JPS6363067B2

JPS6363067B2 -

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Publication number: JPS6363067B2
Application number: JP56039549A
Authority: JP
Priority date: 1981-03-20
Filing date: 1981-03-20
Publication date: 1988-12-06
Also published as: JPS57156422A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はウイルス血清型の型別同定法に関す
る。更に詳しくは、本発明は、DNAウイルス感
染細胞の全DNAの制限酵素切断パターンから、
ウイルス血清型の型別を同定する方法に関するも
のである。ウイルスに基因する疾病の適切な診断、治療及
び予防のためには、ウイルスの血清型を適確に同
定する必要がある。例えば、アデノウイルス群ウ
イルスは、急性熱性咽頭炎、急性気道疾患、咽頭
結膜熱、流行性角結膜炎、百日咳様症候群などの
疾患の原因ウイルスであるが、このウイルス群に
は確認された31の血清型があり（ウイルスDNA
の塩基配列の相同性からＡ〜Ｅの５つの群に分け
られる）、疾患の適切な診断、治療及び予防のた
めには、ウイルス血清型の適確な同定を行なう必
要がある。従来、ウイルス、例えば、アデノウイルスの血
清型の同定に関しては、補体結合反応及び螢光抗
体法がアデノウイルスの共通の抗原を検出する目
的で用いられ、一方、赤血球凝集阻止反応及び中
和反応が型別の決定に用いられてきた。しかしな
がら、赤血球凝集阻止反応及び中和反応による同
定においては、型間で交叉反応を示す場合があ
り、従つて、正確度に疑問のある場合があつた。
また各型の抗血清を準備しなければならず簡便性
の点でも問題があつた。最近、ヘルペスウイルスDNAを制限酵素で切
断し、その切断パターンから血清型を同定する方
法が紹介されている（ザ・ジヤーナル・オブ・イ
ンフエクシヤス・デイジーズ（The Journal of
Infectious Diseases）第138巻、第４号、第488
−498頁（1978年））。しかしながら、この方法に
おいては、ヘルペスウイルスを単離精製して用い
ており、ウイルスの精製には多量の感染細胞が必
要であり、かつ複雑な手法が要求され、多大の時
間と労力を要するので、この方法は特に診断、治
療上は実用的に問題があつた。本発明者らは、DNAウイルスの血清型を少量
の感染細胞を用いて簡単にかつ正確に同定する方
法に関し鋭意研究を行なつた結果、DNAウイル
ス感染細胞から全DNAを抽出し、これをその
まゝ（ウイルスDNAと細胞DNAを分離すること
なく）制限酵素で切断し切断パターンを形成させ
ると、細胞DNAに影響されることなくウイルス
DNAの切断パターンが明瞭に判別でき、簡単か
つ正確にその血清型を同定できることを知見し本
発明に到達した。即ち、本発明は、DNAウイルスをDNAウイル
ス感受性細胞に感染させ、この感染細胞を培養後
感染細胞の全DNAを抽出・精製し、次いでウイ
ルスDNAと細胞DNAを分離することなく前記抽
出精製した全DNAを制限酵素で切断し、その切
断パターンを、血清型が既知のDNAウイルスの
DNAの制限酵素切断パターンと比較することを
特徴とする、ウイルス血清型の型別同定法であ
る。本発明の方法を使つて、血清型の型別を同定で
きるDNAウイルスは特に制限されるものではな
く、その原理はいずれのDNAウイルスに対して
も応用できるが、アデノウイルス群ウイルスやヘ
ルペス群ウイルスには特に好適に適用できる。 DNAウイルス感受性細胞としては、DNAウイ
ルスに感染されかてそれを増殖させうるものであ
れば何でもよいが、アデノウイルス群ウイルスの
場合にはKB細胞、Hela細胞、ヒト胎児腎細胞が
