JPS636048B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、食作用活動の刺激用組成物及びその
刺激方法に関する。 従来、食作用として知られる自然現象に関し、
このメカニズムを理解すると共に、この作用を向
上または刺激することを目的として多くの研究が
なされている。たとえば、ヒアルウロン酸
（HA）および特にそのナトリウム塩（Na−HA）
は、条件に応じて食作用を抑制し、また刺激もす
ることが知られている。たとえば、フオレスター
およびバラズス（1979）は「高分子量ヒアルウロ
ン酸塩による食作用の抑制」（提出されたが、ま
だ刊行されていない）において；またセバグ、バ
ラズス、エアキンス、バハツタシエルジエーおよ
びクルカルニー（1979）は「試験管内における単
核食細胞によるプロスタグランジン合成および食
作用に対するヒアルウロン酸の効果」（ザ・ジヤ
ーナル・オブ・セル・バイオロジーに掲載するた
め提出）において、種々な分子寸法（480〜2300
×10³）のヒアルウロン酸ナトリウム（Na−
HA）が腹膜大食細胞の食作用活動を抑制するこ
とを示した。この抑制は、細胞を露出させる溶液
の粘度により左右される。プラスチツクビーズの
食作用の完全抑制は、媒体が８〜９の比粘度を有
する時生ずることが見出された〔パラズス、「食
作用に対する粘度の効果」（未発表データ）〕。こ
の抑制はNa−HAのみに特異的なものでない。
何故なら、ほぼ同じ粘度のゼラチンおよびDNA
溶液も完全抑制をもたらすからである。しかしな
がら、同様なまたは若干高い濃度の硫酸化グリコ
サミノ−グリカン類、ならびにHAのオリゴサツ
カライド類は抑制を示さず、またそれらはより高
分子量のNa−HAの抑制に対し阻害を示さなか
つた。 ブラントは、「白血球による尿酸１ナトリウム
結晶の摂取に対する滑液ヒアルウロン酸塩の効
果」（クリニカ・ヒミカ・アクタ、第55巻、第307
〜315頁（1974））において、種々な分子量のNa
−HA調製物（2.94〜0.86×10⁶）が血液白血球に
よる尿酸塩結晶の摂取を抑制することを示した。
他の研究者は、スタフイロコツカス菌の食作用が
滑液の存在下で低下することを示している〔ボー
デルおよびホリングワース、「変形関節炎におけ
る血液および関節液からの白血球の比較形態学、
呼吸および食作用機能」、ジヤーナル・オブ・ク
リニカル・インベスチゲーシヨン、第45(4)巻、第
580〜589頁（1966）〕。ひと血液白血球による、カ
プセル化ストレプトコツカスＡ群の食作用も、ヒ
ルシユおよびチヤーチにより試験管内で研究され
た〔試験管内での多形核白血球によるストレプト
コツカスＡ群の食作用の研究、ジヤーナル・エキ
スペリメンタル・メデイスン、第巻、第309〜
322頁（1960）〕。これらの研究者は、カプセルの
Na−HAが食作用阻止活性を有することを示し
た。彼等はまた、ひと血清がカプセルNa−HA
の食作用阻止効果に拮抗する因子を含有するが、
兎血清はこれを含有しないことを示した。この因
子の性質は彼等により説明されていないが、Na
−HAに対する抗体またはNa−HA解重合酵素が
排除された。 単核および多形核食細胞の両者の食作用活動に
対するNa−NAの刺激作用が最近示された。た
とえば、ハカンソン、ハルグレンおよびベンゲ
〔ヒアルウロン酸−新オプソニン（個人通信、
1978）〕は、0.7〜２×10⁶より大きい分子量のNa
−HAが低濃度（１〜10μｇ／ml）においてひと
血液白血球によるプラスチツクビーズの食作用の
初期速度を刺激することを示した。この刺激作用
