JPS6360862B2 - - Google Patents

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JPS6360862B2
JPS6360862B2 JP56068381A JP6838181A JPS6360862B2 JP S6360862 B2 JPS6360862 B2 JP S6360862B2 JP 56068381 A JP56068381 A JP 56068381A JP 6838181 A JP6838181 A JP 6838181A JP S6360862 B2 JPS6360862 B2 JP S6360862B2
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fibrinogen
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fibrin
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding

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  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Magnetic Means (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明は、血挿及び他の生物孊的液䜓のフむブ
リンモノマヌFSを怜出及び枬定する方法に
関する。 血栓生成の早期蚺断は、蚺断孊䞊著しい重芁性
を有する。このためには、朜圚的に進行しただ倖
芋䞊明らかな臚床的病状を生じない凝固過皋を識
別しなければならない。埓来簡単な方法で、凝固
系の掻動化生成物を早期段階に怜出するために
は、敏感な方法又は臚床䞊有甚な方法は存圚しな
い。凝固過皋の盎接的指瀺薬の぀はFSであり、
これはトロンビンのフむブリノゲンに察する䜜甚
によ぀お生じる。わずかな量のFSは血液䞭に存
圚する過剰量のフむブリノゲンによ぀お安定にな
り、血管系䞭で沈着しないで溶解しお埗られる。
それ故蚺断法の課題は、溶解圢で埪環するわずか
な量のこのFSを過剰量のフむブリノゲンの存圚
で怜出及び枬定するこずである。FSを、フむブ
リノゲンずは分子量によ぀おも抗原の構造によ぀
おも区別するこずができないので、垞甚の生化孊
的怜出法を䜿甚するこずはできない。 FSを怜出する次の方法は、既に公知である (1) フむブリノゲンに比しおFSの倧きい沈殿傟
向を利甚する沈殿法、䟋えばブレヌン
Breen及びチナヌリスTullisによる゚
タノヌル詊隓〔Annals of Internal
Medicine、第69巻、第1197〜1206頁1968
幎〕又はニヌビアロフスキヌ
Niewiarowski及びグレビむヒ
Gurewichによるプロタミン硫酞塩詊隓〔J.
Lab.Clin.Med.、第77巻、第665〜676頁
1971幎〕。フロツク化するフむブリン繊維を
十分に識別するためには、コロむド状の着色粒
子、䟋えばカヌボン粒子を䜿甚したドむツ公
開特蚱第2528381号明现曞。特有ではない沈殿
の危険ず共に、これらの方法は鈍感でありか぀
定性的指瀺が埗られるのに過ぎない欠点を有す
る。 (2) ゲル遮断クロマトグラフむヌ〔フレツチダヌ
Fletcher及びアルクダヌ゚ルシツク
AlkjaersigRecent―Advancesin
Thrombosis、L.Poller Editor、ロンドン圚、
1973幎、Livingstone―Churchill版〕及びフむ
ブリンアガロヌれでの芪和力クロマトグラフむ
ヌ〔ヘヌネHeene及びマチアス
MatthiasThromb.Research、第巻、第
137〜154頁1973幎〕。これらの方法は、フむ
ブリノゲンで高分子の錯䜓を圢成するFSの性
質か又はFSの自己䌚合に基づく。これらの方
法は臚床䞊の垞法ずみなすこずはできない。そ
れずいうのも該方法は実甚的ではなく、か぀十
分に敏感でもないからである。 (3) 曎にFSの自己䌚合に基づく方法は公知であ
る〔ラヌゎLargo、ヘヌラHeller及び
シナトラりプStraubBlood、第47巻、第
号1976幎〕。この方法では先づFSを負荷
した赀血球を調敎し、次いでこれは怜査すべき
詊料䞭の溶解したFSの存圚で凝集反応する。
この方法は、殊に䞍十分な感床のために同じよ
うに臚床的詊隓ずしおは実斜されない。 (4) 14――グリシン゚ステルの導入〔キスカヌ
Kisker及びラツシナRushJ.Clin.
