JPS636457A - 固定化酵素膜の酵素活性試験方法 - Google Patents
固定化酵素膜の酵素活性試験方法Info
- Publication number
- JPS636457A JPS636457A JP61148254A JP14825486A JPS636457A JP S636457 A JPS636457 A JP S636457A JP 61148254 A JP61148254 A JP 61148254A JP 14825486 A JP14825486 A JP 14825486A JP S636457 A JPS636457 A JP S636457A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- membrane
- electrode
- immobilized enzyme
- immobilized
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は溶液内の２９質濃度を酵素電極法で定量する際
に用いられる固定化酵素膜の酵素・活性試験方法に係り
、特に試験すべき固定化酵素膜を電極に直接装着するこ
となく、このため前記膜にシワ、剥離傷などが発生せず
、したがって、再び電極に装着したときの特性を保障し
得る固定化酵素膜の酵素活性試験方法に関する。
に用いられる固定化酵素膜の酵素・活性試験方法に係り
、特に試験すべき固定化酵素膜を電極に直接装着するこ
となく、このため前記膜にシワ、剥離傷などが発生せず
、したがって、再び電極に装着したときの特性を保障し
得る固定化酵素膜の酵素活性試験方法に関する。
酵素電極法は現在、臨床、食品、環境分野において、検
体中の被測定物質を迅速、簡便かつ高精度に定量できる
方法として広く用いられている。
体中の被測定物質を迅速、簡便かつ高精度に定量できる
方法として広く用いられている。
ところが、固定化酵素膜の製膜過程で酵素活性がバラツ
キなく一定になるように酵素を固定化することは通常非
常に難しい。したがって、製膜後の酵素活性の検査は固
定化酵素膜の品質管理上極めて重要である。
キなく一定になるように酵素を固定化することは通常非
常に難しい。したがって、製膜後の酵素活性の検査は固
定化酵素膜の品質管理上極めて重要である。
従来、この種の酵素活性の評価方法は第２図（Ａ）に示
されるように０リング２２に保持された固定化酵素膜２
１を、第２図（Ｂ）に示されるように指示電極２３と対
極２４で構成される固体電極の電極面に装着し、第２図
（Ｃ）に示される測定セル２７に挿入し、所定濃度の基
質溶液（試料液）２５の出力を測定する、いわゆる酵素
電極法が知られている。第２図（Ｃ）において、２６は
試料液流路である。ところが、この方法では固定化酵素
膜を電極に装着するために、膜面に力が加わり、この膜
を離したときにシワ、剥離傷などが付き易く、再び電極
に装着した場合の特性を保障できないという欠点があっ
た。
されるように０リング２２に保持された固定化酵素膜２
１を、第２図（Ｂ）に示されるように指示電極２３と対
極２４で構成される固体電極の電極面に装着し、第２図
（Ｃ）に示される測定セル２７に挿入し、所定濃度の基
質溶液（試料液）２５の出力を測定する、いわゆる酵素
電極法が知られている。第２図（Ｃ）において、２６は
試料液流路である。ところが、この方法では固定化酵素
膜を電極に装着するために、膜面に力が加わり、この膜
を離したときにシワ、剥離傷などが付き易く、再び電極
に装着した場合の特性を保障できないという欠点があっ
た。
本発明の目的は試験すべき固定化酵素膜を電極に直接装
着することなく、このためこの膜にシワ、剥離傷などが
発生せず、再び電極に装着したときの特性を保障し得る
、前述の公知技術に存する欠点を克服した非破壊性の固
定化酵素膜の酵素活性試験方法を提供することにある。
着することなく、このためこの膜にシワ、剥離傷などが
発生せず、再び電極に装着したときの特性を保障し得る
、前述の公知技術に存する欠点を克服した非破壊性の固
定化酵素膜の酵素活性試験方法を提供することにある。
前述の目的を達成するため、本発明によれば、溶液内の
基質濃度を酵素電極法で定量する際に用いられる固定化
酵素膜を所定の濃度、容量ならびに温度の基質溶液中に
攪拌しながら浸漬し、一定時間後、この基質溶液より前
記固定化酵素膜を引き上げ、この基質溶液中に含まれる
電極活性な酵素反応生成物を電気化学的手段により定量
し、前記固定化酵素膜の酵素活性を評価することを特徴
とする。
基質濃度を酵素電極法で定量する際に用いられる固定化
酵素膜を所定の濃度、容量ならびに温度の基質溶液中に
攪拌しながら浸漬し、一定時間後、この基質溶液より前
記固定化酵素膜を引き上げ、この基質溶液中に含まれる
