JPS63503242A - 真偽を立証したい物品の標識 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 偽を立証したい物品の標識 本発明は物品の真偽を立証する（ｔｏ　ａｕｔｈｅｎＮｃａｔｅ）ための物品の 標識（ラベル付け）に係る。

現代の世界は多くの領域で真偽の立証に関する重要な問題に直面している。製造 業界でみられるような大量生産された模造品にしても芸術の世界でみられるよう な贋作にしても、これらは混乱を引起こし、かつ真の製作者にとっては収益の損 失を招く。産業の発達した国々の内での世界貿易に関しては贋物製造者の行為に よって何兆ものドルが失われると推定されている。

時計、電気製品、ハイファッションの衣類などのような一流で価値の高い物品の 製造業者にとっては事は特に重大である。生産国または外国での模造品の販売は 産業界にとって商取引上の主要な紛争である。明らかに、嵩の高い低価格の製品 もまた模倣と詐欺的販売の対象になる。

さらに、個人、法人、公共団体および政府が模倣の抑制以外の理由で本物の品物 を標識したいと思うのには多くの理由がある。たとえば、ある物品または品物（ アイテム）の最終的な運命の確認を可能にするように流通・販売網（ネットワー ク）に沿った本物の品物の流れを追跡記録（モニター）するためである。これに よっである特定の流通ネットワークの他と比べた効率に関する情報が得られるで あろう。そしてこの場合明らかに模倣に対して対処する必要はほとんどない。し かしこの原理は、品物を一義的に、そして標識された品物の明白な同定を可能に するシステムによって標識する場合もやはり同じである。

それ自体模倣されることがなく、したがって贋造された贋の品物を保護するのに 悪用されることのない完全に安全な保護システムを得るためにいろいろな作動モ ードに適用することができるシステムに対するニーズがある。そのようなシステ ムを適当な操作条件下で用いると本物の物品の取引と販売をモニター・制御・調 節することができ、しかも製造業者と消費者の双方をある程度保護することにな ろう。次の３つの主要な保護機能を達成するように設計された完全に安全なシス テムに対するニーズがある。

（ａ）ある品物のコピー（複製）品を製造・販売する権利をもたないコピー業者 による、コピーされた贋の品物の詐欺的販売から真の製造業者を保護すること。

（ｂ）コピーされた贋の詐欺品の故意または偶然の販売からそれに気付かない消 費者を保護すること。

（Ｃ）政府および全ての適当な政府機関が、個別にしろ大量生産にしろ模倣され た贋物量の商取引を適宜追跡・調節・制御・取締り・かつ訴追する際に役にたつ こと。

このたび、物品の真偽を立証する問題に対する新しいアプローチが開発された。

本発明においては２つの重要な事実を考慮する。まず第一に、簡単な化学分析手 順によってＤＮＡまたはタンパク質自体のような分子の、存在または不存在を検 出する能力を利用する。このような手順は、ＤＮＡ　（または別の巨大分子）が 存在するか否かを示すプラス／マイナス試験である。

異なる起源、すなわち異なる生体に由来するいろいろなりＮＡ分子間に区別はな い。しかし、このシステムの分解能は２番目の事実、すなわち核酸やタンパク質 のような化合物の全配列または置換部分がもっている、一義的に認識され、した がっである物品が本物であることを明らかにする能力を利用することによってか なり改善することができる。

したがって本発明は真偽を立証したい品物または物質を標識する方法を提供する 。この方法は品物または物質を所定の巨大分子からなる第一の化合物によって標 識することからなるがこの際この第一の化合物の同一性（種類）を暴露（公表） することはしない。この第一の化合物には相補的な第二の化合物が結合すること ができて、その結果第一の化合物の存在を明らかにでき、したがって品物または 物質が本物であることを立証できる。

本発明はまた、品物または物質の真偽を立証・確認するための方法も提供する。

この方法は、 ｉ）所定の巨大分子からなる第一の化合物の存在または不存在が具現化され得る ように第一の化合物に結合することができる相補的な第二の化合物を用いて、品 物または物質が前記第一の化合物によって標識されているか否かを決定し、それ により、１１）品物または物質の本物であることを決定することからなる。

便宜上ここでは第一の化合物をシグナル化合物と称する。このシグナル化合物は 、たとえば核酸の場合は塩基の、タンパク質の場合はアミノ酸の配列からなり得 、この配列には相補的な第二の化合物が結合する。ここではこの配列をシグナル 配列と称する。

したがって、今や、各々が本物として一義的にしかも所定の程度の信頼性をもっ て認識され得るように厳格な保護が望まれる品物もしくは物質または品物群もし くは物質群を標識することが可能になったのである。本発明はタグ（目印）によ る本物の物品の認可された標識に依存しうる。このタグは、たとえば、このタグ （したがってこのタグが付けられている品物または物質）の真偽がこのタグの創 作者（生産者、デザイナ−）によってのみ決定できるような量、形態およびタイ プで１種類以上のシグナル化合物を担持している。

あらゆる物質または品物（物品）を標識することができる。

本発明の技術は時計、香水および衣服のような贅沢品、医薬ならびにその他の肥 料、除草剤および殺虫剤のような化学品、フィルムおよびレコード、銀行券、美 術工芸品、パスポートのような証書類、さらに自動車部品のような機械・部品類 などに適用しうる。

標識はさまざまな方法で実施することができる。たとえば品物または物質の製造 中にその中へ直接シグナル化合物を入れてもよい。あるいは、接着剤などによっ てシグナル化合物を付着させてもよい。この接着剤がシグナル化合物からなって いてもよい。またシグナル化合物は、品物または物質に塗布される塗料またはイ ンクのような材料中に含ませてもよい。品物または物質の内容物がシグナル化合 物を含んでいてもよい。

