JPS6353461A - ペプチドの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［ａ業上の利用分野］ 本発明はペプチドの測定法に関し、詳細には蛋白質の加
水分解によって生じるペプチドをＭｌ−な操作で迅速且
つ正確に測定できる様な酵素電極測定法に関するもので
ある。

［従来の技術］ 近年、食品加工技術の分野において、大豆蛋白質、乳蛋
白質、血液蛋白質、魚蛋白質等の各種蛋白質を蛋白質分
解酵素（プロテアーゼ）によって加水分解し、より利用
価値の高い所謂機能性蛋白質とする技術が種々試みられ
ている。この様な場合に、蛋白質の分解の程度を知る方
法として、分解によって生じるペプチドを測定する技術
が必要となる。又この様な技術は、醤油や味噌等の醸造
食品における熟成度を知る上でも有用である。

蛋白質の分解によって生じるアミノ酸やペプチドを指標
とし、その含有率から原料蛋白質の加水分解率を測定す
る方法としては下記に列挙するものが知られている。

（ａ）蛋白質中における水可溶性窒素及び水不溶性窒素
をケルタール法で夫々測定し、全窒素含有量に対する水
可溶性窒素含有量の比を蛋白分解率とする方法。

（ｂ）水可溶性部分の蛋白質の濃度をフォーリン法で測
定し、蛋白分解率を推定する方法。

（ｃ）水可溶性部分の蛋白質濃度を、波長２８０ｎｍ又
は２ｔ４ｎｍにおける紫外線吸光度から測定し、蛋白分
解率を推定する方法。

（ｄ）水可溶性部分の蛋白質濃度を、クロマトグラフィ
分析による一定画分におけるペプチドの吸収ピークから
求め、蛋白分解率を推定する方法。

上記（ａ）〜（ｄ）の方法は、いずれも比較的低分子量
の水溶性蛋白濃度を測定し総蛋白質量に対する蛋白分解
率を推定する方法である。

或は上述した（ａ）〜（ｄ）の方法以外に電気的性質を
利用した方法として、ある特定の蛋白質、ペプチド及び
アミノ酸等を測定する電気泳動法も知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら上述した方法はいずれも分析操作が煩雑で
あり、蛋白分解率の測定に多大な時間を要するという欠
点があった。即ちこれらの方法では、測定結果を食品製
造プロセスにフィードバックして製品の品質管理に利用
することは極めて困難であった。

本発明はこの様な事情に鑑みてなされたものであって、
その目的とするところはペプチド量を筒車な操作で迅速
且つ正確に測定する方法を提供する点にある。

口問題点を解決する為の手段］ 上記目的を達成し得た本発明とは、蛋白質の加水分解物
にペプチダーゼを作用させて生じるアミノ酸混合物にア
ミノ酸分解酵素を作用させ、酵素反応の結果生じた過酸
化水素又はアンモニアに対応する酸化還元電流又は電位
変化、或は前記酵素反応によって消費される酸素濃度に
対応する酸化還元電流を検出する点に要旨を有するもの
である。

［作用コ 本発明は上述の如く構成されるが、要は一連の酵素反応
の結果生じる過酸化水素、アンモニア或は酵素反応で消
費される酸素４度に対応する酸化還元電流又は電位変化
を検出するといった構成を採用し、ペプチド存在量を電
気的変化量として検出する様にしたもので、ペプチド量
従って蛋白質分解率を迅速且つ正確に測定することがで
きる。

本発明方法の原理を順を追って説明する。

本発明で対象とする蛋白質は、上述した趣旨から明らか
であるが、蛋白質分解酵素によって部分的に加水分解さ
れたものである。この蛋白質（加水分解物）中には、ア
ミノ酸にまで分解されたもの、或はペプチドの状態にま
で分解されたもの等を含んでいる。これは上記蛋白質分
解酵素が蛋白質の特異的結合だけを速やかに切断すると
いった特異性を有しているからである。