は、血清オプソニン処理粒子に対し特異的であ
る。IgG被覆された粒子の摂取は刺激されなかつ
た。 フオレスターおよびバラズス（上記）は、腹膜
大食細胞の食作用も低濃度のNa−HAによつて
刺激されることを見出した。単核−および多形核
食細胞に対する刺激および抑制の両者のメカニズ
ムは、ポールおよびバラズスにより「ヒアウロン
酸ナトリウムによるひと多形核食細胞の食作用の
調整メカニズム」、サイエンス（1979年発表）に
詳細に記載されている。 ストツセルは、「食作用：識別および摂取」、ゼ
ミナール・イン・ヘマトロジー、第12巻、第83〜
116頁（1973）において、食作用が２段階、すな
わち第一段階の識別と付着および第二段階の摂取
と内部移行とにおいて生ずることを確認した。低
濃度におけるNa−HAの刺激効果は、向上した
付着に基づき、この付着は次いで摂取の速度を増
大させる。しかしながら、この刺激により、Na
−HAが存在しない場合よりも多い粒子を細胞が
摂取することはない。刺激により達成されること
は、任意の所定時間に細胞表面に付着される粒子
の総数の増加である。これは、次いで摂取の速度
が増大するのを可能にする。すなわち、細胞はよ
り短い時間内にその最高レベルの食作用を完結す
る。他方、より高濃度のNa−HA（＞100μｇ／
ml）における抑制は少しも付着過程に作用せず、
食作用の摂取段階を抑制する。この効果は全て、
溶液の粘度に依存する。粘度は、濃度と分子寸法
との両者に依存する。したがつて、食作用の全抑
制は、溶液１ml当り10mgのNa−HAと分子量
48000とにより、または溶液１ml当り５mgのNa−
HAと分子量260000とにより、または溶液１ml当
り0.4mgのNa−HAと分子量3200000とにより達成
することができる。 クロツカースおよびロバーツは、「ひとリゾチ
ームによる食作用の刺激」、アクタ・ヘマトロジ
ー、第55巻、第289〜295頁（1976）において、ム
ラミダーゼ（MUas）がひと多形核食細胞による
食作用を刺激することを見出した。しかしなが
ら、同族の、すなわちひとのムラミダーゼのみが
この効果を示し、卵白ムラミダーゼは示さなかつ
た。刺激は、食作用を受ける粒子として酵母細胞
を使用する場合、10〜100μｇ／ml濃度のムラミ
ダーゼにおいて観察された。ムラミダーゼのこの
濃度は、セン、チユー、オーマレイおよびホーラ
ンドにより炎症滲出液中に見出された範囲〔ムラ
ミダーゼ（リゾチーム）に関する実験的および臨
床的研究、アクタ・ヘマトロジー、第44巻、第65
〜77頁（1970）〕ならびにプルザンスキー、オグ
リズロおよびカツツにより関節炎滑液の中に見出
された範囲〔「リユーマチ症におけるリゾチーム
生産および異常」、リゾチーム、アカデミツク・
プレス、ニユーヨーク、第38章、第419〜425頁
（1974）〕と同じ範囲である。クロツカースおよび
ロバーツ（上記）は、摂取段階の際食細胞により
放出されるムラミダーゼ〔ライトおよびマラウイ
スタ、「食作用の際におけるひと白血球からの粒
状酵素の移動および細胞外放出」、ジヤーナル・
オブ・セル・バイオロジー、第53巻、第788〜798
頁（1972）参照〕が細胞に対し「自己刺激」効果
を有することを示唆した。しかしながら、ムラミ
ダーゼはオプソニンではない。何故なら、これは
粒子に対するよりも寧ろ細胞膜に対して作用する
からである。 本発明は、その一面において、食作用および吸
水作用の両種類の細胞、すなわち単核食細胞
（MNP）および多形核食細胞（PNP）を刺激し
うる新規な相乗組成物を提供する。本発明のこの
局面は、HAの公知の食作用刺激効果を少量のム