シグナル化合物が付いているタグを用いて物品を標識してもよい。このシグナル 化合物は透明なプラスチックシートによって保護しておいてもよい。このタグは 物品に直接付着していてもよいし、物品の構造の一部として取込まれていてもよ い。あるいは、このタグをその他の方法で物品と結び付けてもよい。

たとえば、物品が包装されている箱の中に緩く入れておくとか、または物品に付 随する書類の間に挟んでおいてもよい。ある種の物品では、たとえば紙などでは シグナル化合物を直接貼付してもよい。

シグナル化合物は、このシグナル化合物の存在の検出を可能にするように相補的 な第二の化合物が結合することができる化合物である。シグナル化合物は核酸や タンパク質のような巨大分子である。そのような巨大分子の形態のシグナル化合 物、すなわち裸の巨大分子を用いて品物または物質を標識してもよい。

この巨大分子は合成品でもよいし、天然源から得られたものでもよい。したがっ てＤＮＡの場合、ゲノムＤＮＡまたはその制限エンドヌクレアーゼによる部分消 化によって得られるＤＮＡを使用することができる。

しかしながら別方法として、標識としての使用条件に耐え得る胞子またはその他 生体の耐久段階の形態にあるシグナル化合物を用いて品物または物質を標識して もよい。ＤＮＡおよび（ある種のウィルスの場合の）ＲＮＡでは、シグナル化合 物は生体のゲノム全体またはその一部でよい。したがって、特にウィルス、細菌 およびカビのような微生物を標識として使用することができよう。これらは少量 で、しかし測定可能な量で使用し得る。胞子の例は、Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、　 Ｂ、ｃｅｒｅｕｓもしくはＢ、　ｎｅｇａｔｅｒｉｕｉのようなりａｃｉｌｌｕ ｓの種またはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍもしくは＾ｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　Ｉｕｓのよ うなカビの種の胞子である。これらの場合ＤＮＡヤＲＮＡは再単離することがで きる生存系の中に含有され、そのＤ　Ｎ　Ａ　ｈＸＲＮ　Ａを同定することにな るであろう。精子ＤＮＡたとえばサケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（５ｉＨａ　Ｄ−１５０ １＞もシグナル化合物として使用できる。

各々が別々の領域を占める一連のいろいろなシグナル化合物を提供し得る。ある いは、別々の領域の一連の同じシグナル化合物を提供してもよい。この場合、い ろいろな第二の相補的化合物を使用して各領域のシグナル化合物内のいろいろな シグナル配列と結合させることができる。これは特にシグナル化合物が核酸であ る場合に適用される。シグナル化合物は核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましい。

簡単にいえば標識の目的には単に巨大分子の存在または不存在を検出するだけで 十分であろう。すなわち、ある種の目的には、裸の分子としての、または生体系 の一部としてのＤＮＡの存在を決定すれば十分であろう。ＤＮＡの存在を検出す るには、エチジウムプロミド、アクリジンオレンジまたはごスーベンズイミド（ Ｈ３３２Ｓ８．　Ｈｏｅｃｈｓｔ　ｄｙｅ　３３２５８）のような非特異的にＤ ＮＡに結合する化学薬品を使用することができる。エチジウムプロミドの場合こ の化合物は普通の可視光の波長では検出できない。したがって標識はＤＮＡとエ チジウムプロミドとを共に提供することによって達成し得る。これらの存在はそ の後紫外線によって検出することができる。これによって簡単な標識方性が得ら れるが、高い程度の独自性は得られず、したがって高い安全性も得られない。そ れはプラス／マイナス試験である。

各種、さらに極内の各株に対するＤＮＡの独自性と、独特のＤＮＡ分子を迅速、 一義的かつ正確に認識することに関する技術的水準とが相俟って、有生物と無生 物とのあらゆる起源であらゆる種類の物品を、標識された物品が同定し得るよう に標識することの基礎となる。これによって、簡単なプラス／マイナス試験より も洗練された形の標識が可能になる。

生体の各株についてＤＮＡまたはＲＮＡの分子は独特である。

同じ種の異なる株は塩基の配列における小さな変化によって異なっている。たと えば、標識したＤＮＡプローブでＤＮＡを検査することによって異なる種のＤＮ Ａおよび同じ種の異なる株のＤＮＡを認識することが可能である。当該生体のゲ ノムＤＮＡからランダムに得られたＤＮＡの断片からなる特別に構築されたプロ ーブを使用することができる。合成りＮＡプローブを使用してもよく、同様にＨ −１３プロ一ブ構造体のようなバクテリオファージプローブも使用し得る。また 、プラスミドプローブを使用することができる。このプローブＤＮＡは異なるＤ ＮＡ分子内に含有されているかもしれない整合ＤＮＡ配列とハイブリダイズする ことができる。

したがって本発明においては、品物または物質がシグナルＤＮＡで標識され得る 。このシグナルＤＮＡは特定のプローブＤＮＡとハイブリダイズすることができ る配列を含んでいる。この配列がシグナル配列である。シグナルＤＮＡとプロー ブＤＮＡとの双方が秘密にされている。標識されている品物または物質をプロー ブＤＮＡを用いて分析した結果シグナルＤＮＡのシグナル配列が現われた場合、 この品物または物質は本物である。

そうでなければその品物または物質は本物ではない。このプローブＤＮＡはもち ろん、ハイブリダイゼーションが生じたかどうかを具現化するように、たとえば 放射能もしくは酵素ラベルによって、ビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏ ｎ）によって、または光ビオチニル化（ｐｈｏｔｏｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ）によって標識されている。

シグナルＤＮＡは１種以上の異なるシグナル配列を含んでいてもよい。すなわち 、同一のタグに対して所与のＤＮＡシグナル分子を別個に数回使用して個々の特 定ＤＮＡプローブのいずれを使用したかに応じた独特のシグナルを得ることがで きる。