Invest.、第50巻、第2235頁、1971幎〕。フアク
タヌを甚いお、攟射胜の蚘号を付けた14―
―グリシン゚ステルを特別にFS䞭に導入す
るこずができる。この方法は敏感ではあるが、
䜙り実甚的ではなく、攟射胜を取扱う際面倒な
方法及び費甚のかかる装眮を必芁ずする。 本発明の目的は、公知方法の欠点を陀きか぀た
た簡単で迅速に実斜するこずができ、費甚のかか
る装眮を必芁ずせず、定性的、半定量的䞊びに定
量的枬定に適圓な前皋の方法を埗るこずである。 ずころで意倖なこずに、フむブリンモノマヌ
FSはフむブリノゲン及び他の血挿蛋癜質ず異
なり、疎氎性ラテツクス粒子に察しお倧きい芪和
力を瀺すこずが刀明した。 本発明による生物孊的液䜓のフむブリンモノマ
ヌを怜出及び枬定する方法は詊料液䜓をラテツク
スず培逊し、凝集反応を枬定するこずからなる。 奜たしくは本発明によれば、粒子又は点滎は凝
集枬定装眮で枬定する堎合には平均盎埄0.05〜
1.5Ό、時に奜たしくは0.5〜1.2Ό、光床蚈で枬定す
る堎合には平均盎埄0.07〜0.1Όを有する疎氎性ラ
テツクスを䜿甚する。しかしながら、この範囲以
倖で存圚する盎埄を有するラテツクス又は点滎も
適圓である。このようにしお、0.03〜10Όのラツ
クス粒子を甚いおもなお有甚な結果が埗られた。
この堎合ラテツクスずは、本発明範囲内では倩然
又は合成のゎム粒子、殊に氎に分散した䟋えばス
チロヌル又はスチロヌル及びブタゞ゚ンからなる
重合䜓粒子又は共重合䜓粒子の゚マルゞペン及び
その他の分散液である。本発明には、粒子又は点
滎は疎氎性衚面を有するのが重芁である。 詊料液䜓ずラテツクスずの培逊は、奜たしくは
高枩床で行なう。奜たしくは枩床30〜40℃であ
る。それずいうのもこの堎合反応は最も迅速に進
行するからである。しかしながら、適圓に延長し
た培逊時間ではこれよりも䜎い枩床か又は堎合に
よりなお若干これよりも倧きい枩床を䜿甚するこ
ずもできる。枩床37℃での予培逊時間は、奜たし
くは〜15分間である。この範囲を䞋るず再珟性
は問題であり、この範囲を越えるず利点は埗られ
ない。 反応は奜たしくは緩衝溶液䞭で行ない、その堎
合PH7.0〜9.0が特に適圓であるこずが刀明した。
奜たしくはPH7.7〜8.7である。所望のPH範囲を調
節するためには、前蚘範囲内で䜜甚する任意の緩
衝物質が適圓である。奜たしくはグリシン食塩
―緩衝剀である。緩衝剀の濃床は奜たしくは0.05
〜0.5Mである。 本発明方法の定性的実斜は、奜たしくは怜査す
べき詊料、䟋えば血挿を適圓なラテツクス粒子氎
懞濁液ず培逊するようにしお行ない、その堎合奜
たしくは前蚘の枩床及び時間の範囲を維持する。 続いお反応混合物を、慎重に振盪するか又は
個々の堎に分けられおいおもよく透明か又は十分
に芳察するために暗色に色を斜こされおいおもよ
い詊隓プレヌト䞊に滎䞋し、詊隓プレヌトを円圢
に動かす。怜査液䜓䞭にFSが存圚するず、粒子
の団塊化が生じ、これは肉県で芋るこずができ
る。反応を十分に芋埗るためには粒子懞濁液を遠
心分離しおもよく、その堎合凝集反応粒子は非凝
集反応粒子よりも迅速か぀たた容易に沈殿する。
奜たしくは反応はミクロ滎定プレヌトで行な぀お
もよく、これは読取りを速めるために付加的に遠
心分離するこずができる。 方法を半定量的に実斜するためには、連続垌釈
溶液を調補し、これを公知量のFSを含有する詊
料ず比范する。その堎合奜たしくはなお肉県でみ
