球、小板および白血 球を含んでいる。１ミクロリツトルの正常な全血液試料には５Ｘ１０’の赤血球 、３Ｘ１０’の小板および５ＸＩＯ’の白血球を含んでいる。白血球細胞集団は 好中球、好酸球、好塩基球、単球およびリンパ球と称される５つのサブセットま たは集団に再分される。５Ｘ１０３個の白血球計算値を有する人の場合、血液試 料は血液ミクロリットル当り３．０７５個の好中球、１５０個の好酸球、２５個 の好塩基球、２５０個の単球および１５００個のリンパ球を有している。リンパ 球は数種の付加機能カテゴリーの存在の指示により８つの異なるタイプから構成 されている。人体において抗体を作るために制御し、かつ供給される大部分の細 胞はリンパ球として称される白血球の単一集団に見出されることが知られている 。更に、リンパ球サブセットは殆ど数の上で同一視されている。

血液試料の白血球集団の切開検定は有効な診断道具であるとされている。かかる 情報を得る通常の方法には自動電子白血球示差機器、機械的、電子的および光散 乱的細胞計算技術を包含している。このような高価な機器の使用は経済的観点か ら望ましくない。更に、かかる方法は特異な単クローン性抗体および特殊な技術 なしでは白血球サブセット測定を行うのに用いることができない。また、この事 は蛍光タイプの技術の使用に適用される。また、ある従来技術は赤血球の初期溶 解（ｉｎｉｔｉａｌ　ｌｙｓｉｎｇ）を必要とする。

また、赤血球細胞は大抵の細胞オルガネラが欠乏し、このために単一膜、形質膜 のみを有している。細胞の殆どすべての細胞質含有物は浸透溶血により全く純粋 な形質膜である［ゴースト軸ｈｏｓｔｅ）　Ｊを遊離することができる。赤血球 膜が炭水化物に富んでいる数種の蛋白質を有していることは既知の染色法によっ て定めることができる。更に、これらは細胞表面蛋白質（ｃｅｌｌ　５ｕｒｆａ ｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）であることが確かめられている。

赤血球は単一ポリペプチドに付着している１６個のオリゴ糖単位からなるグリコ ホリンとして確認されているトランスメンプラン蛋白質を含有している。このグ リコ蛋白質の量の約６０％は炭水化物であり、これらの炭水化物単位は細胞膜の 外表面上に位置している。グリコ蛋白質Ａ中の多数の炭水化物はその優れた染色 を与えることができる。蛋白質分解、化学修飾および電子顕微鏡研究は、グリコ 蛋白質Ａが（１）すべての炭水化物単位を含有するアミノ末端領域（膜の外表面 に位置する）　、（２）膜の炭水化物コア中に埋置されでいる疎水性中間領域お よび（３）細胞中に位置し、かつポリペプチド鎖からなるカルボキシル−末端領 域を有していることを示ｊプ（゛いる。分子のアミノ−末端蛋白質中の炭水化物 単位は負に帯電されたシアル酸基に富んでいる。

−また、グリコ蛋白質デルタき称されているグリコホリンＢはＳＳア丁７抗原に 関連するグリコ蛋白質である。位置２９１、二おけるメチオニンまたはスレオニ ンの存在はこの了り抗原差を規定する。グリコホリンＢの了ミノー末端蛋白質だ けがデータの結果よして確かめられる。グリコホリンＣはグリコ蛋白質デルタＩ ９よびガンマ乏称される少数の成分である。

赤血球グリコホリンを構成ずグリコ蛋白質鎮はＰＡＧＥに従う特性吸収帯パター ンによるホモ−およびヘテロ−二量体とし“こ生ずることができくまた、グリコ シレージョン（Ｂｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）　：によびシアレーション（ｓｉ ａ！ａｔ、１ｏｎ）のタイプおよび程度における差はグリコホリンの輪郭をたど る。

