JPS6366200B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は駆虫剤及び殺ダニ剤として有用な抗生
物質Ｂ−41D、Ｅ及びＧを工業的に有利に製造す
る方法に関する。 Ｂ−41D、Ｅ及びＧは、ストレプトマイセス属
に属するＢ−41生産菌、例えばＢ−41−146株の
培養によつて得られる抗生物質であつて、次の構
造式を有し、 動物に寄生する蠕虫とくに線虫及び動植物に寄
生するダニの駆除等に有効であることは、特開昭
56−32481号公報、特願昭55−153141号（特開昭
57−77686号）明細書及び特願昭56−7091号（特
開昭57−120589号）明細書に知られている。 ところで、通常の方法でＢ−41生産菌を培養し
た場合、上記構造式に対応して25位がメチル基で
あるＢ−41A₁、A₃、B₂及び25位がエチル基であ
るＢ−41A₄、B₃、B₂などを同時に生産するため、
25位がイソプロピル基である最も活性なＢ−
41D、Ｅ及びＧをより収率よく生産する方法が望
まれる。 本発明者等は、Ｂ−41生産菌を培養するに際
し、培地に特定の物質を添加することにより、Ｂ
−41D、Ｅ及びＧが高収量で生産されることを見
い出した。 本発明は、ストレプトミセス属に属するＢ−41
生産菌を培養してＢ−41D、Ｅ及びＧを製造する
に際し、バリン、イソ酪酸、イソ吉草酸、２−ケ
トイソ吉草酸、イソカプロン酸、これらの酸の塩
またはエステル、イソブタノール及びそのエステ
ルから選ばれた１種または２種以上を培地に添加
することを特徴とするＢ−41D、Ｅ及びＧの製造
法である。 Ｂ−41生産菌、例えばストレプトミセス属Ｂ−
41−146株は通産省工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第1072号として寄託されてお
り、その菌学的性状は特開昭50−29472号公報に
詳しく記載されている。本発明において使用する
菌には、上記Ｂ−41−146株を例えばＸ線照射、
紫外線照射、放射線照射、人工変異剤を用いて人
工変更したものであつて、Ｂ−41D、Ｅ及びＧの
生産能を有するものは包含される。 本発明の方法において培地中に添加するバリン
はＬ体又はDLの光学異性体が用いられる。バリ
ン、イソ酪酸、イソ吉草酸、２−ケトイソ吉草
酸、イソカプロン酸のうちではＬ−またはDLバ
リン、イソ酪酸、２−ケトイソ吉草酸は好適に用
いられる。これらの酸の塩としてはナトリウム
塩、カリウム塩などがあげられ、エステルとして
はメチル、エチル、ｎ−ブチルのような低級アル
キルエステルまたはベンジルエステルがあげられ
る。イソブタノール及びそのエステルも用いるこ
とができ、エステルとしては酢酸、プロピオン酸
のような低級飽和脂肪酸とのエステルがあげられ
る。上記添加物の ¹³C−ラベル化合物を用いた実
験では生成物の25位にイソプロピル基が特異的に
取り込まれていることが確認された。 培地に対するこれら添加物の添加量は一般的に
は0.001〜1W／Ｖ％、好ましくは0.005〜0.01W／
Ｖ％が添加される。添加時期は培地の調製時また
は培養中の適宜の段階で添加してもよい。 Ｂ−41生産菌の培養に用いられる培地は該微生
物が利用しうる栄養源を含むものならよく、上記
添加物を添加するほか、炭素源としてはグルコー
ス、しよ糖、殿粉、グリセリン、水あめ、糖蜜、
大豆油などが使用され、窒素源としてはスキムミ
ルク、大豆粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、
酵母菌体、コーンスチープ・リカー、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム等が使用される。この
ほか必要に応じて炭酸カルシウム、食塩、塩化カ