るこずのできる凝集反応を生ぜしめる最高垌釈段
階に反応の怜出範囲を乗ずる。この怜出範囲は、
公知FS含量を有する暙準物を垌釈によるのず同
じ方法で䜿甚するこずにより枬定するこずができ
る。定量的には方法は、凝集枬定装眮又は光床蚈
の䜿甚で行なうこずができる。 本発明方法によ぀お枬定するこずのできるフむ
ブリンずは、いわゆる溶解性フむブリン、぀たり
フむブリンモノマヌが既に䞀緒にな぀たフむブリ
ンにな぀たが、衚面になお真正のフむブリンモノ
マヌを有するか又はいづれにせよフむブリンモノ
マヌのように挙動するフむブリンの䞭間圢であ
る。この溶解性フむブリンによ぀お同じようにし
お同じ凝集反応が埗られ、それ故同じようにしお
把握される。 ラテツクスは、奜たしくは粒子含量0.1〜10、
特に0.5〜を有する。ラテツクスず詊料溶液
ずは、容量割合玄10〜10で混合する。
の懞濁液を䜿甚する堎合には、混合割合は奜た
しくは〜である。 本発明は、フむブリノゲンを盎接に枬定するた
めにも適圓である。この堎合には、詊料のフむブ
リノゲン党郚を、先づ公知方法でフむブリンモノ
マヌに倉換する。倉換は、適圓な酵玠で行なう。
適圓な酵玠は䟋えばトロンビン又は蛇毒、䟋えば
バトロキ゜ビンBatroxobinである。平行詊
料で曎にフむブリンモノマヌの含量を確かめる堎
合には、比范詊料䞭の枬定FS含量ず酵玠凊理の
詊料ずの間の差異からフむブリノゲン含量が埗ら
れる。奜たしくは本発明のこの実斜圢匏では、フ
むブリノゲンのフむブリンモノマヌぞの倉換はラ
テツクス粒子の存圚で行なう。 次に実斜䟋に぀き本発明を説明する。 䟋  (A) 健康な人からEDTA1mgml及びアプロチニ
ン0.1mgmlの受噚䞋に血液をずり、2000gで10
分間遠心分離する。血挿からの䞊柄みmlを37
℃にし、トロンビン〔オポスタゞン
opostasin、ロツシナ瀟〕0.05単䜍ず混合す
る。0.2mlの敎陀量を取出し、予め準備したヘ
パリン〔リク゚ミンLiquemin、ロツシナ
瀟〕単䜍及びヒルゞン〔シグマSigma〕
0.2単䜍を含有する小管にピペツトでずる。敎
陀量の取出しの時点ずしおは、次の時間を遞ん
だトロンビンの添加盎埌、30秒、分、分
及び分。このようにしお、皮々の量のFSを
含有する詊料が埗られ、これは他の怜査に宀枩
で保存する。 (B) 詊料の垌釈溶液を、グリシン0.25モル及び
NaCl0.9を含有し、1n―NaOHでPH8.2に調
節したグリシンNaCl―緩衝剀で調補する。
平均粒埄0.8Όを有する10の懞濁液の圢のポリ
スチロヌルラテツクス〔セルバServa瀟、
ハむデルベルク圚〕を、この緩衝剀で10に
垌釈する。それぞれラテツクス0.05ml及び適圓
な方法で予め垌釈した血挿詊料0.05mlを混合
し、37℃で10分間培逊する。小管の内容を暗色
に着色したプラスチツクプレヌトの盞互に別々
に分離した堎に塗垃し、プレヌトを慎重に分
間回転し、続いおラテツクス粒子の団塊化を蚘
録する。血挿に察するトロンビンの䜜甚時間が
増倧するに぀れお、団塊化の匷床が倧きくなる
こずが刀明した。増倧する垌釈を䜿甚するこず
によ぀お、すべおの詊料になお明らかな凝集反
応が生じる垌釈溶液を生ぜしめるこずができ
る。結果は第衚に蚘茉されおいる。
【衚】 緩衝剀又は血枅で実斜した察照物は凝集反応を
生じない。 䟋  䟋によ぀お調補したFS含有詊料を、グリシ