ラミダーゼの混合により数倍も高めうるという事
実を見出したことに基づいている。ヒアルウロン
酸（HA）またはムラミダーゼ（MUas）のいず
れかだけの濃度を高めても刺激効果は増大しない
ので、相乗効果が明白である。すなわち、この二
種の物質を共に使用することにより、食作用の刺
激は、これら二種のいずれか一方のみによつては
得られないようなレベルまで高められる。 本発明の効果は、MUasとNa−HAとの血中濃
度を両者共に約10〜50μｇ／mlにした時達成され
る。血中においてこのレベルに達するためには、
約５〜40mg／mlのNa−HAと約２〜20mg／mlの
MUasとを含有する生理食塩溶液が使用される。
典型的には、このような溶液１〜２mlを静脈内ま
たは筋肉内に注射する。二種の物質の緩徐な放出
により、血中に所望濃度10〜50μｇ／mlがもたら
される。 したがつて、本発明による組成物は、純ムラミ
ダーゼ（２〜20mg／ml）と、少なくとも約430000
（上限は臨界的でない）の分子量を有するヒアル
ウロン酸の可溶性塩（好ましくはナトリウム塩）
（Na−HA）５〜40mg／mlとを含有する生理食塩
水溶液である。多形核食細胞の刺激に対し、最も
好適な血中濃度は約10〜30μｇ／mlである。 他面において、本発明は、たとえば広範囲感染
の危険がある重症の火傷患者のような、食作用向
上を必要とする動物に、治療上有効量の本発明に
よる組成物を投与することによる食作用活動の刺
激方法を提供する。 本発明を詳細に説明する前に、本発明を実施す
る際使用される材料と方法とを説明するのが便利
である。 材料および方法 単核食細胞（MNP） これら細胞は、ねずみ
腹膜から得られた。刺激された細胞のみを使用し
た。刺激は、チオグリコレートの腹腔内注射によ
り達成された。注射后２〜３日目に細胞を収穫し
た。 多形核食細胞（PNP） これら細胞は、健康
な雄供与体から得られた。これらは収集された
後、２〜３時間内に使用した。プラスチツクビー
ズを被覆するため使用した血清は、それぞれの場
合、細胞を得たものと同じ血液から得られた。血
液からのPNPのこの分離方法は、エーレンベル
ガーおよびヌツセンツバイクにより、「食作用に
おけるC3bおよびC3dに対する膜受容体の役割」、
ジヤーナル・エキスペリメンタル・メデイスン、
第145巻、第357〜371頁（1977）に記載されてい
る。 食作用試験 これら試験に使用した粒子は、ダ
ウ・ダイアグノスチツクス社、インジアナポリ
ス、インジアナ州から得られたラテツクスビーズ
（直径1.101μ）であつた。これら粒子を、PNPに
おける付着および摂取試験に使用する前に、新鮮
な血清でオプソニン処理した。 MNPに対する食作用試験は、フオレスターお
よびバラズスにより詳細に記載されている。しか
しながら、完全化のため、その試験をここに詳細
に記載する。 食作用分析：大食細胞単一層による食作用を、
バツサリー等の方法〔セル、第８巻1976〕により
ポリスチレンラテツクス球（PLS）（直径1.099μ）
を使用して数量化した。PLSを10倍容量の70％エ
タノール中で１回および同容量の燐酸緩衝塩液
（PBS）中で２回洗浄した。次いで、ビーズを、
20％FCSを有するハンクの最少必須培地
（Hank′s Minimum Eseential Medium）中に
1.36×10⁹PLS／mlの濃度で再懸濁させ、使用す
るまで４℃に保つた。各大食細胞単一層に、予備
加温したPLS1mlを加え、そしてビーズの食作用
を空気95％−炭酸ガス５％の湿潤化雰囲気におい
て37℃で１時間進行させた。次いで、単一層を
PBS（６〜10回）で完全に洗浄し、位相差顕微鏡