本発明においては、グリコホリンＡのみにおける特定のエピトープおよび唯一の 結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）に対する学クローン性抗体を開発した。一 般に入手される磁気微小球を、磁気分離処理において抗グリコホリンへ単りロー ン性抗体で被覆して白血球を大全血液試料から回収することを試みた。この研究 において、カリフォルニア　サン　ジエゴのモレキク、ラ　バイオシステム□Ｊ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手しつる蛋白質Ａ磁気微小球 （カタログＮαＭｉＪＯ２２）を用いた。これらの粒子を米国特許第４．２３０ ．６８５号明細書に記載されているように０．１５〜２．０ミクロンの平均大き さで多分赦し、界面活性剤を必要と）−１た。ビーズ対細胞比は所望の温四時間 、および実際的でない工業的有用性を示す赤血球消耗（ｒｅｙｔｈｒｏｃｙｔｅ 　ｄｅｐｌｅｃｔｉｏｎ）の割合に対して要求される。更に、白血球細胞による 有害な影響に遭遇した。

ペンジルベニア、フィラデルフィアのデュケ　勺イエンを試験研究に利用した。

この場合、粒子を、寸なわぢ、０．２〜０．９ミクロンに多分散し２、また界面 活性剤を必要とした。粒子の凝集および固まるのを観察した。白血球の損失はプ ロセスにおける赤血球消耗によって生ずるから、白血球回収は適切でなかった。

大全血液試料から白血球を分離および回収するために」二連する一般に入手しう る多分散磁気微小球またはビーズを利用する本出願人の試みは、かかる磁気粒子 分離処理を工業的利用に断念せざるをえなかった。従来、通常の磁気微小球を大 量生産することは、この粒子基体を利用するこの技術の工業化に実際的でなかっ たからである。１〜かしながら、本発明者は予期しない、極めてよい結果を得る ようにこの方法学体系に改良を加えた。また、本発明者は、どのような種類の磁 気微小球を唯一の単クローン性抗体と首尾よく使用できるかを確かめた。

本発明は、人界血球の表面膜上にあられれているグリコホリンＡの決定部位に選 択的に結合する本出願人により開発されたマウス単クローン性抗体を具体化した 。この単クローン性抗体はｒＫＣ（６Ｊとして示している。抗グリコホリンＡに 結合する特異性は、血液を溶解する必要なく血液から赤血球を分離する処理によ って、ＫＣ−１６単クロ一ン性抗体を人末梢血液中の白血球集団の一般に可能な 検定に利用することができる。更に、白血球の形態を変えることなく、および試 験血液試料の白血球集団の有害な消耗なく分離を達成することができる。

実際的に首尾よく行うことのできる１つの検定手順は、１．０〜４．５ミクロン 大きさの単分散磁気微小球上にＫＣ（６単クロ一ン性抗体を被覆することを含ん でいる。各側においては、人血液試料を時間経過にわたって常温に維持する装置 試験によって試験管に入れた。１例において７：１および他の例において１４： １の微小球対赤血球細胞比を試験管に導入した。微小球−結合赤血球を血液試料 から試験管の底端に磁力を作用させて分離し、残留する試料の上澄みを傾瀉し、 ｒＥＰＩｃｓ　Ｊ登録商標で入手しうる〕ｐ　ＩＪダ、ハイアリアのクールター ・コーポレーション（ｃｏｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａ−ｔｉｏｎ）の細胞分類計 器を用いる光の散乱技術によって分析した。

付随する白血球回収に伴う赤血球消耗に成功した。赤血球消耗の割合は９７−９ ８％の範囲で残留する白血球集団により９９．５−９９．９９％の範囲であった 。これらの結果は５〜３０分の装置期間で得られた。使用する磁気微小球は非多 孔性の高分子表面を示し、かつ界面活性剤を含まないものを選択した。この微小 球は球状で、単分散し、かつ磁気材料の望ましい均一濃度を有していた。

また、ＫＣ−１６単クロ一ン性抗体は、赤血球を人末梢血液試料から分離するの に適当な特性を有し、しかる後にフロリダ、ハイアリアのクールター・エレクト ロニクス・インコーポレーション；本特許出願の譲受人の子会社より市販されて いるクールター　カウンター（ＣＯＩＩＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ）型計器で行う 電子血液細胞計算（ｃｏｕｎｔｉｎｇ）および分粒（ｓｉｓｉｎｇ）技術を用い る白血球集団について検定する非磁気微小球に結合することができる。ＫＣ−１ ６単クロ一ン性抗体の唯一の特異性は、一般的に可能な検定技術を入手できる。

