JPS6356284A

JPS6356284A - ハエドクソウの大量培養法

Info

Publication number: JPS6356284A
Application number: JP62103734A
Authority: JP
Inventors: Michio Kawamura; 川村　道生; Kiyomi Yamazaki; 清美山崎
Original assignee: NOYAKU BIO TECHNOL KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI
Current assignee: NOYAKU BIO TECHNOL KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI
Priority date: 1986-04-28
Filing date: 1987-04-27
Publication date: 1988-03-10
Also published as: EP0244211A2; EP0244211A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は植物の組織培養法とくに？・工ｒクソワの組織
培養法に関する。

従来の技術ハエｒクンウ（Ｐｈｒｙｍａ　ｌ＊ｐｔｏｍｔａｃｈｙ
ａ　Ｌ、　）はハエ？クンウ科に属する高さ３０〜５０
（至）の多年草で、日本、東南アジア、アメリカ等の山
野の樹下に自生する。夏の頃、茎の頂端あるいは上部の
葉液から花軸を出し、花をつける。果実は１個の種子を
有している。晩秋ＶＣａ１子ができた後、地上部は枯死
するが、根は生きておシ、翌春の発芽にそなえて根幹部
に複数個の体眠芽が形成される。日本では古くから、根
に含まれている成分がハエを殺すのに用いられたが、ハ
エのＩ景かに１蚊、中成等の昆虫に対しても殺虫活性を
有することが知られている。呑口らは、ハエドクソウの
殺虫成分を単離して、これをハエドキサン人（Ｈａｅｄ
ｏｘａｎｓ　Ａ　）と８名した（日本農芸化学会西日本
支部合同大会講演要旨集、６２頁。

１９８３年）。着た、パターソンらは、ノ・エドクソウ
の根、茎、葉、花、実て殺虫成分が存在することを報告
したが、何が殺虫活性成分であるかを述べていない（Ｐ
ａｔｔ＠ｒｍｏｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｌ１ｏｙｄｉａ＋
Ｖｏ１．３８．　Ｎｏ、　５．　ｐ３９１−４０３．８
＊ｐｔ−Ｏｃｔ　１９７５）。

他方において、植物の組織培養法すなわち植物から無菌
的に組織片または細胞集団を取り出して、ガラス器内で
培養する方法（１ｎ　ｖｉｔｒ。

ｃｕｌ　ｔｕｒ・）は、均一な細胞集団を短時間に大量
に得ることができるので、たとえばイチゴ、ユリ、ベゴ
ニア、キャベツ、ブロッコリ、サイコ、ツバキ、ウリ等
の各種の植物の大計栽培に用いられティる〔たとえば、
Ｊ、　Ｒ５１ｎｅｒｔ　ｅｔ　’ＬＢ人ｐｐｌｉ＠ｄ　
　ａｎｄ　Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　　Ａｓｐｅｃｔｓ
　　ｏｆ　　ＰｌａｎｔＣ＠ｌｌ、　Ｔｉ５ｓｕｅ、　
ａｎｄ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　ｐ、３３４−
３５６、　（１９７７）；　Ｊ、　Ａ、　Ｓｉｍｍｏｎ
ｄａ　ｅｔ　ｍｌ、、　５ｃｉａｎｔｉ島）１ｏｒｔｉ
ｃｕｌｔｕｒａｓ、　、５−、　ｐ、１６１−１７０．
　（１９７６）；夏（ａｒｔｍａｎｎ　ａｔ　ｍｌ、、
　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ、　Ｐｒ１ｎ−
ｃｉｐｌａ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　３ｒｄ　Ｅ
ｄｉｔ、、　（１９７５）；　　特開昭５１−１２９８
８号；米国特許４３３８７４５号；特開昭６ｏ−２ｔｓ
３号；同６０−４７６７８号；同６１−５７２７号等〕
。

組織培養には各種の方法があり、振とう培養や照明下で
の培養も知られている。ムラシゲ・スクーグ氏培地、リ
ンスマイヤー・スクーグ氏培地、ホワイト氏培地、クツ
、ツブ氏液などの組織培養用の分収液体培地が広く用い
られている。