シグナル配列が反復して存在しているのが好ましい。これによってプローブＤＮ Ａに対するシグナル配列の感度が向上する。

シグナルＤＮＡは微生物のゲノムＤＮＡであるのが好ましいが、簡単な系では、 合成して得られるような短いＤＮＡ配列を使用することもできる。ウィルスまた は最近のゲノムＤＮＡを使用してもよく、同様にゲノムＤＮＡを制限エンドヌク レアーゼで部分消化したものも使用できる。プラスミドも使用できる。

シグナルＤＮＡのシグナル配列は、これとハイブリダイズすることができるプロ ーブの入手容易性によってあらかじめ定められた配列とすることができる。それ はＤＮＡ分子に固有の配列でもよい。あるいはまた、ＤＮＡ分子の中に特別に導 入してもよいし、ＤＮＡ分子と混合してもよい。シグナル配列のサイズはプロー ブＤＮＡに対する検出可能な応答が引き出されるようなものとすべきである。取 扱上の理由から１〜１０ｋｂｐのシグナル配列が適切である。

シグナルＤＮＡで標識された品物または物質が本物であるという確信がさまざま な程度で得られる。信頼性の程度はシグナルＤＮＡを２種以上用いることによっ て向上することができる。

品物または物質は、別々の領域が各々異なるシグナルＤＮＡによって標識されて いてもよい。シグナルＤＮＡは別のＤＮＡと混合して適用してもよい。これをこ こでは迷路ＤＮＡと称する。

この迷路ＤＮＡが存在すると、シグナルＤＮＡの正確なシグナル配列を決定しよ うとしている人の仕事が複雑になる。

本発明は以下のようにして適用され得る。一連の異なる微生物を個別に増殖させ る。各々の微生物に対してゲノムＤＮＡを抽出し、標準的な分子生物学の技術を 用い、特定の制限エンドヌクレアーゼで消化して生成したゲノムＤＮＡの短い配 列をランダムにクローニングすることによって一組のいろいろなプローブを製造 する。これによって、当該ＤＮＡを得ることができる微生物種のＤＮＡをハイブ リダイゼーションによって認識するブＯ−ブが生成する。したがってプローブＤ ＮＡは、原理的にシグナルＤＮＡのみが所有しているはずのシグナル配列を定め る。

一般的なプローブが異なる種のＤＮＡとハイブリダイズすることはありそうもな いが、これは異なる起源のＤＮＡに対してそのプローブをハイブリダイズさせよ うとして見れば容易にチェックすることができる。クロスハイブリダイズするプ ローブはすべて廃棄することができる。類似の手順を使用して、同じ種の異なる 株から得たＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを調べることによって株に特 異的なブＯ−ブを得ることができる。クロスハイブリダイズしないものは所与の 種のある特定の株に対して特異的である。組にしたプローブを標識し、その後の 使用に備えて貯蔵する。

タグを作るには、紙、精製したセルロースもしくはセルロースアセテート（１） シート、またはＨｙｂｏｎｄ　ＣもしくはＨｙｂｏｎｄ　Ｎ　（＾−ｅｒｃｈａ ｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ）などのようなナイロンベースの膜な どといった適当な支持材料上の決められた位置にシグナルＤＮＡを配置すればよ い。シグナルＤＮＡは、微生物の残部から分離してかまたは処理済み１１胞懸濁 液もしくはペーストの形態で適用できる。このＤＮＡはドツト（点）またはバン ド（帯）のいずれで適用することもできる。各々のドツトまたはバンドは異なる 微生物から得たＤＮＡであるか、または異なるシグナルＤＮＡを含有している。

ＤＮＡは、プローブＤＮＡとハイブリダイズすることができる形態で支持材料に 結合する。すなわち、ＤＮＡは通常変性しておくかまたは一本鎖にしておく。典 型的な場合、各々別個の領域に適用されるシグナルＤＮＡの量は１０ｐ９〜１０ 埒である。シグナルＲＮＡをＤＮＡの代わりに用いてもよい。細菌やカビの胞子 を直接使用してもよく、同様にウィルス粒子も使用できる。

こうして作成したタグを、真偽を立訂したい品物または物質に結合する。そのよ うなタグによって標識されたなんらかの品物または物質の真偽を決定するには、 貯蔵しておいた標識したプローブＤＮＡを用いてタグを処理・加工する。プロー ブＤＮＡをタグに接触させ、各シグナルＤＮＡのシグナル配列に結合させる。プ リセットパターンに従ってハイブリダイゼーションを測定して、標識された品物 または物質が本物であることを確認する。

このようにして品物または物質が本物であるという非常に高度の信頼が達成でき る。たとえば、タグがそれぞれ３つのドツトのＤＮＡ６列からなり、各ＤＮＡが 異なっており、このタグを作るのに少なくとも１０００個の独特なシグナル配列 を与えるＤＮＡの異なる１０００個の起源が使用できると仮定しよう。１０００ 個の別々の異なるＤＮＡのプールからランダムに抜き出した３つのドツトのいず れかの所与の列を偽造者が独立に再生できる確率は、パターンを作るのに１００ ０個のＤＮＡを使用したことを偽造者が知っている場合で１０９に１である。い かなる偽造者でも、その人が生命体のずつと大きいサンプルから得たＤＮＡに対 する診断用ＤＮＡプローブの完全な一組をもっていない限り、いかなる方法によ ってもこのことを悟り始めることさえできないのであるから、この技術の基礎を 形成するのにどの１０００個のＤＮＡを選択したかを偽造者が知ってしまうとい う「Ｒ悪のケース」の例でも起こらない限り、偽造者がこのパターンを再生でき る確率を計算する直接の道はない。この場合ドツト１８個の完全なタグについて 偽造者が正確な列を再生する確率は１０５４に１である。明らかに、いかなる信 頼性限界も、タグのマーカーに利用できるシグナルＤＮＡの数およびタグに適用 するシグナルＤＮＡの数に応じて選択することができる。