電極活性な酵素反応生成物を電気化学的手段により定量
し、前記固定化酵素膜の酵素活性を評価することを特徴
とする。
すなわち、本発明は固定化酵素膜を所定の濃度、容量、
温度の基質溶液に浸漬することによって酵素反応条件を
一定とし、かつ膜に対する物理的損傷を防ぎ、また、前
記反応条件下で一定時間後に画定化酵素膜を基質溶液よ
り引き上げることにより該溶液内における酵素反応を停
止させ、酵素反応で生成した電極活性物質を電気化学的
に定量して固定化酵素膜内の酵素活性を評価しようとす
るものである。
温度の基質溶液に浸漬することによって酵素反応条件を
一定とし、かつ膜に対する物理的損傷を防ぎ、また、前
記反応条件下で一定時間後に画定化酵素膜を基質溶液よ
り引き上げることにより該溶液内における酵素反応を停
止させ、酵素反応で生成した電極活性物質を電気化学的
に定量して固定化酵素膜内の酵素活性を評価しようとす
るものである。
本発明において、固定化酵素膜中に担持される酵素は酸
化還元酵素であり、また、酵素反応生成物は過酸ｆヒ水
素、または酸素である。
化還元酵素であり、また、酵素反応生成物は過酸ｆヒ水
素、または酸素である。
さらに、本発明において、電気化学的手段は酸素または
過酸化水素を選択的に透過する選択透過膜の装着された
電極を用いるポーラログラフ法または酵素電極法である
。
過酸化水素を選択的に透過する選択透過膜の装着された
電極を用いるポーラログラフ法または酵素電極法である
。
叉籐握−上
第１図は本発明方法を実施するための反応器である。固
定化酵素膜１は所定量の標準基質溶液２とともに、底部
に攪拌子５の装着されたガラス容器３の中に投入される
。さらにこのガラス容器３は恒温水７を流すためのシリ
コンチューブ６をコイル状に巻きつけた容器８の中に装
入され、これら二つの容器３．８の間には水４が満たさ
れている。この水４はガラス容器３全体をマグネチンク
スターラ１０によって回転させるための潤滑液として、
および熱媒体としての機能を果たす。シリコンチューブ
６の外側は断熱材９で覆われ、これにより恒温水７の外
部への熱放散が防止される。
定化酵素膜１は所定量の標準基質溶液２とともに、底部
に攪拌子５の装着されたガラス容器３の中に投入される
。さらにこのガラス容器３は恒温水７を流すためのシリ
コンチューブ６をコイル状に巻きつけた容器８の中に装
入され、これら二つの容器３．８の間には水４が満たさ
れている。この水４はガラス容器３全体をマグネチンク
スターラ１０によって回転させるための潤滑液として、
および熱媒体としての機能を果たす。シリコンチューブ
６の外側は断熱材９で覆われ、これにより恒温水７の外
部への熱放散が防止される。
上述の反応器を用いて実験を行った結果、ガラス容器内
の基質溶液の温度変動は±０．３℃であり、固定化酵素
膜に物理的損傷を与えずに十分に基質溶液を攪拌できる
ことがわかった。
の基質溶液の温度変動は±０．３℃であり、固定化酵素
膜に物理的損傷を与えずに十分に基質溶液を攪拌できる
ことがわかった。
天産±−１
実施例１の反応器を用い、固定化酵素膜としてアルコー
ルオキシダーゼ（Ａ ＯＤ）膜、基質溶液として１０％
ＥｔＯＨ−ｐＨ７，０リン酸緩衝液１ｍｌ、設定温度３
０℃の条件で反応させた。ＡＯＤは式（１）％式％（１
） に示されるように、エタノールをアセトアルデヒドに酸
化し、その際、酸素を消費して過酸化水素を生成させる
酵素である。基質溶液内に生成した過酸化水素濃度は第
２図に示される固体電極にアセチルローズ膜を装着し、
指示電極２３に０．６４Ｖを印加して反応途中の基質溶
液１０μｌを測定セル２７に注入し、その際に流れる過
酸化水素の酸化電流値により決定した。
ルオキシダーゼ（Ａ ＯＤ）膜、基質溶液として１０％
ＥｔＯＨ−ｐＨ７，０リン酸緩衝液１ｍｌ、設定温度３
０℃の条件で反応させた。ＡＯＤは式（１）％式％（１
） に示されるように、エタノールをアセトアルデヒドに酸
化し、その際、酸素を消費して過酸化水素を生成させる
酵素である。基質溶液内に生成した過酸化水素濃度は第
２図に示される固体電極にアセチルローズ膜を装着し、
指示電極２３に０．６４Ｖを印加して反応途中の基質溶
液１０μｌを測定セル２７に注入し、その際に流れる過
酸化水素の酸化電流値により決定した。
第３図は基質溶液内に生成する過酸化水素濃度の経時変
化を表わしたグラフである。生成過酸化水素濃度は時間
に対して直線的に増大していることから、酵素反応が擬
−次反応で進行していることが第３図かられかる。
化を表わしたグラフである。生成過酸化水素濃度は時間
に対して直線的に増大していることから、酵素反応が擬
−次反応で進行していることが第３図かられかる。
さらに固定化酵素膜としてグルコースオキシダーゼ（Ｃ
ＯＤ）膜、基質溶液として５００■／ｄ！グルコース−
ｐＨ７，０リン酸緩衝液を用いて実験を行った。ＣＯＤ
