JPS6368072A - コラ−ゲン担体での微生物培養方法、該培養方法を実施するための担体および該培養方法の実施により得られる生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、コラーゲン担体での微生物培養方法、特に細
胞培養方法と、この培養方法を実施するための担体に関
するものである。本発明はまた、この培養方法の実施に
より得られる新規な生成物にも関する。

従来の技術 ３次元細胞培養システムの研究が急速に進んだ結果、こ
のシステムを医学やバイオテクノロジーの分野で広く応
用することができる状態になっている。

重い火傷患者の皮膚を再生するという問題を解決するた
め、皮膚の自己移植や同種移植のほか、皮膚をコラーゲ
ンをもとにした人造または再生シートあるいはフィルム
で覆うという方法が試みられている。ところで、重度の
火傷の場合、十分な量の皮膚を自己移植することは難し
い。また、皮膚を同種移植する場合は一般に拒絶反応が
起こる。

このため、以前から、インビトロで人造皮膚を完成する
ことが精力的に研究されている。

生体の細胞以外の部分の主構成要素であるコラーゲンは
、細胞培養の目的で３次元ゲルとしてさかんに研究され
てきた。特に、造血細胞の培養（ＬＡＮＯＴＴＥ！　Ｍ
、のｒＴｅｒｍｉｎａｌ　ｄｉｆｆｅｒｎｔｉａｔｉｏ
ｎ　ｏｆｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｌ　ｃｌｏｎｅ
ｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｔｒｉｄｉｍｅｎ−ｓｉ
ｏｎａｌ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｍａｔｒｉＸ　：　ｉｎ
　５ｉｔｕ　ｃｅｌｌ　ｍｏｒｐｈｏ−Ｉｏｇｙ　ａｎ
ｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪＢ
ｉｏｌ、　Ｃｅ１ｌ第１ｌ巻、１９８４年、１０７〜１
２０ページを参照のこと）、甲状線源細胞（ＣＩ（ＡＭ
ＢＡＲＤ　Ｍ、、　ＶＢＲＲＩＥ！Ｉｌｌ　ｅ、、　Ｇ
ＡＢＲＩＯＮＪ、およびＭＡＵＣＨＡＭＰ　Ｊ、のｒＰ
ｏｌａｒｉｔｙ　ｒｅｖｅｒｓａｌ　ｏｆｉｎｓｉｄｅ
−ｏｕｔ　ｔｈｙｒｏｉｃｌ　ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ　ｃ
ｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈｉｎｃｏｌｌａｇｅｎ　　ｇ
ｅｔ　　：　　ｒｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｏｆ　　
５ｐｅｃｉｆｉｃ　　ｆｕｎｃ−ｔｉｏｎｓＪ　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｅ１ｌ第１ｌ巻、１９８４年、３１５−３２６
ページを参照のこと）、人造真皮製造用のベル（ＢＢＬ
Ｌ）モデルに従う皮膚繊維芽細胞（ＣＯＵＬＯＭＢ　Ｂ
、。

ＤＩＩＢＥＲＴＲＢＴＬ、、　ＢＢＬＬ　Ｂ、、　ＭＩ
ＥＲＲＩＬＬ　Ｃ１，ＦＯ３ＳＢ　Ｍ、。

ＢＲＢＴＯＮ−ＧＯＲＩＩＩＳ　Ｊ、、　　ＰＲＯ３Ｔ
　Ｃ，およびＴＯＵＲＡＩＮＩＥ　Ｒ。

のｒＥｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ　
ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｈｕｍａｎｄｅｒｍｉｓ：　ａ　
ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔｉａ−ｔｉｏｎＪＪ、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅ
ｒｍａｔｏｌ、第８１　（１）巻、１９８３年、７５〜
７８ヘージおよびＣＯＵＬＯＭＢ　Ｂ、、　ＤＩＩＢＢ
ＲＴＲ８Ｔ　Ｌ、。

ＢＥＬＬ　Ｅ、　およびＴ［］１ＩＲＡＩＮＥ　Ｒ，の
ｒＴｈｅ　ｃｏｎｔｒａｃｔローｉｔｙ　ｏｆ　ｆｉｂ
ｒｏｂｌａｓｔｓ　ｉｎ　ａ　ｃｏｌｌａｇｅｎｌａｔ
ｔｉｃｅ　１ｓｒｅｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｃｏｒｔｉｃｏ
ｓｔｅｒｏｉｄｓＪＪ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａ
−ｔｏｌ、第８２　（４）巻、１９８４年３４１〜３４
４ページを参照のこと）が研究されている。この中でも
特に皮膚繊維芽細胞の研究が盛んである。