リ、リン酸塩類を添加することができる。 培養法としては、一般の抗生物質を生産する方
法と同じく液体培養法、とくに深部培養法が最も
適している。培養は好気的条件下で行なわれ、培
養に適当な温度は22〜30℃であるが多くの場合28
℃付近で培養する。培地の液性は概ねPH5.5〜8.0
の間でよく、望ましくはPH約6.5〜7.5の中性近傍
でよりよい結果をうることができる。培養はＢ−
41D、ＥおよびＧの蓄積濃度が最大となる迄行な
うが、これに要する時間は、培養の方法、温度、
培地の組成など条件によつて差はあるものの、通
常約５〜15日程度である。 Ｂ−41各成分の検定にあたつては次の方法が用
いられる。すなわち、培養物３mlを小試験管にと
り、アセトン７mlを添加振とうして抽出し遠心分
離する。ここで得られた上澄の10〜20μをTLC
用板（メルク社製、Kieselgel 60 F₂₅₄）上の所
定の位置に吸着せしめ、これをジオキサン：四塩
化炭素（18：82）で４時間展開後、二波長クロマ
トスキヤナを用いて245nｍの波長（ブランクは
380nｍ）で測定し、その吸収量を標準物質のそ
れと比較し、算出する。 Ｂ−41D、ＥおよびＧを培養物から採取するに
あたつては、活性炭、アルミナ、シリカゲルなど
の吸着剤、ダイヤイオンHP−10、HP−20（三菱
化成社製）などの合成吸着剤、アビセル（旭化成
社製）、紙などの固定剤、イオン交換樹脂、イ
オン交換ゲル過剤などが使用されうるが、以下
に示す採取方法が最も効果的である。 培養物を、けいそう土などの過助剤を用いて
別し、ここで得られたケーキをメタノール抽出
することにより、目的物はメタノール水に溶解し
てくる。これに水を加えた後、ｎ−ヘキサンで抽
出し、これを減圧下で濃縮することにより、目的
物を含有するオイル状物質が得られる。これをシ
リカゲル（ワコーゲルＣ−200）のカラムに吸着
せしめ、ｎ−ヘキサン：アセトン（95：５）で溶
出し、Ｂ−41Dを含有するフラクシヨン、Ｂ−
41Eを含有するフラクシヨンおよびＢ−41Gを含
有するフラクシヨンを集める。各フラクシヨンは
減圧下で濃縮し、ここで得られた残渣を少量のｎ
−ヘキサン：酢酸エチル（20：１）に溶解し、室
温に放置するとＢ−41D、Ｂ−41E、Ｂ−41Gが
それぞれ結晶状に得られる。 本発明の方法によれば特にＢ−41D、Ｅおよび
Ｇ成分の生成比率が非常に高く、また生成量も増
大するので、分離精製が容易になり工業生産上き
わめて有利な方法である。 以下実施例を挙げて、本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ 種培地（シユクロース１％、ポリペプトン0.35
％、K₂HPO₄0.05％）100mlを500mlエルレンマイ
ヤーフラスコに分注し、滅菌後、Ｂ−41−146株
を１白金耳接種し、48時間28℃で培養し、種培養
とした。 この１mlを主培地（グルコース４％、大豆粉１
％、スキムミルク１％、NaCl0.3％、コーンスチ
ープ・リカー0.2％及びCaCO₃0.05％）20ml含む
100mlエルレンマイヤーフラスコに接種し、28℃
で３日振とう培養したのち、DL−バリン−２−
¹³Cを0.01W／Ｖ％になるように添加し、さらに
２日間培養した。培養終了時、培養物中に生成し
たＢ−41群抗生物質のうちＢ−41Dの占める割合
は約65％、Ｅの割合は18％及びＧの割合は５％で
あつた。なお添加物なしに培養したときＤ、Ｅお
よびＧの占める割合は、それぞれ37％、９％およ
び２％であつた。 DL−バリン−２− ¹³Cを添加して培養した培
養物を過し、菌体をメタノール抽出した。これ
に水を加えて50％メタノール溶液にし、ｎ−ヘキ
サンで抽出した。得られたｎ−ヘキサン層は芒硝
で脱水後、減圧下で濃縮し、オイル状物質を得
た。このオイル状物質をシリカゲルカラムさらに
ローバーカラム（メルク社製）で精製し、Ｂ−41
