JPS6363700A

JPS6363700A - 細胞培養用高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法

Info

Publication number: JPS6363700A
Application number: JP61208436A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Hizuka; 正博肥塚; Junpei Enami; 淳平榎並; Masataka Hata; 正隆羽多; Kaneo Suzuki; 鈴木　銀男
Original assignee: Nitta Gelatin Inc
Current assignee: Nitta Gelatin Inc
Priority date: 1986-09-04
Filing date: 1986-09-04
Publication date: 1988-03-22
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: JPH0774239B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕この発明は、高ゲル強度の酸可溶性コラーゲンを得る方
法に関する。

〔背景技術〕

生体内において、コラーゲンは細胞内で合成され、種々
の修飾反応をうけて３末鎖のプロコラーゲンができて細
胞外に分泌される。このプロコラーゲン分子は、コラー
ゲン分子より大きく、両末端に非コラーゲン性のかなり
大きなプロペプチドをもっている。生体内では、これら
のプロペプチドは、特異的なプロテアーゼにより僅かに
ペプチドを残して通常のコラーゲン分子となる。このよ
うにして生じたコラーゲン分子（トロポコラーゲン）は
、分子量約１０万のポリペプチド鎖が３本葉まってコラ
ーゲン特有のらせん構造を形成しており、長さ約３００
０人、直径１５人、分子量約３０万の棒状の分子である
。分子の両末端にはらせん構造をとらないペプチド鎖（
テロペプチド）が付いている。

プロコラーゲンがコラーゲン分子となると、初めて規則
性のある集合体を形成してコラーゲン線維となる。コラ
ーゲン線維内のコラーゲン分子は、加令により、分子内
架橋および分子間架橋が形成される。架橋の進行により
、コラーゲン組織は硬く丈夫なものに変化していくとと
もに、可溶性区分が減少し、不溶性区分が増大していく
。

これらのコラーゲン線維を含む組織から、コラ−ゲン分
子の形状を全く変化させることなく、コラーゲンの可溶
性区分を得るには、大別して、■食塩等の中性塩溶液で
抽出する方法、■希酸溶液で抽出する方法がある。■の方法で得られたコラーゲンは中性塩可溶性
コラーテーン、■の方法で得られたコラーゲンは酸可溶
性コラーゲンとそれぞれ呼ばれ葛。中性塩で抽出される
コラーゲンは、分子間架橋が形成されていないコラーゲ
ン（モノメリックコラーゲン）がほとんどである。しか
しながら、通常利用されうる動物組織を抽出原料として
用いた場合、中性塩で抽出されるコラーゲンの量が極め
て微量であるため、これを工業的に利用することは実質
的にほとんど不可能である。これに対し、酸で抽出を行
うと、モノメリックコラーゲンとともに分子間架橋によ
り生じるコラーゲン分子のオリゴマー（ポリメリックコ
ラーゲン）も抽出される。

しかし、酸可溶性コラーゲンにおいても、幼若な動物組
織を用いた場合には、その収率（モノメリックコラーゲ
ンおよびポリメリックコラーゲンの収率）が高々数％以
下であることが知られているこのほかに、不溶性コラー
ゲンを可溶化するには、ペプシン等のプロテアーゼ（蛋
白質骨）・警￥素）で処理する方法、あるいは、飽和硫
酸ソーダの存在下で苛性ソーダで処理する方法が公知で
ある。これらの方法によって、コラーゲンのらせん構造
を保ったまま、はとんど１００％の収率で可溶化コラー
ゲンが得られる。しかじ、前者の方法では、テロペプチ
ド部分が消化されており、後者の方法では、さらにコラ
ーゲン分子中のアスパラギン、グルタミンのアマイドが
加水分解され得られたコラーゲンの等電点が低下してお
り、＋Ｂ１’Ｍな意味では元のコラーゲン分子の構造を
すべて保持しているものではない。