最後に引用した論文の著者達によると、ペプシン処理さ
れていないＩ型のコラーゲンのみが繊維芽細胞の存在下
で伸縮性をもち、機械的に堅固で手での取扱いが可能な
網構造を形成する。

このような人造真皮およびその製造方法は、アメリカ合
衆国特許第４．４８５．０９６号と特許出願ＷＯ３０１
０１３５０号に記載されている。この２つの文献による
と、子牛またはラットの皮膚または腺から得られるコラ
ーゲン、すなわちＩ型の動物性コラーゲンとヒトの繊維
芽細胞とを適当な培地の存在下で混合することにより人
造真皮を得ることができる。この製造方法の要点は、繊
維芽細胞が生存するコラーゲンゲルとなるはずの混合物
を形成することにある。このコラーゲンゲルは、コラー
ゲン繊維にくっつく繊維芽細胞の作用により収縮して、
コラーゲン網となる。次いで、このようにして得られた
人造真皮の表面に、火傷患者自身から採取した上皮細胞
またはケラチン細胞を接種する。

コラーゲンの応用に関する上記の研究は、医学の分野で
重要な意味をもつ。特に、火傷患者の治療、新しい包帯
、癒合剤、生体組織接触部位補綴物質の開発にとって重
要である。

従って、あらゆる炎症反応や免疫反応を逃れるためには
、ヒトのコラーゲンと同じあるいはヒトのコラーゲンに
できるだけ近いコラーゲンを利用できることが重要であ
ることが理解される。ところで、現在市販されていて適
当な価格で十分な量を人手できるコラーゲン調剤はラッ
トの尾または腺、あるいは若い動物（子牛、子豚）の皮
膚から得られたもので、すべてＩ型のコラーゲンから構
成されている。しかし、このコラーゲン調剤は、使用す
ることにより受容生体に炎症反応や免疫反応を起こす危
険性があるという欠点をもつ。

ところで、３次元的に細胞を培養する、特に人造真皮を
製造する目的で皮膚繊維芽細胞を３次元的に培養するた
めには、酵素処理を施していないラットまたは牛の酸可
溶性コラーゲンを使わざるをえないことが多くの文献に
記載されている。例えば、ＰＲＢＹ他の第１回Ａｔ１ａ
ｎｔｉｃ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎＣｏｌｌａｇｅｎ　
（リヨン、１９８５年９月）での発表を参照されたい。

酸可溶性動物性コラーゲン調剤にこのコラーゲンのテロ
ペプチドが含まれているものは非常に免疫原性が強い。

このことは、ヒトの治療に応用する目的でこの種のコラ
ーゲン調剤を開発するにあたっての大きな問題点となる
可能性がある。

従って、ヒトのコラーゲンを利用できることが望ましい
。しかし、ヒトからのコラーゲン抽出を実際に工業的ス
ケールで行うのは、胎盤から以外は実現不可能である。

この点に関してはフランス国特許第８１２２６０６号お
よび第８５１３（１６）４号を参照されたい。この２つ
の特許だけでなく、この問題について記載のある他の文
献によると、酸可溶性のヒトの胎盤コラーゲンを十分な
量抽出するためには、酸素処理または化学処理を施して
コラーゲンのテロペプチド間および他の分子間の結合を
切断する必要がある。結合を切断するためには、一般に
、酸性溶媒中でペプシン処理する。

ところで、上記の文献には、酵素処理または化学処理し
たコラーゲンが細胞を３次元的に培養する担体には適さ
ないことがはっきりと記載されている。

上記のフランス国特許第８１２２６０６号に記載の方法
は、胎盤コラーゲンをアルカリ処理する方法であるが、
場合によってはさらに、アルカリ処理したコラーゲンを
ペプシンを用いて可溶化する。このようにして得られた
コラーゲンは細胞培養用の担体には適していない。