試験内診断機器で利用できることである。

本発明は人界血球の表面膜上にあられれているグリコホリンＡの特定エピトープ に選択的に結合するマウス単クローン性抗体を提供することである。グリコホリ ンＡに対するこの特異性を有するすべての単クローン性抗体をｒ　ＫＣ−１６Ｊ として称することができる。

ＫＣ−１６単クロ一ジ性抗体を製造できる１例の雑種細胞またはハイブリドーマ を次のようにして作った：ハイブリドーマを、マウス形質細胞腫細胞系、Ｓｐ　 ２１０−Ａｇ　１４および肺臓腺癌生検からの全細胞を注射したＢｏｌｂ／ｃマ ウスからの肺細胞の融合から発生させた。マウスに３つの分離物を２週間間隔で 注射し、最終注射後４日目で殺した。細胞融合は、コヒラー（Ｋｏｈｌｅｒ）お よびミルスチン０Ｊｉｌｓｔｅｉｎ）による手順によって行った（　ｒＮａｔｕ ｒｅＪ　２５６：４９５〜４９７（１９７５））。

この融合において、７ＸｌＯ’個の肺細胞を３０％ポリエチレン　グリコール（ ＰＥＣ）および３．６Ｘ１０’個の骨髄腫細胞を有するダルベツコ修飾イーグル の培地（ＤＭＥＭ）中で融合した。細胞融合後、細胞を約１０００ウエル（ｗｅ ｌｌ）に分布し、ヒボキザンタン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する選 定培地（）ＩＡＴ）中で培養した。ウェルを細胞生長について到立顕微鏡下が規 則正しく観察し、次いで生長を示す細胞から上澄みを採取し、初めにマウス免疫 グロブリンを生成するＥｌｉｓａ技術を用いてふるい分けした（ｓｃｒｅｅｎｅ ｄ）・次いで、マウス免疫グロブリンに対する陽性（ｐｏｓ　ｉ　ｔ　ｉ　ｖｅ ）のコロニーからの上澄みを間接免疫ペルオキシダーゼ染色工程成績表を用い、 および肺臓腺癌および正常肺臓を凍結し、パラフィン包埋した組織部分を使用し てふるい分けした。

ＫＣ−１６コロニーを含む上澄みは赤血球による比反応性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　 ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が確かめられ、および他の組織元素（ｔｉｓｓｕｅ　ｅ ｌｅｍｅｎｔｓ）の染色しないことを示した。このコロニーを軟アガロースにお いて２回再クローンしくｒｅｃｌｏｎｄｅ）、単一クローン、ＫＣ−１６を得る ようにした。クローンにより生成したＫＣ−１６抗体をマウス免疫グロブリンＩ ｇＧ１による二重免疫拡散法によって定めた。追加ふるい分け（ａｄｄｉｔｉｏ ｎａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）人界血球タイプ〇−陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）、 〇−陽性（ｐｏｓ　ｉ　ｔ　１ｖｅ）、八−陽性、八−陰性、Ｂ−陽性、Ｂ−陰 性、ＡＢ−陽性およびＡＢ−陰性血液タイプの血液凝集を用いて行った。

ＫＣ−１６単クロ一ン性抗体を生成しつる雑種細胞系（ｈｙｂｒｉｄｃｅｌｌ　 １ｉｎｅ）の試料をアメリカン　タイプ　力ルチュアコレクション（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託し、Ｎａ　 ＣＲＬ　８９９４で登録した。

また、ＫＣ−１６単クロ一ン性抗体を次の手順を用い免疫マウスからの腹水液体 （ａｓｃｉｔｅｃ　ｆｌｕｉｄ）のアフイニテイ精製により得た。凍結腹水液体 を水浴中３７℃で解凍し、凝塊を除去した。ヘパリンを解凍した腹水液体に腹水 液体の２ｍｇ／−の最終濃度に添加し、３０分間にわたり２５℃でかきまぜた。