本発明は、対象とする蛋白質中に含まれるペプチド量を
測定するものである。尚対象とする蛋白質試料中には上
述した様にペプチドの他にアミン酸も含まれているが、
このアミノ酸量は一般的にはほぼ無視できる程度の微量
である。従って後述する一連の操作によってペプチド量
を測定することができるのであるが、場合によっては無
視できない程度の多量のアミノ酸を含んでいることもあ
り得る。即ちペプチド量の測定は、後述する様にペプチ
ドが分解して生じるアミノ酸量から得られるものであり
、最初からアミノ酸を多量に含んでいる場合はペプチド
の測定に影響を及ぼすからである。この様な場合には後
述する方法で、最初から含まれているアミノ酸量をも同
時に測定して補正する必要がある。

蛋白質の加水分解物にペプチダーゼを作用させると、上
記加水分解物中に含まれるペプチドはペプチダーゼの作
用によってアミノ酸まで分解される。尚遊離するアミノ
酸は、天然に存在する蛋白質が分解して生じたものであ
るのでその大部分かＬ型アミノ酸である。！０ち、生体
内に存在するアミノ酸としてはＬ型、Ｄ型の双方の型が
あるが、天然の蛋白質中に存在するアミノ酸はその大部
分がＬ型アミノ酸である。遊離したアミノ酸は更にアミ
ノ酸分解酵素の作用によって分解されペプチド濃度に比
例した過酸化水素（Ｈ２０２）を生成する。このときの
反応機構は下記（１）式の如く表わされる。

Ｒ−ｃＨ−ｃｏ；＋０２＋Ｈ２０ ＮＨ３ ↓ 口 Ｒ−Ｃ−ｃｏ；　＋ＮＨ：　　＋Ｈ，Ｏ□　　・　（１
）上記の反応によって生成するＨ２Ｏ２をポーラログラ
フ電極で還元すると、Ｈ２Ｏ２濃度に比例した電極電流
（酸化還元電流）が発生する。そして既知濃度のペプチ
ド標準液の電極電流を測定して予め検量線を作成してお
き、この検量線と得られた電極電流とを比較することに
よって対象蛋白質中に含まれるペプチド量を測定するこ
とができる。

尚本発明において電気的変化量を求める方法は過酸化水
素による方法に限定されるものではない。例えば上記の
反応によって生じるアンモニア（ＮＨ３）によっても求
めることができる。

或は酵素反応によって消費される酸素濃度に対応して酸
化還元電流を検出する構成を採用してもよい。

本発明における効果を更に有効に達成する為には下記に
示す２つの実施態様を提案することができる。即ち、（
Ａ）ペプチダーゼ及びアミノ酸分解酵素として、担体に
固定化された固定化酵素を使用すること、及び（Ｂ）第
１及び第２の電極を有し、第１の電極の近傍ペプチダー
ゼ及びアミノ酸分解酵素の固定化酵素を配置し、第２の
電極の近傍にアミノ酸分解酵素の固定化酵素を配置して
酸化還元電流又は電位変化を検出すること等である。

上記（Ａ）による効果としては、使用する２種の酵素を
固定化酵素とすることによって、対象蛋白質中に含まれ
る有色物質や共存物質の影響を受けることなく、簡便且
つ精度よく短時間にペプチドを測定できると共に長時間
に亘る安定した測定が可能となる。

父上記（Ｂ）による効果としては最初からアミノ酸を多
量に含んだ蛋白質中のペプチドだけを測定する場合に特
に有効である。即ち前第１の電極の近傍にペプチダーゼ
及びアミノ酸分解酵素の固定化酵素を配置することによ
って本発明に従う一連の酵素反応を進行させると共に、
Ｓ２の電極の近傍にアミノ酸分解酵素の固定化酵素を配
置することによって最初から含まれるアミノ酸を測定し
、両者の差によって補正する。この様に補正することに
よって、対象蛋白質に最初から含まれているアミノ酸に
よる影響を受けることなくペプチド量を正確に測定する
ことができる。