好ましく、ヘルペス群ウイルスの場合にはHep
細胞、Hela細胞又はVelo細胞が好ましく、更に
ヘルペス群ウイルスの中の水痘ウイルスの場合に
はヒト胎児肺細胞、繊維芽細胞が好ましい。 DNAウイルスを感染させた感染細胞は公知の
方法で培養できる。適当は培地としては、例え
ば、５％子牛血清を含むイーグルミニマムエツセ
ンシヤルミデイアム（MEM）がある。培養条件
は、例えば、５％CO₂通気下、37℃で１〜７日で
十分である。感染細胞が破壊されウイルス粒子が
飛び出すと、その後の処理に不便であるから培養
は、明瞭な細胞変性効果が発現した段階で止める
のが最も好ましい。その後、かかる感染細胞から
感染細胞の全DNA、即ちウイルスDNAと細胞
DNAを抽出・精製する。DNAの抽出・精製法は
特に限定されるものではないが、以下のフエノー
ル法とジエチルピロカーボネート（DEPC）法が
好ましい。後者は、特に少量の細胞を処理する場
合に適している。 (1) 本発明において好ましく用いられるフエノー
ル法の１例は以下の通りである。ウイルス感染細胞（３×10⁵個）をリン酸緩
衝生理食塩水（PBS）で一度洗浄し、1500rpm
で５分間遠心して得られた細胞を0.1Mエチレ
ンジアミンテトラ酢酸と1.0％のドデシル硫酸
ナトリウムを含む0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）に懸濁させ、室温にて10分間放置する。
これに、プロナーゼを500μｇ／mlの割合で添
加し37℃で３時間処理し、更にこれに等容量の
フエノールを加え、充分に混和して後、
2000rpmで10分間遠心分離して水層に核酸を抽
出する（この操作を３回くり返す）。得られた
水層に酢酸ナトリウムを0.3Mとなるように加
える。その後、この溶液に氷冷下、冷却した２
〜2.5倍容量のエタノールを滴下し、−70℃で10
分間放置した後、15000rpmで５分間遠心して、
得られた沈殿を風乾する。そしてこの沈殿を、
0.015M塩化ナトリウム及び0.0015Mクエン酸
ナトリウムの水溶液に再懸濁し、これに100単
位／mlのRNase（予め90℃で10分間熱処理した
もの）を加え37℃で２時間処理し、混在してい
るRNAを分解して目的とする精製全DNAを得
る。 (2) ジエチルピロカーボネート法の１例は以下の
通りである。前記(1)のフエノール法の場合と同様にして得
られた細胞を、1.0％のドデシル硫酸ナトリウ
ムと0.1〜0.5％のDEPCを含む0.05Mトリス塩
酸緩衝液（PH7.5）に懸濁させ、０℃で20分間
おだやかに撹拌する。その後等量のエチルエー
テルを加え、DEPCを除去した後、1500rpmで
３〜５分間遠心分離して得られた下層（水層）
に、酢酸ナトリウムを0.3Mとなる様に加える。その後、得られた溶液に氷冷下、冷したエタ
ノールを滴下し、以後は前記(1)のフエノール法
の場合と同様に処理する。本発明において用いられる制限酵素は、DNA
の特異的なヌクレオチド配列を認識し、特異的な
部位でDNAを切断する酵素であれば特に限定は
ない。これらは一般に型の制限酵素と呼ばれて
おり、例えば、BamH、Hind、EcoR、
Sal、Hpaがある。しかしながら、かかる制
限酵素によるDNAの切断パターンを個々のウイ
ルス血清型の型別同定に具体的に応用するために
は、特定のウイルスあるいは特定の血清型に合せ
て、実施例に述べる如き方法等で型の制限酵素
の中から最適のものを選択する必要がある。例え
ば、アデノウイルスDNAの血清型の型別同定を
行なうのに適した制限酵素は、まずアデノウイル
スDNAを分析可能な数の特異的フラグメントに
切断する制限酵素、例えば、６つの塩基配列を認
識するHind、EcoR、BamH、Sal及び
Hpaの中から選択を行なう。そして、更に、こ
れらの中から、異なる血清型間で共通の切断部位
のできるだけ少ない制限酵素を選択する必要があ