次いで、塩化マグネシウム溶液＜１．５１０を腹水液体−当り０．０３４４−の 濃度に添加し、３０分間にわたり２５℃でかきまぜた。得られた液体を１５℃で ３０分間にわたり１５５Ｇで超遠心分離して上澄みを得た。この上澄みを分離し 、次いでｐＨ９，０を有し、かつ１Ｍグリシンおよび４Ｍ塩化ナトリウムを含む 結合緩衝剤（ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）により１：１容量基準で希釈した 。アフィニティ　カラムを結合緩衝剤により平衡にした指示蛋白質Ａ−セホロー ス（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ−Ｓｅｐｈｏｒｏｓｅ）により作った。緩衝上澄みをカ ラムに上澄み１ｄ対１／２−の蛋白質Ａ−セホロース比で、３ＸＣ３Ａで導入し た。カラムを結合緩衝剤でカラムの基線に洗浄し、ＫＣ−１６抗体を０．１Ｍ酢 酸カリウム（ｐＨ６，０）でカラムから第１ピークに関して溶離した。溶離ＫＣ −１６抗体を濃縮し、０．１％アシズ（ａｓｉｚｅ）でＰＢＳにデアフィルトレ ートした（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）。

ＫＣ−１６単クロ一ン性抗体の、赤血球の表面膜上に現れた特定グリコホリンＡ エピトープに対する結合選択性のために、大全血液試料からの赤血球および白血 球集団の分離を白血球に結合させないで達成することができる。この血液細胞分 離を達成する１つの方法においては、ＫＣ−１６単クロ一ン性抗体は適当な磁気 微小球に被覆でき、次いでこの微小球は全血液試料に導入でき；　ＫＣ−１６単 クロ一ン性抗体により、微小球−血液混合物に磁界を作用させることによって白 血球から分離できる赤血球に選択的に結合する。かかる分離は、赤血球を溶解す ることなく、他の検定および分析の条件で白血球の形態を変えることなく、およ び凝集または別の方法の理由により白血球細胞の有害消耗を与えることなく達成 できる。一般に、単一分散し、または均一の４．５または１．０ミクロン直径の 非多孔性磁気微小球（しばしばビーズと称されている）を、その上にＫＣ−１６ 単クロ一ン性抗体を結合するために、次のように微小球をウサギまたはヤギ抗マ ウス免疫グロブリン（ＲＡＭまたはＧＡＭ）で予め被覆することによって状態調 節した（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）：２５０　ｍｇのビーズを３ｍｆの蒸溜水に 分散し、２〜３分間にわたり音波処理した。ビーズを水に混合した混合物を数時 間にわたって４℃で冷却した。次いで、ビーズを磁気的に分離し、水を捨てた。

次いで、ビーズを５ｍｇのＲＡＭに再懸濁し、５００ミクロリツトルのりん酸緩 衝溶液（ＰＢＳ）で希釈し；この混合物を室温で温置し、４〜５時間にわたり転 倒かきまぜた。

しかる後、ビーズをＰＢＳ−１％ＢＳＡの混合物の４ｍ１部分で６回洗浄した。

次いで、ビーズを４ｄのＰＢＳ−１％ＢＳＡに再懸濁し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡを ３回２４時間にわたって変えながら転倒かきまぜた。

５Ｘ１０”量の懸濁ビーズをシリコン処理した試験管にピペットで入れた。ビー ズを捨てた液体から磁気的に分離した。次いで、ビーズをＰＢＳに再懸濁し、Ｋ Ｃ−１６単クロ一ン性抗体を溶液に、溶液の０．５ｍｇ／ｍｆの最終濃度に添加 した；次いで溶液をかきまぜながら１時間にわたり室温で温置した。次いでＰＢ Ｓ−１％ＢＳＡで６回洗浄し、１蔵のＰＢＳ−１％ＢＳＡに再懸濁した。