これらの培地は、所望により、カイネチン、ゼアチン、
ベンジルアデニンなどのサイトカイニン類、２．４−ジ
クロロフェノキシ酢酸、ナフタレン酢酸、インｒ−ル酢
酸などのオーキシン類、必要に応じてジベレリン、アブ
シリン酸などの生長ホルモン類などを程よく含有する。

しかし、ハエｒクソウの組織培養法は１だ知られていな
い。

本発明は、オーキシンおよびサイトカイニンの１種以上
の有効量を含有する培地を用いること罠より、ハエドク
ソウを大量に短期間に！ｆｌ織培養し得るという知見に
基いている。

本発明の目的は、ハエドクソウの組織培養法を提供する
ことにある・問題点を解決するための手段本発明によるハエドクンウの組織培養法は、オーキシン
およびサイトカイニンの１８１以上の有効量を含有する
培地を用いることを特徴としている。その際、オーキシ
ン０．００１〜５０　ｐｐｍ　４たはサイトカイニンｏ
、ｏｏｓ〜１５０　ｐｐｍを単独に、あるいはオーキシ
ン０．００１〜５０ｐｐｍとサイトカイニンｏ、ｏｏｓ
〜１５０　ｐｐｍとを含有する。

本発明の方法に用いられる培地は、公知の組織培養用培
地と同様に、植物の培養（必要な蔗糖などの炭水化物、
脂肪酸などの有機酸、エタノールなどのアルコールのよ
うな炭素源、無機゛または有機の窒紫源、無機塩を含有
し、さらに微量金属イオン、アミノ酸、ビタミンなどを
含有することもできる。通常、培地は炭素源約５〜１ｏ
ｏｙ／ｌＳ窒素源約０．１〜１０Ｖ）、無機成分的０．
００１〜１００ＯＮ９／ノ、ビタミンおよびアミノ酸を
各約０．０１〜３０！！Ｉ９／Ｊ含有する。

オーキシンは葉茎植物の伸長成長を誘導する２！ｌ質の
総称で、インゾール−３−酢酸と同様の生理作用を有し
ている。オーキシンは細胞膜の透過性の増大、細胞分裂
の促進、側芽成長抑制、不定根形促進、花芽形成促進な
どを引き起す。

一般にオーキシンは低濃度で促進的な、高濃度で阻害的
な効果をもたらす。しかし植物の種類や器官または組織
のちがいによってオーキシンの作用は異なるほか、生理
的年令のちがいによっても相違がある。

次にサイトカイニンはカイネチンと同様な生理作用を有
する化合物であり・かつ６−アミノプリンの６位のアミ
ノ基に通常、炭素数５の胃換基が結合した基本骨格をも
つ誘導体群の総称で、天然起源のサイトカイニンではぜ
アチンがよく知られている。サイトカイニンは、芽の伸
長、葉の生長促進作用を示すとともに老化阻止、アミノ
酸のＳ積、気孔開孔作用などを引き起す。

これら両ホルモンが、植物の分化制御に深くかかわって
いることが知られている。

培養は通常、温度２０〜３０℃で行なわねる。オーキシ
ンとして１−ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡという）で
たはインドール−３−酢酸（以下ＩＡＡという）を用い
、サイトカイニンとしてベンジルアデニン（以下ＢＡと
いう）を含有するムラシゲ・スクーグ氏培地（以下ＭＳ
培地という）を用いる場合を例として、本発明の方法を
次に説明するうその他の培地を用いる場合も下記によっ
て容易に理解することができる。

（Ｎ　組織培養用材料すなわち組織片またはｕＢ胞集団
の１ＭＪ製。

（リ　ろ子を常法により適当な培地で培養して発芽させ
、芽の頂部を無蕗的罠採取して本培養に供する。

（２）根の幹部から体眠芽を採取し、常法により休眠打
破を行ない、芽の頂部を無立的に散り出し、常法により
組織培養して、芽の頂部の発育が肉眼で認められた後、
本＠養に供する。

