JPS6368075A - 後天性免疫不全症候群に関するワクチンおよび免疫検定法 - Google Patents

後天性免疫不全症候群に関するワクチンおよび免疫検定法

Info

Publication number
JPS6368075A
JPS6368075A JP61225052A JP22505286A JPS6368075A JP S6368075 A JPS6368075 A JP S6368075A JP 61225052 A JP61225052 A JP 61225052A JP 22505286 A JP22505286 A JP 22505286A JP S6368075 A JPS6368075 A JP S6368075A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
recombinant
virus
peptide
protein
lav
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP61225052A
Other languages
English (en)
Inventor
シュー−ロク　フ
アンソニー　エフ．パルチオ
リンダ　メディセン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oncogen LP
Original Assignee
Oncogen LP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncogen LP filed Critical Oncogen LP
Publication of JPS6368075A publication Critical patent/JPS6368075A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１０発明の分野） 本発明は、リンパ節疾患関連ウィルス［ｔｙｍｐｈａｄ
ｅｎｏｐａｔｈｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓ
ｌ（ＬＡＶ）／ヒト下細胞性白血病つィルス団ｕｍａｎ
　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓｌ（肘
ＬＶＩＩ）のエピトープ、すなわちリンパ節疾患症候、
群［Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍ
ｅ］（ＬＡＳ）および後天性免疫不全症候群［Ａｃｑｕ
ｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　ｏｅｒｒｃｒｅｎｃｙ　Ｓｙ
ｎｄｒｏｍｅ］（ＡＩＤＳ）の病因因子に関連するペプ
チドおよびタンパク質を発現するウィルスに関するもの
である。防御免疫応答を引き起こすＬＡＶ／肘［ｖ■関
連ペプチドを発現する本発明のウィルスは、ＬＡＳもし
くはＡＩＤＳに対するウィルスワクチン処方におけるま
たは多価ワクチン処方における免疫原として用いられ得
る。事実、疾患を起こすことなく宿主中において繁殖し
得る本発明の伝染性ウィルスは、遷延免疫原性刺激を与
える生ウィルスワクチンにおいて用いられることができ
、そして実質的な免疫を起こすことのできるものである
。
本発明はまた、ＬＡＳもしくはＡＩＤＳに対するサブユ
ニットワクチン処方におけるまたは多価ワクチン処方に
おける免疫原として、あるいはしＡＳもしくはＡＩＤＳ
に関する診断学的免疫検定法における抗原として用いら
れることのできるＬＡＶ／旧ＬＶ［ｌのエピトープに関
連するペプチドおよびタンパク質に関するものである。
これらのペプチドおよびタンパク質は、任意のベクター
−宿主系における組換えＤＮＡ技術を用いて産生され得
、あるいはまたこれらは化学的方法によって合成され得
る。従って本発明はまた、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ関連ペプ
チドおよびタンパク質が精製され得る適当な宿主細胞に
おけるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連ペプチドおよびタン
パク質の発現を導くために用いられ得る、新規なりＮＡ
配列ならびにプラスミドＤＮＡおよび例えば、ヒトウィ
ルス、動物ウィルス、昆虫ウィルスまたはバクテリオフ
ァージのようなウィルスＤＮＡを含むベクターの形成に
関するものである。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連ペプチドおよびタンパク質
の合成のための化学的方法がまた述べられる。
本発明の特定の実施態様において、組換え型ワクシニア
ウィルスが、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープもし
くはコア関連タンパク質を産生するために用いられた。
このために、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩの糖タンパク質も
しくはコア構造タンパク質に関してコードするｅｎｖも
しくはＱａＱのＤＮＡ配列は、適当な宿主においてＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶｌ［遺伝子の発現を導き得るワクシニアベ
クター中に挿入された。組換え型ワクシニアウィルスに
よって産生されたＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ
関連タンパク質は、抗原性でかつ免疫原性であり、そし
て類人霊長類において体液および細胞媒介免疫を引起こ
し得る組換え型ワクシニアウィルスによって産生された
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ａａａ関連タンパク質は真正
コアタンパク質の主要なエピトープを含む免疫反応性タ
ンパク質である。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ関連タンパク質を
発現する組換え型ワクシニアウィルスは、単独であるい
は、その伯のＬＡＶ／ＨｒＬＶＩＩ関連タンパク質（例
えば、コア構造タンパク質のような）と組合せて、ウィ
ルスワクチン処方において用いられることができる。あ
るいはまた、該組換え型ウィルスにより産生されたＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連タンパク質は、精製され得るま
たは化学的に合成され得、そしてサブユニットワクチン
処方において免疫原として用いられ得る。該ＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩ関連糖タンパク質（群）は、宿主動物におい
て“異質″として認識されるだろうゆえ、体液性および
／または細胞媒介免疫応答がこのタンパク質あるいはタ
ンパク質の組合せに対して生起するであろう。適当に調
製されたワクチン処方において、これは、宿主をその後
のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ感染に対して保護する。
本発明の伯の特定の実施態様において、組換え−２９＝ 型バキュロウィルス（オートグラフ？・カリフォルニカ
核多角体病ウィルス［Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏ
ｓｉｓ　ｖｉｒｕｓｌないしＡｃＮＰＶ）がＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩＩエンベロープおよびコア関連タンパク質を
産生するために用いられた。このために、エンベロープ
あるいはコア構造タンパク質をそれぞれコード化する、
ｅｎｖあるいはｇａｇのＤＮＡ配列が、適当な宿主にお
いてＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ遺伝子の発現を導き得るバ
クロウィルスベクター中へ挿入された。組換え型バクロ
ウィルスによって産生されたＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩタ
ンパク質は、放射免疫沈降およびＥＬＩＳＡ（酵素結合
免疫吸着剤検定）によって測定された場合に抗原性であ
ることが見出された。
本発明はまた、ヒト医学において一般的に重要なもので
あるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ抗原の製造を提供するものであ
る。これらは、血液試料、体液、組織等における［Ａν
／ＨＴＬＶＩＩＩの検知に関する診断学的手段として有
用である例えば酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）
試験やラジオイムノアッセイのような免疫検定法におけ
る試薬としての本発明の該ベプチドおよびタンパク質の
使用を含むものである。さらに、この試薬は、ＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩの病理発生の機構を解明するのにおいて
価値ある手段であろう。
（２０発明の背景） （２，１，ＡＩＤＳウィルス） 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）は、患者の
細胞媒介免疫応答の損傷に主として帰因する深刻な免疫
不全により特徴づけられる疾患である（ゴトリエブ、エ
ム、ら、　１９８１年、ザ　ニューイングランド　ジャ
ーナル　オブ　メデイシン３０５：１４２５；マシャー
、ジエイ、ら、　１９８１年、ザニュー　イングランド
　ジャーナル　オブ　メディシン　３０５：１４３１［
ＧＯｔｔｌｉｅｂ、Ｍ、ｅｔ、ａｌ、、１９８１．Ｎ。
Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｈｅｄ、３０５：１４２５．）（ａｓｕ
ｒ、Ｊ、ｅｔ、ａｌ、、　１９８１．Ｎ。
Ｅｎｃ＋１．Ｊ、Ｈｅｄ、３０５；１４３１１）　。こ
の疾患の２つの臨床的表示が認識されており、これは（
ａ）慢性リンパ節疾患、白血球減少、および疾患の進行
と同時に２から０．１ないしそれ以下へと変動する正常
末梢ヘルパ一対すプレッサーＴリンパ球比（ＯＫＴ４：
ＯＫ丁８）の逆転へと通じる末梢血ヘルパー細胞（ＯＫ
Ｔ４）における量的減少によって特徴づけられるリンパ
節疾患症候群（ＬＡＳ）と呼ばれる前駆期および（ｂ）
ＯＫＴ４細胞における減少および正常０ＫＴ４　：　０
ＫＴ８比の逆転、絶対的リンパ球減少、ならびに主とし
てニューモジステイス・カリネイ［Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓ
ｔ　ｉ　５ｃａｒｎｉ　ｉ　］による反復的に日和見感
染によって特徴づけられる免疫不全状態であり、この後
者の段階は、症例の大多数における死亡と終局的に関連
するものである。患者のある少数派は、リンパ腫および
カポジ肉種の増加した発生率を有する。現在、この疾患
に対する手当ないし治療はない。該疾患を獲得した患者
のタイプに関する情報に沿った流行伝染病学データは、
親密な接触によって伝染した感染性因子が該疾患の原因
であるかもしれないことを示唆した。続いて３つのグル
ープが、エイズの原因因子がヘルパー下リンパ球に対す
る指向性を有するレトロウィルスであることの強力な証
拠を提示した。これらのグループは、以下の通りである
。
（ａ）ナショナル　インステゴテ１−ト　オブヘルス［
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａ
ｌｔｈｌのアール、シー、ガロと協力者はエイズ（ＡＩ
ＤＳ）およびプレエイズ（ｐｒｅ−ＡＩＤＳ）の患者か
ら細胞変性レトロウィルス団ｎｖｍ＞を単離することが
できた（ガロ、アール、シー、ら、　１９８４年、サイ
エンス２２４：５００　；ボポどツク、エム。
ら、　１９８４年、サイエンス２２４：４９７　［Ｇａ
ｌ　Ｉｏ、　Ｒ。
Ｃ，ｅｔ、　ａｌ、　、　１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　
２２４：５００；Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｈ。
１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：４９７］）。彼ら
はまた、エイズの患者の血清中に■且ＶＩＩに対する抗
体を検知した。
（ｂ）ザ　パスツール　インステゴテ１−ト［ｔｈｅＰ
ａｓｔｅｕｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｌのエル、モジタグ
ニア［Ｌ、　ＨＯｎｔａ（ｌｎｉｅｒｌと協力者は、頚
部リンパ節疾患を示しそしてエイズに関する危険のある
患者からＴリンパ球親和性レトロウィルス（ＬＡＶ）を
単離したくバレーシノッシ、エフら、　１９８３年、サ
イエンス２２０：８６８［Ｂａｒｒｅ−３ｉｎＯｕＳＳ
ｉ　、　Ｆ、　。
ｅｔ、ａｌ、、１９８３，５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８
６８］）　、このグループはまたエイズ患者からの血清
中にＬＡＶに対する抗体を証明することができた（カル
ヤンスラマン、ブイ、ニス、ら、　１９８４年、サイエ
ンス２２５：３２１ＥＫａ＋ＶａｎＳｒａｍａｎ、Ｖ、
Ｓ、。
ｅｔ、ａｌ、、１９８４，５ｃｉｅｎｃｅ　２２５；３
２１１）　。さらに彼らは、エイズを発現した供与者か
らの血液を受けた後にエイズを発現した患者のリンパ球
からＬＡＶを単離することができた（フエオリノ、ピー
、エム、ら、　１９８４年、サイエンス２２５：６９［
Ｆｅｏｒｉｎｏ、Ｐ、Ｍ、ｅｔ、ａｌ、、１９８４，５
ｃｉｅｎｃｅ２２５　：６９］）。
（Ｃ）ジエイ、レビーと協力者はエイズの患者の末梢単
核細胞から感染性レトロウィルス（エイズ関連レトロウ
ィルス［ＡＩＤＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｒｅｔｒｏｖ
ｉｒｕｓコ、あるいは＾ＲＶと命名された。）を単離し
た（レビー、ジエイ、エイ、ら。
１９８４年、サイエンス２２５：８４０［Ｌａｖｖ、Ｊ
、＾、、ｅｔ、ａｌ、、１９８４，５ｃｉｅｎｃｅ　２
２５：８４０１）。
３つのウィルスのすべてが別個に単離されたものである
が、これらはおそらくすべて同じレトロウィルスサブグ
ループに属しくレビー、ジエイ。
エイ、ら、　１９８４年、サイエンス２２５：８４０）
　、そして本明細書においてＬＡＶ／ＨＴＬＶＩと正確
に呼称されるであろう。
レトロウィルスの一般的構造は、該ウィルスが細胞出芽
の過程の間に獲得するエンベロープを含む脂質によって
囲繞されたリボ核タンパク質のコアのものである。エン
ベロープ中に包埋されそして外方に突出したものがウィ
ルスコード化糖タンパク質である。これらは該ウィルス
の宿主域を決定し、そして受は入れ得る細胞の表面上の
特異的レセプターと反応する。中和抗体は、エンベロー
プ糖タンパク質に結合し、そして細胞の表面上のレセプ
ターとのそれらの相互作用を阻止すると考えられている
（ザ　モレキュラー　バイオロジーオブ　チューモア　
ウィルシズ、ジョン　トウーズ編、　１９７３年、］−
ルド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−中の第５３４
〜５３５頁、ＲＮ＾テユーモアウィルシズ、アール、ウ
ニイス、テイチ、エヌ、。
ヴアーマス、エイチ、およびコツフィン、グレイ。
編、　１９８２年、コールド　スプリング　ハーバ−ラ
ボラトリ−中の第２２６〜２２７頁および第２３６〜２
３７　頁［ｐｐ、５３４−５３５　　ｉｎ、丁ｈｅ　　
）ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　　Ｔｕ
ｍｏｒ　　Ｖｉｒｕｓｅｓ　　ｅｄ、Ｊｏｈｎ　　丁ｏ
ｏｚｅ、１９７３．Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　）（ａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ｐｐ２２６−２２７
　ａｎｄ　２３６−２３７ｉｎ、ＲＮＡ　　丁ｕｍｏｒ
　　Ｖｉｒｕｓｅｓ、ｅｄ、Ｒ，Ｗｅｉｓｓ、丁ｅｉｃ
ｈ、Ｎ、、Ｖａｔ”ｍｕｓ、Ｈ，ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎ
、Ｊ、、１９８２．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）（ａ’
ｒｂｏｒＬａｂｏｒ４ｔｏｒｙｌ　）。ＬＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩＩＩの特定な場合において、Ｔリンパ球のサブセッ
ト（亜群）に存在するＴ４抗原が該ウィルスに関するレ
セプターないしはレセプターの構成成分である証拠があ
る（ダルグレイシュ、エイ、ジー、ら、　１９８４年、
ネイチャー３１２ニアＢ３；クラツヅマン、ディー、ら
、　１９８４年、ネイチャー　３１２ニア６７［Ｄａｌ
ｇｌｅｉｓｈ、Ａ、Ｇ、ｅｔ、ａｌ、、１９８４゜Ｎａ
ｔｕｒｅ　３１２ニア６３；にＩａｔＺｍａｎｎ、　Ｄ
、　、　ｅｔ、　ａｌ、　、　１９８４．Ｎａｔｕｒｅ
　３１２ニア６７］）。
［＾Ｖ／ＨＴＬＶｎｌのＲＮＡゲノムが第１図に図示さ
れる。３つの遺伝子が通常認識される：朋遺伝子は該ウ
ィルスの内部構造タンパク質（コア　タンパク質に関し
てコードし、そしてウィルス群特異抗原を限定する。」
射遺伝子は、ピリオン（［ｖｉｒ１ｏｎｌ、ウィルス粒
子）関連逆転写酵素に関しコードする。」竺遺伝子は、
ウィルス糖タンパク質に関しコードする。その他の領域
は、読み取り枠［ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍ
ｅ］を含むグノムノ」πオよび３°ｆ表示エリアを記す
。これらの領域の機能は現時点では知られていない。
（２，２，ワクチン） 現在、いくつかの方法が、ウィルス感染の予防および治
療に関して使用されている。これらは、能動免疫応答を
引き出すワクチン、化学治療剤での処置およびインター
フェロン処置を含むものである。
ワクチン調製の伝統的方法は、不活性化あるいは弱毒化
ウィルスの使用を含むものである。ウィルスの不活性化
は、生物学的試剤としてそれを無害にするが、その免疫
原性を破壊するものではない。これらの“殺された″ウ
ィルス粒子の宿主中への注入は、次に、生きたウィルス
での将来の感染を中和し得る免疫応答を引き出すだろう
。しかしながら、死菌ワクチン（不活性化ウィルスを使
用する〉の使用における主要な問題点は、ウィルス粒子
すべてを不活性化することの不首尾である。
これが達成されたとしても、殺されたウィルスはそれら
の宿主において繁殖しないゆえに、得られた免疫は、し
ばしば短命であり、そして付加的な免疫処置が通常必要
とされる。最後に、不活性化プロセスは、免疫原として
ウィルスタンパク質をより有効でないものにするように
ウィルスタンパク質を変容する。
弱毒化は、疾患を引起こす能力を本質的に失なったウィ
ルス株の製造に帰するものである。これを達成するため
の１つの方法は、ウィルスを尋常でない成長条件および
／または細胞培養における頻繁な継代にかけることであ
る。ビルレンス（毒性）か失なわれたが免疫応答を引起
こすことが今だできるウィルス変異株が次に選択される
。
この弱毒化ウィルスは、これらが宿主細胞中において実
際に複製されるので通常良好な免疫原を構成し、そして
長く持続する免疫を引き起こす。しかしながら、いくつ
かの問題が、生ワクチンの使用において遭遇し、その最
も気にかかる事は、不十分な弱毒化である。
上記の方法に対する代りのものは、サブユニットワクチ
ンの使用である。これは、適切な免疫学的物質を含むそ
れらのタンパク質のみでの免疫処置を含むものである。
エンベロープを有するウィルスの多くに関して、ウィル
スコード化糖タンパク質は、中和抗体を引き出し得るそ
れらのエピトープを含むものである。これらは、ラ　ク
ロツセウイルス［Ｌａ　Ｃｒｏｓｓｅ　Ｖｉｒｕｓｌ（
ゴンザレスースカラノ、エフ９．ショープ、アール、イ
ー０．カリジャー、シー、イー、およびナサンソン、エ
ヌ、。
１９８２年、ヴイロロジ−１２０：４２［ＧＯｎＺａｌ
ｅＺ−３Ｃａｆ”ａｒ）０、　Ｆ、　、　５ｈｏｐｅ、
　Ｒ，Ｅ、　、　Ｃａｌ　１ｓｈｅｒ、　Ｃ，Ｅ、　ａ
ｎｄ　Ｎａｔｈａｎｓｏｎ、　Ｎ。
、１９６２．Ｖｉｒｏｌｏｏｙ　１２０：４２］）　、
新生児ウシ下痢性ウィルス［Ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｃａ１
ｆ　Ｄｉａｒｒｈｅａ　Ｖｉｒｕｓｌ　（ｖツノ。
ニス、およびイノウニ、ニス９．１９８３年、インフエ
クション　アンド　イミユニティ　３９：１５５［）ｆ
ａｔｓｕｎｏ、Ｓ、ａｎｄ　Ｉｎｏｕｙｅ、Ｓ、、１９
８３．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ
　３９：１５５］）　、ベネズエラ　ウマ脳を肺炎ウイ
ルス［Ｖｅｎｅｚｕａｌａｎ　Ｅｑｕｉｎｅ　Ｅｎｃｅ
ｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ　ＶｉｒＵＳ］　（マシュ
ーズ、ジエイ、エイチおよびローリッグ、ジエイ、ティ
、１９８２年、ジャーナル　オブイムノロジイ１２９：
２７６３団ａｔｈｅＷｓ、Ｊ、Ｈ，ａｎｄ　ＲＯｅｈｒ
ｉ（］　Ｊ、■、、１９８２．Ｊ、Ｉｍｍ、１２９：２
７６３］）、プンタトロ　ウィルス［Ｐｕｎｔａ　Ｔｏ
ｒｏ　Ｖｉｒｕｓｌ　（ドウリンプル、ジエイ、エム０
．ペーターズ、シー、ジエイ、、スミス、ジエイ、エフ
、およびジエントリー、エム。
ケイ０．１９８１年、“レプリケーション　オブ　ネガ
ティブ　ストランド　ウィルシズ′ディー、エイチ、エ
ル、ビショップおよびアール、ダブリュ。
コンバンズ編、第１６７頁、■ルセバー、ニューヨーク
中［Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ、Ｊ、）１．、Ｐｅｔｅｒｓ、
Ｃ，Ｊ、、Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、Ｆ。
ａｎｄ　Ｇｅｎｔｒｙ、Ｈ，に、、１９８１．Ｉｎ　”
Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＮｅＱａｔ＋ｖｅ　５
ｔｒａｎｄ　ＶｉｒｕＳｅＳ”、Ｄ、Ｈ，Ｌ、Ｂ１５ｈ
ｏｐ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ。
Ｃｏｍｐａｎｓ、ｅｄｓ、ｐ、１６７、Ｅｌｓｅｖｅｉ
ｒ、Ｎｅｖ　　Ｙｏｒｋｌ）、マウス白血病ウィルス団
ｕｒｉｎｅ　ＬｅｕｋｅｍｉａＶｉｒｕｓ］　（スティ
ーブス、アール、エイ０．スト　ランド、エム。
およびオーガスト、ジエイ、ティー０．１９７４年。
ジャーナル　オブ　ピロロシイ　１４：１８７［５ｔｅ
ｅｖｅｓ、　Ｒ，Ａ、　、　５ｔｒａｎｄ、　Ｈ，ａｎ
ｄ　Ａｕｇｕｓｔ、　Ｊ、　Ｔ、　、　１９７４．　Ｊ
、　Ｖｉｒｏｌ。
１４：１８７］）、およびマウス乳癌ウィルス［ＭＯｕ
Ｓｅ　）ｌａｍｍａｒｙ　丁ｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｌ（
マツセイ、アール、ジエイ。
およびショチェットマン、ジー、１９８１年、ピロロシ
イ　１１５　：２０［）１ａｓｓｅｙ、　Ｒ，Ｊ、　ａ
ｎｄ　Ｓｈｏｃｈｅｔｍａｎ、　Ｇ、　１９８１、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ　１１５：２０］）の糖タンパク質を含む
も（７）Ｔ−ある。サブユニットワクチンの１つの利点
は、不適切なウィルス物質が排除されることである。
ワクチンはしばしば種々のアジュバントと共に投与され
る。アジュバントは、免疫原が単独で投与された場合と
比較して、より数少ない投与においてより少ない量の抗
原を用いてより永続性のあるそしてより高いレベルの免
疫を達成することを助長する。アジュバント作用の機構
は複合でありそして完全に理解されていない。しかしな
がら、それは、細網内皮系の食作用およびその他の活性
の刺激、ならびに抗原の遅延された解放および退化を含
むであろう。アジュバントの例には、フロイント　アジ
ュバント（完全または不完全）、アジュバント　６５（
ビーナツツ油、マンニド　モノオレエートおよびアルミ
ニウム　モノステアレートを含む）、測成ポリオール　
Ｌ−１２１［ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌ　Ｌ−１
２１］　、アブリジン［ＡＶｒｉｄｉｒｌｅｌ、および
例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは
ミョウバンなどのような鉱質グルが含まれる。フロイン
ドアジュバントは、これが非代謝性鉱質油を含みまた潜
在的な発癌性物質であるゆえ、もはやヒトに対するワク
チン処方において用いられない。
（２，２，１，組換え型ＤＮＡ技術およびワクシニアウ
ィルス） サブユニットワクチンの製造のための組換えＤＮＡ技術
の使用は、分子クローニングおよび宿主動物における中
和応答を引き出し得るウィルスのタンパク質に関しコー
ドするウィルスの遺伝子情報の適当なベクターにおける
発現を含むものである。ウィルスの他のすべての遺伝子
情報は排除され、そして中和応答を起こすのに必要とさ
れるそれらのタンパク質のみが宿主動物に与えられる。
宿主は、完全ウィルスに全くさらされることなく、そし
て感染することになる危険性のないものである。
最近、サブユニットワクチンの製造において潜在的に有
用である新しいアプローチが述べられている（マケット
、エム０．スミス、ジー、エル。
およびモス、ビー、　、　１９８２年、プロシイ−ディ
ング　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ゛　　サ
イエンシズ　７９．７４１５〜７４１９．マケット、エ
ム０．スミス、ジー、エル、およびモス、ビー、。
１９８４年　ジャーナル　オブ　ピロロシイ　４９，８
５７〜８６４；パニカリ、ディー、およびパオレツテイ
ー。
イー、　、　１９８２年、プロシイ−ディング　オブ　
ザナショナル　アカデミ−オブ　サイエンシズ７９．４
９２７〜４９３１［）（ａｃｋｅｔｔ、Ｈ，、Ｓｍ１ｔ
ｈ、Ｇ、Ｌ、ａｎｄ　Ｍｏ５ｓ。
Ｂ、、１９８２．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．八ｃａｄ、ｓ
ｃｉ、７９．７４１５−７４１９；）（ａｃｋｅｔｔ、
Ｈ，、Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｌ、ａｎｄ　Ｍｏ５ｓ、Ｂ、、
１９８４．Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、４９，８５７−８６４；Ｐａｎ１ｃａｌｉ
、Ｄ、ａｎｄ　Ｐａｏｌｅｔｔｉ、Ｅ、。
１９８２、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’　１．＾ｃａｄ、ｓｃｉ
、　７９．４９２７−４９３１１＞。
このアプローチは、ゲノム中に挿入された外来遺伝子を
発現するためのベクターとしてのワクシニアウィルスの
使用を含むものである。宿主動物中への導入において、
組換え型ワクシニアウィルスは、挿入された外来遺伝子
を発現し、そしてこれによりこのような遺伝子産物に対
する宿主免疫応答を引き出す。生絹換え型ワクシニアウ
ィルスはワクチンとして用いられることができるゆえ、
このようなアプローチは、サブユニットワクチンおよび
生ワクチンの双方の利点を組合せる。
ワクシニアウィルスは約１８７キロベースペアの線状二
重鎖ＤＮＡゲノムを含み、そして感染細胞の細胞質中に
おいて複製される。これらのウィルスは、ウィルス感染
性に必要とされるウィルス」ア中に完全転写酵素系（キ
ャップ形成、メチル化およびポリアデニル化酵素を含む
〉を含むものである。ワクシニアウィルス転写調節配列
（プロモーター）は、ワクシニアＲＮＡポリメラーゼに
よる転写の開始を許容するが、宿主細胞ＲＮＡポリメラ
ーゼによるものは許容しない。
組換えワクシニアウィルスにおける外来ＤＮＡの発現は
、外来遺伝子のＤＮＡ配列をコードするタンパク質への
ワクシニアプロモーターの連結反応を必要とする。挿入
ベクターとも呼ばれるプラスミドベクターは、ワクシニ
アウィルス中へキメラ遺伝子を挿入するために形成され
た。挿入ベクターの１つのタイプは、（ａ）転写開始部
位を含むワクシニアウィルスプロモーター、（ｂ）外来
ＤＮＡフラグメントの挿入ために転写開始部位より下流
に位置されたいくつかの非反復制限エンドヌクレアーゼ
クローニング部位、（Ｃ）ウィルスゲノムの相同非必須
、領域中へのキメラ遺伝子の挿入を導く、該プロモータ
ーおよびクローニング部位を側面に有する非必須ワクシ
ニアウィルスＤＮＡ（丁に遺伝子のごときもの）、なら
びに（ｄ）複製の細菌源およびエシェリキア・コリ（Ｅ
、ｃｏｌｉ）における複製および選択のための抗生物質
耐性標識からなるものである。このようなベクターの例
はマケットによって述べられている（マケット。
エム１．スミス、ジー、エル、およびモス。
ビー、　、　１９８４年、ジャーナル　オブ　ピロロシ
イ４９．８７５〜８６４［）（ａｃｋｅｔｔ、）！、　
、Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、　Ｌ、　、ａｎｄ　Ｍｏ５ｓ。
Ｂ、　、　１９８４．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４９．８
５７−８６４］　）。
組換えワクシニアウィルスは、予めワクシニアウィルス
で感染された細胞中への、外来遺伝子を含む組換え細菌
性挿入プラスミドのトランスフェクションによって製造
される。相同組換えは感染細胞内で起こり、そしてウィ
ルスゲノム中への外来遺伝子の挿入という結果となる。
感染細胞は、免疫学的技術、ＤＮＡプラークハイブリッ
ド形成、あるいはその後に単離されることのできる組換
えウィルスに関する遺伝的選択によりスクリーニングさ
れることができる。これらのワタシニア組換え体はそれ
らの本質的な機能および感染性を維持しており、そして
外来ＤＮＡの約３５キロベースを収容するように形成さ
れることができるものである。
外来遺伝子発現は、酵素または免疫学的検定法（例えば
、免疫沈降、ラジオイムノアッセイあるいはイムノブロ
ッティング［ＩＩＩＩＩ１１１１ｒ１０ｂｌＱｔｔｉ＋
’４Ｑ］　）によって検知され得る。組換えワタシニア
感染細胞から産生きれた自然発生膜部タンパク質は、粘
付加され、そして細胞表面に輸送されるだろう。高い発
現レベルは、強力なプロモーターを用いることによって
、あるいは単一遺伝子の多重のコピーをクローニングす
ることによって得られることができる。
（２，２，２，組換えＤＮＡ技術およびバクロウィルス
） 最近、組換えタンパク質の産生に潜在的に有用であるア
プローチが述べられている（ペノツクら、１９８４年、
モレキユラー　セル　バイオロジー４：３９９、スミス
ら、　１９８３年、ジャーナル　オブ　ピロロシー４６
＋５８４［Ｐｅｎｎ０Ｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．
）ｔｏｌ、ｃｅｌｌＢｉｏｌ、４：３９９．Ｓｍ１ｔｈ
　ｅｔ　ａｌ、、１９６３．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４６：５
８４］　）。このアプローチは、ゲノム中に挿入された
外来遺伝子を発現するためにハキ１０ウイルスベクター
を使用することを包含するものである。
適当な宿主細胞中への導入において、組換え型バクロウ
ィルスは外来遺伝子を発現する。
バクロビリダニ［ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅｌ科の原
型は、オートグラファ・カリフオルニカ核多角体病つイ
、−４７− ）Ｌ、、ス（ＡｃＮＰＶ）　テある。ＡｃＮＰＶのゲノ
ムは、いくつかの制限部位に関してマツプとされている
（スミス、ジー、イー、およびサマーズ、エム。
ディー、１９７８年、ピロｏジー８９：５１７［Ｓｍ１
ｔｈ、　Ｇ、　Ｅａｎｄ　Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｈ，Ｄ、、
１９７Ｂ、ν１ｒｏｌｏｏｙ　８９：５１７］）１２８
キロベースペアの二重鎖環状ＤＮＡ種からなるものであ
る。該ウィルスは、感染昆虫細胞の核において複製する
。ウィルスの２つの形態が、感染されやすい細胞の野生
型ＡｃＮＰＶ感染の結果として産生され、閉塞および非
閉塞ウィルス粒子である。閉塞ウィルス粒子はポリヘト
リン遺伝子［ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｇｅｎｅ］　ニに