近年、コラーゲンゲルマトリックスを利用した紐胞培養
法が注目されている。コラーゲンゲルを支持基質として
細胞培養を行う７ケ法には、ゲル上に細胞を単層培養す
る方法と、ゲル内に細胞を包埋培養する方法とがある。

さらに、単層培養法は、ゲルが培養器に付着したままの
状態の付着コラーゲンゲル培養法と、ゲルが培養液中に
浮かんでいる状態の浮遊コラーゲンゲル培養法とに分け
られる。

浮遊コラーゲンゲル培養法は、これまで困難とされてい
た培養細胞における分化機能の維持を可能にした。すな
わち、この方法を応用すれば細胞培養により生体物質、
生理活性物質を大量に採取することも可能になってきた
。

また、コラーゲンゲル包埋培養法は、試験管内において
も形態形成、組織構築を観察することが可能になった。

これらのように、細胞培養に極めて有効なコラーゲンゲ
ルは、上記のようにして得られた可溶性コラーゲンの溶
液のｐＨを中性とし、さらに塩類を加えて生体内の塩濃
度（ＮａＣｆで０．１４Ｍ）にした後、２５℃〜３７℃
に加温することによって得られる。これは、溶液中に分
散しているコラーゲン分子が生理的条件下で再び会合を
始め、コラーゲン線維が再構成され、網目状の線維の間
に液が閉じ込められるからである。

このようにして得られるコラーゲンゲルを細胞培養に用
いる場合、ゲルを調製する際に要求される特性としては
、線維再構成のスピード、すなわち、ゲル化速度が早い
こと、得られるゲルの強度が高いこと、および、ゲルの
透明度が高いことである。これらいずれの特性も得られ
る可溶性コラーゲンの中で酸可溶性コラーゲンが最も優
れており、他の方法によって得られるコラーゲンでは、
上記特性のすべてまたはいずれかを満足するものが得ら
れない。すなわち、酵素可溶化コラーゲンおよびアルカ
リ可溶化コラーゲンに比べ、酸可溶性コラーゲンは、元
のコラーゲン構造をほとんど損なうことなく保持してい
るために、線維再構成能が高く、したがって、その溶液
は、生理的条件下においた時、素早く、かつ、硬いゲル
を構成し、細胞の支持体として極めて優れたマトリック
スとなる。

しかし、これまでのところ、高いゲル強度をもつコラー
ゲンを高い収率、すなわち、工業的に利用できる程度の
収率でつくる方法は見出されていない。

〔発明の目的〕

この発明は、以上のことに浴みて、ゲル強度の高いコラ
ーゲンゲルを与えるコラーゲンを高い収率で得ることが
できる高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法を提供する
ことを目的とする。

〔発明の開示〕

この発明は、上記の目的を達成するために、動物組織か
ら酸溶液により抽出して可溶性コラーゲンを得る方法に
おいて、前記動物組織として豚由来のものを用いるよう
にするとともに、抽出により得られた溶液を、前記動物
組織の乾燥固形分量１重量％以下、ｐＨ３以下、遠心加
速度３００００９以下の条件で遠心分離にかけて不溶性
コラーゲンを除くことを特１牧とする高ゲル強度酸可溶
性コラーゲンの製法を要旨とする。

以下に、この発明の詳細な説明する。

この発明では、抽出原料として、豚由来の動物組織を用
いることにしている。これは、豚由来の動物Ｍｉ織を抽
出原料として用いると、高ゲル強度のコラーゲンが高い
収率で得られるからである。

豚由来の動物組織としては、たとえば、豚皮、４鍵など
が用いられるが、これらに限定されない。

豚由来の動物組織は、通常の方法に従って積装されたの
ち酸溶液に分散し、抽出を行う。この抽出を行った後、
その抽出液は、遠心分離にかけ、可溶性コラーゲン両分
と不溶性コラーゲン画分に分離する。前記酸溶液として
は、酢酸、クエン酸などの有機酸、および、塩酸などの
無機酸のン容）夜が用いられるが、これらに限定されな
い。抽出時間は、特に限定されないが、通常どおり一夜
ないし三日間行うのがよい。