しかし、驚くべきことに、本発明によれば、通常の酵素
処理、特にペプシン処理を施したヒトの胎盤コラーゲン
をもとにして、中性ｐＨの水に溶けず、温度範囲２５〜
４０℃、特に３７℃で安定な繊維からなるゲルを形成で
きることが判明した。このゲルには細胞、特に繊維芽細
胞が生存可能であり、ペプシン処理を施していない動物
性コラーゲンのもつ伸縮性がある。

発明の目的 本発明は、工業的スケールで利用可能な、ヒトの胎盤コ
ラーゲンをもとにした微生物培養用コラーゲン担体を製
造する方法を提供することを目的とする。

本発明の別の目的は、細胞、特に繊維芽細胞の存在下で
伸縮性をもち、手での取扱いが可能な機械的強度を有す
るコラーゲン担体を製造する方法を提供することである
。

本発明の別の目的は、コラーゲンを主成分とするシート
を形成することのできる３次元的微生物培養法を提供す
ることである。

本発明のさらに別の目的は、細胞の培養だけでなく細胞
上にウィルスを培養することのできる、分散状態での微
生物培養法を提供することである。

発明の構成 本発明によれば、コラーゲン担体上に微生物を培養する
方法であって、酵素処理を施したＩおよび／または■型
胎盤コラーゲンをもとにして、中性ｐ−Ｈ下かつ細胞培
養温度、特に約３７℃で安定なゲル担体を形成し、該担
体上に細胞のコロニーを形成させることを特徴とする方
法が提供される。

好ましい実施態様によれば、担体は、酸性溶媒中でペプ
シン処理したコラーゲンゲルをもとにして形成する。

本発明によればさらに、上記の微生物培養法を実施して
細胞のコロニーを形成するのに用いる上記ゲルからなる
担体が提供される。担体は、いろいろな形状にすること
が可能である。

特に、担体はシートの形状であることが好ましい。

しかし、担体は、微粒子、例えば球状微粒子の形状にす
ることも可能である。微粒子担体を培地中に分散状態に
してこの微粒子担体上に細胞を培養することができる。

本発明によればさらに、シートや微粒子状であり、癒合
剤としての用途があるコラーゲン担体を得ることができ
る。

本発明の微小コラーゲン担体は、ウィルスの培養やワク
チンの製造にも用いることができる。

実施例 本発明の他の利点および特徴は、添付の図面を参照した
以下の説明により明らかになろう。以下の実施例は単な
る例であって、本発明を限定するものではない。

実施例１ Ｉ＋Ｉ［［型のヒトの胎盤コラーゲンの製造方法。

凍結したヒトの胎盤３（１６）ｋｇを粉砕して数ｃＩ１
１の大きさの破片にする。破片は、最終的にエタノール
８％、ＮａＣ１６ｇ／ｊ７．セルロース１０ｋｇを含む
水溶液３（１６）１に混合する。１０℃で撹拌した後、
この混合溶液を圧搾機を用いて圧搾して血液と胎盤繊維
を分離する。すると、胎盤繊維が１０２ｋｇ得られる。

この胎盤繊維には水が６５％含まれている。

圧搾機により抽出された胎盤繊維をｐＨ７，２の０．０
５Ｍクエン酸ナトリウム５（１６）１中で１０℃にして
３０分間撹拌して洗浄した後、圧搾して胎盤繊維を回収
する。同じクエン酸ナトリウム５（１６）１にＮａＣ’
１を３０ｇ／Ｉｔの割合で添加して、胎盤繊維をもう一
回洗浄する。圧搾して胎盤繊維を回収した後、やはりｐ
Ｈ７，２の０．０５Ｍクエン酸ナトリウム５（１６）　
Ｉｌを用いて３回目の洗浄を行う。このように中性ｐＨ
の溶液を用いて洗浄を行った胎盤繊維は、次に酸性ｐＨ
溶液中で何回か続けて洗浄することが好ましい。

この場合温度は１０℃に保ったままにする。

この洗浄は、ＨＣＩを添加することによりｐｈが２．８
と酸性になったクエン酸水溶液中で行い、次に０．５Ｍ
の蟻酸中で約１５時間行い、さらにＮａＣ１を２０ｇ／
Ｉ！。

の割合で添加したクエン酸中で行うとよい。

酸性ｐＨの溶液で洗浄して圧搾により回収した胎盤繊維
は白色である。このことは、最初に胎盤繊維に含まれて
いた血液色素がきれいに除去されたことを意味している
。得られた胎盤繊維の重量は８２ｋｇである。