　ツＴ　：］−ト化サすルホリへドラ［ｐｏ　Ｉ　ｙｈ
ｅｄ　ｒａ　］と呼ばれるタンパク質によって囲繞され
たウィルス粒子である（ピロロジー１３１　：５Ｂ１〜
５６３．１９８３年［Ｖ　ｉ　ｒｏ　ｌ　、　１３１　
：　５６１−５６３゜１９８３　］を参照のこと。）。
閉塞ウィルス粒子は、光学顕微鏡を用いることによって
感染細胞において容易に視識化され得る。
組換え型バキュロウィルスにおける外来ＤＮＡの発現は
、バキュロウィルスプロモーターの、外来遺伝子のタン
パク質コード化ＤＮＡ配列への連結を必要とする。挿入
ベクターとも呼ばれる、プラスミドベクターは、ＡｃＮ
ＰＶ中へキメラ遺伝子を挿入するために形成される。挿
入ベクターの１つのタイプは、（ａ）転写開始部位を含
むＡｃＮＰＶプロモーター、（ｂ）外来ＤＮＡフラグメ
ントの挿入のために転写開始部位より下流に位置された
いくつかの非反復制限エンドスフレアーゼクローニング
部位、（Ｃ）ウィルスゲノムの相同非必須領域中へのキ
メラ遺伝子の挿入を導く、該プロモーターおよびクロー
ニング部位を側面に有する非必須Ａｃ　ＮＰＶ　　ＤＮ
Ａ　（ポリヘトリン遺伝子のごときもの）、ならびに（
ｄ）複製の細菌源およびエシェリキア・コリにおける複
製および選択のための抗生物質耐性標識からなるもので
ある。このようなベクターの例は、ミャモトらによって
述べられている（１９８５年、モレキユラ　セル　バイ
オロジー５：２８６０［１９８５，）ｌｏｌ、ｃｅｌｌ
　Ｂｉｏｌ　５：２８６０］）。
組換え型バキュロウィルスは、該遺伝子を含む組換え型
細菌性挿入プラスミドでの、バキュロウィルスＤＮＡと
組立せた、細胞の同時トランスフェクションによって製
造される。相同組換えは、感染細胞内で起こり、そして
ウィルスゲノム中への外来遺伝子の挿入という結果とな
る。外来遺伝子がポリヘトリン遺伝子中へ挿入されると
、閉塞ウィルス粒子はもはや製造されず、そして得られ
た組換え型プラークは閉塞体の欠除に関して視覚的にス
クリーニングされることができる。感染細胞はまた、免
疫学的技術、ＤＮＡプラークハイブリッド形成、あるい
は続いて単離可能な組換え型ウィルスに関する遺伝的選
択によりスクリーニングされることができる。これらの
バキュロウィルス組換え体は、これらの本質的な機能お
よび感染性を維持している。
外来遺伝子発現は、酵素または免疫学的検定法（例えば
免疫沈降、ラジオイムノアッセイあるいはイムノブロッ
ティング）によって検知され得る。
高い発現レベルは、強力なプロモーターを用いることに
よっであるいは単一遺伝子の多重のコピーをクローニン
グすることによって得られることができる。
（３０発明の概要） ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩのエピトープに関連するペプチ
ドまたはタンパク質の発現を導くウィルスが述べられる
。防御的免疫応答を導＜　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連
エピトープを発現する本発明のウィルスは、ＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶ■感染からヒトを守るためにウィルスワクチンと
して処方され得るものである。本発明の１つの特定な実
施態様においては、生ウィルスワクチン処方が、感染宿
主においてＬＡＶ／旧Ｌｖ■関連エピトープを発現する
が宿主において疾患を引き起こさない感染性ウィルスを
用いて調製され、得る。
本発明はまた、ＬＡＶ／Ｈ且Ｖ［［のエピトープに関連
するペプチドまたはタンパク質を示すものである。
防御的免疫応答を導くこれらは、ＬＡＶ／旧ＬＶＩ［ｌ
感染からヒトを守るためにサブユニットワクチン中に処
方され得る、あるいはこれらは多価ワクチン中に処方さ
れ得るものである。あるいはまた、本発明のペプチドま
たはタンパク質はＡＩＤＳまたはＬＡＳの診断検定にお
いて用いられ得る本発明のペプチドまたはタンパク質は
、任意の宿主細胞−発現ベクター系において産生きれ、
そしてこれらから単離され得るものである。これらには
、例えば、適当な組換え型ウィルスで感染された動物も
しくは昆虫細胞培養株；組換え型プラスミド、コスミド
もしくは）７−ジでトランスフェクションされた細菌の
ような微生物；ならびに組換えプラスミドで形質転換さ
れた酵母が含まれる。本発明はまた、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ
ＩＩＩのエピトープに関し、コードする遺伝子情報の発
現のために用いられる方法、手順およびＤＮＡ形成を提
供するものである。あるいはまた、本発明のペプチドお
よびタンパク質は化学的に合成されることができる。
実施例にて詳述される本発明の特定の実施態様において
、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩのエンベロープ糖タンパク質ま
たはコア構造タンパク質に関しコードする遺伝子配列（
すなわち、それぞれ［Ａν／肘ｔｖＩＩＩｅｎｖまたは
ＱａＱ遺伝子配列）は、初期ワクシニアウィルスプロモ
ーターがＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ遺伝子配列の開始メチ
オニン配列（ＡＴＧ）に対し５′側に位置し、結果とし
てワクシニア　チミジン　キナーゼ（１Ｋ）　Ｄ　Ｎ　
Ａ配列によって側面を接されたキメラ遺伝子となるよう
に、プラスミド中へ挿入される。これらのプラスミドは
次に、予め野生型ワクシニアウィルスで感染された細胞
中へトランスフェクションされ、これによって、ワクシ
ニアウィルスのＴＫ遺遺伝子へ組換えられることがＴＫ
配列によって側面を接されたキメラＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ
ＩＩ　ｅｎｖまたは」亜遺伝子に許容される。細胞は、
溶解され、そして得られたウィルスはＴＫ−（チミジン
キナーゼ活性を欠く）細胞上にプラークされる。組換え
型ウィルスは５−プロモーデオキシウリジンの存在下に
おいてこれらの細胞上でプラーク形成するそれの能力に
よって、ならびに放射性標識化プローブ（ＬＡＶ／ＨＴ
ｔｖ１１−エンベロープもり、　＜　ｉａ　ＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶ［Ｉ　−Ｏａｇ（７）　イずれかより構成される
）に対するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成によって選
択される。
ハイブリッド形成陽性プラークは精製され、拡張され、
そして得られた組換え型ウィルスはＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ
ＩＩエンベロープ糖タンパク質またはコア構造タンパク
質を産生ずるそれの能力に関し試験される。該組換え型
ワクシニアウィルスによって発現されたＬＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩＩＩエンベロープ関連ワクシニアウィルスは、抗原
性でかつ免疫原性であり、類人霊長類において体液およ
び細胞媒介免疫の双方を引き起こし得ることが立証され
た。該組換え型ワクシニアウィルスによって発現された
［Ａシ／ＨＴＬＶＩＩＩｇａｇ関連タンパク質は推定コ
アタンパク質の主要なエピトープを含んだ免疫反応性タ
ンパク質であった。
本発明の他の特定の実施態様において、ＬＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩｕのｅｎｖまたはｑａｇ配列は、ベキ１０ウイルス
ポリヘトリンプロモーターが、３゛末端においてポリヘ
トリンＤＮＡ配列によって後続されたし＾Ｖ／ＨＴＬＶ
Ｉ遺伝子の開始メチオニン配列（ＡＴＧ）に対して５°
に位置するように、プラスミド中へ挿入された。これら
のプラスミドは、次に野生型ハキ１０ウイルスＤＮＡと
共に細胞中へ同時トランスフェクションされ、これによ
り、付加的なＡｃＮＰＶによって側面を接されたキメラ
［ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ遺伝子にバキュロウィルスのポ
リヘトリン遺伝子中に組換えられることを許容した。細
胞は溶解することをなされ、そして得られたウィルスは
プラークされた。組換え型ウィルスは閉塞体の欠除に関
する視覚的観察あるいは、放射標識化ＬＡＶ／肘ＬＶＩ
ＩＩ　ｅｎｖモＬ／　＜　ハＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　
ｐａｇプローブへのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成に
よって選択された。組換え型プラークは、精製され、増
殖され、そして得られた組換え型ウィルスは、ＳＤＳポ
リアクリルアミドゲルにおける分析を伴なう免疫沈降に
よって、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ■関連タンパク質を産生する
それらの能力に関してスクリーニングされた。感染セル
溶解物は血清中のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ抗体を検知す
るそれらの能力に関し、ＥＬＩＳＡによって試験された
。
（４９発明の詳細な 説明はＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩのエピトープに関連した
ペプチドおよびタンパク質を産生ずるウィルスに注がれ
るものである。本発明はまた、組換えＤＮＡ法を用いで
あるいは化学的合成によって製造され得ルＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶＩＩ［のエピトープに関連したペプチドおよびタン
パク質に注がれるちのである。本発明のウィルスまたは
ペプチドおよびタンパク質は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ
、すなわ＃５ＬＡＳおよびＡＩＤＳ（７）病因因子での
感染を防ぐための種々のワクチン処方（多価ワクチン処
方を含む）において免疫原として用いられ得るものであ
る。あるいはまた、本発明のペプチドまたはタンパク質
は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩに対して特異的な患者抗体
の検知のための診断学的免疫検定における抗原として用
いられ得る。本発明の免疫検定において用いられるペプ
チドまたはタンパク質は、抗原性（すなわち、ＩＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩに対する抗体と反応性である〉でなけれ
ばならないが、免疫原性（すなわち、免疫応答を引き起
こし得ること）である必要はない。さらにまた、該診断
学的免疫検定において用いられる抗原は、生体内［ｉｎ
　ｖｉｖｏ］において防御免疫応答を引き起こす必要は
ない。
本発明の１つの実施態様によると、組換えＤＮＡ技術が
、適当な宿主細胞におけるＬＡＶ／ＨＴＬＶ■配列の発
現を導く発現ベクター中へ、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ■エピト
ープをコード化するヌクレオチド配列を挿入するために
用いられる。これらの発現ベクター−宿主細胞系は、試
験管内り堕　ＶｉｔｒＯ］においてＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ
ＩＩ関連ペプチドおよびタンパク質を製造するために用
いられ得、この場合において、遺伝子産物は、培養培地
中の細胞から精製されることができる。そして防御免疫
応答を引き起こし得るペプチドまたはタンパク質はサブ
ユニットワクチン処方における免疫原として用いられる
ことができる。あるいはまた、本発明の免疫原性あるい
は単に抗原性のペプチドおよびタンパク質は、ＬＡＶ／
肘［ｖ■に対して特異的な患者抗体を検知することを意
図する免疫検定における抗原として用いられることがで
きる。本発明のペプチドおよびタンパク質の製造に関す
る代用的アプローチにおいて、これらのペプチドおよび
タンパク質のアミノ酸配列は、抗原性および／または免
疫原性の［Ａν／ＨＴＬＶＩＩＩ関連ペプチドおよびタ
ンパク質を発現する組換え体中に含まれるＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶｌ［ヌクレオチド配列から誘導され得る。これらの
ペプチドおよびタンパク質は次に化学的に合成され得、
そして合成サブユニットワクチン処方において（免疫原
性の場合〉、あるいは診断学的免疫検定における抗原と
して（抗原性および／または免疫原性の場合）用いられ
得る。
発現ベクターが防御免・疫応答を引き起こすことのでき
るＬＡＶ／ＨＴＬＶのエピトープに関連する免疫原の発
現を導くウィルスである場合には、ウィルスそれ自体が
ワクチンとして処方され得る。宿主において疾患を引き
起こさない感染性組換え型ウィルスは、実質的な免疫を
与える生ウィルスワクチン調製物において用いられるこ
とができる。あるいはまた、不活化ウィルスワクヂンが
“′殺された″ウィルスを用いて調製され得る。さらに
、２ないしそれ以上のしＡＶ／Ｈ且Ｖ［［のエピトープ
おるいは１つのＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩのエピトープな
らびにその他の疾患を引き起こす因子のエピトープを含
む多価ワクチンが調製され得る。
本発明の方法は、巣ｇ記述の目的のために以下の段階に
分けられる。すなわち、（ａ）　ＬＡＶ／旧ＬＶＩウィ
ルスタンパク質をコード化する、遺伝子あるいは遺伝子
フラグメントの単離、（ｂ）発現ベクターへの該遺伝子
あるいは遺伝子フラグメントの挿入、（Ｃ）遺伝子を複
製し、そして発現することのできる宿主系における組換
え型発現ベクターの同定および増殖、（ｄ）遺伝子産物
の同定および精製、（ｅ）該産物の免疫力の測定、なら
びに（ｆ）ワクチンの処方である。
本発明の特定の実施態様において、我々は、ＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩＩのエンベロープ遺伝子を含む組換え型ワク
シニアウィルスおよびバキュロウィルス（該組換え型ウ
ィルスによって感染された組織培養細胞におけるＬＡＶ
／ＨＴＬＶＩのエンベロープ遺伝子に免疫学的に関連し
たタンパク質の発現を導くものである。）の形成を述べ
る。しかしながら、本明細書において述べられる組成物
および方法は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープま
たはｇａｇ関連タンパク質を発現する組換え型ウィルス
の形成に限定されるものではなく、そしてＡＩＤＳの任
意の病因因子の抗原に関連したポリペプチドの製造のた
めの任意の発現ベクター系における組換え体の形成に用
いられ得るものである。
論議を明快とするために、全体の方法が、ＬＡＶ／＋１
ＴＬＶＩエンベロープおよびｐａｇＪ仏子によって述べ
られるであろう。しかしながら、同様な技術が、組換え
型発現ベクターを形成するために、ならびにＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩ［の任意のタンパク質に関連したポリペプチド
および関連ウィルスのそれを製造するために同様の様式
において適用され得る。このようなタンパク質は、ｇａ
ｇ、　ｐｏｔおよびｅｎｖのごときＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ
［ｌの遺伝子産物、ならびにＳＯｒ、　ｔａｔ、　３’
−ｏｒｆおよび様々に名前をつけられた（ａｒｔまたは
ｔｒｓ）　１つの遺伝子の少なくとも４つの今日までに
命名された付加的な遺伝子を含むものであるが、もちろ
んこれらに限定されるわけではない。
（４，１，ＬＡＶ／Ｈ丁ＬＶｍウィ）ｌスタンパ’：ｙ
質をコード化する遺伝子または遺伝子フラグメントの単
離）ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ遺伝子の単離は、最初に、
エンベロープあるいはｇａｇのような所望の遺伝子配列
を含むＤＮＡフラグメントを単離することを含むもので
ある。すでに説明したようｋＴ　、　ＬＡＶ／ＨＴＬＶ