物質の各成分を単離した。得られた各成分中の
¹³Cの取り込みを、400メガヘルツの ¹³C−NMR
及びマス・スペクトルで測定したところ、DL−
バリン−２− ¹³Cの ¹³CがＢ−41D、ＥおよびＧ
のＣ−25位に特異的に取り込まれている事がわか
つた。 実施例 ２ 実施例１の種培養物をグルコース６％、アスパ
ラギン0.3％、ロイシン0.5％、リン酸第２カリウ
ム0.05％、硫酸マグネシウム0.05％、食塩0.05％、
塩化カルシウム0.02％、硫酸亜鉛0.005％、硫酸
マンガン0.001％、硫酸第１鉄0.002％及び微量の
ビタミン類からなる培地20mlに１mlづつ接種し、
Ｌ−バリン、イソ酪酸、２−ケトイソ吉草酸、イ
ソカプロン酸及びイソブタノールを第１表に示す
条件で添加して、28℃で８日間振とう培養した結
果、第１表に示す結果が得られた。

【表】 実施例 ３ 実施例１に示した種培地を調製し、その600ml
を2000mlエルレンマイヤーフラスコに分注し、滅
菌した。これにＢ−41−146株を１白金耳接種し、
48時間28℃で培養を行ない、この2000mlエルレン
マイヤーフラスコ２本を30ジヤー・フアメンタ
に移植した。ジヤー・フアメンタには、グルコー
ス４％、大豆粉１％、コーンスターチ0.5％、ス
キムミルク１％、コーンスチープ・リカー0.2％、
食塩0.3％及びCaCO₃0.05％を含有する培地20
を仕込み、PHを7.2〜7.5に調節し、十分に滅菌し
ておいた。培養期間中は、28℃、内圧0.5Kg／cm²
に保持した。３日培養後DL−バリンを0.01％添
加しさらに５日間培養した。Ｂ−41群抗生物質総
生産量のうちＤは68％（重量比）の割合を占め
た。同条件でDL−バリンを添加せず培養した場
合には、Ｂ−41Dの割合は35％にとどまつた。
DL−バリンを添加して得られた培養物20のPH
を硫酸で３とし、セライト１Kgを加えて加圧過
すると約３Kgのケーキが得られた。これを15の
メタノールで抽出し、別し、得られたメタノー
ル溶液15に水10を加え、20のｎ−ヘキサン
で抽出した。得られたｎ−ヘキサン層は芒硝で脱
水後、40〜45℃水浴中で減圧下濃縮すると23ｇの
オイルが得られた。これを約30mlのｎ−ヘキサン
にとかし、あらかじめ２Kgのシリカゲルをｎ−ヘ
キサンでつめてあるカラムに吸着せしめ、ｎ−ヘ
キサン：アセトン（95：５）で展開した。その結
果目的物質Ｂ−41Dを含有するフラクシヨンを
2.5得た。これらを前述と同様の条件で濃縮す
るとＢ−41Dの粗結晶が得られた。これをｎ−ヘ
キサン：酢酸エチル（20：１）に溶解後、室温に
放置し、析出する結晶を取し、Ｂ−41Dの精結
晶210mgを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ストレプトマイセス属に属する抗生物質Ｂ−
   41生産菌を培養してＢ−41D、Ｅ及びＧを製造す
   るに際し、バリン、イソ酪酸、イソ吉草酸、２−
   ケトイソ吉草酸、イソカプロン酸、これら酸の塩
   またはエステル、イソブタノール及びそのエステ
   ルから選ばれた１種または２種以上を培地に添加
   することを特徴とするＢ−41D、Ｅ及びＧの製造
   法。 ２ Ｂ−41生産菌がストレプミセス属Ｂ−41−
   146株である特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ Ｂ−41Dを製造するための特許請求の範囲第
   ２項記載の製造法。 ４ ストレプトミセス属Ｂ−41−146株を、Ｌ−
   またはDL−バリン、イソ酪酸、２−ケトイソ吉
   草酸およびこれらの酸の塩またはエステルから選
   ばれた１種または２種以上を添加した培地に培養
   してＢ−41Dを製造する特許請求の範囲第１項記
   載の製造法。