る。例えば、アデノウイルス３型と７型の切断パ
ターンは、Hind、EcoR又はSalを用いた
のでは明瞭に区別できないが、BamHの切断
パターンを比較すると明瞭に区別できる。従つ
て、アデノウイルスの３型と７型を区別するため
には、制限酵素としてBamHを用いるのが最
適であることがわかる。以上の如き手法で、特定のウイルス血清型の型
別同定に最も適した制限酵素を、適宜選択するこ
とができる。制限酵素によるDNAの切断と切断パターンの
作成は、例えば、下記の如き方法で行なうことが
できる（バイロロジー（Virology）第82巻、第
509−512頁、（1977）参照）。 DNAに対し充分量（例えば、DNA1μｇ当り
0.2〜1.0単位）の制限酵素を加え、37℃で３〜５
時間反応させる。反応液の総量は20〜70μと
し、適当な緩衝液を用いる。DNAの明瞭な切断
パターンを得るためには、0.4〜10μｇのDNA量
で十分である。反応終了後、反応液を、例えば1.4％アガロー
ス平板ゲルを用いて、泳動用緩衝液中で電気泳動
を行ない、エチジウムブロマイドで染色し、紫外
線下で切断パターンの観察、写真撮影を行なう。制限酵素による切断パターンの比較は、サウザ
ーン（Southern）のブロツト法（J.MOl.Biol.、
98、503〜517（1975）参照）で行なうこともでき
る。即ち、前記の如く感染細胞DNAを制限酵素
で切断し、アガロースゲル電気泳動にかけ、アガ
ロースゲル中の各DNA断片をアルカリ処理によ
り一本鎖とした後、サウザーンの方法に従つてメ
ンブレンフイルター上に移し、 ³²P又は ³Hで標
識したブローベDNAとハイブリツドを形成させ
検出する。かかるサウザーンのブロツド法を利用
すると、切断パターンの比較検討に必要な感染細
胞DNA量は、より少なくすることができ、明瞭
な細胞変性効果が発現する前の感染細胞からも、
明瞭な切断パターンを得ることができる。切断パターンの比較は、また、DBMペーパー
ブロツト法で行なうこともできる（Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.74、5350−5354参照）。即ち、ジ
アゾベンジルオキシメチル（DBM）で処理され
た３紙上にDNAを移し、 ³²P又は ³Hで標識し
たブローベDNAとハイブリツドを形成させて検
出する。本発明の方法において、スポツトハイブリダイ
ゼーシヨン（Spot Hybridization）（Gann、70、
239〜243（1979）参照）法を併用することにより
DNAの制限酵素切断パターンによる同定がより
容易となる場合がある。例えば、アデノウイルス
感染細胞の全DNAをアルカリ処理後、メンブレ
ンフイルター上にスポツトし、 ³²Pで標識したア
デノウイルスの各亜群DNAとの間でハイブリツ
ドを形成させ、オートラジオグラフイホモロジー
の有無を検討し、あらかじめ感染ウイルスの亜群
を決定する。そして、その後は感染細胞全DNA
の切断パターンを同一の亜群内のDNAウイルス
の切断パターンと比較すればウイルス血清型の型
別が容易に同定できる。本発明の方法によれば、少量のウイルス感染細
胞を用い（必要な感染細胞数は、精製ウイルスの
DNAを用いる場合の約1/40以下）、ウイルス
DNAと細胞DNAを分離することなく、簡単かつ
正確にウイルス血清型の型別の固定を行なうこと
ができるので、本発明は、ウイルス病の診断、治
療及び予防あるいはウイルスに関する医学研究上
その利用価値は極めて大きなものである。以下、実施例により本発明を詳述する。実施例１本実施例は、DNAウイルス感染細胞から全
DNAを抽出し、これをそのまゝ（ウイルスDNA
と細胞DNAに分離することなく）制限酵素で切
断しその切断パターンを作成すると、そこに形成
されるウイルスDNAの切断パターンは細胞DNA
の存在に影響を受けることなく、精製ウイルス
DNAを用いた場合と同一の切断パターンを示す