ＩＩＩはＲＮＡゲノムを有しており、それゆえ、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶ■遺伝子をコード化する相同するＤＮＡは、
（ａ）精製ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩピリオンから単離された
ＲＮＡのＣＤＮＡクローニングによッテ、（ｂ）　ＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩ感染細胞から得られたポリ［Ａ］含
有ＲＮＡ［ｐｏｌｙ［Ａ］−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｒ
ＮＡＩのＣＤＮＡクローニングによって、あるいは（Ｃ
）　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ感染細胞から精製されたゲ
ノムＤＮＡをクローニングすることによって得られるこ
とができる。以下、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ遺伝子をコ
ード化スルＤ　Ｎ　Ａ　ハ、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ１１１Ｄ
ＮＡと呼称される。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩｎ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを生む
ために、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ［ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａは、種々
の制限酵素を用いて、特異的部位で開裂され得る。ある
いはまた、該ＤＮＡをフラグメント化するためにマンガ
ンの存在下においてＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレア
ーゼ）を使用することができ、さらにまた該ＤＮＡは、
例えば音波処理によるように、物理的に切断され得る。
線状ＤＮＡフラグメントは、次に、アガロースおよびポ
リアクリルアミドゲル電気泳動ならびにカラムクロマト
グラフィーを含む（もちろんこれらに限定されるわけで
はない。）標準的技術によってサイズに従い分離される
ことができる。
任意の制限酵素または制限酵素の組合せが、該酵素がエ
ンベロープまたはｃ＋ａｇタンパク質遺伝子産物の免疫
力を破壊しない限りにおいて、エンベロープまたはｇａ
ｃ＋配列を含むＬＡＶ／旧ＬＶＩ［ｌＤＮＡフラグメン
ト（群）を生むために用いられ得る。例えば、あるタン
パク質の抗原部位は約７〜約１４アミノ酸から構成され
ることができる。これゆえ、該エンベロープペプチド前
駆体の該サイズ（約９７０００ドルトン）のあるタンパ
ク質は、多くの別々の抗原部位を有し、重複配列、二次
および三次構造考慮、ならびにアセチル化、グリコリル
化またはホスフォリル化のようなプロセッシング事象を
考慮すればおそらく何千個も有するであろう。
それゆえ、多くの部分的なエンベロープポリペプチド遺
伝子配列が、ある抗原部位に関しコードすることができ
る。従って、多くの制限酵素組合せが、適当なベクター
中へ挿入された場合において異なる抗原決定基からなる
エンベロープ特異性アミノ酸配列の産生を導くことので
きるＤＮＡフラグメントを生むために用いられ得る。
ＤＮＡフラグメントが生みだされると、所望のＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩ遺伝子を含む特定のＤＮＡフラグメント
の同定が、いくつかの方法において行なわれ得る。第１
に、完全ＬＡＶ／肘ＬＶｍゲノムに一致するＤＮＡフラ
グメントを配列決定し、そして次に、エンベロープタン
パク質遺伝子またはＱａＱタンパク質遺伝子配列を含む
フラグメントを、予め決定されたアミノ酸配列の該エン
ベロープタンパク質またはＱａ（Ｊコアタンパク質のア
ミノ酸配列との比較に基づき同定することが可能である
。第２に、完全ゲノム配列が決定されると、広い読み取
り枠［Ｉａｒｏｅ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆ’ｒ
ａｍｅ］が５′から３′へ定座されることができる。今
日まで調べられたすべてのレトロウィルスのゲノム構成
が５’−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−３°であるゆえ、３
°末蝙に最も近い広い読み取り枠が、おそらくエンベロ
ープ遺伝子に関しコードするであろう。一方５゛末端に
最も近い広い読み取り枠がおそら＜　ｇａＱ遺伝子に関
しコードするであろう。第３に、特定の遺伝子の有望な
同定が核酸ハイブリッド形成分析あるいは配列比較（配
列が既知である場合〉のいずれかによる他の既知のレト
ロウィルス遺伝子に対する相同性の認識によって達成さ
れることができる。
あるいはまた、エンベロープまたはｇａｇタンパク質遺
伝子を含むフラグメントはｍＲＮＡ選択によって同定さ
れ得る。この手法において、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　
Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントはハイブリッド形成により相補
的ｍＲＮＡを単離するために用いられる。
単離されたｍＲＮＡの試験管内的翻訳産物の免疫沈降分
析は、該ｍＲＮＡを同定し、そしてそれゆえ、エンベロ
ープまたはＱａＱタンパク質配列配列む相補的ＬＡＶ／
旧ＬＶＩ［１ＤＮＡフラグメントを同定する。最後に、
特異性ｍＲＮＡは、エンベロープまたはｇａｇタンパク
質に対して指向する固定化抗体への、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ
ｎｌ感染細胞から単離されたポリソームの吸着によって
選択される。放射性標識化エンベロープタンパク質ＣＤ
ＮＡ（相補的ＤＮＡ）は、この選択されたｍＲＮＡ（吸
着したポリソームからの）を鋳型として用いて合成され
ることができる。放射性標識されたｍＲＮＡもしくはＣ
ＤＮＡは次にエンベロープまたはＱａＱ遺伝子配列を含
むＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを
同定するためにプローブ［ｐｒｏｂｅ］として用いられ
得る。エンベロープまたはＱａＱ遺伝子を単離するため
の代用手段としては、該遺伝子配列それ自体の化学的合
成（配列が既知とされる場合）、あるいは該エンベロー
プまたはＱ８Ｑ遺伝子をコード化するｍＲＮＡに対する
ＣＤＮＡの作成が含まれるが、もちろんこれらに限定さ
れるわけではない。
同定されそして単離されると、関心対象である配列ヲ含
ムＬＡＶ／ＨＴＬＶＩｎ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントは、
該ＤＮＡを複製するために適当な宿主細胞を形質転換す
るのに用いられる例えばプラスミドクローニングベクタ
ーのようなりローニングベクター中に最初に挿入され、
それによって関心対象のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ配列の
多くのコピーが生みだされる。これは、相補的付着端を
有するクローニングベクター中へ［＾Ｖ／ＨＴＬＶＩＩ
Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを連結させることにより達
成される。しかしながら、ＬＡＶ／旧ＬＶＩＩＩＤＮＡ
を７ラグメント化するために用いられる相補的制限部位
が、クローニングベクター中に存在しない場合は、ＤＮ
Ａ分子の末端は修飾される。
このような修飾には、−重鎖ＤＮＡ末端を消化し返すこ
とによってまたは該−重鎖末端を満たすことによってプ
ラント末端を生成し、これによって該末端がプラント末
端連結反応され得るようにすることを含むものである。
あるいはまた、所望される任意の部位が、該ＤＮＡ末端
上へヌクレオチド配列（リンカ−）を連結反応させるこ
とにより生成される。これらの連結されるリンカ−は、
制限部位識別配列をコード化する特定の化学的合成オリ
ゴヌクレオチドから構成される。他の方法によると、開
裂したベクターおよびＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩＤＮＡフ
ラグメントは、ヘモポリメリック　ティリング団ｅｍｏ
ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ］によって修飾さ
れ得る。
単離された遺伝子、ＣＤＮＡあるいは合成りＮＡ配列を
取込んだ組換え型ＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換は
、該遺伝子の複数のコピーの生成を可能とする。これゆ
え、該遺伝子は、被形質転換体を増殖し、被形質転換体
から組換え型ＤＮＡ分子を単離し、そして必要であれば
、単離された組換え型ＤＮＡから挿入された遺伝子を回
収することによって大間に得られうる。
最終目標が該遺伝子を、ワクシニアウィルスもしくはア
デノウィルスのごときウィルス発現ベクター中に挿入す
ることである場合には、［＾Ｖ／Ｈ且Ｖ■遺伝子を取込
んだ組換え型ＤＮＡ分子は、該遺伝子がウィルスゲノム
中に挿入されることを可能とするために、ウィルスで感
染した細胞における遺伝子組換えを許容するウィルス配
列によって該遺伝子が側面を接されるように修飾される
ことができる。
完全［＾Ｖ／Ｈ且Ｖ■ゲノムは、ウニイン　ホブソンら
によってクローン化され、そして配列決定されている（
ウエインーホブソン、ニス、ら、　１９８５年。
セル４０：９［Ｗｅｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、ｅｔ、ａ
ｌ、、１９８５．Ｃｅ１ｌ　４０：９１）。
ラムダＪ１９（λＪ１９）と呼ばれる１つのクローンは
、ラムダＬ４７．’ｌ　（λＬ４７．１）の日ｉｎｄ　
ｍ部位中に挿入されたＬＡＶゲノム配列の９，２キロベ
ースペアＤＮ△フラグメントを含んでいた。
［＾Ｖ／ＨＴＬＶＩ［ｌエンベロープ遺伝子を含むλＪ
１９の特に有用なサブクローンは、ｐＵｃ１８のＥＣ０
ＲＩおよび３ｓｔ（部位中に挿入されたＬＡＶ／ＨＴＬ
Ｖ［ｌヌクレオチド配列の３，８４０塩基対旦ＣＯＲＩ
→５ＳｔＩフラグメントからなるｐＲ８−３である。
ｐＲ８−３中に含まレルＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ［特異性Ｄ
ＮＡは、しＡＶ／Ｈ且ｖ■ゲノムにおけるヌクレオチド
５２８９番に位置する旦ＣＯＲＩ部位からヌクレオチド
９１２９６８　一 番に位置する旦旦１部位までである（ウェインーホブソ
ン、ニス、ら、　１９８５年　セル４０：９）。
ｐＲＳ　−３中に含まれルＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ヌ
クＬ／　、ｔ　チト配列を画く第２図を参照のこと。し
かしながら、ヌクレオチドコード化配列の縮重［ｄｅｎ
ｅｎｅｒａｃｙｌゆえに、第２図に画かれたものと同じ
アミノ酸配列を、実質的にコード化する他のＤＮＡ配列
は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩのエンベロープ遺伝子のク
ローニングに関する本発明の実施に用いられることがで
きる。
これらは、配列内に同じあるいは機能的に等価なアミノ
酸残基（例えば、同じ極性のアミノ酸）をコード化する
異なる］トンの置換（こよって変容された（これゆえ沈
黙変異を生む）第２図に画かれるエンベロープヌクレオ
チド配列の全部または一部からなるヌクレオチド配列を
含むものであるが、もちろんこれらに限定されるわけで
はない。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｏａｏｌ仏子を含有するλＪ
１９の特に有用なサブクローンは、ＤＫＳ−５および１
）３８５である。ＤＫ’Ｓ５プラスミドは、ｐＵＣ１８
中（ｉ’）３１４８塩基対（７）　Ｓ　Ｓｔ　Ｉ　→Ｋ
　ｌ）ｎ　Ｉ　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩフラグメントか
らなる。ＤＫ　Ｓ　−５中に含まれるＬＡＶ／ＨＴＬＶ
ＩＩＩ特異性Ｄ　Ｎ　Ａ　ハ、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ
ゲノムにおいてヌクレオチド２２４番（位置する旦旦■
部位からヌクレオチド３．３７２番に位置するＫｌ）ｎ
Ｉ部位までである。ＤＢＳ−５プラスミドはＩ）ＵＣｌ
３中（７）５．　１　ｋｂｐ　ノ５ｓｔｌ−＋Ｓａｌ　
ＩＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ７７グメントからなる。１）
８３−５中に含まれる［Ａν／ＨＴＬＶＩ［特異性Ｄ　
Ｎ　Ａ　ハ、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩり／ムニ＃イてヌ
クレオチド２２４番に位置する５ＳｔＩ部位からヌクレ
オチド５３３１番に位置する５ａＩ　１部位までである
（ウエインーホブソン、ニス、ら、　１９８５年。
セル４０：９）。ＤＫＳ−５およびｐ８８−５中に含ま
れるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ［ｌヌクレオチド配列を画く第
１４図を参照のこと。しかしながら、ヌクレオチドコー
ド化配列の縮重ゆえに、第１４図に画かれたものと同じ
アミノ酸配列を実質的にコード化する他のＤＮＡ配列は
、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ（７）　Ｑａｇ遺伝子（Ｄ　
’）ローニングに関する本発明の実施に用いられること
ができる。これらは、配列内に同じあるいは機能的に等
価なアミノ酸残基（例えば、同じ極性のアミノ酸）をコ
ード化する異なるコドンの置換によって変容された（こ
れゆえ沈黙変異を生む。）第１４図に画かれたｇａｇヌ
クレオチド配列の全部または一部からなるヌクレオチド
配列を含むものであるがもちろんこれらに限定されるわ
けではない。
（４，２，配列をコート化ｔ　ルＬＡＶ／ＨＴＬＶ　Ｉ
［Ｉタンハク質の発現ベクター中への挿入） 例えばエンベロープ、ｇａｇのようなＬＡＶ／ＨＴＬＶ
ＩＩＩタンパク質あるいはその一部をコードするヌクレ
オチド配列は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入さ
れるタンパク質］−ド化配列の転写および翻訳のために
必要な要素を含むベクター中に挿入される。種々の宿主
−ベクター系が該タンパク質コード化配列を発現するた
めに利用され得る。これらは、ウィルス（例えばワクシ
ニアウィルス、アデノウィルスなど）で感染された咄乳
動物細胞系；ウィルス（例えばバキュロウィルス）で感
染された昆虫細胞系；ならびにイーストベクターを含む
イーストまたはバクテリオファージＤＮＡ。
プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換さ
れた細菌などのような微生物を含むものであるが、もち
ろんこれらに限定されるわけではない。これらのベクタ
ーの発現要素は、それらの強さおよび特異性において変
化する。利用される宿主−ベクター系に依存して、好ま
しい転写および翻訳要素のいくつかのうらの任意の１つ
が用いられる。例えば、哺乳動物細胞系においてクロー
ニングされる場合、哺乳動物細胞のゲノムから単離され
たプロモーター（例えばマウス　メタロチオネイン←プ
ロモーター）、またはこれらの細胞中において増殖した
ウィルスから単離されたプロモーター（例えばワクシニ
アウィルス７．５にプロモーター）が用いられ得る。組
換えＤＮＡまたは合成技術によって製造されたプロモー
ターがまた、挿入された配列の転写を与えるために用い
られる。
特定の開始信号がまた、挿入されたタンパク質コード化
配列の十分な翻訳のために必要とされφ。
これらの信号は、Ａ丁Ｇ開始コドンおよび隣接配列を含
むものである。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を
含む完全［Ａν／ＨＴＬＶＩＩ［エンベロープまたはＱ
ａＱ遺伝子が適当な発現ベクター中に挿入される場合に
おいては、付加的な翻訳制御信号は必要とされない。し
かしながら、該エンベロープまたはｇａｇコード化配列