これらの考察は、本発明を適用し得るさらに進んだレベルにもあてはまる。これ は、ＤＮＡ制限酵素の冬型性に基づく生体の同一性における微小な差の検査に依 存する。これをいかに行なうかは我々の一〇−Ａ−８６１０２１０１に開示され ている。これによって、いずれかの同一性（種類）は知られている第一と第二の 生体が同一であるかどうかを決定するための方法が得られる。この方法は、 （ｉ）　第一の生体のゲノムＤＮＡを１種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化 し、 （ｉｉ）　こうして得られたＤＮＡ断片を電気泳動によって分離し、（ｉｉｉ） こうして分離した断片の、１種以上の第一の標識プローブとハイブリダイズする 断片の位置を決定しく「ハイブリダイゼーションパターン」、「バンドパターン 」または「マツプ」）［このプローブまたは各々のプローブは第一または第二の 生体と同じ種の生体のゲノムＤＮＡからランダムに誘導されたＤＮＡの断片を含 む］、 （ｉｖ）　こうして決定された断片の位置を、前記第一のプローブまたはその各 々に結合するＤＮＡ断片（これは第一の生体のゲノムＤＮＡから得られたＤＮＡ 断片と同じ方法によって第二の生体のゲノムＤＮＡを前記の制限エンドヌクレア ーゼまたはその各々で消化して第二の生体のゲノムＤＮＡから生成しかつ電気泳 動にかけておいたものである）の位置と比較することからなり、 ここで、ステップｍから（ｉｖ）は、ステップ（ｉｖ）での比較によってふたつ の生体が同一でありそうであることが明らかにされた場合、このふたつの生体が 真に異なる無関係のものとして区別され得ないという確率（×）、すなわちＸ　 −Ｆ　ｑ（１） ［ただし、ｑはステップ（ｉｉｉ）におけるプローブ検査によって明らかにされ た位置の数であり、Ｆは、第一と第二の生体と同じ種から独立に得られた生体の 対のゲノムＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ消化したものの間における、同一で あるＤＮＡ断片の割合を表わす率である］によって決定される確率（Ｘ）が１０ −１２以下となるように、ステップ（ｉｉｉ）におけるハイブリダイゼーション によって充分なバンドが具現されるような量のプローブＤＮＡと１種以上の制限 エンドヌクレアーゼを使用し、（ａ）前記第一と第二の生体と同じ種を代表する Ｆ値を得るのに充分な数の、前記種から独立に得た生体のゲノムＤＮＡを、同じ 制限エンドヌクレアーゼを使用して別々に消化し、場合によっては各々の消化物 を別々の部分に分割し、（ｂ）独立に得た生体の各々に対して消化物または消化 物の一部を、平行してゲル電気泳動にかけ、 （Ｃ）前記種の生体のゲノムＤＮＡからランダムに得られたＤＮＡの断片からな る第二の標識プローブを用いてゲルをプローブ検査し、 （ｄ）こうして具現化されたゲル上のハイブリダイゼーションパターンヲ、独立 に得た生体の対合結合（ｐａｉｒｗｉｓｅ　ｃｏｉｂｉｎａＮｏｎｓ）に関して 比較し、さらに （ｅ）場合によっては、独立に得た生体の各々に対する消化物の１つ以上の別の 部分についてステップ（ａ）から（ｄ）を繰返す（ただし、毎回具なる前記のＤ ＮＡ断片からなる前記第二の標識プローブを用いる） ことによって実施する。

換言すると、ｑは、２つの生体が同一のマツプをもっている場合、ステップ（ｉ ｖ）における第一と第二の生体の対合比較によって明らかにされたＤＮＡ消化断 片の共通の位置の合計数である。

ステップｍから（ｉｖ）は、 （ｉｏ）第一の生体のゲノムＤＮＡと第二の生体のゲノムＤＮＡとを同じ制限エ ンドヌクレアーゼによって別々に消化し、場合によっては各消化物をいくつかの 部分に分割し、（ｉビ）各生体について消化物または消化物の一部を平行してゲ ル電気泳動にかけ、 （ｉｉｉ’）前記第一の標識されたプローブを用いてゲルをプローブ検査し、こ うして具現された２つの生体のハイブリダイゼーションパターンを比較し、 （ｉｖ’）場合によって、各生体の消化物の１個以上の別の部分について、ただ し各回毎に異なる前記のＤＮＡ断片からなる前記第一の標識されたプローブを用 いてステップ（ｉｉ’）と（ｉｉｉ’）を繰返す ことによって実施するのが好ましい。

ステップ（ｉｏ）から（ｉｖ’）の手順は、各回毎に異なった制限エンドヌクレ アーゼを用いて二回以上実施することができる。

ＭＯ−Ａ−８６１０２１０１の方法は、２つの生体に対するハイブリダイゼーシ ョンパターンの間にある差を検出できないことがどの程度同一性の証明と考えら れるかの程度に依存する。その方法を本発明に適用して、シグナルＤＮＡ　（第 一の生体）は、典型的な場合２５〜２５０ｎの旦でタグに適用（塗布）する。こ のタグを、真偽を立証したい品物または物質に付着（結合）させる。物品の真偽 を決定するには、たとえば電気溶出によってシグナルＤＮＡをタグから除去し、 すでに貯蔵しておいた本物のシグナルＤＮＡ　（第二の生体）と比較する。シグ ナルＤＮＡのシグナル配列は、ＷＯ−Ａ−８６１０２１０１に従ってハイブリダ イゼーションパターンを決定する際に使用するプローブとハイブリダイズする配 列である。シグナル配列はあらかじめ決定し得る。プローブは先に構築して貯蔵 しておくことができる。あるいはまたプローブは、ラベルから想定されるシグナ ルＤＮＡを本物のシグナルＤＮＡと比較する時点で製造することもできる。