全操作は、コラーゲンの変性を避けるために、１〜１０
°Ｃの低温で行うことが好ましい。

遠心分離は、以下のような条件で行われる必要がある。

まず、動物組織の乾燥固形分の量を、酸溶液に対し１重
量％以下とすることである。前記乾燥固形分の量が酸溶
液に対し１重量％を上回ると、遠心分離の際、コラーゲ
ン溶液の粘性によって可溶性コラーゲン画分の分離が困
難となる。前記乾燥固形分の量としては、０．７重量％
以下が好ましく、０．５重量％以下がより好ましい。分
離に必要な乾燥固形分量は、遠心加速度によって異なる
が、たとえば、約２００００９の場合０．３重量％以下
が好ましい。つぎに、ｐＨを３以下とすることである。

抽出ｐＨは、通常用いられるｐＨ（２〜４）でよいが、
遠心分離時のｐＨが高すぎると、可溶性コラーゲン両分
の分離が困難となる。

遠心分離時のｐＨは、２．７以下が好ましく、２．５以
下がより好ましい。遠心分離の遠心加速度は、３０００
０９以下とする。３００００９を上回ると、そのような
遠心装置は、処理量が小さく、工業的に利用することは
実質的にほとんど不可能である。

具体的操作としては、あらかじめ動物組織の乾燥固形分
の量が酸溶液に対して１重量％以下となるようにしてｐ
Ｈ３以下の酸溶液で抽出を行い、引き続き遠心分離を行
うか、もしくは、抽出は適当な条件で行い、遠心分離の
直前に遠心分離にかける溶液（抽出により得られた？８
液）を、動物組織の乾燥固形分量が酸溶液に対し１重量
％以下、ｐＨが３以下となるように調整して遠心分離を
行うことがあげられる。

遠心分離にかけられる溶液が上記の乾燥Ｉ形分量および
ｐＨであれば、３００００９で少なくとも３０分間以上
遠心分離を行うことにより、上澄みの可溶性コラーゲン
画分と下層の不溶性コラーゲン画分に分離する。なお、
このとき、遠心分離の遠心加速度を高くする程、可溶性
コラーゲン画分中のモノメリックコラーゲンの割合が増
すが、特に細胞培養に適した高ゲル強度のコラーゲンゲ
ルを調製するのに用いるコラーゲンには、ポリメリック
コラーゲンが含まれていても差支えない。

また、両画分を分離するには、高い遠心加速度を用いる
程、分離が容易に行えることはいうまでもないが、実際
に敵方Ｓ以上の遠心加速度が得られる、いわゆる超遠心
装置は、その処Ｆ１が小さく、これを工業的に利用する
ことが実質的にほとんど不可能である。このようなこと
から、この発明は、実際に工業的に利用可能な低遠心加
速度の遠心分離機（通常３００００９以下）を用いて、
酸可溶性コラーゲンを効率良く得る方法を研究した結果
、豚由来の動物ｍＷを用い、上記の条件で処理すること
により達成できることを見出し、完成するに至ったもの
である。

豚由来の動物組織を用い、上記のようにして遠心分離を
行うことにより、他の動物組織を原料にした場合に比べ
、大量の酸可溶性コラーゲンが得られる。

上記のようにして、遠心分離を行ったあと、上澄みの可
溶性コラーゲン画分を回収し、通常の方法にしたがって
精製を行えば、精製酸可溶性コラーゲンが得られる。

このコラーゲン溶液（たとえば、３■／−濃度）８部を
水中で冷却しながら、この溶液にＮａＣｌを１．４Ｍ含
む０．１Ｍリン酸緩衝液１部およびＮａＯＨ溶液１部を
加えて、ｐＨ７，４に調整し、よく混合して３７℃に加
温すると、数分で高ゲル強度のコラーゲンゲルが形成さ
れる。