により検査した。全てのPLSが細胞結合している
のが見られ、85％は細胞内にあると思われた。４
℃で培養した比較培養物を全ての実験に含ませ
て、PLSの真正摂取とは異なる、細胞表面に対す
る粒子付着を説明した。 次いで細胞を蒸留水中0.05v／ｖ％濃度のトリ
トン−X100（フイツシヤー・サイエンテイフイツ
ク社、ニユージヤージー）0.5mlで溶解させ、次
いでPLS懸濁物を0.05％トリトン−X1.0mlで希釈
した。次いで、PLS懸濁物を通過する540uｍに
おける吸光度を測定した。これら値を、溶解細胞
膜の存在による最小かつ一定の背景濁度について
補正した。得られた値を標準曲線に対して比較
し、単一層により摂取されたPLS粒子の数を、対
照および試験条件において比較した。大抵の場
合、試験条件下（C_E）と対照条件下（C_O）との
摂取PLSの濃度比である食作用指数（C_E／C_O）
をこの比から計算した。 大部分の実験において、試験１回当り0.5×10⁶
個の細胞を使用し、かつ細胞１個当り約100〜
1000個のプラスチツクビーズを使用した。培養時
間は１〜５時間で変化させた。 付着および摂取に関する試験は、ミクル、オー
ルバウムおよびシルバーシユタインにより、「２
−デオキシグルコースはねずみ腹膜大食細胞にお
いてF_Cを選択的に抑制すると共に、受容体媒介
された食作用を補足する」および「 食作用お
よびATP−発生に対する２−デオキシグルコー
スの抑制効果の分離」、ジヤーナル・エキスペリ
メンタル・メデイスン、第144巻、第1484〜1493
頁（1976）に記載されている。 ムラミダーゼ 本発明においては、卵白ムラミ
ダーゼ（リゾチーム）を使用する。 ヒアルウロン酸塩 ヒアルウロン酸のナトリウ
ム塩もしくはその他任意の水溶性塩を使用するこ
とができる。Na−HAの純度は、本発明におい
て臨界的でない。したがつて、ヘアロンと呼ばれ
る高度に精製したNa−HAの特定部分（米国特
許第4141973号）が好適であるが、その他のより
低い純度の市販製剤も使用することができる。 Na−HAの分子量は、式 MW＝（〔η〕／0.026）^1.25 〔式中、〔η〕はc.c.／ｇで表わされる極限粘度数
である〕 を使用して極限粘度数測定値により決成された。 食作用活動のムラミダーゼ刺激 従来示されているところでは（クロツカースお
よびロバーツ、上記）、卵白ムラミダーゼはひと
顆粒球食作用を刺激しない。何故なら、この分子
は種特異性を有するからである。本発明を行なう
際、本発明者は下記から判るようにこの事実を確
認した。さらに、ラツテおよびひとの腹膜大食細
胞に関する限り、この規則は当てはまらないこと
も見出された。ムラミダーゼによる食作用の刺激
は、比較的狭い濃度範囲、すなわち約10〜50μ
ｇ／ml（下記第１表）においてのみ起こると思わ
れる。100μｇ／mlの濃度では、刺激が起こらな
いのみならず、寧ろ抑制が生ずる。 食作用に対するNa−HA効果 本発明者の実
験室における従来の未発表の研究が示したところ
では、食作用のレベル、すなわちMNPにより摂
取される粒子の総数は、Na−HAを媒体に添加
しても増加させることができない（ポールおよび
ブラズス、上記）。しかしながら、細胞壁に付着
するビーズの数および摂取の速度は、10〜100μ
ｇ／mlの血中レベルを得るに足る量の分子量
300000以上のNa−HAを添加して刺激すること
ができる。 しかしながら、ムラミダーゼは異なつて作用す
ると思われる。これは、MNPにより摂取される
ビーズの総数を僅かに刺激する。この僅かな食作
用の増大は、本発明によれば、低濃度（10〜30μ