ＭＯ−Ａ−８６１０２１０１の方法を利用することによって、あるシグナルＤＮ Ａが所与の種の特定の株に由来するものであることを所定の確信程度まで解析す ることができる。このように、添加される各ＤＮＡについてそれが特定の株に由 来するという信頼限界を得ることができる。たとえば、３×１０６２に１回の信 頼度で誤って同一であるとされるような場合、贋のタグの製造者が２つの正確な シグナルＤＮＡを用いてタグを作成するチャンスは９Ｘ　１０１２４である。

また別の場合にはシグナル化合物がタフパフ質であってもよい。ここで本発明は いろいろなタンパク質のアミノ酸配列の変化とそのような配列を認識する能力と によっている。たとえば抗原−抗体システムを使用してもよい。シグナル化合物 が抗原として機能する場合、シグナル配列は抗体によって認識される抗原決定基 である。シグナル化合物が抗体として機能する場合、シグナル配列はこの抗体の 中で対応する抗原に結合する際に媒介となる配列である。抗原分子と抗体分子の 双方がイムノグロブリンであるイディオタイプ−抗−イディオタイプシステムを 使用してもよい。一方のイムノグロブリンが他方の抗原結合部位に対する結合特 異性を有している。

抗体−抗原システムは以下のようにして用いることができる。

一連の異なるハブテンのような、交差反応しない各種の異なる抗原で動物群を免 疫して抗体を製造する。その動物から血清を収集し、個々の抗原に対して生起し た抗体を精製する。次にこの抗体を、硝酸セルロースまたはナイロンベースの基 材たとえばＨｙｂｏｎｄ　ＤやｈｙｂｏｎｄＮのような適切な基材上に固定化す る。抗り上げる。次いでこの結合用の膜の非特異的結合特性をブロックする。こ の膜を乾燥し、プラスチックの下に密封し、真偽を立証したい品物または物質に つなぐ。解読するには、特異的な抗原またはハブテンをタグに塗布する。適当な 検出系を用いて結合を検出する。

本発明によって提供される安全性は、シグナル化合物が秘密に保たれる特定の暗 号系に依存する。あらかじめ決定した所定のシグナル化合物を標識に使用するが 、その同一性（種類）は公表しない。どのシグナル化合物が使用されているかが 肉眼の検査では明らかにならないようにして品物と物質を標識する。

しかし、製造業者は、贋物が容易に同定されるように自分の製品を安全に標識し たいならば、それが本発明に従って標識されていることを公表するかあるいはこ の事実を開示しないで目的を達成することができる。

前者の場合、製造業者は広告によって、本物の製品がすべてシグナル化合物で、 たとえばタグの形態で保護されていることを宣言することができる。このタグは 、取外しのできる目立つラベルを形成していてもよい。ただしこのラベル上には 、なんらかの所望の印刷した情報、とくに製造業者の個々の独特のタグに対する バッチコード番号が出現するようになっている。製品を病人した消費者はこのタ グを調査分析させるために郵送することができる。したがって偽って印刷された タグは容易に同定することができる。

後者の場合製造業者はタグの存在を公表することなく秘密裡にそのタグを自分の 製品に付ければよい。製造業者の代理人が通常の消費者を装って小売店から製品 をサンプリングすることによって、このタグの製造者は贋物の製品が出現してい るか否かを発見することが可能になる。

どちらの道を採用したとしても各々のタグはユニークであり得、かついろいろな シグナル化合物を有し得る。あるいは、同じシグナル化合物をもった１群のタグ を使用してもよい。シグナルＤＮＡを使用する場合、すでに記載したどちらのレ ベルでも作動するようにタグを設計することができる。

以下の実施例で本発明を例示する。

実ＪＬｆＬ−ユニａｃｏｂａｉ　ａ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＢＴＬＳｌは１４０−Ａ− ８６１０２１０１に記載されている。これは、１９８５年９月２５日、ｔｈｅ　 Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ０ＩｌｅＣｔｉＯｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　（現 在はａｎｄ　Ｍａｒｉｎｓ）　Ｂａｃｔｅｒｉｓａ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ。

（英国）に受託番号ＮＣＩＢ　１２１５６として寄託されている。−０−Ａ−８ ６１０２１０１に記載されているようにしてＢＴＬＳｌからゲノムＤＮＡを得た 。このゲノムＤＮＡを１００°で５分間加熱して変性した。

Ｈｙｂｏｎｄ　ＣまたはＮのタグの材料上にＤＮＡを付着させるためにこのタグ の反対側から変性ＤＮＡの溶液の試料を塗布した。

タグは次いで３１℃で３０分間乾燥した。次に、８０℃で４時間までベーキング することにより、またはタグを３０分間紫外光（３０４ｎｍ）に露出することに より、変性ＤＮＡをタグに共有結合させた。

いくつかのタグは、可撓性で透明なＰ　Ｖ　Ｃ（ＩＣＩ　ｐｌｃ）かサランラッ プ（ｎｏｗ　ＣｏｒｎｔｎＱ）で覆うことにより保護した。また、綿織物とナイ ロン織物（シャツ）も変性ＤＮＡで標識した。各織物に変性ＤＮＡの溶液を１０ ０ρずつ加えた後空気中で乾燥した。

５ｎｇから５Ｉ！ｇの旦のＤＮＡをタグと織物に塗布した。

その後、プラスチックフィルムが付いていたタグからそのフィルムを除去した。

５１１９７ｄ未満のエチジウムブロマイドの溶液でこのタグを染色した。紫外線 を照射（３０４ｎ１１）すると赤橙色のケイ光が観察された。これは、エチジウ ムブロマイドがＤＮＡに結合したことを意味している。類似のやり方でシャツの 綿織物とナイロン織物のＤＮＡが塗布されている領域をエチジウムブロマイド溶 液で染色した。やはりケイ光が観察され、ＤＮＡの存在が明らかになった。