は式（２）、すなわち、に示されるようにグルコースを
グルコン酸に酸化し、ＡＯＤと同様に酸素を消費して過
酸化水素を生成させる。生成過酸化水素濃度はＡＯＤと
同様、０乃至６０分の範囲で時間に対して直線的に増大
することがわかった。
ＯＤ）膜、基質溶液として５００■／ｄ！グルコース−
ｐＨ７，０リン酸緩衝液を用いて実験を行った。ＣＯＤ
は式（２）、すなわち、に示されるようにグルコースを
グルコン酸に酸化し、ＡＯＤと同様に酸素を消費して過
酸化水素を生成させる。生成過酸化水素濃度はＡＯＤと
同様、０乃至６０分の範囲で時間に対して直線的に増大
することがわかった。
以上の結果より各固定化酵素膜について一定時間の生成
過酸化水素濃度を測定することによって膜内の酵素活性
を評価することができる。
過酸化水素濃度を測定することによって膜内の酵素活性
を評価することができる。
大施五主
ＡＯＤ膜に関する実施例２の実験結果に鑑み、反応時間
を３０分、基質溶液を２００μ２とし、複数枚のＡＯＤ
膜について生成過酸化水素濃度を測定した。さらに、そ
れぞれのＡＯＤ膜を電極に装着し、酵素電極法で出力を
測定し、生成過酸化水素濃度との関係を検討した。この
結果を第４図に示す。
を３０分、基質溶液を２００μ２とし、複数枚のＡＯＤ
膜について生成過酸化水素濃度を測定した。さらに、そ
れぞれのＡＯＤ膜を電極に装着し、酵素電極法で出力を
測定し、生成過酸化水素濃度との関係を検討した。この
結果を第４図に示す。
第４図において、縦軸は上述の条件下での生成過酸化水
素濃度、横軸は酵素電極法で２０％エタノールの出力で
ある。ただし、酵素電極の出力は電極自体の過酸化水素
に対する感度の変動を補正するための６０ｐｐｍ過酸化
水素溶液の出力で割った値を採用した。
素濃度、横軸は酵素電極法で２０％エタノールの出力で
ある。ただし、酵素電極の出力は電極自体の過酸化水素
に対する感度の変動を補正するための６０ｐｐｍ過酸化
水素溶液の出力で割った値を採用した。
第４図のグラフより生成過酸化水素濃度を測定すれば、
電極に装着したときのセンサ出力が推定できる。したが
って、本発明による固定化酵素膜の酵素活性の評価試験
が酵素；掻における出力のバラツ牛低減に有効であるこ
とがわかる。
電極に装着したときのセンサ出力が推定できる。したが
って、本発明による固定化酵素膜の酵素活性の評価試験
が酵素；掻における出力のバラツ牛低減に有効であるこ
とがわかる。
また、前述の実施例では生成する過酸化水素濃度を測定
化学種としたが、反応前後の溶存酸素濃度差、すなわち
酵素反応で消費される酸素濃度を測定してもよい。その
際第１図のガラス容器３の内部は不活性ガスで置換し、
密閉する必要がある。
化学種としたが、反応前後の溶存酸素濃度差、すなわち
酵素反応で消費される酸素濃度を測定してもよい。その
際第１図のガラス容器３の内部は不活性ガスで置換し、
密閉する必要がある。
さらに酸素濃度の検出には指示電極２３の印加電圧を０
．６０Ｖとするボーラロ型酸素電極を用いる。
．６０Ｖとするボーラロ型酸素電極を用いる。
上述の本発明によれば、固定化酵素膜を所定の濃度、容
量、温度の基質溶液に一定時間浸漬し、電極活性な反応
生成物を電気化学的手段により定量することにより、固
定化酵素膜に物理的損傷を与えずに、かつ正確な酵素活
性の評価を行うことができる。その結果、酵素活性評価
のための膜のロスがなくなるのみならず、全数試験によ
るスクリーニングが可能となる。
量、温度の基質溶液に一定時間浸漬し、電極活性な反応
生成物を電気化学的手段により定量することにより、固
定化酵素膜に物理的損傷を与えずに、かつ正確な酵素活
性の評価を行うことができる。その結果、酵素活性評価
のための膜のロスがなくなるのみならず、全数試験によ
るスクリーニングが可能となる。
第１図は本発明方法を実施するための反応器の断面図で
あり、第２図（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は従来公知の酵素
電極の測定系の構成図であり、第３図は生成過酸化水素
濃度の経時変化を表したグラフであり、第４図は生成過
酸化水素濃度と酵素電極の出力との関係を表したグラフ
である。 ■、２１・・固定化酵素膜、２・・基質溶液、３・・ガ
ラス容器、 ５・・攪拌子、６・・シリコンチューブ
、７・・恒温水、１０・・マグネテインクスターラー、
あり、第２図（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は従来公知の酵素
電極の測定系の構成図であり、第３図は生成過酸化水素
濃度の経時変化を表したグラフであり、第４図は生成過
酸化水素濃度と酵素電極の出力との関係を表したグラフ
である。 ■、２１・・固定化酵素膜、２・・基質溶液、３・・ガ
ラス容器、 ５・・攪拌子、６・・シリコンチューブ