この発明の高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法は、酸
可溶性コラーゲンを高い収率で容易に得ることができる
。得られたコラーゲンから調製したコラーゲンゲルは高
いゲル強度を有しており、ゲル化速度および透明度など
の特性にも優れている。このため、このコラーゲンは、
上記のコラーゲンゲルマトリックスを利用した細胞培養
法において、マトリックスとして用いるのに適したもの
である。

（実施例１）新鮮な豚皮の毛および付着物を取り除いて得た真皮層を
細断し、５％ＮａＣ１溶液および水でよく洗浄し、さら
にメタノール−クロロホルム混合溶液で脱脂し、ついで
よく洗浄して精製豚皮原料を得た。この原料１５ｇ（乾
燥重量３．８ｇ）をｐ）Ｉ２．４のＨＣＩ溶液溶液１７
００定Ｚ夜膨潤させ、ついでホモジナイザー（ポリトロ
ンＰＴＩＯ−３５型：　Ｋ　Ｉ　ＮＥＭＡＴＩ　ＣＡ社
製）を用い、よく分散し、約０．２２重量％の原料濃度
（乾燥重量基準、以下同様）の分散液を得た。得られた
分散液を時々攪拌しながら２４時間放置した後、遠心分
離機（日立高速冷却遠心機Ｈ１ＭＡＣ３ＣＲ２０Ｂ型：
日立１機社製：ＲＰＲ１２−２型ローター使用）を用い
、１２０００ｒｐｍ（最大遠心加速度２２２２０Ｘ９）
で１時間遠心分離した。なお、１回の処理量は約１１で
あった。遠心分離した溶液は、透明な上層と不透明な下
層に分離されており、上層の透明な部分を下層部が混入
しないように注意深く吸引回収し、酸可溶性コラーゲン
画分６６０−を得た。

次に、この溶液に１０％；；度になるように、Ｎａｃｌ
を加えて一夜放置し、生じた沈澱を遠心分離して回収し
、水洗後、ｐＨ３，０のＨＣ１溶液に再溶解した。さら
に、この溶液にＮａｏＨ溶液を加えてｐＨ７，０に調整
し、−夜装置して、生じた沈澱を回収し、よ（水洗した
後、ｐＨ３，ｏのＨＣ１溶液にコラーゲン濃度が３．０
■／ｍ／になるように溶解した。なお、上記の全操作は
すべて１０”Ｃ以下で行った。得られた精製酸可溶性コ
ラーゲン溶液は２０３ｍ１であり、収率は乾燥重量基準
で１６．０％であった。

次に、前記精製酸可溶性コラーゲン溶液４０ｍＪを１０
０ｍｊビーカーにとり、氷冷しなからＮ　ａ　Ｃ２を１
．４Ｍ含む０．１Ｍリン酸緩Ｓｈ液５−を加えてよく混
合し、さらにＮ　ａ　ＯＨ溶液５−を加えてｐＨ７，４
に調整し、直ちに３７℃の恒温槽に入れ、１時間保持し
た。得られたコラーゲンゲルをレオメータ−（不動工業
社製、ＮＲＭ−２００２Ｄ型：径１″／２粘弾性用アダ
プター、浸入ａ度り０ｎ、浸入速度６ｃｍ／分で測定）
を用いてゲル強度を測定した結果、２３５ｇの高いゲル
強度であった。

（実施例２）新鮮な豚足部から採取した鍵を実施例１と同様に細断し
、精製して得た精製豚皮原料１５ｇ（乾燥重量３．３ｇ
）をｐ　Ｈ２，２のＨ（ｌ溶液１６５０ｍＺ（乾燥重量
で約０．２％濃度）に膨潤し、引き続き実施例１と同様
に処理して精製酸可溶性コラーゲン溶液（濃度３．　Ｏ
ｑ／　ｍｊ）　１９８　ａｎｔを得た。収率は１８．０
％であった。また、実施例１と同様にしてゲル強度を測
定したところ、２４６ｇであった。