１．１．微生物のＤＮＡ源を選択する。

１．２．標準的な手法によってゲノムＤＮＡを調製・精製して純粋な高分子間の ＤＮＡを得る。

１．３．ＤＮＡを制限酵素（たとえば５ａＵ３Ａ）で消化してプローブ用の特異 的配列を選択し、１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡをサイズ分画し、こ れから、便利なサイズの断片を電気溶出し［ＨＣＤＯｎｎｅｌ　＋４．Ｗ、ら（ １９７７）　Ｊ、　Ｈｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、。

ユ１１９参照］、適したプラスミドベクター中ヘクローン化することができる。

これらのクローンは次に、Ｋａｆａｔｏｓ　Ｃ，ら（１９７９）　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７．１５４１の急速な「ドツトプロット 」法のようなテストを用いて他のＤＮＡ源との相同性を試験することができる。

この方法に従うと、所望のＤＮＡｌ１ｔと特異的にハイブリダイズする配列を選 択することが可能になる。

別法として、このようなプローブはＬａ１ａｒ　Ｅ、Ｅ、およびｐａ＋ｍｅｒＥ 、（１９８４）　Ｃｅ１ｌ、　３７　、１７１−１７７の欠失富化技術のような 富化技術を用いて同定することができ、こうすると労力が大幅に軽減される。

１．４．適切なプローブを選択した後、標準的なプラスミド調製技術を用いてシ グナルＤＮＡを大ａに調製し、抽出・精製して高分子量のＤＮＡを得る。

１．５．シグナルＤＮＡはいずれも、所望であればＢｕｔｌｅｒＥ、Ｔ、　＆　 Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ　Ｈ，Ｈ，（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、、２５７．５７７２が記載しているＳＰ系列のベクターを使用することにより 、一本領のＲＮＡＩ導体に変換することができる。この誘導体は一本鎖のＤＮＡ よりも迅速にＤＮＡとハイブリダイズし、しかも制限酵素で切断することができ ない。

２、タグの製造 ２．１．タグマトリックス上のドツトの各々に対して、タグ股上の選択された部 位にそれぞれ選択した起源のシグナルＤＮＡ５〜１０ｑ　（または任意の充分量 ）を塗布する。ＤＮＡを変性し、これを膜たとえばＨｙｂｏｎｄ　ＤまたはＨｙ ｂｏｎｄ　Ｎに共有結合させる。

２．２．この膜を乾燥し、密封する。

３、又又二亙１ ３．１０問題にしている物品に対して調製したタグの本質的な特徴を記録するデ ータバンクを参照する。タグの上に印刷されている数を使用して、どんなりＮＡ が使用されたか、およびシグナルドツトマトリックス上にどのようにＤＮＡを分 布させたかを確認することができる。適当なプローブの混合物またはひとつのプ ローブを一時に使用して、本物のＤＮＡが塗布されているであろう回収されたタ グ上の部位に対するこれらのプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって タグの真偽を証明に詣 １、迷路ＤＮＡの“告 １．１．微生物のＤＮＡ源を選択する。

１．２．生体を成長させてＤＮＡを得る。

１．３．ＤＮＡを抽出し、標準的な手法によって￥ａ製して高分子間のＤＮＡを 得る。

１．４．ＤＮＡを超音波処理して、選択したシグナルＤＮＡの分子量に等しい平 均分子量を有する分子の１団を得る。

１．５．膜を乾燥し、密封する。

２、シ　ナルＤＮＡの ２．１．微生物のＤＮＡ源を選択する。これらは迷路ＤＮＡの起源と同じであっ ても同じでなくてもよい。

２．２．標準的な手法によってゲノムＤＮＡを調製・精製して純粋な高分子量の ＤＮＡを得る。

２．３．ＤＮＡを制限酵素（たとえば５ａＬＩ３Ａ）で消化してプローブ用の特 異的配列を選択し、１％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡをサイズ分画し、 これから、便利なサイズの断片を電気溶出し［ＨｃＤｏｎｎｅｌ　ＨＪ、ら（１ ９７７）　Ｊ、’　Ｈｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、。

旦１１９参照］、適したプラスミドベクター中ヘクローン化することができる。

これらのクローンは次に、Ｋａｆａｔｏｓ　Ｃ，ら（１９７９）　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｌ１５４１の急速な「ドツトプロット」 法のようなテストを用いて他のＤＮＡ１ｌｉ！との相同性を試験することができ る。この方法に従うと、所望のＤＮＡ源と特異的にハイブリダイズする配列を選 択することが可能になる。

別法として、このようなプローブはＬａｍａｒ　Ｅ、Ｅ、およびＰａｌｍｅｒＥ 、（１９８４）　Ｃｅ１ｌ、　３７　、１７１−１７７の欠失富化技術のような 富化技術を用いて同定することができ、こうすると労力が大幅に軽減される。

２．４、適切なプローブを選択した後、標準的なプラスミド調製技術を用いてシ グナルＤＮＡを大量に調製する。同種の迷路ＤＮＡかまたは異種の迷路ＤＮＡに 添加するのにシグナルＤＮＡが必要な場合、このシグナルＤＮＡはさらに精製し なければならない。すなわち、適当な制限酵素を用いて特異的シグナル配列を切 除した後、標準的な手法により残留するプローブＤＮＡからシグナルＤＮＡを分 離する。このような精製シグナルＤＮＡはその後向等な平均分子量の洗練された 迷路ＤＮＡに添加できる。