配列部のみが挿入される場合においては、ＡＴＧ開始コ
ドンを含む外因性翻訳制御信号が提供されなければなら
ない。さらにまた開始コドンが、該完全挿入物の翻訳を
確実とするために、エンベロープタンパク質コード化配
列の解読枠と同時にあるへきである。これらの外因性翻
訳制御信号および開始コドンは、天然および合成の種々
の源のものであり得る。
ベクター中へのＤＮＡフラグメントの挿入に関して取前
に述べられた方法の任意のものが、適当な転写／翻訳制
御信号およびタンパク質」−ド化配列からなるキメラ遺
伝子を含む発現ベクターを形成するために用いられ得る
。これらの方法は、試験管内組換えＤＮＡおよび合成技
術、ならびに生体内組換え（遺伝的組換え）を含むもの
である。
本発明の実施例において詳述される特定の実施態様にお
いては、ワクシニアウィルスおよびバキュロウィルスが
、発現ベクターとして選ばれた。
しかしながら、本発明はワクシニアウィルスあるいはバ
キュロウィルスの使用に限定されるものではない。すで
に説明したように、用いられることのできる発現ベクタ
ーには、以下のベクターおよびその誘導体が含まれるが
もちろんこれらに限定されるものではない：すなわち、
ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなヒト
または動物ウィルス；バクロウィルスのような昆虫ウィ
ルス：酵母ベクター；バクテリオファージベクター、お
よびプラスミドおよびロスミドＤＮＡベクターなどが少
ないが列挙される。
アデノウィルスが発現ベクターとして用いられる場合に
おいては、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ遺伝子
は、アデノウィルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後
期プロモーターおよび３分節系リーダー配列［ｔｒｉｐ
ａｒｔｉｔｅ　１ｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ］へと
連結される。このキメラ遺伝子は、次に、試験管内また
は生体内組換えによってアデノウィルス中に挿入される
。ウィルスゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１または
［３）における挿入は、生存可能でかつ感染宿主におけ
るＬＡＶ／肘ＬＶＩＩ関連タンパク質を発現し得る組換
え型ウィルスをもたらす。現在、軍事人員に対するワク
チンとして是認され使用されているアデノウィルスの２
つの株（タイプ４および７）がある。これらは、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶＩＩＩ遺伝子を発現するためのベクターとし
ての使用に関しての最重要候補である。
さらに、挿入配列の発現を転調する、あるいは、望まれ
る特定の様式においてキメラ遺伝子産物を修飾し、そし
てプロセッシングする宿主細胞株が選ばれる。いくつか
のプロモーターからの発現は、いくつかのインチ１−サ
ー（誘発因子）（例えばメタロチオネイン　プロモータ
ーに対する亜鉛およびカドミウムイオン）の存在におい
て高められ得る。それゆえ、遺伝子工学されたＬＡＶ／
Ｈ且Ｖｌタンパク質の発現は制御され得る。これは、ク
ローン化外来遺伝子のタンパク質産物が宿主細胞に対し
て致死的である場合に重要である。ざらにまた、タンパ
ク質産物の修飾（例えば、グリコジル化）およびプロセ
ッシング（例えば開裂）は、該タンパク質の機能に重要
である。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロ
セッシングおよび修飾に関して特徴的なかつ特定な機構
を有する。適当な細胞系ないしは宿主系が、発現された
外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングに続
くように選ばれることができる。
本発明の実施例において詳述される２つの特定の実施態
様においては、我々は、種々のプラスミドにおいてキメ
ラ遺伝子を形成するためにワクシニアウィルスの７．５
プロモーターに、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ■エンベロープコー
ド化配列（ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ−配列）を
、それの完全形態およびその一部分の双方において、ま
たはＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ　Ｏａｇコード化配列配列連
結させた。これらのプラスミドにおけるキメラ遺伝子は
、ワクシニアウィルスＴＫ遺伝子と相同の付加的なワク
シニアウィルス配列によって側面を接された。キメラ遺
伝子の形成は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ與Ｗ−配列またはＬ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｇａａ配列の転写および翻訳に
関する天然および合成ヌクレオチドコード化制御信号の
使用を含むものであった。キメラ遺伝子は次に、プラス
ミドベクターおよびワクシニアウィルスゲノムの双方に
おいて存在する相同ＴＫ領域間の生体内組換えを通じて
ワクシニアウィルス発現ベクター中へ導入された。キメ
ラ遺伝子を有するこれらの組換え型ウィルスは、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ関連タンパク質またはＬ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｇａｐミル関連タンパク製造す
るための発現ベクターとして用いられた。
実施例において詳述される本発明の他の特定な実施態様
において、我々は、種々のプラスミドにおいてキメラ遺
伝子を形成するためにＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩエンベロー
プコード化配列あるいはＬＡＶ／肘ＬＶＩＩＩｇａｇコ
ード化配列のいずれかを、アウトグラフ？・カリフォル
ニカ核多角病ウィルス［Ａｕｔｏｏｒａｐｈａｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏ
ｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ］（ＡｃＮＰＶ）のポリヘトリン［
ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ］プロモーターへ連結した。これ
らのプラスミドにおけるキメラ遺伝子は、付加的なＡｃ
ＮＰＶ配列（よって側面を接された。このキメラ遺伝子
の形成は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶｍ　ｕａａまたはｅｎｖ配
列の転写および翻訳に関する制御信号をコード化した天
然ヌクレオチドの使用を含むものである。キメラ遺伝子
は次（プラスミドベクターおよびＡｃＮＰＶゲノムの双
方に存在する相同ＤＮＡ間の生体内組換えを介してＡｃ
ＮＰＶ発現ベクター中へ導入された。キメラ遺伝子を含
むこれらの組換え型ウィルスは、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ■エ
ンベロープ関連タンパク質またはＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
ＩＱａＱ関連タンパク質を産生ずるための発現ベクター
として用いられた。
（４，３，挿入遺伝子を複製しかつ発現し得る組換え型
発現ベクターの同定） 外来遺伝子挿入物を含む発現ベクターは、３つの一般的
なアプローチ、すなわち（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ッド形成、（ｂ）　　”標識″遺伝子機能の存在または
不在、および（Ｃ）挿入された配列の発現によって同定
されることができる。第１のアブロー゛チにおいては、
発現ベクターにおける挿入された外来遺伝子の存在は、
外来挿入遺伝子に相同する配列からなるプローブを用い
るＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成によって検知され得
る。
第２のアプローチにおいては、組換え型ベクター／宿主
系はある゛′標識″′遺伝子機能（例えばチミジン　キ
ナーゼ活性、抗性物質に対する耐性、形質転換表現型、
バキュロウィルスにおける閉塞体形成など）の、該ベク
ター中への外来遺伝子の挿入によって引き起こされた、
存在または不在に基づき同定されそして選択されること
ができる。例えばＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　Ｍ信子が、
ベクターの標識遺伝子配列内に挿入された場合、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶＩＩ挿入物を含む組換え体は、該標識遺伝子
機能の不在によって同定され得る。第３のアプローチに
おいては、組換え型発現ベクターは、該組換え体によっ
て発現された外来遺伝子産物を検定することによって同
定されることができる。このような検定は、該遺伝子産
物の物理的、免疫学的あるいは機能的特性に基づくもの
であり得る。
特定の組換え型ＤＮＡ分子が同定されそして単離される
と、いくつかの方法が、このような組換え体が１つの自
己複製単位（レプリコン）を構成するか否かに依存して
、それを繁殖するために用いられ得る。例えばプラスミ
ド、ウィルス、細胞等の自己複製単位は、適当な細胞性
環境および増殖条件においてそれ自体を複製できる。自
己複製単位を欠く組換え体は、繁殖させるためにこのよ
うな単位を有する分子中に統合されなければならない。
例えば、宿主細胞中への導入においていくつかのプラス
ミド発現ベクターは、繁殖および組換え遺伝子の適当な
発現に続くように細胞性染色体中へ統合される必要があ
る。適当な宿主系および増殖条件が確立されると、組換
え型発現ベクターは繁殖され大量に調製されることがで
きる。
実施例において詳述される本発明の特定な実施態様にお
いて、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩのｅｎｖまたはＱａＱ’：
Ｊ　−ド化領域を含むキメラ遺伝子は、ワクシニアウィ
ルスゲノムのＴＫ遺遺伝子へ挿入され、これによってウ
ィルスはＴＫ−に転化（すなわちチミジン　キナーゼを
産生ずるウィルスの能力の破壊）された。このような組
換え体は、ＴＫ＋細胞に対しては致死的であるがＴＫ−
細胞に対してはそうではないヌクレオシド類似体である
、５−プロモーデオキシウリジンを含む培地において増
殖する能力によって選択された。組換え体は、さらに、
しＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ特異性またはＬＡＶ／
旧ＬＶＩＩＩ　０８ｇ特異性プローブを用いてのＤＮＡ
−ＤＮＡハイブリッド形成によって同定された。ＴＫ−
組換え型ウィルスは、プラーク精製によって単＠されそ
して株が感染組織培養ＩＲ飽から調製された。
実施例において詳述される本発明の他の特定な実施態様
において、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩのｅｎｖまたはａａ
ａコード化配列配列むキメラ遺伝子が、ＡｃＮＰＶゲノ
ムのポリヘトリン遺伝子中へ挿入され、これによってウ
ィルスは非閉塞原型に転化した。このような組換え体は
、閉塞ウィルス粒子のそれらの欠除によって視識的に選
択された。組換え体はざらに、［＾Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩ
　ｅｎｖ特異性プローブまたはし＾Ｖ／ＨＴＬＶ　ｇａ
ｇ特異性プローブを用いるノーザン　プロット分析［Ｎ
ｏｒｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓｌによっ
て同定された。組換え型ウィルスは、プラーク精製によ
って単離され、そして株が感染組織培養細胞から調製さ
れた。
（４，４，発現された遺伝子産物の同定および精製） ＬＡＶ／ＩＩＴＬＶ　ｎｕ遺伝子を発現する組換え体が
同定されると、遺伝子産物が分析されるべきである。こ
れは、該産物の物理的、免疫学的または機能的特性に基
づき検定され得る。免疫学的分析は、最終目的が遺伝子
産物あるいはこのような産物を発現する組換え型ウィル
スのワクチン処方におけるおよび／または抗体としての
診断学的免疫検定法における使用であるので、特に重要
である。
種々の抗血清が、該産物の免疫反応性を分析するために
役立ち得るものであり、例えばＬＡＳまたはＡＩＤＳ患
者から誘導された面漬、ならびに、ＬＡＶ／旧ＬＶ［［
ウィルス、ウィルスエンベロープタンパク質もしくはＱ
ａＱ遺伝子によりコード化されたコアタンパク質に対し
て指向する多価抗血清などが含まれるがもちろんこれら
に限定されるわけではない。免疫原性分子は、細菌系に
おいて産生ざれた同族体または、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
Ｉエンベロープまたはコア抗原の抗原決定基を含む合成
ペプチドを含むものである。本発明において述べられる
ペプチドおよびタンパク質の同定は、２つの要望に基づ
くものである。第１には、ＬＡＶ／肘ｔｖ１１関連タン
パク質は、組換え型ウィルス感染細胞においてのみ産生
きれるべきである。第２には、該ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩｎ
関連タンパク質は、関連タンパ音質血清に対して、また
は、ＬＡＶ／Ｈ丁ＬＶＩＩ［エンベロープもしくはコア
タンパク質もしくはその同族体および誘導体に対し指向
する種々の抗体に対して免疫反応性であるべきである。
該タンパク質は、それが完全遺伝子配列の発現、該遺伝
子配列の一部の発現、あるいは融合タンパク質の産生を
導くために連結される２ないしそれ以上の遺伝子配列か
らのものであることにかかわらず免疫反応性であるべき
である。この反応性は、放射性免疫沈降、放射性免疫競
合あるいはイムノプロットのような標準的免疫学的技術
によって示され得る。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連タンパク質が同定されると
、それは、クロマトグラフィー（例えばイオン交換。
親和性、サイズ規正カラムクロマトグラフィー）、遠心
分離、溶解度差を含む標準的方法によって、あるいはタ
ンパク質の精製に関するその他の標準的技術によって、
単離され精製される。
あるいはまた、組換え体によって産生きれた免疫反応性
ＬＡＶ／旧ＬＶ■関連タンパク質が同定されると、該免
疫反応性タンパク質のアミノ酸配列は、該組換え体中に
含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推論され
ることができる。結果として、該タンパク質は当業者に
公知である標準的な化学的方法によって合成されること
ができる（例えば、バンカピラー、エム、ら、　１９８
４年、ネイチャーぢ３１０：１０５〜１１１　［Ｈｕｎ
ｋａｐｉ　Ｉ　Ｉｅｒ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　。
１９８４、Ｎａｔｕｒｅ　星１０５−１１１１を参照の
こと。）。
本発明の特定の実施態様においては、このようなペプチ
ド（組換えＤＮＡ技術によっであるいは化学的合成方法
によって製造された）は、機能的に等価なアミノ酸残基
で配列内の残基が置換され、結果的に沈黙変異となった
変容配列を包含して、第２図中に実質的に画かれたよう
な、あるいは第１４図中に実質的に画かれたようなアミ
ノ酸配列の全体あるいは一部を含むものであるが、もち
ろんこれらに限定されるわけではない。例えば、配列内
の１ないしそれ以上のアミノ酸残基は、機能的等何体と
して作用する同様の極性の伯のアミノ酸によって置換さ
れることができ、沈黙変容をもたらす。配列内のアミノ
酸に対する置換体は、該アミノ酸が属するクラスの他の
メンバーより選ばれ得る。例えば、非極性（疎水性）ア
ミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン
、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよび
メチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セ
リン、トレオニン、システィン、チロシンを含む。陽帯
電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒ
スチジンを含む。陽帯電（酸性）アミノ酸はアスパラギ
ン酸およびグルタミン酸を含む。
（４，５，組換え林産物の免疫力の測定）ＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶＩＩＩエンベロープ関連産物の免疫力は、該精製タ
ンパク質または合成ペプチドもしくはタンパク質での免
疫処置後の試験動物の免疫応答を監視することによって
測定されることができる。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連タンパク質が感染性組換え
型ウィルスによって発現された場合においては、組換え
型ウィルスそれ自体が、試験動物を免疫処置するのに用
いられることができる。試験動物は、マウス、ウサギ、
チンパンジーおよび最終にヒト被験者を含むものである
。免疫原の導入の方法は、口内、皮肉、筋肉、腹腔内、
静脈内、皮下、鼻内あるいは免疫処置の任意のその他の
標準的経路を含む。被実験体の免疫応答は３つのアプロ
ーチによって分析されることができる。すなわち（ａ）
公知の技術、例えば酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳ
Ａ）イムノプロット、放射性免疫沈降等によって検定さ
れるような、得られた免疫血清の真正なＬＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩＩＩウィルス抗原に対する反応性；（ｂ）試験管内
におけるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ感染性を中和する免疫
血清の能力（ロバートーガロフ、エム、　、　１９８５
年、ネイチャ−３１８：　７２〜７４［Ｒｏｂｅｒｔ−
Ｇｕｒｏｆｆ、　Ｈ，、１９８５゜Ｎａｔｕｒｅ　３１
６：７２−７４）；および（Ｃ）免疫処理された動物に
あけるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ［感染からの防御および／
または感染性症状の減衰（フランシス、ディー。
ピー０．１９８４年、ランセット２　：　１２７６〜１
２７７　；ガジュセク、ディー、シー、　、　１９８５
年、ランセット１　：５５〜５６［Ｆｒａｎｃ　ｉ　ｓ
、　Ｄ、　Ｐ、　、　１９８４．　Ｌａｎ５ｅｔ　２　
：１２７６−１２７７；Ｇｕｊｄｕｓｅｋ、　Ｄ、　Ｃ
，、１９８５，Ｌａｎ５ｅｔ　１　：５５−５６］　）
である。
（４，６，ワクチンの処方） 本発明のこの実施態様の目的は、免疫原がＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶ■エピトープ、またハＬＡＶ／旧Ｌｖ■ウィルス感
染を防ぐような免疫原を発現する組換え型ウィルスに関
連するものであるＬＡＳないしＡＩＤＳの予防のための
ワクチンを処方することである。さらに、１以上の免疫
原性ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連決定基を含む多価ワク
チン処方が調製されることができる。
このようなワクチンは、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ　Ｉ［Ｉエン
ベロープ関連エピトープが単独であるいは、例えば０８
ｇ関連エピトープのようなその他のＬＡＶ／ＨＴＬＶｎ
ｌエピトープと組合せて処方されたものを含むワクチン
を包含するものであるが、もちろんこれらに限定される
わけではない。ｅｎｖコード化エピトープおよびｇａｇ
コード化エピトープの双方を含むこのような多価ワクチ
ンは、ＡＩＤＳの進展を顕著に防ぐものである。無症状
である個体は、疾病患者と比べてより頻繁に抗ｇａｇ抗
体を産生じていると思われるが、一方、双方のグループ
の患者は、エンベロープ決定基に対して指向する抗体を
産生ずる（サイエンス、　１９８Ｂ、２２３：４１９［
５ＣｉｅｎＣｅ、１９８Ｂ、２２３：４１９］）研究は
また、初期無症状性段階におけるＡＩＤＳ患者が、エン
ベロープおよびコア（ｐａｇ）タンパク質に対する抗体
を産生することを示している。疾患が進行し症状が発現
すると、抗ＱａＱ抗体は減少され、一方抗エンベロープ
抗体は維持される（サイエンス、　１９８６，２２３：
２８２＞。これゆえ、ｇａｇ関連エピトープのワクチン
処方中における含有（その製法は本発明の特定の実施態
様として述べられる。）は、ＬＡＶ／肘［ｖ■関連疾患
の免疫予防あるいは免疫治療において重要である。
多価ワクチンは、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＵ遺伝子産物およ
び／または該キメラ遺伝子産物を発現する組換え型ウィ
ルスを含有するように処方されることができる。これら
はまた、ＬＡＳないしＡＩＤＳおよび他の疾患の予防の
ための伯の免疫原と組合せて用いられ得る。種々の処方
の例が、以下に述べられる。
（４，６，１，ウィルスワクチン処方）生絹換え型ウィ
ルスワクチンあるいは不活化組換え型ウィルスワクチン
のいずれも処方され得る。
選択は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ［関連エピトープを発現す
るのに用いられる組換え型ウィルスの状態に依存する。
組換え型ウィルスが、免疫処置されるべき宿主に対して
感染性であるが、疾患を引き起こさない場合には、宿主
における複製が自然無症状感染において起こるものと同
様の種類および程度の遷延刺激となり、そしてそれゆえ
実質的に永続する免疫性を授与するので、生ワクチンが
好ましい。宿主動物中への導入において、感染性組換え
型ウィルスは、そのキメラ遺伝子からＬＡＶ／Ｈ且Ｖｌ
関連タンバク質を発現し得、そしてそれによってＬＡＶ
／ＨＴＬＶ■抗原に対する免疫応答を刺激することがで
きる。
このような免疫応答が、その後のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
Ｉ攻撃に対して防御的である場合においでは、生絹換え
型ウィルスは、ＡＩＤＳウィルス感染に対する予防ワク
チンとして単独で用いられ得る。このような処方におい
て用いられるこのような組換え型ウィルスの製造は、試
験管内（例えば組織培養細胞）および生体内（例えば天
然宿主〉系の双方を含むものである。ワクシニアウィル
ス組換え体がこの点において特に有用である。痘痕ワク
チンの調製および処方のための周知方法が、生絹換え型
ウィルスワクチンの処方のために適用され得る（例えば
、ワクシニアウィルスおよびワクチン抗原に関するファ
クター、キナン、シー、ブイ、編エルセベア、　１９８
５年、第１０９〜１１６頁［Ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖ；ｒ
ｕｓｅｓ　ａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｖａｃｃｉ
ｎｅ　ＡｎｔＬｇｅｎｓ、Ｅｄ、Ｑｕｉｎｎａｎ。
Ｇ、　Ｖ、　、　Ｅ　ｌ５ｅｖｉｅｒ、　１９８５．　
ｐｐ、　１０９−１１６１を参照のこと。〉多価生ウィ
ルスワクチンは、いくつかのＬＡＶ７ＨＴＬＶＩ［Ｉ　
／ＨＴＬＶ関連エピトープを発現する単一のあルイハ二
、三の感染性組換え型ウィルスから調製されることがで
きる。このワクチンはまた、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩの
エピトープに加えて、伯の疾患を引き起こす有機体のエ
ピトープを発現するウィルスを含み得る。例えばワクシ
ニアウィルス（約３５キロベースの外来ＤＮＡを収容し
得る。）は、ＬＡＶ／ＨＴＩＶ■のエンベロープおよび
Ｑａ（Ｊ関連エピトープの双方に関するコード化配列を
含み得るように工学処理され得る。該ウィルスはまたＬ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩに関するこれらのものに加えて、
その他のエピトープをコード化し得る。このような組換
え型ウィルスそれ自体が、多価ワクチンにおける免疫原
として用いられることができる。あるいはまた、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶ■および／または伯の疾患誘発有機体の異な
るエピトープに関してコードする異なる遺伝子の発現を
それぞれ導き得る、ワクシニアあるいは他のウィルスの
混合物が、多価ワクチンにおいて処方され得る。
組換え型ウィルスが、免疫処置されるべき宿主に対して
感染性であるか否かにかかわらず、不活化ワクチン処方
は調製され得る。不活化ワクチンは、それらの感染性が
、通常はホルムアルデヒドによって、破壊されていると
いう点で“′死んだ″ものである。理想的には、ウィル
スの感染性は、ウィルスの免疫原性を負うキャプシドな
い１）はエンベロープタンパク質を影響することなく破
壊される。不活化ワクチンを調製するために、多量の組
換え型ウィルスが、必要な量の関連抗原を与えるように
培養において増殖されなければならない。
異なるエピトープを発現する不活化ウィルスの混合物は
“多価″ワクチンの処方に用いられ得る。
いくつかの例において、同時に投与される生ウィルスの
相互干渉での潜在的困難性ゆえに、これは、生ワクチン
処方よりも好ましい。どちらの場合にも、不活化組換え
型ウィルスまたはウィルスの混合物は、それらの抗原に
対する免疫学的応答を高めるために、適当なアジュバン
トと共に処方されるべきである。適当なアジュバントは
、例えば水酸化アルミニウムのような鉱質グル、リソレ
シチンや構成ポリオールのような界面活性物質、ポリア
ニオン、ペプチド、および油エマルジョン、ならびにＢ
ＣＧ　（カメットーグラン杆菌）やコリネバクテリウム
φパルバム［ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒ
ｖｕｍ］のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含
むが、もちろんこれらに限定されるわけではない。
多くの方法が、上記したワクチン処方を導入するために
用いられ得、これらは、口内、皮肉、筋肉、腹腔内、静
脈内、皮下および鼻内経路を含むが、もちろんこれらに
限定されるわけではない。
生絹換え型ウィルスワクチン処方が用いられる場合、そ
れは、ワクチン処方中の組換え型ウィルスを製造するの
に用いられた親好生型［ｐａｒｅｎｔ　ｗｉｌｄｔｙｐ
ｅ］ウィルスの感染の自然経路を介して導入される。
（４，６，２，サブユニットワクチン処方）ウィルスワ
クチンに代わるものにおいて、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ
関連タンパク質それ自体は、サブユニットワクチン処方
（多価であり得る。）における免疫原として用いられ得
る。先に説明したように、サブユニットワクチンは、宿
主を免疫処置するのに必要な関連免疫原性物質よりのみ
構成される。
従ッテ、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　関連タンパク質（群
）　、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエピトープを発現する組
換え体から精製される。このような組換え体は、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶＩＩＩエピトープを発現する、前述したウィ
ルス感染培養細胞、細菌性被形質転換体、または酵母被
形質転換体の任意のものを含むものである（第４．２．
４．３および４．４節を参照のこと。）。本発明の仙の
実施態様において、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連ペプチ
ドもしくはタンパク質は、化学的に合成される。このた
めに、このようなペプチドもしくはタンパク質のアミノ
酸配列は、それの発現を導くキメラ遺伝子のヌクレオチ
ド配列から推論されることができる（第４．４節参照の
こと。） 免疫原が組換え体から精製されたあるいは化学的に合成
されたにかかわらず、最終産物は、適当な濃度に調整さ
れ、そして任意の適当なワクチンアジュバントと共に処
方され、使用のために包装される。適当なアジュバント
は、例えば水酸化アルミニウムのような鉱質グル；リソ
レシチン、深成ポリオールのような界面活性物質：ボリ
アニオン；ペプチド；油エマルジョン；ならびにＢＣＧ
（カメットーグラン杆菌）やコリネバクテリウム・パル
バム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ；ｕｍ　ｐａｒｖｕｍ
］のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、
もちろんこれらに限定されるわけではない。免疫原はま
た、リポソーム中へ取込まれ得、あるいは多糖類および
／またはワクチン処方中に用いられるその他のポリマー
に複合［ＣＯｎｊｔＪｇａｔｅ］され得る。
ＬＡＶ／旧ＬＶＩ関連ペプチドもしくはタンパク質がハ
プテン、すなわち、同種の抗体と選択的に反応し１ｑる
というように抗原性であるが、免疫応答を引き出すこと
のできないというような免疫原性でない分子である場合
においては、該ハプテンは担体ないしは免疫原性分子、
−例を挙げると、ハプテンが結合した場合に免疫原性を
授与するであろう例えばタンパク質血清アルブミンのよ
うな巨大タンパク質へ共有結合される。このハプテン−
担体はワクチンとしての使用のために処方される。
（４，６，３，受動免疫および抗イデオタイプ抗　９５
一 体） ウィルスワクチンまたはサブユニットワクチンでの能動
的免疫処置に代わり、ＬＡＶ／Ｈ且ｖ■のエピトープに
対して指向する前調製抗体の投与により、宿主に短期間
防御を授与することが可能である。
従って、上記されたワクチン処方は、受動免疫療法にお
いて使用するための抗体を製造するために用いられるこ
とができる。ヒト免疫グロブリンは、異種免疫グロブリ
ンがそれの外来免疫原性成分に対する免疫応答を刺激す
るであろうゆえに、ヒト医学において好まれるものであ
る。このような受動免疫処置は、例えば病院およびその
他の健康管理施設におけるようにＡＩＤＳ患者と接触す
ることにざらされる者のごとき、特別の危険性にざらさ
れる未免疫個体の、急速な防御のための緊急体制におい
て用いられることができた。あるいはまた、これらの抗
体は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ　ＩＩＩエピトープに対する免
疫応答を刺激するための抗原として交互に用いられるこ
とのできる抗イデイオタイプ抗体の製造に用いられるこ
とができる。
（４，７，免疫検定法） 本発明のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ関連ペプチドおよびタ
ンパク質は、種々の患者組織および体液ならびに血液銀
行および病院における血液中のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ
に対する抗体の検知のための免疫検定法における抗原と
して用いられ得る。このために、本発明の抗原は、少な
いが列挙すると、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（
酵素結合免疫吸着剤検定）゛′サンドイッチパ免疫検定
、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検定、凝集検
定、補体結合検定、免疫放射検定［ｉｍｍｕｎｏ−ｒａ
ｄｉｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙｌ、螢光免疫検定、プ
ロティンＡ免疫検定および免疫電気泳動検定のような技
術を用いる競合および非競合検定系を含む（もちろんこ
れらに限定されるわけではない。）当業界において公知
の任意の免疫検定系において用いられ得る。
本発明の免疫検定は、血液銀行における血液および患者
をＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩへの暴露に関し、検査するた