この胎盤繊維を酵素を用いて消化させる。そのために、
ペプシン３（１６）ｇを含むｐＨ２，８で０．０５Ｍの
クエン酸５（１６）１を用いる。消化は＋１０℃で１５
時間行わせる。

分散状態になった溶液に＋１０℃の水を５（１６）１加
えて希釈してｐＨ７，５に調整したする。この溶液を＋
１０℃に保って１５時間放置した後に遠心分離すると重
要なＩ型と■型のコラーゲンがまだ含まれている胎盤繊
維残留物が得られる。得られる胎盤繊維残留物は１０３
ｋｇである。

この胎盤繊維残留物を、ペプシン３（１６）ｇを含むｐ
Ｈ２，８で０．（１５Ｍのクエン酸８（１６）　ｊ２に
再び入れて＋１０℃で７２時間放置する。この結果得ら
れた分散液に５０ｇ／ｊ２の割合のＮａＣ１を２（１６
）１加えて希釈した後、遠心分離により胎盤繊維残留物
を除去する。

上澄液にＮａＯＨを添加してｐＨを７．５に調整するこ
とによりペプシンを変性させる。２時間放置し。

た後に４ＮのＨＣＩを添加してｐＨを２．７に再調整す
る。この分散液を＋４℃に保って１５時間放置した後、
遠心分離する。沈澱物を除去し、上澄液にＮａＣ１を３
０ｇ／βの割合で添加する。＋４℃に保って１５時間放
置した後、形成されたコラーゲン沈澱物を遠心分離する
ことにより回収する。沈澱物は１２ｋｇ得られる。この
沈澱物を０．０１ＭのＨＣＩ　６（１６）ｊ！に再び溶
解させてから２４ｇ／βの割合のＮａＣｌ　６（１６）
１を加えて希釈する。この分散液を＋４℃に保って１５
時間放置した後、遠心分離により沈澱物を除去する。上
澄液にＮａＣｌを添加して濃度を最終的に３０ｇ／βと
する。

４℃に保って１５時間放置した後に形成されているコラ
ーゲン沈澱物を遠心分離により回収する。

得られる沈澱物の重量は８ｋｇである。

この沈澱物は、アセトンを用いて何回か洗浄した後、無
菌空気流中で乾燥させる。すると、■型と■型が混在し
た無菌の乾燥コラーゲン繊維が１ｋｇ得られる。

実施例２ ゲルの製造方法。

実施例１で得られた乾燥繊維からなる粉末を無菌水に溶
かして濃度を２ｇ／ｊ！とする。

このコラ−ゲンゲルをＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｄ［ＩＬＢＥ
ＣＣＯＭｏｄｉｆｉｅｄ　ＢＡＧＬＢ　Ｍｅｄｉｕｍ）
濃縮培地と混合すると、均一な分散液が得られる。この
分散液の組成は以下の通りである。

ＤＭＥＭ　　５　ｘ　ｃ　　　　　　　１．（１６）ｍ
ｅＨ２（１６），５５ｍｅ Ｆ　Ｃ３０，４５ｍ コラーゲン（２ｍｇ／−）　　　　２．５〇−この分散
液を、容器に非常にゆっくりと注ぎ込んで所望の形状に
する。

実施例３ 実施例２で得られた分散液を、底が細胞集合単一層で覆
われた直径５ｃｍのファルコンフラスコに非常にゆっく
りと注ぎ込む。さらに、子牛の血清を１０％含むＤＭＥ
Ｍを０．５ｍｌ添加する。

中性ｐＨで３７℃に保つとコラーゲンゲルが速やかに重
合する。

このようにして培養した細胞をＣＯ２が多く含まれる空
気中で３７℃に維持する。培地は定期的に交換する。

この結果、コラーゲンゲル層は、厚さが徐々に減少する
が直径はまったく変化しない。４日後、繊維芽細胞が生
存しているコラーゲンフィルムが得られる。このコラー
ゲンフィルムの厚さは１　ｎ＋ｍである。このコラーゲ
ンフィルムの直径は、第１図の曲線Ｈに示すように日数
が経っても一定である。このコラーゲンフィルムからな
るシートは、手での取扱いに十分な機械的強度があり、
人造真皮として使用することができる。