２．５．シグナルＤＮＡはいずれも、所望であればＢｕｔｌｅｒＥ、Ｔ、　＆　 Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ　Ｈ，Ｈ，（１９８２）　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ 、、２５７．５７７２が記載しているＳＰ系列のベクターを使用することにより 、−末鎖のＲＮＡ誘導体に変換することができる。この誘導体は一本鎖のＤＮＡ よりも迅速にＤＮＡとハイブリダイズし、しかも制限酵素で切断することができ ない。

３、タグの製造 ３．１．シグナルＤＮＡを迷路ＤＮＡと混合して、迷路ＤＮＡの各単位に対して ４０〜１００コピーの個々のシグナルＤＮＡ単位を得る。タグマトリックス上の ドツトの各々に対して、タグ膜上の選択された部位にＤＮＡの混合物５０〜１１ ００ｎ　（または任意の充分量）を塗布する。ＤＮＡを変性し、これを膜、たと えばＨｙｂｏｎｄ　ＤまたはＨｙｂｏｎｄ　Ｎに共有結合すｔｉル。

３．２．この膜を乾燥し、密封する。

４、タグの解読 ４．１１問題にしている物品に対して調製したタグの本質的な特徴を記録するデ ータバンクを参照する。タグの上に印刷されている数を使用して、どんなりＮＡ が使用されたが、およびシグナルドツトマトリックス上にどのようにＤＮＡを分 布させたかを確認することができる。その後適当なプローブの混合物またはひと つのプローブを一時に使用して、本物のＤＮＡが塗布されているであろう回収さ れたタグ上の部位に対するこれらのプローブの特異的ハイブリダイゼーションに よってタグの真偽を証明する。

Ｌａｃｔｏｂｅｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ＢＴＬＳｌのゲノムＤＮＡ から４種のプローブを製造した。これらのプローブはｐＢＴＬ８、ｐＢＴＬ２３ 、ｐＢＴＬ２９および１）ＢＴＬ３０であった。これらのプローブの製造はＮｏ −Ａ−８６１０２１０１に記載されている。そこに記載されているようにしてこ れらのプローブを標識した。これらのプローブを、迅速なｒドツトプロット」法 により他の起源のＤＮＡとの相同性について試験した。特にＮｏ−Ａ−８６１０ ２１０１に記載されているようにして使用した高緊縮条件下で試験した属または 種のいずれに由来するＤＮＡとも有意にハイブリダイズしたものはなかった。こ れら試験した他のＤＮＡがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍに 由来しないＤＮＡとハイブリダイズすることを疑う理由はない。したがって、こ れらの４種のプローブは所与の種に独特のものであり、これら４種はいずれもり 、　ｐｌａｎｔａｒｕｌｌｌＤ　Ｎ　Ａを検出するのに使用することができるで あろう。さらに解析したところ、実際にはプローブｐＢＴＬ２９だけがり、　ｐ ｌａｎｔａｒｕｍのＤＮＡと顕著にハイブリダイズすることが示された。

Ｌ、　ｐｌａｎｔａｒｕｌｌｌＢＴＬＳｌのゲノムＤＮＡを、実施例１に記載さ れているようにしてＨｙｂｏｎｄ　ＣのタグまたはｔｌＶｂｏｎｄ　Ｈのタグに 共有結合した。実流例１に記載されているプラスチックフィルムで密封したタグ を実施例１に記載されているようにして製造した。

その後タグを密封しているプラスチックフィルムを除いて各タグの分析ができる ようにした。

これらのプローブを使用してり、　ｐｌａｎｔａｒｕｍのシグナルＤＮＡの存在 を検出するために、これらのプローブを、［３５Ｓ］−ｄＣＴＰ　（デオキシシ チジン５’−（Ｘ　［３５Ｓ　］−チオトリホスフェート）またはＲｅ１ｌＺテ ラベルしたプローブ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１２． 　３４３５−３４４４４．１９８４）　、すなわち酵素の西洋ワサビペルオキシ ダーゼに結合したプローブのどちらかで標識した。

ヒートシールしたポリエチレンバッグ（Ｐｉｆｃｏ　Ｌｔｄ、）中、２゜１１９ ／ｄｉの変性したニシン精子Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、　）を含有するブレハイブリダイゼーションバッフｙ　−［６ｘ　ｓｓｃ； 　５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’Ｓ溶液−０，１％（ＩＩ／Ｖ）−Ｊｉｃｏｌｌ−４０ ０，０，１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（１４／　Ｖ）ＳＤＳＩ 中でタグを３時間洗浄した。

新しいプレハイブリダイゼーションバッファー中６５℃でハイブリダイゼーショ ンを実施し、標識されたＤＮＡプローブを変性した後に最終濃度１０〜４０ｎＣ Ｉ／　ｄで加えた。ハイブリダイゼーション反応液を含有するシールしたポリエ チレンバッグを６５℃で１６時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション の後、フィルターヲ６５℃（１）　２ｘＳＳＣ中テ１５分スつ二回、６５℃（７ ）　２ｘ　ｓｓｃ。

０．１％（Ｗ／　Ｖ）ＳＯ３中テ３０分カケチー回、最後ニ６５℃（７）　ｏ、 １ｘＳＳＣまたはＩＸ　ＳＳＣである緊縮洗浄液中で１０分間洗浄した。次に、 　ｌ１ｈａｔ■ａｎ　３８Ｈクロマトグラフイーペーパーを用いてフィルターを プロット乾燥した。

Ｎｏ−Ａ−８６１０２１０１に記載されているようにしてオートラジオグラフィ ーか、または比色酵素反応（Ｒｅｎｚら）によって、同種のシグナルＤＮＡの存 在を検出した。前者の方法では、タグ上の同種シグナルＤＮＡの位置はＸ線フィ ルム上に暗いスポットとして現われた。同種でないＤＮＡの結合がない場合には スポットは検出゛されなかった。同様に、ＲｅｎＺの技術では、Ｌ−已且倶３二 」のシグナルＤＮＡおよびプローブＤＮＡのハイブリダイゼーションが存在する と、酵素反応の黒い生成物が析出した。