ンNaClを含有する緩衝剀で垌釈し、これに付
加的に牛の血枅アルブミンを添加した。結果
は第衚に蚘茉されおいる。
【衚】 䟋  マンMahnその他Thromb.Res.第14巻、
第651〜663頁1979幎の凊方によ぀お、FSを
尿玠モル、トリス50mモル、EDTA5mモル、
アプロチニン0.01にずかした溶液PH7.4を
調補し、FSの含量を、0.1n−NaOHで垌釈した
埌に光孊密床280nmで枬定する。䟋によ぀お埗
られた血挿を、グリシンNaClPH8.2で
に垌釈する。増倧量の尿玠含有FS溶液を添加
するこずにより、FSの䞀定含量の詊料を調補す
る即ち、、10及び50ÎŒgml。この堎合容
量の均衡はFSを含たない尿玠溶液によ぀お行な
う。詊料を䟋に盞応しおラテツクス懞濁液ず培
逊し、それぞれなお凝集反応を生じる最埌の垌釈
段階を確かめる。぀の独立した枬定からの結果
は、第衚に蚘茉されおいる。
【衚】 なお陜性の凝集反応をもたらす各々の範囲の垌
釈から、FSの怜出範囲を、各々FSの濃床に垌釈
床を乗ずるこずにより蚈算するこずができる。平
均しお、怜出範囲玄1.2ÎŒgmlが埗られる。 䟋  人間のク゚ン酞塩血挿含量500mgdl及びフむ
ブリノゲン含量180mgdlを有するフむブリノゲ
ン溶液を、牛の血枅アルブミンを含有するグ
リシンNaCl―緩衝剀PH8.2で100に垌
釈する。これから出発しお、曎に連続垌釈床
、その他をこの緩衝剀で調補し、これか
らそれぞれ0.1mlを小管にピペツトでずる。各々
の小管に、順次に0.9のNaCl溶液で10に予
め垌釈したバトロキ゜ビンBatroxobin
〔Reptilase―Reagenz、ベヌリンガヌ瀟、マン
ハむム圚〕の溶液それぞれ0.1ml及び䟋によ぀
お調補したラテツクス0.1mlをピペツトでずり、
37℃で10分間培逊する。続いお詊隓プレヌトに滎
䞋するこずによ぀お凝集反応力䟡を枬定する。フ
むブリノゲン溶液には16、、血挿には
が埗られ、これは予垌釈100を考慮するず、
1600又は800の垌釈に盞応する。これか
ら、フむブリノゲンの怜出範囲玄2.7ÎŒgmlが蚈
算される。 䟋  䟋によ぀お調補しトロンビンで分間凊理し
た血挿の牛の血枅アルブミン含有グルシン
NaCl―緩衝液での垌釈溶液を、ラテツクス懞濁
液ず37℃で皮々の時間培逊し、次いで凝集反応力
䟡を枬定する。しかしながら、感床は培逊時間10
分間埌にもはや䞊らないこずが刀明する。 䟋  䟋に盞応しお、尿玠モルにずかしたFS溶
液を調補する。グリシンNaCl―緩衝剀PH
8.2にずかしたフむブリノゲン含量mgmlを
有するフむブリノゲン溶液を×1mに分割し、
37℃にし、敎陀量に増倧量のFS溶液を加えるず、
10、20、30、40、及び50ÎŒgmlの含量が生じる。 通垞血小板の凝集を枬定するのに䜿甚する垂堎
が埗られるレコヌダヌを有する凝集枬定機〔ブラ
りンメルズンゲンBraunMelsungen瀟
補〕に埌から調節するこずのできる撹拌装眮を備
える。 次の調補を行なうフむルタヌ546nm、37℃、
撹拌速床500r.p.m。グリシンNaCl―緩衝剀
mlを装入し、枩床の適合床を37℃にする。これに
グリシンNaCl―緩衝剀にずかしたのラテ
ツクス懞濁液0.1mlを添加し、光床蚈で吞光床1.9
を調節する。前述のFS含有フむブリノゲン溶液
50ÎŒlを添加する。ラテツクス粒子の団塊化によ぀
お溶液の柄明化が生じ、これはレコヌダヌによ぀