（実施例３）実施例２において、分散液の原料濃度０．２重量％およ
びｐＨ２，２を、原料濃度１．５重量％およびｐ　Ｈ３
，５に変えて分散を行い、２４時間後ＨＣ１゜溶液を加
えて、原料濃度０．２重量％、ｐ　Ｈ２，２に調整し直
ちに実施例１と同様にして遠心分離および精製を行い、
精製酸可溶性コラーゲン溶液１８１　ｍｌを得た。収率
は１６．５％であった。また、実施例１と同様にしてゲ
ル強度を測定したところ、２２０ｇであった。

（比較例１）実施例２において、分散液の原料濃度０．２重量％を１
．２重量％に変えた以外は、すべて実施例２と同じ条件
で処理したところ、遠心分離によって透明な酸可溶性画
分が得られなかった。

（比較例２）実施例２において、分散液のｐ　Ｈ２，２を３．５に変
えた以外は、すべて実施例２と同じ条件で処理したとこ
ろ、遠心分離によって透明な酸可溶性画分が得られなか
った。

（比較例３）新鮮な牛皮を実施例１と同様に精製した後、実施例１と
同様の条件で処理したところ、精製酸可溶性コラーゲン
溶液が得られたが、収率は３．４％であった。

（比較例４）新鮮な手足部から採取した股を、実施例１と同様に精製
した後、実施例２と同様の条件で処理したところ、精製
酸可溶性コラーゲン溶液が得られたが、収率は４．９％
であった。

Ｃ比較例５）実施例１と同様にして得られたコラーゲン分散液にペプ
シン（乾燥重量に対し、４％）を加え、攪拌しながら２
０℃で４８時間処理し、原料コラーゲンを溶解してアテ
ロコラーゲン溶液を得た。

この溶液を精製水を加えて２倍に希釈した後、グラスフ
ィルターで濾過し、残渣を除き、引き続き実施例１と同
様に精製処理を行って、精製アテロコラーゲン溶液を得
た。収率は８７．５％であった。この精製アテロコラー
ゲン溶液を実施例１と同様にしてゲル強度を測定したと
ころ、６５ｇと低いゲル強度であった。

第１表に、実施例および比較例でそれぞれ得た可溶性コ
ラーゲンの原料、収率およびゲル強度を示した。

第　　　１　　　表第１表にみるように、同じ酸処理であっても、豚由来の
原料からは高い収率で可溶性コラーゲンが得られている
のに対して、牛山来の原料からは低い収率でしか可溶性
コラーゲンが得られていない。同じ豚由来の原料からで
も、酵素処理コラーゲンは、酸可溶性コラーゲンに比べ
て非常に高い収率で得られている。しかし、酵素処理コ
ラーゲンは、ゲル化した場合、酸可溶性コラーゲンに比
べてゲル強度が非常に小さい。

〔発明の効果〕

この発明にかかる高ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法
は、以上にみるように、豚由来の動物組織を用いるよう
にするとともに、抽出により得られた溶液を、前記動物
組織の乾燥固形分量１重量％以下、ｐＨ３以下、遠心加
速度３００００９以下の条件で遠心分離にかけて不溶性
コラーゲンを除くことを特徴とするので、ゲル強度の高
いコラーゲンゲルを与えるコラーゲンを高い収率で得る
ことができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）動物組織から酸溶液により抽出して可溶性コラー
ゲンを得る方法において、前記動物組織として豚由来の
ものを用いるようにするとともに、抽出により得られた
溶液を、前記動物組織の乾燥固形分量１重量％以下、ｐ
Ｈ３以下、遠心加速度３００００ｇ以下の条件で遠心分
離にかけて不溶性コラーゲンを除くことを特徴とする高
ゲル強度酸可溶性コラーゲンの製法。