Ｋ（ニー１６被覆磁気微小球を用いる赤血球（ＲＢＣ％）および白血球（ＷＢＣ ，）の全血液分離を、微小球を１運の全血液試料と１０〜１００ミクロリツトル の範囲で混合して７：１〜２０：１の範囲の微小球：赤血球比を有する混合物を 生成した。微小球および全血液の混合物を個々の試験管中で室温でゆるやかにか きまぜながら２分間にわたり温置した。各試験管を磁界に置き、赤血球−結合磁 気微小球が試験管の底に分離し、および白血球が上澄みに移行し、この上澄みを ｒＥＰＩＣ３’Ｅ’　Ｊ登録商標で市販されているフロリグ。ハイアリアのクー ルター・コーポレーションの細胞分類計器を用いる光の散乱技術によって分析し た。これらの分離結果を表■に示す。この表Ｉには１０：１〜２０：１の範囲の 微小球対赤血球または細胞比が全血液試料中の赤血球の９９．９９％消耗するこ とを示している。

表Ｉ 微小球対ＲＢＣ５Ｏ比 比　％ＲＢＣｓ（消耗）　％１ＩｉＢｃ、　（残留）７：１　９９．２１　９０ １０：１　９９．９９　７３．６ １４：１　９９．９９　６１．２ ２０：１　９９．９９　７８．４ 第２の一連の分離において、６つの異なる供与体からの７つの全血液試料をＫＣ −１６被覆微小球と各混合物において同じ微小球対細胞比１４：１で混合した。

１分後、第１の上澄みを傾瀉し、１分の第２期間後第２の上澄みを傾瀉し；これ ら２回の引き続く上澄み中の赤血球消耗の割合および白血球残留の割合をＩＥＰ ＩＣ３■計器を用いて測定し、この結果を表Ｈに示した。この表■は赤血球の平 均９９．９７十０．０２％が２つの引き続く１分の温置後に消耗したことを示し ている。

表■ 微小球ＲＢＣｓの１４＝１比における２回の引き続く１分装置による標識４．５ ミクロン磁気微小球の使用によるＲＢＣ消耗 第１の上澄み　第２の上澄み ％ＲＢＣ’、％ｌｌｌＥＣ，％ＷＥＣ，％ＷＥＣ。

消耗　残留　消耗　残留 ９９．７９　７８．６　９９．９５　７１．４９９、９５　９６．６　９９．９ ８　９０．９９９．９４　１００　９９．９９　１００９９．８０　１００　９ ９．９４　１００９９．８５　１００　９９．９５　１００９９．９４　１００ 　９９．９９　９４．８本発明において有利に定め、かつ使用した磁気微小球は ２つの供給源から得た。使用したビーズの一例は上述するシンテフ氏の特許出願 に記載している。使用したビーズの他の例はペンシルバニア。フィラデルフィア のデコケ　ザイエンティフ、イックにより市販されている１ｏＯミクロンラテッ クスーアクリルアミドである。

ＫＣ−１６単クロ一ン性抗体の唯一の特異性は、使用する場合に、特性によって 非磁性である他の支持体またはビーズに適応する。この出願において、ＫＣ〜１ ６単クロー単性ローン性抗体特性の支持体またはビーズに被覆し、この適当な合 成プラスチックは均一な大きさからなる。赤血球をＫＣ−１６被覆支持体に結合 させた後、血液試料の上澄みを、ビーズを捕え、なお上澄みを通過しつる所望ケ ージの金網に通すことによって上澄みを生成することができる。次いで白血球細 胞についての検定を行うことができる。

グリコホリンＡは赤血球膜のシアレーテッド（ｓｉａｌａｔｅｄ）グリコ蛋白質 主成分であることが知られている。グリコ蛋白質分子のエピトープまたは抗原部 位は特定の炭水化物部分であり、この部分に本発明におけるＫ（ニー１６単クロ ーン性抗体が選択的に結合し、上述するように達成される満足な結果が得られる 。　本発明は、本発明の範囲を逸脱しない限り、当業者により種々変更を加える ことができる。