ｇ／ml）のNa−HAを媒体に対し同時に加える
と、著しく高められる。このことは、約10〜30μ
ｇ／mlの血中濃度を得るに足るNa−HAを添加
することを意味する。Na−HAのこの刺激効果
は、大分子量（MW430000もしくはそれ以上）の
Na−HAについてのみの性質である。 Na−HA単独で、ムラミダーゼを伴なわない
場合は、PNPにおける食作用の速度を刺激する
ことが知られている（ハカンソン等、上記）。こ
れは、Na−HAの存在下で細胞表面に対し粒子
の付着が増大することにより惹き起こされる（ポ
ールおよびバラズス、上記）。卵白ムラミダーゼ
は、ひとPNPのこの食作用を刺激しなかつた。
今回、本発明により、ムラミダーゼの存在下にお
けるNa−HAは食作用のレベルを顕著に増大さ
せることが示された（下記第４表）。 実験および結果 単核食細胞のムラミダーゼ刺激 ムラミダーゼは、ねずみもしくはラツテの腹膜
大食細胞の食作用を刺激することが見出された。
この刺激は大して劇的なものでないが（約30％）
極めて顕著であり、さらに1μｇ／mlまたは100μ
ｇ／mlのムラミダーゼ濃度のいずれでも起こらな
い。ムラミダーゼ刺激は、細胞自身が極度に高い
食作用活動を示さない時のみ観察される。これら
実験の結果を第１表に示す。これらの結果から判
るように、刺激効果は、約10〜50μｇ／mlの濃度
で生ずる。

【表】 Na−HAによる刺激の欠如 Na−HAは、
MNPにおける食作用のレベルを高めないことが
判明した。すなわち、２〜５時間の培養后におけ
る食作用指数は、培養培地中に低濃度（10〜30μ
ｇ／ml）のNa−HAが存在するかまたは存在し
ない場合と異ならない。Na−HAの分子量を
48000〜2300000の間で変化させても、何らの相異
をもたらさない。これを第２表に示す。

【表】

【表】 Na−HAおよびムラミダーゼによるMNPの食
作用の刺激 10〜50μｇ／mlの濃度でムラミダーゼをも存在
させた媒体に低濃度（10〜50μｇ／ml）のNa−
HAを添加すると、食作用指数は第３表に示すよ
うに著しくかつ有意に増大する。食作用のこの予
期せぬ刺激は、添加Na−HAの分子量が約
430000もしくはそれ以上の場合のみ起こる。

【表】 多形核食細胞の刺激 ムラミダーゼ（卵白）単独は、ひとPNPの付
着または食作用のいずれをも刺激しない。しかし
ながら、低濃度（10〜30μｇ／ml）のNa−HAが
存在すると、第４表に示すように付着も食作用も
有意に高められる。

【表】 作用仮設 上記から明白なように、Na−HAとムラミダ
ーゼとの併用は食作用の顕著な刺激効果向上を発
揮する。この結果は説明しうると信じられ、した
がつて完全化のため次の仮設を立てる。勿論、こ
れは単に仮設に過ぎず、これにより何ら拘束する
ことを意図するものでない。 食作用の第一段階は、識別とその後の細胞表面
に対する粒子の付着とを必要とする。これは、特
異的な抗原−抗体反応によるかまたは血清もしく
は組織オプソニンのいずれかにより達成される。
この過程は細胞の代謝活動を必要とせず、したが
つてこれは４℃においておよび被毒細胞において
も生ずる。ラテツクス粒子を使用した本発明者の
実験において、識別および食細胞表面に対する付
着には血清オプソニンを必須とした。 大分子量Na−HAは連鎖構造を有し、特定の
細胞表面受容体と相互作用する分子上の特定部位
を備える。細胞表面と相互作用するNa−HAは、
オプソニン処理された粒子の付着において補因子
として作用する。したがつて、大分子量Na−
HAの存在下では、これが存在しない場合よりも
多くの粒子が細胞の表面に付着する。ムラミダー