実施例４ 実施例３と同じ操作を行う。ただし、コラーゲンフィル
ムとなるはずの分散液に、牛の胎児の血清を１０％含む
ＤＭＥＭ培地中でトリプシン処理したＭＲＣ−５細胞を
２Ｘ１０’個含むＤＭＥＭ培地を０．５−添加してから
、この分散液を細胞集合層で底部が覆われたフラスコ内
に流し込む。

第１図の曲線Ｇかられかるように、細胞が培養されても
コラーゲンシートの直径はまったく減少しない。ただ、
実施例゛１と同様シートの厚さが減少する。

実施例５ 実施例２と同じ組成のコラーゲンゲルを重合させて、得
られるコラーゲンシートの厚さが３ｍになるようにする
。

これとは別に、牛の胎児の血清を１０％含むＤＭＥＭ培
地中で培養したＭＲＣ−５細胞集合層をファルコンフラ
スコ中に調製する。細胞集合層が形成された時点で、上
記のゲル化したコラーゲンをこの細胞集合層上に載せる
。

細胞がコラーゲンシート上にコロニーを形成すると、こ
のコラーゲンシートの厚さが減少する。

厚さは７日後に約０．５ｍｍとなって、以後その値にと
どまる。直径はまったく減少しない。

実施例６ 実施例１と同じ組成の分散液を直径が５ｃｍのファルコ
ンフラスコに注入して、子牛の血清を１０％含むＤＭＥ
Ｍ培地中でトリプシン処理したＭＲＣ−５細胞を添加す
る。コラーゲンゲルを形成するための分散状態にある細
胞を含む培地０．５−をさらに添加する。得られた溶液
を均質化してからＣＯ２雰囲気で３７℃に保って培養を
行う。定期的にコラーゲンゲルの直径を測定して収縮状
態を確かめる。その結果、第１図の曲線Ａかられかるよ
うに、最初は５ｃｍあった直径が８日後には約１ｃｍに
まで減少する。

まったく同じに調製した別のファルコンフラスコ内には
やはり上記したのと同じコラーゲンゲルが形成されるが
、１日後にこのコラーゲンゲルをやはりＭＲＣ−５繊維
芽細胞を含む第２のコラーゲンゲル層で覆う。この場合
も得られるコラーゲンゲルの直径が減少する。このこと
を示すのが第１図の曲線Ｃで、曲線Ａとほぼ同じである
。同様に、第３のファノ１コンフラスコを用意して、１
日後に繊維芽細胞を含まない第２のコラーゲン層で覆う
。すると、この場合もやはり得られるコラーゲンゲルの
直径が徐々に減少する。このことを示すのが第１図の曲
線Ｂで、曲線Ａとほぼ重なる。

実施例７ 実施例６と同じ繊維芽細胞を含むコラーゲン分散液をフ
ァルコンフラスコ内に調製する。

′−日日後形成されたコラーゲンゲルを細胞集合単一層
上に載せる。この場合は、第１図の曲線Ｆかられかるよ
うに、コラーゲンゲルの直径の減少がただちに止まる。

ただコラーゲンゲルの厚さだけが減少し続ける。

実施例８ 実施例７と同様であるが、コラーゲンゲルを細胞集合層
上に載せた直後にこのコラーゲンゲルを繊維芽細胞を含
む第２のコラーゲンゲルで覆う。

第１図の曲線りかられかるように、コラーゲンゲルの直
径の減少がただちに止まる。

実施例９ 実施例８とは違って、第２のコラーゲンゲルに繊維芽細
胞が含まれていない場合である。この場。

合、第１図の曲線Ｅかられかるように、コラーゲンゲル
の直径の減少がただちに止まる。

実施例ＩＯ 実施例３〜９に記載した操作を繰返す。ただし、子牛の
血清の代わりにヒトのタンパク質のみを含む胎盤コラー
ゲンゲルを用いる。この胎盤コラーゲンゲルの組成は以
下の通りである。