ことを例示するものである。 (1) DNAウイルス（アデノウイルス７型）感染
細胞の培養 KB細胞を直径３cmのシヤーレを用い、５％
子牛血清を含むイーグルミニマムエツセン
シヤルメデイウム（MEM）で単層培養し
（細胞数約1.5×10⁵個）、これにウイルスを
moi10−50PFU／cellで接種し、37℃で明瞭な
細胞変性効果が見られるまで約３日間培養し
た。 (2) ウイルス（アデノウイルス７型）DNAの抽
出・精製グリーンとピナ（Green and Pina）の方法
に基づき（Proc.Natl.Acad.Sci.51、1251−
1259（1964）及びVirology20、199−207（1963）
参照）、前記(1)で得られた感染細胞を破壊し有
機溶媒で細胞由来蛋白を変性除去し、塩化セシ
ウム密度勾配平衡遠心によりウイルス粒子を精
製した。その後、フエノール法を適用してウイ
ルスDNAの抽出・精製を行なつた。 (3) 感染細胞の全DNAの抽出・精製前記(1)で得られたDNAウイルス感染細胞を、
フエノール法に従つて処理し（フエノール処理
以降は２回くり返した）、感染細胞の全DNAの
抽出・精製を行なつた。 (4) 感染細胞の全DNAの制限酵素による切断と
切断パターン前記(3)で得られた感染細胞の全DNAを10μ
ｇをとり、これに制限酵素としてDNA1μｇ当
りHind、BamH、Sal又はEcoRを充
分量加え、37℃で５時間反応させた。なお、反
応用緩衝液としては、Hindの場合は20ｍ
MTris−HCl（PH7.4）、７ｍMMgCl₂、60ｍ
MNaCl、２ｍM2−メルカプトエタノールの系
を、BamHの場合は６ｍMTrisHCl（PH7.5）、
６ｍMMgCl₂、20ｍMKCl、６ｍM2−メルカ
プトエタノールの系を、Salの場合は、50ｍ
MTris−HCl（PH7.5）、10ｍMMgCl₂の系を、
EcoRの場合は100ｍMTris−HCl（PH7.5）、
10ｍMMgCl₂、50ｍMNaClの系を用い、反応
混液の総量は50μであつた。反応終了後、反応混液を1.4％アガロース平
板ゲル（２×160×220mm）を用いて、泳動用緩
衝液−36ｍMTris−HCl（PH8.1）、32ｍ
MKH₂PO₄、0.1ｍMEDTA中で、13時間、
50Vで電気泳動を行ない、エチジウムブロミド
（0.5μｇ／ml）で15分間染色し、染外線下で切
断パターンの観察と写真撮影を行なつた。用い
た制限酵素毎に、その切断パターンを第１図の
それぞれａとして示した。上記と全く同様にして（但し、ウイルス
DNAは1μｇを使用）、前記(2)で得られたウイ
ルスDNAのみの制限酵素切断パターンを求め、
第１図のｂとして示した。第１図から明らかな如く、感染細胞の全DNA
の切断パターン(a)において、その背景に細胞
DNAの連続的なパターンが薄く現われてはいる
が（第１図のａにおいて斜線で示した。なお第
２，３図では省略。）、これはウイルスの同定に障
害となる程のものではないことがわかる。そして
また、かくして形成されたウイルスDNAの切断
パターンは、精製ウイルスDNAの切断パターン
(b)と完全に一致していることがわかる。以上の事実は、ウイルスDNAの制限酵素切断
パターンを調べるためには、感染細胞からウイル
ス粒子の単離・精製そしてウイルスDNAの抽
出・精製という煩雑な操作を行なつて試料を調製
する必要はなく、感染細胞から直接全DNAを抽
出精製し、それをそのまゝ試料として用いれば良
いことを示している。また、第１図から明らかな
如く、ウイルスの血清型は同じでも、用いる制限
酵素によつて切断パターンは異なるので、特定の
ウイルスの特定の血清型を同定するには、それに
最も適した制限酵素を選択するのが望ましい。実施例２本実施例は、感染細胞の全DNAの制限酵素切
断パターンから、アデノウイルス３型と７型（共
にＢ群に属しDNAホモロジーが高い）の区別が
できることを示す例である。ウイルスとしてそれぞれアデノウイルス３型と