（３）　　所望により、植物の茎、葉オたは根の切片を
適当な培地で組織培養して、不定芽を形成させ、これを
その１着、オたは不定芽のみを採取して本培養罠供する
。

材料調製に組織培養用培地を用いた場合は、この培地に
オーキシンおよびサイトカイニンの１種以上を添加した
後、本培養を行なうことができる。

＜Ｂｌ　　本培養本発明者が行なった各種試験の結果、次のことがわかっ
た。

（１）　　ＭＳ培地（濃度／２、蔗糖３％含有、ｐＨ６
，２）に、たとえばオーキシン０．０１〜１５ｐｐｍお
よびサイトカイニンＱ、１　〜１５０　ｐｐｍの１１ｔ
！１以上を含む培地で温度２５℃で人工照明（照度２５
００ルツクス）下に培養すると、約３週間で腋芽の数が
約１０倍に増加する。

（２）次に１サイトカイニンの含有量を０．００５〜１
５　ｐｐｍ　Ｋ変えるほか、同様の条件で３〜４週間培
養すると、地上部の伸長生育が認められる。

（３）さらに、オーキシンおよびサイトカイニンの含有
量を、それぞれ、０．１７’−’２．５ｐＰｍおｏ、ｏ
ｏｓ〜５ｐｐｍＫ変えるほか、同様の条件で培養を続け
ると、根が生長して、得られる根の重量は植物体重量の
約１０％以上に達する。たとえば、生育した腋芽（０，
５±０．２１１）をと記の方法に准じて、液体培地（Ｍ
Ｓ培地、ｘｏＯＴＲｊ）を用いて、３０〜４０日間、温
度２５℃で培養した結果、得られた植物体全体の湿重量
（約２〜４Ｉｌ）の約３０〜４０’％に達する根部が得
られた。

（４）根、葉、茎の組織片を培養する培地に含有スるオ
ーキシンおよびサイトカイニンの実用的な濃度の例は次
表のとおりである。

第　　１　　表組繊片　　　　目的産物　　　　オーキシン（ｐｐｍ）
サイトヵイニ：ｙ　（ｐ　ｐｍ　）根　　　伸長した根
　　ｏ、ｏｏｓ〜ｓ　　　ｏ、ｏｏｓ〜　５根　　　生
育した茎葉　０，００１−０．５　０．０５　〜５０茎
　　　伸長した根　　ｏ、ｏｏｓ〜ｓ　　　　ｏ、ｏｏ
ｓ〜　５エ　　　生育した茎葉　ｏ、ｏｏｓ〜５　　　
０，０５　〜５０葉　　　伸長した根　　ｏ、ｏｏｓ〜
ｓ　　　ｏ、ｏｏｓ〜　Ｏ，Ｓ葉　　　生育した茎葉　
ｏ、ｏｏｓ〜５　　　０．０５　〜５０各試薬を単独で
用いる場合の濃度範囲はたとえばオーキシン０．００１
〜！！Ｏｐｐｍ、サイトカイニンｏ、ｏｏｓ〜１５０　
ＰＰ０Ｉとすることができる。

上記の培地に、たとえば３　ｐｐｍ以下のジベレリンを
加えると、さらに良い結果が得られる。液体培地の代わ
りに寒天培地を用いることもできる。

実用的なＭＳ培地の組成と培養条件の例は次のとおりで
ある口（ａ）　　腋芽生育用培地ＭＳ培−地濃度１／２゜蔗糖（３％）　、ＮＡＡ（１ｐ
ｐｍ　）およびＢム−（１０ｐｐｍ　）を含むＯｐＨ６
，０゜所望により寒天０．８俤を加える。

期間２０〜３０日。温度２５℃。

（ｂ）　　根部の伸長および生育用培地Ｍ８培地濃度ｌ
／ｉ０ｏ　ＮＨ４Ｎｏ、およびＥＤＴＡヲ含有セず、蔗
糖（１％）お！びＮＡＡ　（０，ｌｐｐｍ＞を含む。ｐ
Ｈ６，０゜所望によりＢＡＯ，ｉｐｐｍ以下を含む。期
間３０〜４０日。温度２５℃。