ＤＭＥＭ　　５　Ｘ　ｃ　　　　　　　　　１．０Ｏ−
Ｈ２Ｏ０，４５ｍＮ ヒトのアルブミン（５０ｍｇ／−）　　　０．５０−ヒ
トの血清　　　　　　　　　　　０．０５ｍｆｒ＋ｍ型
コラーゲン（２ｍｇ／ｍ１）　　２．５０ｍｊ！子牛の
血清を１０％含むＤＭＥＭ培地中でトリプシン処理した
細胞１（１６）０　ｇを４℃で１分間遠心分離する。次
に、子牛の血清を含まないＤＭＥＭ培地中に得られた沈
澱物を添加する。このようにして得られた細胞分散液（
２Ｘ１０５個の細胞を含む）０．５ｍｌをコラーゲン分
散液に注入する。

混合溶液を、実施例３〜９に記載したのと同じ条件にし
た直径が５ｃｍのファルコンフラスコに注入する。得ら
れる結果はまったく同じである。

実施例１１ 実施例１０と同じ操作を行う。ただし、胎盤コラーゲン
ゲル中のヒトのタンパク質の割合は減らしておく。

この胎盤コラーゲンゲルの組成は以下の通りである。

ＤＭＥＭ　　５　Ｘ　ｃ　　　　　　　　　　１．（１
６）ｍｌ１Ｈ２（１６），９５− ヒトの血清　　　　　　　　　　　０．０５ｍｆＩ＋Ｉ
ＩＩ型コラーゲン（２ｍｇ／＋ｎｅ）　　２．５０ｍ１
！得られる結果はまったく同じである。

実施例１２ 実施例３と同じ操作を行う。ただし、ＭＲＣ−５細胞の
代わりにヒトの皮膚から採取して増殖させた皮膚繊維芽
細胞からなる細胞集合単一層を用いる。

得られる結果はまったく同じである。

実施例１３ 実施例３と同じ操作を行う。ただし、ＭＲＣ−５細胞の
代わりにヒトの軟骨の軟骨細胞からなる細胞集合単一層
を用いる。

得られる結果はまったく同じである。

実施例１４ コラーゲン球状微粒子の製造方法。

９部のアセトンと１部の０．ＩＮ水酸化ナトリウムとの
混合溶液中に、２７Ｇまたは２５Ｇの針を備える注射器
を用いて実施例１のコラーゲン粉末をもとにした２％の
Ｉ＋ＩＩＩ型胎盤コラーゲン酸性溶液を滴下する。

一滴滴下するごとに液滴はただちにゲル化して、球形が
そのまま保たれる。

このようにして得られた分散液を無菌生理的溶液を用い
て洗浄し、アセトンを除去するとともにｐＨを完全に中
性の値にする。得られる球状微粒子は直径が約１ｍｌ１
１である。

次にこの球状微粒子を用いて細胞を培養する。

コラーゲン球状微粒子を大量に生産するには他の方法を
用いることもできる。特に、微小液滴からなる乳剤を調
製する方法として公知の任意の方法を使用することが可
能である。例えば、２相のうちの一方が上記のコラーゲ
ン酸性溶液であり、もう一方の相がアルカリ性薬品であ
る乳剤を調製することができる。また、コラーゲンの酸
性を中和するため、全体にアルカリ性薬品を徐々に添加
して中性近傍で全体をゲル化することもできる。

実施例１５ 胎盤コラーゲン球状微粒子への細胞培養法。

実施例１４で製造した直径１論のコラーゲン球状微粒子
を、ＦＣ３を１０％含むＤＭＥＭ培地中で培養したＭＲ
Ｃ−５型ヒトの二倍体繊維芽細胞の分散液中に３７℃で
撹拌しながら混合する。

２時間後には繊維芽細胞はすべてコラーゲン球状微粒子
の表面に付着する。４日間３７℃で培養を行うと、コラ
ーゲン球状微粒子全体に繊維芽細胞のコロニーが形成さ
れて、直径が最終的に１（１６）〜２（１６）ミクロン
になる。