本発明で用いられるペプチダーゼは、基質のペプチドに
作用してアミノ酸をａｌｌＪさせるものであれば良く、
特にその超厚は限定されるものではない。該ペプチダー
ゼとしては、例えばロイシンアミノペプチダーゼ、シス
チルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダ
ーゼ、アスパルテートアミノペプチダーゼ、アミノペプ
チダーゼＰ、ペプチダーゼａ５アラニンアミノペプチダ
ーゼ及びその他の各種アミノ酸ジペプチダーゼ等のアミ
ノペプチダーゼや、セリンカルボキシペプチダーゼ、グ
リシンカルボキシペプチダーゼ、チロシンカルボキシペ
プチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペ
プチダーゼＢ、アルギニンカルボキシペプチダーゼ、グ
リシンカルボキシペプチダーゼ、アスパルテートカルボ
キシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、
キモトリプシン、キモトリプシンＣ１トリプシン等のカ
ルボキシペプチダーゼ等を挙げることができる。また使
用するアミノ酸分解酵素としては、例えばＬ−アミノ酸
オキシダーゼ、Ｌ−グルタメートオキシダーゼ、Ｌ−リ
ジンオキシダーゼ、メチオニンアンモニアリアーゼ、Ｌ
−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、Ｌ−アルギニ
ンデカルボキシラーゼ、し−リジンデカルボキシラーゼ
、し−チロシンデカルボキシラーゼ、グルタミナーゼ、
アスパラギナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ等を
挙げることができ、必要によってこれらの酵素を二種以
上併用したり、或はこれらの酵素を生成する微生物やオ
ルガネラ（細胞小器管）等を使用しても良い。

酵素（又は微生物等）の固定化には、通常知られている
方法がすべて採用でき、何ら限定するものではない。例
えば架Ｉｎ法や共有結合法等の化学結合法では、酵素や
担体に含まれるアミノ基、水酸基、カルボキシル基等の
官能基をグルタルアルデヒドやヘキサメチレンジイソシ
アネート等の架橋剤を介して酵素が固定化できる。また
ジアゾカップリング法、臭化シアン活性化法、トリアジ
ニル話導体法、ハロゲノアセチル誘導体法、酸アジド誘
導体法、若しくはカルボキシクロリド誘導体法を利用し
ても、酵素を固定化することが可能である。更に包括法
では、包括マトリックスとしてポリアクリルアミド、ポ
リビニルアルコール、ポリヒドロキシエチルアクリレー
ト又は各種の光硬化型感光性樹脂の様な合成高分子やキ
トサン、ゼラチン、カラギーナン等の天然高分子を用い
て酵素等を固定化することが可能である。

固定化ＯＮ素の形状としては、（ａ）酵素電極を構成す
るときに一体化できること、（ｂ）妨害物質を透過せず
に基質や；極検知物質のみを透過させることができる等
を考慮すると、膜状であるのが最適である。しかしなが
ら場合によっては繊維状、粒状担体を用い、バイオリア
クター型カラムとして用いることも可能であり、適宜決
定すればよい。

本発明で用いられる電極としては、例えば白金（ｐＢア
ノード及び鉗（Ａ　ｇ　）カソードからなるポーラログ
ラフ電極、及び炭酸ガス電極並びにアンモニウムイオン
電極等を挙げることができる。また実際の電流測定装首
の構成は何ら３艮定されるものではなく、固定化酵素の
反応をカラムを用いて行なった後検知物質を電極によっ
て電気的に測定するりアクタ一方式、或は固定化酵素を
膜状として電極と一体化した酵素電極方式等を挙げるこ
とができる。

［実施例コ 以下実施例によって本発明を更に詳細に説明する。

亙直■ユ 厚さ４．５μｍのアセチルセルロース系非対称構造膜の
多孔質層を、γ−アミノプロピルトリエトキシシラン０
．１＋＋ｌ、酢酸０．０３　ｍＩｌ及び蒸留水ｌｌｌ１
ｆｌからなる溶液に浸漬し、室温で３０分風乾してから
９５℃で６０分間熱処理した。次に０．Ｉ　Ｎ水酸化ナ
トリウム溶液に１０分間浸漬し、蒸留水で十分洗浄した
。