活性成分は根部に多く含まれている。大量の根部を得る
ために、次の培地を用いると、とくに有利であることが
わかった。

第　２　表（ＰＭ培地）ＫＮＯ３１９０Ｃ！ＩＣＩ　２・２Ｈ２０４，４Ｍｇ５Ｏ４・７　Ｈ２０３７ＫＨ２ＰＯ４１・７Ｆｓ８０４　・７Ｈ２０２，７８Ｈ３ＢＯｓ　　　　　　　　　　　０．６２ＭｎＳＯ４
・４Ｈ２００，２２３ＺｎＳＯ４・７ＨｘＯ０，０８６ＫＩ０．００８３Ｎａ２Ｍｏｏ＜・２ＨｚＯ０，００２５ＣｕＳＯ４・５
Ｈ２００，００２５Ｃｏａｌ　ｚ　・６Ｈ２００，０００２５チアミン−Ｍ
ＣＩ　　　　　　　　０．００４ミオ−イノシトール　
　　　　１ピリドキシン−ＨＣｌ　　　　　　０．０！５ニコチン
酸　　　　　　　　ｏ、ｏｏｓグリシン　　　　　　　
　　　０．００２（注）（１）　水を加えて全量１１と
する。ｐＨ６，０〜６．５゜（２）　　オーキシンｏ、ｏｉ　〜ｓｏ　ｐｐｍを含み
、所望によシサイトカイニン５０　ｐｐｍ以下（たとえ
ば５　ｐｐｍ以下）を含んでもよい。

（３）　　培地成分の濃度を、培養条件や植物の生理的
条件等によって、たとえば／２ｏから２０倍までの範囲
で変えることができる。

たとえば下記実施例４で用いられた培地の濃度は３倍で
あった。

本発明の方法において、たとえば、２０代以上の継代培
養を続けても、活性成分の量の減少は認められなかった
。

殺虫成分はたとえば茎葉部および根に存在している。野
生ハエ「クツ９根部、培讐ノ）工ｒクック根部および茎
葉部から、それぞれ、合口らの方法〔アグリカルチエラ
ル・バイオロジカル・ヶミストリイ（Ａｇｒ、Ｂｌｏｌ
、　Ｃｈｓｍ、）、　３６．１０１３゜（１９７２））
　Ｋ　ｆｌｈじて殺虫成分を単離した。得られた成分は
次表のとおり殺虫活性を有している。

第３表野生根部　　　　　粗品　　　０．０１４１′ｎＩ製　
　　０．００６組織培養根部　　　粗品　　　０．０１６（江）　イエ
バエ（雌）。局所施行法（深見ら編、農業実験法１．ｐ
、７３．　　ソフトサイエンス社、　１９８１年）Ｋよ
る。

野蚕植物の根部と組織培養により得られた根部とを、そ
れぞれ呑口らの方法で抽出分離した試料の成分含量は、
野生植物では殺虫活性を有しない成分が多く、組織培養
の場合の１０倍以上であった。また、組織培養されたも
のから分離された殺虫成分の量は野生植物からのものと
同勢以上である。

１庶Ｕ」ハエ−タックの種子１００個を１１０００ｐｐのジベレ
リンで１８時間処理し、休眠打破を行なった。

その後、７０チエタノールで３分間処理し、さらＫ　Ｏ
，５９６次亜塩素酸す）ＩＪウムで３ｏ分間処理し無菌
化した。得られた無＠種子の発芽を培養室（温度２５℃
）に１０日間放置し、無ｕ１幼植物体８５株を得た□ 得られた無菌芽１０個を、ＭＳ培地（きＩＩＦ、／２　
ｐ３％蔗糖、ｏ、８％寒天含有）にオーキシンとしてｌ
−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ　）　０．１　ｐＰｍ−サイ
トカイニンとしてベンジルアデニン（ＢＡ）　１０ｐｐ
ｍを添加した培＋！ｅ＋　（ｐＨ６，２）　ＩＱｄＩ′
Ｃ温度２５℃、照度２５００ルツクスで３週間培養した
結果、腋芽１３２個を得た。得られた腋芽から任意の個
数を採敗し、期間１ケ月の継代培養をくり返した。

１０回目の継代培養によって得られた腋芽２５個を、培
地に添加する植物ホルモンをＮＡＡ０．１Ｐｐｆｆｌ　
−ＢＡ　１　ｐｐｍ　Ｋ変え、寒天を除いた培地３００
−に前記と同様の条件で培養した結果、４週間で地上部
が伸長生育した。発根も認められたが、その量は少なか
った。