７型を用い、実施例１の(1)(3)及び(4)の場合と同様
にして、各種制限酵素（Hind、BamH、Sal
、EcoR）の切断パターンを得た。その結果
を第２図に示した。第２図から明らかな如く、アデノウイルス３型
と７型の切断パターンは、Hind、Sal及び
EcoRを用いた場合には酷似しており区別が困
難であるが、一方BamHを用いた場合には、
両者でバンドの数と位置が異なり明確に区別でき
る。実施例３本実施例は、BamHを用いた場合、アデノ
ウイルスの各型によつて制限酵素切断パターンが
明瞭に異なることを示すものである。アデノウイルスとしてそれぞれ12、31（以上Ａ
群）、３、７（以上Ｂ群）、２、５（以上Ｃ群）、９、
13（以上Ｄ群）及び４（Ｅ群）の各型のウイルスを
用い、制限酵素としてBamHを用いて、実施
例(1)(3)及び(4)の場合と同様にして切断パターンを
得た。それらの結果を第３図に示した。第３図か
ら、12型は８本、31型は11本、３型は９本、７型
は９本、２型は４本、５型は２本、９型は４本、
13型は４本、４型は８本のバンドが明瞭に観察で
き、それぞれが区別できることがわかる。次に、EcoRにより切断形成されたアデノウ
イルス７型のDNAフラグメント、Hindにより
切断形成された12型のDNAフラグメント及び
BamHにより切断形成された２型のDNAフラ
グメントをサイズマーカーとして用いて得られ
た、電気泳動におけるDNAフラグメントの相対
移動度と分子量（ダルトン）の関係曲線（第４
図）に基づいて、前記BamHを用いた場合の
アデノウイルス各種の各バンド（DNAフラグメ
ント）の分子量を算出し、その結果を第１表に示
した。

【表】

【表】第１表より、各型により特異な制限酵素切断パ
ターンが数値として得られ、これは型別の同定に
利用できることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各種制限酵素（Hind、BamH、
Sal及びEcoR）によるアデノウイルス７型感
染細胞の全DNAの切断パターン(a)と、アデノウ
イルス７型DNAの切断パターン(b)を示す。第２
図は、各種制限酵素（Hind、BamH、Sal
及びEcoR）によるアデノウイルス３型感染細
胞の全DNAの切断パターンと、アデノウイルス
７型感染細胞の全DNAの切断パターンの比較を
示す。第３図は、制限酵素としてBamHを用
いた場合の、アデノウイルス各型感染細胞の全
DNA切断パターンを示す。第４図は、電気泳動
におけるDNAフラグメントの相対移動度と分子
量（ダルトン）の関係曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ DNAウイルスをDNAウイルス感受性細胞に
感染させ、この感染細胞を培養後感染細胞の全
DNAを抽出精製し、次いでウイルスDNAと細胞
DNAを分離することなく前記抽出精製した全
DNAを制限酵素で切断し、その切断パターンを、
血清型が既知のDNAウイルスのDNAの制限酵素
切断パターンと比較することを特徴とする、ウイ
ルス血清型の型別同定法。２ DNAウイルス感受性細胞が、KB細胞、
Hela細胞、ヒト胎児腎細胞、又はVelo細胞であ
る、特許請求の範囲第１項記載のウイルス血清型
の型別同定法。３感染細胞の培養を、感染細胞の明瞭な細胞変
性効果が発現するまで行なう、特許請求の範囲第
１項記載のウイルス血清型の型別同定法。４制限酵素がBamH、Hind、EcoR、
Sal又はHpaである、特許請求の範囲第１項
記載のウイルス血清型の型別同定法。５制限酵素切断パターンが、電気泳動法による
切断パターンである、特許請求の範囲第１項記載
のウイルス血清型の型別同定法。６制限酵素切断パターンの比較が、エチジウム
ブロマイド染色法又はサウザーン（Southern）
のブロツト法又はDBMペーパーブロツト法によ
り行われる、特許請求の範囲第１項記載のウイル
ス血清型の型別同定法。