、７・・恒温水、１０・・マグネテインクスターラー、
Claims (3)
- （１）溶液内の基質濃度を酵素電極法で定量する際に用
いられる固定化酵素膜を所定の濃度、容量ならびに温度
の基質溶液中に撹拌しながら浸漬し、一定時間後、この
基質溶液より前記固定化酵素膜を引き上げ、この基質溶
液中に含まれる電極活性な酵素反応生成物を電気化学的
手段により定量し、前記固定化酵素膜の酵素活性を評価
することを特徴とする固定化酵素膜の酵素活性試験方法
。 - （２）特許請求の範囲第１項に記載の方法において、固
定化酵素膜中に担持される酵素が酸化還元酵素であり、
酵素反応生成物が過酸化水素、または酸素である試験方
法。 - （３）特許請求の範囲第１項に記載の方法において、電
気化学的手段が酸素、あるいは過酸化水素を選択的に透
過する選択透過膜の装着された電極を用いるポーラログ
ラフ法または酵素電極法を用いる試験方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61148254A JPS636457A (ja) | 1986-06-26 | 1986-06-26 | 固定化酵素膜の酵素活性試験方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61148254A JPS636457A (ja) | 1986-06-26 | 1986-06-26 | 固定化酵素膜の酵素活性試験方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS636457A true JPS636457A (ja) | 1988-01-12 |
Family
ID=15448672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61148254A Pending JPS636457A (ja) | 1986-06-26 | 1986-06-26 | 固定化酵素膜の酵素活性試験方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS636457A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019111551A1 (ja) * | 2017-12-06 | 2019-06-13 | 株式会社アドバンテスト | 温度測定装置、リアクター、酵素活性度の評価装置およびその評価方法 |
| WO2020005810A1 (en) * | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Basf Se | Methods of measuring enzyme activity in coating compositions |
-
1986
- 1986-06-26 JP JP61148254A patent/JPS636457A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019111551A1 (ja) * | 2017-12-06 | 2019-06-13 | 株式会社アドバンテスト | 温度測定装置、リアクター、酵素活性度の評価装置およびその評価方法 |
| JP2019100950A (ja) * | 2017-12-06 | 2019-06-24 | 株式会社アドバンテスト | 温度測定装置、リアクター、酵素活性度の評価装置およびその評価方法 |
| WO2020005810A1 (en) * | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Basf Se | Methods of measuring enzyme activity in coating compositions |
| CN112513287A (zh) * | 2018-06-28 | 2021-03-16 | 巴斯夫欧洲公司 | 测量涂料组合物中的酶活性的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cammann et al. | Chemical sensors and biosensors—principles and applications | |
| EP0035480B1 (en) | Enzyme electrode using electrolytic oxygen | |
| US4127448A (en) | Amperometric-non-enzymatic method of determining sugars and other polyhydroxy compounds | |