繊維芽細胞が生存しているこのようなコラーゲン球状微
粒子分散液は、例えばウィルスの培養に使用することが
できる。

皮膚の繊維芽細胞や軟骨の軟骨細胞を同様の方法で培養
したところ似た結果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、コラーゲン１ｍｇと細胞２　Ｘ１０３個を１
ｒｎｌ中に含むゲルからなる本発明のコラーゲンシート
と従来のコラーゲンシートの直径の経時変化の比較結果
を示すグラフであり、 曲線Ａは従来のコラーゲンシートの経時変化曲線であり
、 曲線Ｂは２４時間後にゲルを繊維芽細胞を含まない第２
のゲルで覆った場合のコラーゲンシートの経時変化曲線
であり、 曲線Ｃは２４時間後にゲルを繊維芽細胞を含む第２のゲ
ルで覆った場合のコラーゲンシートの経時変化曲線であ
り、 曲線りは２４時間後に細胞集合単一層上にゲルを載せた
直後にこのゲルを繊維芽細胞を含む第２のゲルで覆った
場合のコラーゲンシートの経時変化曲線であり、 曲線Ｅは２４時間後に細胞集合単一層上にゲルを載せた
直後にこのゲルを繊維芽細胞を含まない第２のゲルで覆
った場合のコラーゲンシートの経時変化曲線であり、 曲線Ｆは細胞集合層上にゲルを載せた場合のコラーゲン
シートの経時変化曲線であり、曲線Ｇは繊維芽細胞を含
むゲル分散液を細胞集合単一層上に直接注いだ場合のコ
ラーゲンシートの経時変化曲線であり、 曲線Ｈは繊維芽細胞を含まないゲル分散液を細胞集合単
一層上に直接注いだ場合のコラーゲンシートの経時変化
曲線である。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）コラーゲン担体上に微生物を培養する方法であっ
   て、酵素処理を施した I および／またはIII型胎盤コラ
   ーゲンをもとにして、中性ｐＨ下かつ細胞培養温度、特
   に約３７℃で安定なゲル担体を形成し、該担体上に細胞
   のコロニーを形成させることを特徴とする方法。
2. （２）酸性溶媒中でペプシン処理したコラーゲンゲルを
   もとにして担体を形成することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。
3. （３）コラーゲンシートを形成することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
4. （４）コラーゲンの微粒子、特に球状の微粒子を形成す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項
   に記載の方法。
5. （５）ゲル形成の際に適当な培地中に細胞を導入するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１
   項に記載の方法。
6. （６）適当な培地中で細胞を上記担体と接触させること
   を特徴とする特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項
   に記載の方法。
7. （７）コラーゲンの微粒子、特に球状微粒子を、分散状
   態の細胞の存在下の適当な培地中に分散させることを特
   徴とする特許請求の範囲第４項および第６項に記載の方
   法。
8. （８）上記培地としてＤＭＥＭ培地を使用することを特
   徴とする特許請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記
   載の方法。
9. （９）子牛の血清の存在下で細胞培養を行うことを特徴
   とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。
10. （１０）ヒトのアルブミンの存在下で細胞培養を行うこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。
11. （１１）繊維芽細胞、特にＭＲＣ−５型の繊維芽細胞を
    培養することを特徴とする特許請求の範囲第１〜１０項
    のいずれか１項に記載の方法。
12. （１２）軟骨細胞を培養することを特徴とする特許請求
    の範囲第１〜１０項のいずれか１項に記載の方法。
13. （１３）微生物を培養するためのコラーゲン担体であっ
    て、酵素処理、特にペプシン処理あるいは化学消化処理
    を施した I および／またはIII型胎盤コラーゲンをもと
    にして得られる、中性ｐＨ下かつ３７℃で安定なゲルを
    用いて製造することを特徴とする担体。
14. （１４）シートの形状であることを特徴とする特許請求
    の範囲第１３項に記載の担体。
15. （１５）微粒子、特に球状微粒子の形状であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１３項に記載の担体。
16. （１６）上記微粒子の初期直径は約１ｍｍであることを
    特徴とする特許請求の範囲第１５項に記載の担体。
17. （１７）酵素処理、特にペプシン処理あるいは化学消化
    処理を施した I および／またはIII型胎盤コラーゲンを
    もとにして得られる、中性ｐＨおよび３７℃で安定なゲ
    ルを用いて製造したコラーゲン担体の細胞を利用したウ
    ィルスの培養方法。
18. （１８）酵素処理、特にペプシン処理あるいは化学消化
    処理を施した I および／またはIII型胎盤コラーゲンを
    もとにして得られる、中性ｐＨ下かつ３７℃で安定なゲ
    ルを用いて製造した、初期直径が約１ｍｍの球状微粒子
    の形状をもつコラーゲン担体を応用した包帯。