次に、培地に添加する植物ホルモンをＮＡＡ　ｌｐｐｍ
　Ｋ変えた培地３００　ａｊ　Ｋ　ｍ記と同様の条件で
茎葉部（地上部）　０．４５ｐを培養した結果、３週Ｉ
ｓ！ｊで根の生育伸長がみられた。根ｌ蓋は全湿重３１
　（５，４６Ｊ／　）の２１．３チであった。・腋芽の
継代培養を〈シ返し行なうことＫより１多量の腋芽を得
ることができた。継代培養した腋芽から得られた茎葉部
および根部に含着れる殺虫成分の量は、継代培養の回数
ととくに関係がなかった。

実施例２無菌種子の発芽よシ得た幼植物体から５〜６１１１に切
断した茎の切片を、ＭＳ培地（ａ度４゜３チ蔗糖、Ｏ，
ＳＳ寒天含有）にオーキシンとしてＮＡＡ　Ｏ，１ｐｐ
ｍ　、サイトカイニンとしてＢＡＯ，１ｐｐｒａを添加
した培地　（ｐＨ６，２）１０−で温度２５℃、照度２
５００ルツクスで培養した。２週間経通頃から発根が認
められ、１．５チ月後には５本の発根がみられ、平均の
根の長さは４．５冨ｌであった。

実施例３５〜６箇層に切断した茎の切片を、ＭＳ培地にＮＡＡ　
０．１　ｐｐｍ　、　ＢＡ　１０　ｐｐｍを添加した培
地（ｐＨ６，２）１０１１１７上で前記と同様の条件に
より培養した。３週間後には不定芽の発芽が見られ、１
．５か月ＩＫは不定芽６個を得た。

実施例４実施例１記載の方法に應じて、第２表記載の培地（１０
０ＷＬｔ、濃度３倍、ＮＡＡ　１　ｐｐｍ　、　ＢＡＯ
，３ｐｐｍ　、　蔗糖１％を含む、ｐＨ６，０）を用い
て地上部（０，５６５１）を培養した。５週間後に根部
の伸長と生育が認め、られた。得られた植物体全体（２
，４３ｊｌ　）の３２チは根部であった。

参考例実施例１〜４で得られた茎葉部（地上部）０．５１およ
び植物体根部０．４６＃よシ、呑口らの方法に進じて殺
虫成分含有分画を分離した。

分離した殺虫成分分画を０．５１のイソプロピルエーテ
ルに溶解し、高速液体クロマトグラフィー（溶媒、イソ
ゾａピルエーテル：酢酸工′チル＝９　：　１．　　シ
リカゲル）で殺虫成分ピークを分離した。得られた殺虫
成分ピークを集め、濃縮、乾固することにより殺虫成分
の、粉末】６μｙ（茎葉部）および４４μｙ　（根部）
を得た。

ある試験例において、組織培養された植物の根部と地上
部とから得られた粗活性成分の量はそれぞれ乾燥重量で
６２６μｍ／／ｌおよび５０．９μｍ／１１であった。

さらに１本発明の方法によって得られた植物から、天然
のハエｒクソツから得られる活性成分かりも多ｆｉ（た
とえば重量で１．５倍）の活性成分が得られることがわ
かった。

発明の効果野生植物と同等以上の殺虫活性成分を含み、しかも少量
の不用成分を含む改頁されたノ・工ｒクソウを大量に、
短時間で培養することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）活性成分としてオーキシンおよびサイトカイニン
の１種以上の有効量を含有する培地を用いて、ハエドク
ソウの植物組織を培養する工程からなるハエドクソウの
大量培養法。
（２）培地がオーキシン０．００１〜５０ｐｐｍを含む
特許請求の範囲第１項記載の方法。
（３）培地がサイトカイニン０．００５〜１５０ｐｐｍ
を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
（４）培地がさらに１種以上の生長促進ホルモンを含有
する特許請求の範囲第１項記載の方法。
（５）３ｐｐｍ以上のジベレリンを含有する特許請求の
範囲第４項記載の方法。
（６）植物組織が根部組織であり、培地が０．０１〜５
０ｐｐｍのオーキシンを含み、硝酸アンモニウムとエチ
レンジアミン四酢酸とを含まない、特許請求の範囲第１
項記載の方法。
（７）培地がさらに５０ｐｐｍ以下のサイトカイニンを
含む特許請求の範囲第６項記載の方法。
（８）培地が５ｐｐｍ以下のサイトカイニンを含む特許
請求の範囲第７項記載の方法。