| US4230537A (en) | Discrete biochemical electrode system | |
| US3838034A (en) | Apparatus for detection of catalase-containing bacteria | |
| US4065357A (en) | Detection of catalase-containing bacteria | |
| Wangsa et al. | Fiber-optic biosensors based on the fluorometric detection of reduced nicotinamide adenine dinucleotide | |
| JPS61128152A (ja) | 生物化学センサ | |
| Karube et al. | Amperometric determination of ammonia gas with immobilized nitrifying bacteria | |
| Belghith et al. | An enzyme electrode for on‐line determination of ethanol and methanol | |
| US4350763A (en) | Method for determining biochemical oxygen demand | |
| JPH046907B2 (ja) | ||
| Mascini et al. | Determination of free and total cholesterol in human bile samples using an enzyme electrode | |
| Pemberton et al. | An assay for the enzyme N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase) based on electrochemical detection using screen-printed carbon electrodes (SPCEs) | |
| Vlasov et al. | Enzyme semiconductor sensor based on butyrylcholinesterase | |
| JPS636457A (ja) | 固定化酵素膜の酵素活性試験方法 | |
| Filipović-Kovačević et al. | Cyanide determination in fruit brandies by an amperometric biosensor with immobilised Saccharomyces cerevisiae | |
| Shimohigoshi et al. | Development of uric acid and oxalic acid sensors using a bio-thermochip | |
| Kuntawong et al. | A Prussian Blue Modified Electrode Based Amperometric Sensor for Lactate Determination | |
| Flanagan et al. | Thin‐film antimony–antimony‐oxide enzyme electrode for penicillin determination | |
| Duffy et al. | A conductometric device for monitoring of enzyme-catalyzed reactions | |
| Kriz et al. | SIRE-technology. Part I. Amperometric biosensor based on flow injection of the recognition element and differential measurements | |
| Filipović-Kovačević et al. | Amperometric biosensor for monitoring respiration activity of Saccharomyces cerevisiae in the presence of cobalt and zinc | |
| Morelis et al. | Rapid and sensitive discriminating determination of acetylcholinesterase activity in amniotic fluid with a choline sensor | |
| JPH01228498A (ja) | 微生物濃度の迅速測定法及びその装置 |