得られたアミノ化アセチルセルロース膜を５％グルタル
アルデヒド水溶液に浸漬し、室温で１０分間処理して膜
面にアルデヒド基を導入した。アルデヒド基を導入した
アセチルセルロース非対称構造膜の多孔質面６０　ｃｍ
２に、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＥＣ，３，４，１
１，２，８，４１Ｕ／ｍｇ　）　５　ｍｇ、　　Ｌ−ア
ミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ，１、４，３，２，０，１３
１［１／ｍｇ　）　５ｍｇ、牛血清アルブミン２０ｍｇ
、０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）１５０μｍ及び
４％グルタルアルデヒド水溶液５０μλからなる酵素溶
液を均一に流延し、４℃で３０分間反応させた。

次に１Ｍグリシン溶液で反応を停止させた後、０．０５
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）で十分洗浄を繰返した。そ
して固定化酵素が汚染されるのを防止する為に、孔径０
４０５μｍの多孔性ポリカーボネート膜をラミネートし
た後、４℃で風乾し、固定化酵素膜Ｉを得た。

得られた固定化酵素膜■におけるロイシンアミノペプチ
ダーゼ及びＬ−アミノ酸オキシダーゼの活性を調べたと
ころ、Ｌ−ロイシル−ｐ−ジエチルアミノアニリド及び
Ｌ−ロイシンを基質としたときに、夫々０．２４ｒ　Ｕ
　７ｃｍ２．０．０！８　　Ｉ　Ｕ　／ｃｍ’であった
。

前記固定化酵素膜Ｉを得た平頭と全く同様にして、Ｌ−
アミノ酸オキシダーゼ単独の固定化酵素ｓ　Ｉ　　（０
，０３４１Ｕ　／　Ｃｍ２）を得た。

次にＰｔ−アノード及びＡｇ−力ソードからなる過酸化
水素検知型ポーラログラフ電極を阜備し、第１の電極近
傍に前記固定化酵素膜■（以下ペプチドセンサーと呼ぶ
）を、第２の電極近傍に前記固定化酵素膜１１　（以下
アミノ酸センサーと呼ぶ）を夫々配置した。

更に上記各センサーをフローシステム分析計に装着し、
０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，０，、３７℃）を用
い、緩衝液フロー速度２．０ｍ４／分、サンプル景１０
μλの条件で、Ｌ−ロイシルグリシルグリシン及びＬ−
ロイシンに対する応答性を調査した。

ペプチドセンサーのし一ロイシルグリシルグリシンに対
する応答曲線を第１図に、アミノ酸センサーのし一ロイ
シンに対する応答曲線を第２図に夫々示した。尚第１，
２図において（１）〜（６）で示した部分は、濃度が夫
々（１）　０．１　、　　（２）　０．２　。

（３）　　０．３　、　　（４）　　０．４　、　　（
５）　０．５　、　　（６）　　１．０　　（ミリｍｏ
ｌ／ｆＬ）であることを示している。第１゜２図の結果
から明らかであるが、夫々の基質濃度はＯ〜１．ｏｍＭ
の範囲でセンサー出力との間に良好な直線関係があるこ
とが理解される。

また下記第１表には、各センサーのジペプチド及びオリ
ゴペプチドに対する出力をＬ−ロイシンに対する相対出
力として示した。尚第１表中、Ｌ　ｅｕ、　Ｇ　ｌｙ、
　Ｐ　ｈｅ及びＴｙｒは夫々、ロイシン、グリシン、フ
ェニルアラニン及びチロシンを示している。

第１表 第１表の結果によると、アミノ酸センサーはアミノ酸以
外には応答せず、ペプチドセンサーはＬ−ロイシンの様
なアミノ酸の他にジペプチド及びトリペプチド等のオリ
ゴペプチドにも反応していることを示している。これは
本発明方法がペプチドの測定に正確な結果をもたらすも
のであることを示している。