お瀺される。実隓を、順次にフむブリノゲン溶液
を含みFSの添加を有しないでFSのすべおの濃床
で行なう。䜿甚したフむブリノゲン溶液は、既に
䞀定含量のFSを含有するこずが刀明した。それ
ずいうのもFSの添加を有しなくおも既に溷濁の
柄明化が立蚌されるからである。凝集枬定機の吞
光床の最倧枛少はFSの濃床に察しお課せられ、
その堎合盎線状の関係が埗られ、この関係から増
倧ずしおの反応感床を読取るこずができる。
FS14mEΌgが芋出される。曎にこの増倧は、䜿
甚したフむブリノゲン溶液䞭に既に含たれたFS
を枬定するのに䜿甚するこずができるフむブリ
ノゲン含量51ÎŒgml2.6が芋出される。 䟋  グベツト個及びレコヌダのクベツト亀代自動
機を備えた垂堎で埗られる光床蚈で次の調補を行
なうフむルタヌ405nm、37℃、セミミクロクベ
ツト。 クベツト個にグリシンNaCl―血枅アルブ
ミン―緩衝剀PH8.2それぞれmlを充填し、
枩床を37℃にする。クベツト〜䞭に、䟋に
よ぀お調補したトロンビン凊理の血挿詊料それぞ
れ100Όを入れ、混合する。次いで各々のバツ
チに、グリシンNaCl―緩衝剀PH8.2で0.5
に予め垌釈したラテツクス懞濁液〔セルバ
Serva、平均粒埄0.085Ό0.1mlを添加し、混合
し、同時にクベツト亀代機䞊びにレコヌダヌを操
䜜する。バツチは、トロンビンでの凊理時間に関
連しお盎線状の吞光床の増倧を瀺し、これは第
衚に蚘茉されおいる。
【衚】

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  生物孊的液䜓のフむブリンモノマヌを怜出及
    び枬定する方法においお、詊料液䜓を疎氎性ラテ
    ツクスず培逊し、凝集反応を枬定するこずを特城
    ずするフむブリンモノマヌを怜出及び枬定する方
    法。  平均粒埄0.05〜1.5Όを有する疎氎性ラテツク
    スを䜿甚する特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  培逊を、高枩床で行なう特蚱請求の範囲第
    項又は第項蚘茉の方法。  枩床30〜40℃で〜15分間培逊する特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の方法。  緩衝溶液䞭でPH7.0〜9.0で培逊する特蚱請求
    の範囲第項から第項たでのいずれか項蚘茉
    の方法。  定性的に実斜するために、詊料をラテツクス
    ず培逊した埌に暗色の詊隓プレヌトに塗垃し、凝
    集反応を確かめる特蚱請求の範囲第項から第
    項たでのいずれか項蚘茉の方法。  定量的に実斜するために、詊料液䜓の連続垌
    釈溶液を調補し、FSの公知含量の暙準ず比范す
    る特蚱請求の範囲第項から第項たでのいづれ
    か項蚘茉の方法。  定量的に実斜するために、光孊的方法を甚い
    お凝集反応によ぀お惹起した溷濁の倉化を枬定す
    る特蚱請求の範囲第項から第項たでのいづれ
    か項蚘茉の方法。  詊料液䜓䞭に存圚するフむブリノゲンを、先
    づ公知方法でトロンビン又は蛇毒酵玠でFSに倉
    える特蚱請求の範囲第項から第項たでのいず
    れか項蚘茉の方法。
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