ゼは、食作用のこの第一段階に影響を与えない。 第二段階、すなわち摂取（飲込みまたは内部移
行）は食細胞により放出されるムラミダーゼによ
つて開始することができる。細胞のこの自己刺激
が進行し、添加ムラミダーゼは摂取を僅かに刺激
する。ムラミダーゼのこの刺激効果は明らかに分
子の構造に対し極めて鋭敏であり、ひとPNPは
種特異性酵素を必要とするのに対し、ねずみ
MNPは雌鶏ムラミダーゼにより刺激することが
できる。Na−HAの役割は、この過程において
臨界的である。極めて低濃度（10〜50μｇ／ml）
のこの分子はMNPにおけるムラミダーゼ効果を
顕著に高めると共に、PNPの場合約３倍の増大
をもたらす。この効果のメカニズムは、Na−
HAによる付着の刺激に基づいている。より多く
の粒子が細胞の表面に存在するので、より多くの
ものを細胞中に組込むことができる。さらに、細
胞表面上におけるムラミダーゼとNa−HAとの
間の連携結合は、酵素がその基質に一層良好に結
合されるのを確実にする。細胞被覆性多糖類に対
するムラミダーゼの酵素作用が、粒子の摂取には
必須であると想定される。ムラミダーゼとNa−
HAとの混合物を添加することにより、細胞表面
に対する粒子のより大きな付着と、摂取にとつて
肝要な酵素活性の増加とを確保することができ
る。 実際的使用 本発明の医学的意義は、感染症の場合或いは食
作用活動が阻害された場合（たとえば火傷患者）、
Na−HA−ムラミダーゼ混合物の皮下もしくは
筋肉内注射または局部塗布が血液循環に対し両物
質を緩徐に放出させて、白血球の食作用活動に対
する効果を刺激しうるという点にある。正常な血
液循環により、二種の化合物は、細菌性もしくは
無菌性の傷害が食作用系にストレスを及ぼしてい
る組織内の特定個所まで運搬される。このような
個所におけるNa−HAとムラミダーゼの濃度の
増加は、細胞の食作用活動を回復させ、或いはこ
れを高めさえする。 ムラミダーゼ（ひともしくは動物源）と混合も
しくは組合せたNa−HAを使用することができ
る。ゼリー状の高濃度（10〜30μｇ／ml）のNa−
HAをムラミダーゼと混合すれば、注射個所から
の拡散が緩徐となり、貯蔵型の処置が達成され
る。上記濃度のヒアルウロン酸をムラミダーゼと
混合すれば沈殿物が生じ、これは0.02〜0.1N
NaCl（PH6.5〜7.5）中に懸濁させると、皮下また
は筋肉内に注射しうる懸濁物を形成する。次い
で、ヒアルウロン酸は錯体を形成し、この錯体は
細胞内空間にて塩溶液の作用下にゆつくり溶解す
るであろう。混合物のこの緩徐な可溶化および循
環系に対するその緩徐な放出は貯蔵型処置をもた
らすであろう。 本発明の思想および範囲を逸脱することなく、
変更および改変をなしうることは勿論である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ムラミダーゼと少なくとも約430000の分子量
   を有するヒアルウロン酸の可溶性塩とを含有する
   生理食塩溶液からなり、両者をその約１〜２mlが
   哺乳動物に皮下もしくは筋肉内注射された際前記
   哺乳動物の血液系中におけるそれぞれの濃度が約
   10〜50μｇ／mlとなるのに足る量で含有すること
   を特徴とする食作用活動の刺激用組成物。 ２ それぞれの濃度が約10〜30μｇ／mlである特
   許請求の範囲第１項の食作用活動の刺激用組成
   物。 ３ 溶液がこの塩水溶液１〜２ml当り約５〜40mg
   のヒアルウロン酸の塩と約２〜20mgのムラミダー
   ゼとを含有する特許請求の範囲第１項記載の食作
   用活動の刺激用組成物。