実施例２ 乳カゼイン５ｇを０．Ｉ　Ｎ燐酸溶液３５ｍｆｔに溶解
し、８０℃で１０分間加温した。室温にまで冷却後、０
．Ｉ　Ｎ＊酸化ナトリウムによってｐＨ７，０に調整し
、蒸留水を加えて全量を１００ｍＪ２とした。この様に
調整した５％カゼイン溶液４部に対し、プロテアーゼ−
ＣＥ（天野製薬株式会社製）を０．３１．３，６２．５
，１２５，２５０Ｕ／ｄｕとなる様に各酵素液の一部を
添加し、４０℃で３０分間反応させカゼインを加水分解
した。反応後、８０℃で１０分間加熱し、プロテアーゼ
を失活させた。加水分解させたカゼイン溶液に酢酸を加
えて酸沈泗させた後、上澄中の可溶性蛋白のＮ量をケル
ゾール法で測定し、カゼインの全Ｎ２ｔに対する比率を
蛋白分解率とした。このときに得られた分解率は夫々コ
ントロール、１２，３．２１，４．３４．８．４６．８
％であった。

上記５種類の加水分解カゼイン溶液について、実施例１
で示したペプチドセンサーによる応答曲線を調査した。

この結果は第３図に示す。尚第３図に示した結果は、Ｌ
−ロイシルグリシルグリシン又はＬ−ロイシンをオ票準
ン夜としたものであり、図中（１）は０．５　ミリｍａ
ｉｌ／１のＬ−ロイシルグリシルグリシン標準液による
応答曲線を示し、（２）〜（６）は上記各分解率のカゼ
イン溶液の応答曲線を示している。

この第３図で得られたペプチドの見かけの濃度と分解率
との関係を調査すると第４図に示す結果が得られた。

第４図の結果からも明らかであるが、カゼイン中のペプ
チド量は分解率に伴なって顕著に増加し、両者の間には
良好な比例関係が認められる。

従って本発明方法によるペプチドの測定法は、ケルゾー
ル法に匹敵する程の正確さで蛋白質の分解率を測定でき
るものであり、ペプチドの測定法として極めて有用な技
術である。

更に本発明者らは、本発明に係る各センサーの測定耐久
性についても調査した。即ち各センサーのし一ロイシル
グリシルグリシン及びし−ロイシンに対する初期出力を
１００％とし、経過日数による相対出力（％）の変化を
調査した。尚条件は０．０５Ｍ燐酸緩１對ン夜を用い、
ｐＨ７，０，３７℃にて行なった。その結果は第５図に
示すが、経過４０日後においても１０５％（ベフ゛チド
センサー）、１４１％（アミノ酸センサー）を保持した
。

［発明の効果コ 以上述べた如く本発明によれば、既述の構成を採用する
ことによってペプチド１を簡単な操作で迅速且つ正確に
測定できる様になった。

【図面の簡単な説明】

第１図はペプチドセンサーのし一つイシルグリシルグリ
シンに対する応答曲線、第２図はアミノ酸センサーのし
一ロイシンに対する応答曲線、第３図は実施例２で用い
た各種カゼイン溶液に対するペプチドセンサーの応答曲
線、第４図はカゼイン溶液中のペプチド及びアミノ酸に
関する本発明方法による測定濃度とケルゾール法による
分解率との関係を示すグラフ、第５図は各センサーにお
ける経過日数よる相対出力（％）の変化を示すグラフで
ある。 第１図 ｏ　　　　　　１０　　　　　２０　　　　　３０　　
　　　４’。 時　４間　（分） 第２図 時間（分） 第３図 時間（分）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛋白質の加水分解物にペプチダーゼを作用させて
   生じるアミノ酸混合物にアミノ酸分解酵素を作用させ、
   酵素反応の結果生じた過酸化水素又はアンモニアに対応
   する酸化還元電流又は電位変化、或は前記酵素反応によ
   って消費される酸素濃度に対応する酸化還元電流を検出
   することを特徴とするペプチドの測定法。
2. （２）前記ペプチダーゼ及びアミノ酸分解酵素として、
   担体に固定化された固定化酵素を使用する特許請求の範
   囲第１項に記載の測定法。
3. （３）第１及び第２の電極を有し、前記第１の電極の近
   傍にペプチダーゼ及びアミノ酸分解酵素の固定化酵素を
   配置し、第２の電極の近傍にアミノ酸分解酵素の固定化
   酵素を配置して酸化還元電流又は電位変化を検出する特
   許請求の範囲第１項又は２項に記載の測定法。