補正口の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和６２年　７ 月１７日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 ２、発明の名称 人抹消血液中における白血球を回収するだめの単クローン性抗体およびかかる星 り０−ン性抗体を用いる回収方法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国フロリダ州　３３０１０　ハイ７リーウエスト　トウニ ンティーセカンド　ストリート４４０名　称　クールター・コーポレーション５ 、補正口の提出年月日 １９８７年３月／り日 ６、添付書類の目録 訂正請求の範囲 １、　入光血球の表面膜上にあられれるグリコホリンＡ蛋白質の特定エピトープ に結合する単クローン性抗体を生ずる雑種細胞系。

２、　前記抗体生成細胞はマウス膵臓細胞である請求の範囲第１項記載の細胞系 。

３、　前記細胞は人がん肝細胞で免疫１〜だマウスから誘導した請求の範囲第１ 項記載の細胞系、。

４、　抗体生成細胞はＢａ１ｂ／ｃマウスから誘導した請求の範囲第２項記載の 細胞系。

５、　アメリカン　タイプ　カルチコア　コレクションＮｎ　ＣＲＬ　８９９４ で寄託された試料の確認特性を有する雑種細胞系。

６、　人界血球細胞の膜の表面にあられれるグリコホリンＡのエピトープに特定 のｌクローン性抗体。

７、　単クローン性抗体はアメリカン　タ、イブ　カルチコアコレクション　寄 託Ｎｎ　Ｉｌ、　８９９４の特性を有する雑種細胞系により生成した請求の範囲 第６項記載の単クローン性抗体。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．人赤血球の表面膜上にあらわれるグリコホリンＡ蛋白賛の特定エピトープに 結合ずる単クローン性抗体を生する雑種細胞系。 ２．細胞を生ずる前記抗体はマウス脾臓細胞である請求の範囲第１項項載の細胞 系。 ２．前記細胞は人がん腫細胞で免疫したマウスから誘導した請求の範囲第１項記 載の細胞系。 ４．細胞を生ずる抗体はＢａｌｂ／ｃマウスから誘導した請求の範囲第２項記載 の細胞系。 ５．アメリカンタイプカルチュアコレクションＮｏＣＲＬ８９９４で寄託された 試料の確認特性を有する雑種細胞系。 ６．人赤血球細胞の膜の表面にあらわれるグリコホリンＡのエピトープに特定の 単クローン性抗体。 ７．単クローン性抗体はアメリカンタイプカルチェアコレクションＮａＣＲＬ８ ９９４の特性を有する雑種細胞系により生成した請求の範囲第６項記載の単クロ ーン性抗体。 ８．人末梢血液試料の赤血球集団を溶解することなくかかる試料中の白血球集団 を検定する方法において、１．前記血液の含有試料に、該試料において所望の微 小球対細胞比を有する請求の範囲第７項に記載する単クローン性抗体で被覆した −定量の実質的に単分散微小球を導入し； ２．被覆微小球を前記血液試料と、殆どすべての赤血球が単クロ−ン性抗体被覆 に白血球集団を不都合な度合いに消耗させることなく結合するのに十分な時間に わたって接触させ； ３．抗体一結合微小球を残留血液試料から分離し；および ４．回収血液試料の白血球集団を検定することを特徴とする白血球集団の検定方 法。 ９．微小球は特性において磁性であり、抗体−結合微小球を残留血液試料から容 器の外部から前記微小球の近くに磁界を作用させて分離して凝集させる請求の範 囲第８項記載の方法。 １０．徴小球を非磁性高分子支持体とし、抗体−結合微小球を残留血液試料から 、試料を傾瀉する際に前記微小球を捕える大きさの機械的メッシュまたはスクリ ーンによって分離する請求の範囲第８項記載の方法。 １１．前記微小球は殆ど均一な４．５ミクロン直径を有する請求の範囲第９項記 載の方法。 １２．血液試料に導入する微小球対赤血球比を約７：１〜２０：１の範囲内にす る請求の範囲第９項記載の方法。 １３．前記比を約１４：１にする請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．前記比を約７：１にする請求の範囲第１２項記載の方法。 １５．前記微小球は殆ど均一な１．０ミクロンの直径を有する請求の範囲第９項 記載の方法。