めにおよびＬＡＳないしはＡＩＤＳに関する治療を受け
ている患者を監視するために用いられ得る。ＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩＩの抗原に関連する任意のペプチドおよびタ
ンパク質が、本発明による免疫検定において用いられる
ことができる。このような抗原は、ｅｎｖ、　ＱａＱ、
　ｐｏｌの遺伝子産物、ならびにＳＯｒ、　ｔａｔ、　
３゜−ｏｒｆおよびａｒｔ　（ないしはｔｒＳ）の今日
までに命名された４つのその他の遺伝子に関連するペプ
チドおよびタンパク質を含むものであるが、もちろんこ
れらに限定されるわけではない。本発明の特定の実施態
様において、抗原のパネルが、ＬＡＶ／ＨＴＬν■の異
なるエピトープに対し指向する抗体のプロフィールに関
して患者を検査するための免疫検定において用いられた
。本発明の他の実施態様において、本発明のワクチン処
方で予防接種された患者は、その後のＬＡＶ／ＨＴＬＶ
ＩＩＩに対する暴露を検知するために監視された。この
ような場合において、免疫検定において用いられる抗原
は、患者を予防接種するのに用いられたワクチン処方の
免疫原ではない本発明のペプチドまたはタンパク質であ
ることが好ましく、なぜなら、このような予防接種され
た個体は、ワクチン処方に用いられた特定のエピトープ
に対して血清陽性であり、結果として、ウィルスへの暴
露に関わりなく試験に陽性となるであろうゆえである。
例えば、患者が、本発明のＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエン
ベロープ関連エピトープで予防接種された場合、この患
者は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩに対して特異的な患者抗
体の存在を測定するために、任意のその他の非エンベロ
ープＬＡＶ／ＨＴＩＶＩＩＩ関連タンパク質を用いて［
Ａν／ＨＴＬＶＩＩＩ感染に関して検査される。
これゆえ、エンベロープ関連エピトープで予防接種され
た患者は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩコア抗原、あるいは
ｓｏｒおよび３°−ｏｒｆ遺伝子産物および同様なもの
を含む（もちろんこれらに限定されるものではない。
）　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩの他の抗原に関して特異的な
抗体に関し検査されることができる。
代わりとなる実施態様において、本発明の［Ａν／ＨＴ
ＬＶＩＩＩ関連ペプチドおよびタンパク質は、患者の血
液、血清等におけるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩコード化タ
ンパク質の存在を検知しそして定凹するために、競合免
疫検定において用いられ得る。
（５，実施例：ワクシニアエンベロープ組換え体）以下
の実施例において、種々のプラスミドベクターが、ワク
シニアウィルスの転写調節配列に対して下流に位置する
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＪＩＩエンベロープコード化配列から
なるキメラ遺伝子を含んで形成された。
ワタシニアプロモーターおよびしＡＶ／Ｈ且Ｖ［ｌエン
ベロープ］−ド化配列を含むこれらのキメラ遺伝子は、
生体内組換えを介してワクシニアウィルスのゲノム中へ
挿入された。このような組換え型ウィルスは同定されそ
して精製され、そしてウィルス株が感染組織培養細胞か
ら調製された。免疫反応性しＡＶエンベロープ関連タン
パク質は、試験管内においてこれらの組換え型ワクシニ
アウィルスによって産生きれることが示された。これら
の組換え体は、中和または防御免疫応答を引き出すこれ
らの能力に関して、およびＡＩＤＳに対するワクチンと
しての使用に関して実験動物において試験された。
（５，１，一般的手順） （５，１，１，細胞およびウィルス） アフリカグリーンモンキー［ＡｆｒｉＣａｎ　ｐｒｅｅ
ｎ　ｍｏｎｋｅｙｌ細胞（ＢＳＣ−１細胞、ＡＴＣＣＮ
ｏ、ＣＣＬ２Ｂから誘導されたアフリカグリーンモンキ
ー細胞の連続系である、株Ｂ５Ｃ−４０）は、アール、
コンジット［Ｒ，Ｃｏｎｄｉｔｌ　にューヨーク州バッ
フ７０−のステートユ二ヴアシティー　オブ　ニューヨ
ークの主列学科の准教授）から得られ、そして１０％胎
児ウシ血清ならびにペニシリンおよびストレプトマイシ
ンをそれぞれ１００単位／ｄ追補されたダルベツコ修正
イーグル培地（Ｄ）ＩＥＭ、ジブコ［Ｇｉｂｃｏｌ、ニ
ューヨーク州グランドアイランド）において増殖された
。ヒト１４３ＴＫ−細胞（リム、ジエイ、ニス。
ら、　１９７５年、インターナショナル　ジャーナルオ
ブ　キャンサ−１５：２３〜２９［Ｒｈ１ｍ、　Ｊ、　
Ｓ、　ｅｔ、　ａｌ、　。
１９７５、Ｉｎｔｌ　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　１５：２３−
２９］）は、エム、ボッチャン［８，Ｂｏｔｃｈａｎｌ
　（カリフォルニア州バークレイのユニヴ７シティ　オ
ブ　カリフォルニアの分子生物学科の教授）から得られ
、そして５−プロモーデオキシウリジン（ＢｔｌｄＲ）
　２５μｇ／−の添加された上記の培地において増殖さ
れた。
ヒト複相細胞（）ＩＲｃ−５＞は、アメリカン　タイプ
カルチャーコレクション［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
　ｃｕｌｔｕｒ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ］から得られ（
ＡＴＣＣＮＯ，ＣＣＬ　１７１）そしてＢＳＣ−４０に
関して使用されたものと同じ培地において増殖された。
ワクシニアウィルス（株ＷＲ，ＡＴＣＣＮＯ，ＶＲ−１
１９）ハアール、コンジットから得られ、そしてＤＭＥ
Ｍに５％ガンマグロブリン非含有ウシ血清ならびにペニ
シリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ１００単位
／ｄを加えたものの中のＢＳＣ−４０細胞において増殖
された。ＴＫ−組換え体は、ＢＬＪｄＲ２５μｇ／ｄを
含む同じ培地中の１４３ＴＫ−細胞において選択され、
そして１％ノープル寒天［Ｎｏｂｌｅ　ａｇａｒｌ　（
ディ７］　［ＤＪＦＣＯ］、ミシガン州デトロイト）、
５％ガンマグロブリン非含有ウシ血清、ペニシリンおよ
びストレプトマイシンそれぞれ１００単位／ｄ、ならび
に２５μび／ｄＢＩＪｄ　Ｒを含むＤＭＥＭ中の同じ細
胞系においてプラーク精製された。ウィルス株［５ｔａ
ｃｋ］希釈物は、１ｒｎｇＭ（ＩＩｃＩ、２　　および
０．０１％ウシ血清フル１ミンを追補されたリン酸緩衝
食塩水（ＰＢＳ、　１ｇ当りＮａＣｌ　ＪＦ、　ＫＣＩ
　Ｏ，２ｇ、　　ＮａＨ２ＰＯ４１，５９゜Ｋ　　ＨＰ
Ｏ４０，２ｇを含む。）（ＰＢＳＡＨ）において作成さ
れた。
ワクシニアウィルスのザ　ニ１−］−り　ボード　オブ
　ヘルス［Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｏａｒｄ　ｏ
ｆ　Ｈｅａｌｔｈ］株は、ワイズ　ラボラトリーズ［Ｗ
ｙｅｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｌ　（ペンシルへ
ニア州マリエツタコにより販売される痘痕ワクチンの市
販製品（叶ｙｖａｘ■ロット３２１５０１Ｇ）から精製
された。痘痢ワクチンはＰＢＳＡＭ　（下記を参照のこ
と。）で希釈され、そしてＢ１０−４０１１胞において
３回連続的にプラーク精製された。株（以下ｖ−ＮＹと
呼称する。）が、このようなプラーク精製単離体からＢ
１０−４０において調製され、モして組換え型ウィルス
と対比して用いられた。Ｖ−ＮＹから誘導された組換え
型ウィルスの株は、ＭＲＴ−５０００細胞において増殖
された。
（５，１，２，ＤＮＡの調製、制限および修飾）特にこ
とわらない限り、以下の手順に用いられたすべての方法
は、マニアティスら、　１９８２年、モレキュラー　ク
ローニング、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラト
リ−［）１ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ、ａｌ、。
１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）（ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ］　（７）指示ヘーシ、ｔ　ａ　ね＃３、プラスミ
ドＤＮＡの調製（第８６〜９６頁）、ＤＮＡの制限消化
（第９８〜１０６頁）および低融点アガロースゲルから
の制限フラグメントの精製（第１５７〜１６１頁および
第１７０頁）、フレノウフラグメント　エシェリキア・
］すＤＮＡポリメラーゼ酵素に関する反応条件（第１０
７〜１１４頁）、ウシ腸アルカリホスファターセ（第１
３３〜１３４頁）およびリガーゼ反応（第１４６頁）、
ニックトランスレーション化プローブ（第１０９〜１１
２頁〉ならびにＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成に関す
る手順（第３２４〜３２５頁）、に）ホベられるように
して行なわれた。
（５，２，ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ遺伝子
のコード化配列に連結されたワクシニアウィルスプロモ
ーターを含むプラスミドベクターの形成）以下の分節は
、ワクシニアウィルス転写制御配列によってプロシーデ
ィングされたＬＡＶエンベロープ遺伝子のコード化配列
を含む種々のプラスミドベクターの形成を述べるもので
める。なおこれらのキメラ配列は、ＴＫ　　ＤＮＡによ
って側面を接されている。これらの組換え型プラスミド
ベクターは、生体内組換えを介してワクシニアウィルス
のゲノム中にＬＡＶ／旧ｔｖ１１エンベロープコード化
配列を挿入するために後に用いられた。
以下の分節において、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロ
ープコード化配列は、λＪ１９のサブクローンの１つで
あるｐＲ３−３（ウエインーホブソン、ニス。
ら、　１９８５年、セル４０：９［Ｗａ　１ｎ−Ｈｏｂ
ｓｏｎ、　Ｓ、　、　ｅｔ、　ａ　１．　。
１９８５、　Ｃｅ１ｌ　４０：９］）から精製され、そ
して、ｐＶ−ｅｎｖｌ、　ｐＶ−ｅｎｖ２．およびｐｖ
−ｅｎｖ５を形成するために、プラスミドｐＧｓ２０（
マケット、エム９．スミス、シー、エル、およびモス、
ビー、　、　１９８４年。
ジャーナル　オブ　ピロロジー［ｔｌａｃｋｅｔｔ、　
）１．　。
Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｌ、ａｎｄ　）１ｏｓｓ、Ｂ、、１９
８４．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　４９．８５７−８６４］　）
中へ、ρＧ５２０中に含まれるワクシニア７．５にプロ
モーターに対し下流に挿入された。
これらの形成のそれぞれにおいて、キメラ遺伝子（すな
わち、ＬＡＶ特異性ヌクレオチド配列に連結した７、５
にワクシニアプロモーター）は、ワクシニアＴＫｍ信子
配列によって側面を接される。
先に説明したように、ＰＢＳ−３は、ｐＵＣ１８の旦ｃ
ｏＲＩおよび旦ＳｔＩ部位中にクローンさ’４’１．り
λＪ　１９１．；：含マレルＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　
Ｄ　ＮΔ挿入物の３．８．４０ベースペアＥｃｏＲＩ−
＋５ｓｔＩフラグメントからなる。それは、ｐＢＴ−１
を形成するためにｐＬＩｃ１８の５ｓｔＩ部位中へ５ｓ
ｔＩ制限フラグメントを挿入し、そして次にｐＢＴ−１
をＥＣ０ＲＩで消化し、そして再連結することによって
得られた。このＤＮＡはエシェリキア・コリを形質転換
するために用いられ、そしてプラスミドｐＲＳ　−３が
単離された。ｐＲＳ　−３中に含まれルＬＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩＩＩ特異性Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔ、ｔ、ＬＡｖゲノムにお
いてヌクレオチド５２８９番に位置する旦ＣＯＲ７部位
からヌクレオチド９１２９番に位置する５ｓｔ１部位ま
でである（ウエインーホブソン、ニス、ら、　１９８５
年、セル４０：　９）。第２図を参照のこと。
（５，２，１，ＬＡＶ／ＨＴＬＶｌｎｅｎｖ遺伝子の３
′コ一ド化配列に連結されたワクシニアウィルスプロモ
ーターを含むプラスミドベクターの形成）ｐＲＳ−３プ
ラスミドＤＮＡの５ｇが制限酵素Ｋ　ｐｎ　Ｉを用いて
完全に消化され、そして得られたフラグメントは、１％
低融点、アガロースゲルにおいて分解された。２．６８
Ｋｂｐ（キロベースペア）フラグメントが単離されそし
て精製された。このフラグメントは、ＬＡＶ／Ｈ丁ＬＶ
ＩＩ［エンベロープタンパク質のＣ末端位置をコード化
する配列（５８８９〜８３４９　）を含むヌクレオチド
番号５８８９号から８５７２まｒ　（７）ＬＡＶ／Ｉ′
ＩＴＬＶ　Ｉｌｌ特異性ＤＮＡを含んでいた。
このフラグメントの１μびが、予め制限酵素ＢａｍＨＩ
で線状化された１）ＧＳ２０　　ＤＮＡ０．５μｇと混
合された。これらの２つの７ラグメントの連結反応は、
５°−ＧＡ丁ＣＣＡｃＣＡＴＧＧＴＡｃ−３°−ＤＨｏ
、６μ３および５°−ＣＡＴＧＧ丁Ｇ−３°−ＤＨｏ、
３μ３からなるオリゴデオキシヌクレオチドの存在下に
おいて４℃で２４時時間待させられた。これらのリンカ
−は、（ａ）　　ｐＲＳ　−３プラスミドＤＮＡから誘
導された２、６８ＫｂｐフラグメントのＫｌ）ＩＩＩ付
着端を、開裂されたＤＧＳ２０　　ＤＮＡの圧印ＨＩ付
着端と相補的である圧印ＨＩ付着端に転化するため、お
よび（ｂ）　ＬＡＶ／肘ＬＶＩ［Ｉエンベロープ遺伝子
配列ならびに転写されたｍＲＮＡの十分な翻訳のために
必要とされるヌクレオチド配列に関する正しい解読枠に
おける翻訳開始配列（ＡＴＧ）を提供するために与えら
れる。該連結混合物は、エシェリキア・コリ株ＭＣ１０
０Ｏを形質転換するために用いられた。アンピリジン耐
性被形質転換体からのプラスミドＤＮＡは、挿入物の配
位およびＢａｍＨＩ、ＮＣ０ＩおよびＫ　ｐｎ　１部位
の連結点での再生に関して試験された所望されたプラス
ミドであるｐｖ−ｅｎｖ２の確認された構造は、第３図
に示され、これにおいて、ヌクレオチド番号５８８９番
〜８５１２番（第２図に示される）に相当するＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩエンベロープ遺伝子のカルボキシルコード化
部分は、７．５にワクチンプロモーターに対して下流に
位置されている。該ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロー
プ配列は、リンカ−ＤＮＡによって供給された開始ＡＴ
Ｇに−１０８一 対して正しい解読枠中に位置している。
（５，２，２，ＬＡＶエンベローフ遺伝子）５゜コード
化配列に連結されたワクシニアウィルスプロモーターを
含有するプラスミドベクターの形成）ｐＲＳ　−３プラ
スミドＤＮＡの５μ３がＮ！ＩＩ制限酵素で完全に消化
され、そして得られたフラグメントは、１％低融点アガ
ロースゲルにおいて分解された。０．８２ＫｂＤフラグ
メントが単離され、そして精製された。このフラグメン
トは、ヌクレオチド番号５６１１番から６４９０番（第
２図に示される。）までのＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ特異
性配列を含んでいた。これは、該エンベロープタンパク
質のＮ−末端部分をコード化する配列（ヌクレオチド番
号５１６６番〜６４９０番）およびＬＡＶ（７）５°近
位未翻訳配列の９５塩基対を含むものである。このフラ
グメントは過剰なデオキシリボヌクレオチド　トリホス
フェートの存在下においてフレノウフラグメント　エシ
ェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼで処理された。得ら
れたプラント末端は、予め３ｍａ工で線状化され、そし
てウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理さ
れたρＧ５２０　　ＤＮＡ０．５μｇに連結された。連
結反応は１２℃で１６時時間待させられた。連結混合物