１．１．　ＷＯ−Ａ−８６１０２１０１に記載の手順に従ってすでに特異的に同 定されているＤＮＡを有するいくつかの微生物から、高分子量の二本鎖ＤＮＡを 調製する。

１．２．　２５０／／９までの選択したＤＮＡを、タグ股上の広さが約２５０ｒ ｎＩＡの定められた部位に塗布し、この膜からその後純粋な（ｉｎｔａｃｔ）Ｄ 　Ｎ　Ａを溶出した。

２、タグの解読（ｄｅｃｏｄ　ｉｎｇ　）２．１０問題にしている物品に対して 調製したタグの本質的な特徴を記録するデータバンクを参照する。印刷されてい る数を使用して、どんなシグナルＤＮＡが使用されたかを確認することができる 。本物のＤＮＡが塗布されているであろう回収されたタグ上の部位の電気溶出を 実施した後、誓０−＾−８６１０２１０１の方法に従って解析することによって 解析を進める。

国際調査報告 ｌｍ５ｍ５＋１ｅｎａｌ　Ａｅｅｌｌ。ｌ１６＊Ｎｖ　ＰＣＴ／ＧＢ　８７１０ ０２４２Ａ）ＩＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＦ、Ｅ　ＩＮＴＥＰ−ＮＡＴ：０ＮＡＬ　！： ＥＡＲＣＨＲＥ？ＯＲＴ　ＱＮＵＳ−Ａ−３８６１８８６２１１０１／７５　Ｎ ｏｎｅＵＳ−Ａ−４３９０４５２２８１０６／８３　ＮｏｎｅＵＳ−Ａ−３７７ ２２００１３／１１／７３　ＵＳ−Ａ−３８９７２８４２９１０７／７５ＵＳ− Ａ−４３６３９６５１４／１２／８２　Ｎｏｎｅ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．真偽を立証したい品物または物質の標識方法であって、所定の巨大分子の第 一化合物（シグナル化合物）を用いてこの第一化合物の正体を明らかにすること なく品物または物質を標識し、この第一の化合物には相補的な第二の化合物が結 合し得、その結果第一の化合物の存在を明らかにし、したがって品物または物質 が本物であることを立証できるようになっていることを特徴とする方法。
2. ２．シグナル化合物を直接品物もしくは物質中に組み込むか、シグナル化合物を 品物もしくは物質に付着せしめるか、シグナル化合物を含んでいる材料を品物も しくは物質に塗布適用するか、またはシグナル化合物を品物もしくは物質の内容 物中に含ませることによって、標識を達成する、請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．シグナル化合物が付着しているタグを用いて物品を標識する、請求の範囲１ に記載の方法。
4. ４．タグを、直接物品に取り付けるか、物品の構造の一部として物品中に直接組 み込むか、またはその他のやり方で物品に結合する、請求の範囲３に記載の方法 。
5. ５．巨大分子の形態にあるシグナル化合物を用いて品物または物質を標識する、 請求の範囲１に記載の方法。
6. ６．細菌もしくはカビ類の胞子の形態またはウィルスの形態にあるシグナル化合 物を用いて品物または物質を標識する、請求の範囲１に記載の方法。
7. ７．シグナル化合物が核酸である、請求の範囲１に記載の方法。
8. ８．核酸がＤＮＡである、請求の範囲７に記載の方法。
9. ９．ＤＮＡが、特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズし得る１個以上のシグナ ル配列を含んでいる、請求の範囲８に記載の方法。
10. １０．前記ＤＮＡを他のＤＮＡと混合する、請求の範囲８に記載の方法。
11. １１．ＤＮＡが、微生物のゲノムＤＮＡまたは制限エンドヌクレアーゼによるそ の部分消化物に由来するＤＮＡである、請求の範囲８に記載の方法。
12. １２．ＤＮＡがブラスミドの形態にある、請求の範囲８に記載の方法。
13. １３．ＤＮＡが合成ＤＮＡである、請求の範囲８に記載の方法。
14. １４．各々が別々の領域を占めている一連の異なるシグナル化合物を準備する、 請求の範囲１に記載の方法。
15. １５．一連の別々の領域の同一のシグナル化合物を準備する、請求の範囲１に記 載の方法。
16. １６．贅沢品、医薬およびその他の化学薬品、フィルムおよびレコード、銀行券 、美術工芸品、証書類ならびに機会および部品から選択された品物または物質を 標識する、請求の範囲１に記載の方法。
17. １７．その後品物または物質がシグナル化合物で標識されているかどうかを、第 一の化合物の存否を明らかにできるように相補的な第二の化合物を用いて決定し 、その結果品物または物質が本物であることを確かめることをさらに含んでいる 、請求の範囲１に記載の方法。
18. １８．品物または物質の真偽を決定するための方法であって、（ｉ）品物または 物質が所定の巨大分子の第一化合物（「シグナル化合物」）によって標識されて いるかどうかを、第一の化合物の存否を明らかにできるようにこの第一の化合物 に結合することができる相補的な第二の化合物を用いて決定し、その結果、 （ｉｉ）品物または物質が本物であることを決定することを特徴とする方法。
19. １９．シグナル化合物の存否を検出する、請求の範囲１８に記載の方法。
20. ２０．シグナル化合物に結合することができる標識された核酸プローブを、品物 または物質が本物である場合にシグナル化合物が占めている領域に接触させ、こ のプローブがこの領域で第一の化合物とハイブリダイズするかどうかを判定する 、請求の範囲１８に記載の方法。
21. ２１．プローブがＤＮＡプローブである、請求の範囲２０に記載の方法。
22. ２２．核酸の、品物または物質のラベルとしての用途。