はエシェリキア・コリ株ＨＣｌ００Ｏを形質転換するた
めに用いられた。アンピリジン耐性被形質転換体からの
プラスミドＤＮＡは、ワクシニアウィルス転写制御配列
に対するＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ挿入物の配位に関して
試験された。所望されたプラスミドであるｐｖ−ｅｎｖ
ｌに関する確認された構造は、第４図に示され、ここに
おいて、ヌクレオチド番号５６１１番から６４９０番（
第２図に示される。）までに相当する、それ自体の開始
ＡＴＧを含むＬＡＶエンベロープ遺伝子のアミノコード
化部分は、ワクシニア７．５にプロモーターに対し下流
に位置されている。
（５，２，３，ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンへ［］−１
３１１伝子（Ｄ完全コード化配列に連結されたワクシニ
アウィルスプロモーターを含むプラスミドベクターの形
成）ｐｖ−ｅｎｖｌプラスミドＤＮＡの２μ９が制限酵
素旦ｔｕｂ、旦別■およびＸ　ｈｏ　Ｉによって完全に
消化された。得られたフラグメントは１％低融点アカロ
ースグルにおいて分解された。Ｓ　ｔｕ　ＩおよびＰＶ
ＵＩでのｐｖ−ｅｎｖｉの開裂は、一方がＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶＩＩＩの５°部分を含みそして他方がｐＧｓ２０を
含む、２つの４　Ｋｂｐフラグメントをもたらした。Ｘ
ｈＯＩは、ＤＯ３２０を含む４　ＫｂＤフラグメントを
より小さなフラグメントへと開裂し、そしてこれゆえ、
ワクシニアウィルス転写調節要素およびＬＡＶ／ＨＴＬ
Ｖエンベロープコード化配列の５°部分配列む４にｂρ
５ｔｕＩ／ＰＶｕＩノラグメントの同定を可能とする。
このフラグメントは単離され、精製され、ｐｖ−ｅｎｖ
２の旦厘Ｉおよび２別Ｉ制限消化によって作成された６
、５Ｋｂｌ）フラグメントに連結された。
連結混合物は、■シエリキア・コリ株ＭＣ１００Ｏを形
質転換するために用いられた。アンピリジン耐性被形質
転換体が選択された。個々の被形質転換体からのプラス
ミドＤＮＡは、足座１および旦ｖｕｌ制限部位の再生お
よび親の４　Ｋｂｐおよび６．５Ｋｂｐフラグメントの
存在に関して試験された。第４図に画かれる望まれるプ
ラスミドであるｐｖ−ｅｎｖ５は、ワクシニアウィルス
転写制御要素より下流に連結された、ヌクレオチド番号
５１６６番から８３４９番（第２図に示される。）まで
に相当するＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩの完全エンベロープ遺
伝子を含むものである。
（５，２，４，トランスメンブレン［ｔｒａｎｓｍｅｍ
ｂｒａｎｅｔ（アンカー）配列を欠失したＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶＩＩＩ　ｅｎ＋４伝子に連結したワクシニアウィル
スプロモーターを含むプラスミドベクターの形成） プラスミドｐｖ−ｅｎｖ５Ｄ　Ｎ　Ａ　（１０μｇ＞が
１−（ｉｎｄ■で完全に消化され、そして得られたフラ
グメントが１％低融点（ＬＨＰ）アガロースゲルにおい
て分解された。ワタシニア７．５にプロモーターおよび
しＡＶ／旧ＬＶ［ｌ　ｅｎｖコード化配列配列°プロモ
ーターを含む３　Ｋｂｐフラグメントが精製され、そし
て次に付着端に満たすためのフレノウ酵素で処理された
。このフラグメントは次に、予めＥＣ０ＲＩで消化し、
次にフレノウ酵素およびウシ腸アルカリホスファターゼ
（ＣＩＡＰ）で連続的に処理された、複数部位クローニ
ングベクターである９２６に連結された。ｐＶ−ｅｎｖ
Ｓ中の充ｔａｔＨｉｎｄＩ［１部位とプラスミドル２６
中の充填旦ＣＯＲｌの連結反応は、ｅｎｖに関するコー
ド化配列と同相に停止コドンを生成するこの中間形成体
は、ｐｖ−ｅｎｖ５／２６と呼称された。
プラスミドｐｖ−ｅｎｖ５／２６は、■シエリキア・コ
リ）１ｃ１００Ｏを形質転換するために用いられ、拡張
されそして精製された。それは、次にＢａ１ｌｌＨＩお
よび１−１ｐａＩで消化され、そして得られたフラグメ
ントは１％アガロースゲルにおいて分解された。ＬＡＶ
／ＨｒＬＶＩＩＩエンベロープコード化配列を含む２．
１にｂｐフラグメントが単離され、そして次に、予めＢ
ａ１ｌｌＨＩおよびβｍａＩで消化されたプラスミド１
）ＧＳ２０に連結された。得られたプラスミドｐｖ−ｅ
ｎｖ７は、ｅｎｖ開始コドンの９６塩基対上流から始ま
るヌクレオチド番号　７６９８番の）ｌｉｎｄｌ１１部
位までのＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ特異性配列に連結した
ワクシニアウィルス７．５にプロモーターを含むもので
ある（第５図）。このプラスミドはそれゆえ、ＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩ　８ｎＶ遺伝子の推定アンカー配列を欠いて
いるものである。
（５，３，キメラＬＡＶ／）ＩＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ遺
伝子を含む組換え型ワクシニアウィルスの形成および特
徴づけ〉ワクシニアウィルスの２つの親株が、組換え型
ウィルスの形成（用いられた。すなわち、標準研究株で
あるＷＲと、ニューヨーク　シティ　ボード　オブ　ヘ
ルス株の誘導体であるｖ−ＮＹである（第５．１．１節
参照のこと。）。
ワクシニアウィルス中へのキメラＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
ｅｎｖ配列の挿入は、プラスミドｐＶ−ｅｎｖ２．　ｐ
Ｖ−ｅｎｖ５およびｐｖ−ｅｎｖ７がチミジン　キナー
ゼ（丁に）遺伝子に関してコードするりクシニアウィル
ス配列によって側面を接されているという事実によって
可能とされた、生体内組換えによって達成される。
これらのプラスミドのワクシニアウィルス感染細胞中へ
の導入は、該プラスミドにおけるＴＫ遺伝子とワクシニ
アウィルスグノム中の相同配列との間で組換えが起こる
ことを許容するものであった。
キメラ遺伝子の挿入が側面に接する配列における二重組
換えの結果として起きる。このような組換え体はワクシ
ニアＴＫ遺信子中に挿入されたキメラ遺伝子を有し、従
って表現的にＴＫ−であろう。
このようなＴＫ−組換え体は、ＴＫ＋細胞に対しては致
死的であるがＴＫ−に対しては致死的ではないＢＬＩｄ
　Ｒで追補された培地における増殖に関して選択された
。この手順の一般的原理は既に述べられている（マケッ
ト、エム１．スミス、ジー。
エル、およびモス、ビー０．１９８４年、ジャーナルオ
ブ　ピロロジー　４９．８５７〜８６４［）（ａｃｋｅ
ｔｔ、　Ｈ，、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、　Ｌ、　ａｎｄ　Ｍ
ｏ５ｓ、　Ｂ、　、　１９８４．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、
　４９．８５７−８６４］　）（以下余白） （５，３，１，キメラＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ
　Ｍ信子を含む組換え型ワクシニアウィルスの形成）８
０％集密アフリカグリーンモンキー腎細胞（株Ｂ５Ｃ−
４０）の１００ｍディツシュ（皿）が、０．０５の感染
多重度（ｍｏｉ）でワクシニアウィルス（株ＷＲ）に感
染された。３７℃で２〜４時間のインキュベーションの
後、感染細胞はプラスミドｐｖ−ｅｎｖ２もしくはｐｖ
−ｅｎｖ５　ＤＮＡのリン酸カルシウム共沈澱物でオー
バレイ（重層）された。該沈澱物は、２ＸＨｅ　８３溶
液０．５ｄに２ＸＤＮＡ−Ｃａ　Ｃｌ　２溶液０．５ｍ
を滴下的に添加することによって調製された。（２ＸＤ
Ｎ＾−ＣａＣ１２は０．２５８ＣａＣ１２０，５ｄ中に
プラスミドＤＮＡ　２０μｆｊを含み、２ＸＨｅＢＳは
、　１ｒｄ当たりＮａＣｌ　１６　ｍｇ、ＫＣＩ　Ｏ，
７４ｍｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４−２１１２００，２５ｍｇデ
キストロース２ｍ９およびへペス（ＨＥＰＥＳ）　１０
ｍｇをｐＨ７，０８で含む。）ＤＮＡ−リン酸カルシウ
ム共沈澱物は、室温で３０分間形成することをなされた
。該沈澱物のオーバーレイの４時間後に、細胞はｌＸＨ
ｅＢ５で１度洗浄され、１ＸＨｅＢＳ中の１５％グリセ
ロール２ｄの存在下において３７℃３分間インキュベー
トされ、そして次にｌＸＨｅＢ５でさらにもう１度洗浄
され、増殖培地（ＤＨＥＨに１０％胎児ウシ血清ならび
にペニシリンおよびストレプトマイシンをそれぞれ１０
０単位／ｍｌ加えたもの）１〇−でインキュベートされ
た。２日後、感染細胞は採取されそして遠心分離（４°
ＣＣ１２０００Ｘで１０分間）によって集められた。ウ
ィルス株［５ｔｏｃｋｌは、これらの細胞をＰＢＳＡ）
１１ｍＲに再懸濁し、続いての凍結解凍の２サイクルお
よび３回の１５秒音波処理によって調製された。
組換え体は、ＤＭＥＭ中の１％ノーベル［Ｎ０ｂｅｌコ
寒天（ディフコ［Ｄｉｒｃｏ］　、ミシガン州デトロイ
ト）、５％ウシ血清、２５１１９／１ｉｌｌ　　Ｂｕｄ
Ｒにより１デイシユ（皿）当り５Ｉ／ＪＲでオーバーレ
イされた、集密的ヒト１４３ＴＫ−細胞の６０＃デイツ
シユにおいて上記よりのウィルス株の１０−３希釈物の
０．１ｍｅを平板培養することによって選択された。平
板培養化の２日後、細胞は、上記と同様の成分および０
．０１％ニュートラルレッドを含む寒天媒体の１ディシ
ュ当り２ｄでオーバーレイすることによって着色された
。個々のプラークは着色の１日後に技取られ、０．１ｄ
　　ＰＢＳＡＭ中に再懸濁され、そして該ウィルス懸濁
液のアリコツト（部分標本）（０，２５ｄ　）が、選択
培地（ＤＨＥＨに１０％胎児ウシ血清、ストレプトマイ
シンおよびペニシリンそれぞれ１００単位／ｄ、ならび
（２５μｇ／ｄＢｕｄＲを加えたもの）条件下において
直径１６Ｉｎｍウェル（窪み）中に播種された集密的１
４３ＴＫ−細胞を感染するために用いられた。感染され
た細胞は、遠心分離によって集められそしてトリプシン
０．５１ｎ９／ｍｌおよびＥＤＴＡｏ、２ｍｌ／ｍｅを
含むＰＢＳ　　１０−Ｏμ、ｌＪ中に再懸濁された。細
胞は、３７℃で３０分間のインキュベーション、および
その後のそれぞれ２０秒の音波処理の３サイクルによっ
て溶解された。細胞溶解物は、複数ウェル濾過分岐管［
ｍｕｌｔｉ−ｖｅｌｌ　ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ　ｍａｎｉ
ｆｏｌｄ　（シュレイサー　アンド　シューエル［５ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５Ｃｈｕｅｌｌｌ、　？サ
チューセッツ州アーリントン）の使用によってニトロセ
ルロースフィシター上に集められた。これらの試料中の
ＬＡＶ／旧ＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ特異性ＤＮＡ配列の存在
は、既述されたようなりＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成
によって測定された（マケット、エム１．スミス、ジー
。
エル、およびモス、ビー、　、　１９８２年、プロシイ
−ディング　オブ　ヂ　ナショナル　アカデミーオブ　
サイエンス７９．７４１５　Ｎ７４１９［）１ａｃｋｅ
ｔｔ、　Ｈ，。
Ｓｍｉ　ｔｈ、　Ｇ、　Ｌ、　、　ａｎｄ　）ｌｏｓｓ
、　Ｂ、　、　１９８２．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　’　
１．Ａｃａｄ。
ＳＣｉ、７９．７４１５−７４１９１）。ニック翻訳に
よって調製された３２ｐ標識プラスミドｐＲ３−３ＤＮ
Ａがハイブリッド形成プ凸−ブとして用いられた。この
プローブに対し陽性のハイブリッド形成を与える組換え
体は、選択的条件（ＢｔＪｄＲを含む培地）下で１４３
ＴＫ−細胞において２度または非選択的条件下でＢ１０
−４０細胞において１度さらにプラーク精製された。Ｄ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成による最後の確認の後、
ウィルス株がＢ１０−４０細胞における３度精製された
プラークから調製され、そして以後の特徴づけに用いら
れた。
該組換え型ウィルスの形成の図解的表示が第５図に示さ
れており、ここにおいてワタシニア７．５にプロモータ
ーより下流に位置する（Ｐ→）ＬＡＶ／ＨＴＬＶ■エン
ベロープ遺伝子配列（ｅｎｖ）は、ワタシニアグノム中
のＴＫ　　ＤＮＡ配列によって側面を接されている。ワ
クシニアウィルスゲノムとプラスミドｐＶ−ｅｎｖ５と
の間の組換えから誘導されたウィルス株は、Ｖ−ｅｎｖ
５と呼称され、そして完全ＬＡＶエンベロープ遺伝子を
含むものである。本明細書における実施例において述べ
られる特定の実施態様において、Ｖ−ｅｎｖ５は該完全
エンベロープ遺伝子ならびに９６塩基対の５゛近位未翻
訳配列および２２３塩基対の３゛近位未翻訳配列を含む
ものであるａｐｖ−ｅｎｖ２から誘導されたウィルス株
はＶ−ｅｎｖ２と呼称され、そしてＬＡＶ／ＨＴＬＶＪ
ＩＩエンベロープ遺伝子のほとんど（すなわちＫｐｎＩ
フラグメント）を含むが、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエン
ベロープタンパク質の最初の４２アミノ酸をコード化す
る配列の部分が欠失しているものである。［Ａν／ＨＴ
ＬＶｌ［ｌエンベロープタンパク質の推定信号配列は該
タンパク質の最初の４９アミノ酸中に位置するので、ｖ
−ｅｎｖ２は信号配列を欠くタンパク質を産生ずべきで
ある。
従って、この組換え型ウィルスによって産生されたＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩ［ｌ関連タンパク質は、膜へ輸送されな
いことが期待できるであろう。これに対して、完全ＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ配列を含むｖ−ｅｎｖ５は
膜へ輸送されるタンパク質を産生すべきである。ｐｖ−
ｅｎｖ７から誘導されたウィルス株はｖ−ｅｎｖ７と呼
称され、そしてＬＡＶ／ＨＴＬＶｒｆｉエンベロープ遺
伝子の完全Ｎ末端を含む一方、）ｌｉｎｄＪ１部位の下
流の配列を欠いている。この形成体においては、推定ト
ランスメンブラン（アンカー）配列が誤っている［ｍｉ
ｓｓｉｎｇ］ものであるので、この組換え体によって産
生された［Ａν／旧［ｖ■関連タンパク質が、増殖培地
中へ分泌されることが期待できる。この特性は、診断試
薬としての使用に関するあるいはサブユニットワクチン
としての処方に関するこのタンパク質の精製に有利であ
る。
（５，３，２，ワタシニア−しＡＶ／Ｈ丁ＬＶＩ［Ｉ　
エンベロープ組換え体の制限パターン） 親ワクシニアウィルス株ＷＲおよびＶ−ＮＹ、ならびに
これらの誘導体ｖ−ｅｎｖ５およびｖ−ｅｎｖ５ＮＹそ
れぞれからのＤＮＡは、既述（エスボシトら、　１９８
１年。
ジャーナル　オブ　ピロロジー　メソツヅ２：１７５〜
１８０［Ｅｓｐｏｓｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１．
Ｊ、シ１ｒ０１．ＨｅｔｔｌＯｄｓ、２：１７５−１８
０１）のようにして単離された。これらは、制限酵素）
１ｉｎｄｌｌｌで消化され、そして得られたフラグメン
トは０．７％アガロースゲルにおいて分解された。親株
ＷＲからのＤＮＡは、既述（デフィリブス、　１９８２
年、ジャーナル　オブ　ピロロシー４３：１３６〜１４
９［［）ｅＦｉ　ｌ　１ｐｐｅｓ、　１９６２．　Ｊ、
　Ｖｉｒｏｌ、　４３：１３６−１４９］）されるよう
な代表的制限パターン（第２Ａ図）を示した。ｖ−ＮＹ
に関する制限パターンも同様であるが、ＷＲのものとは
別個のものであった。
最も明らかな差異は、ワクシニアウィルスゲノムにあけ
る末端フラグメントである、）ｌｉｎｄｌ［ＩＢおよび
Ｃの長さにおけるものであった。組換え体Ｖ−ｅｎｖ５
およびｖ−ｅｎｖ５ＮＹは、これらの親株のＨｉｎｄｍ
Ｊフラグメントを有していない。代わりに、大きさ５．
４Ｋｂｌ）および３．２Ｋｂｐの２つの新たなフラグメ
ントが観察された。この観察は、ＨｉｎｄｌｌＪフラグ
メント上に位置するワクシニアＴＫ遺信子中にＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープコード化配列を挿入した二
重相配列事象の結果と一致している。［ＡＶ／ＨＴＬＶ
ＩＩＩ配列中（７）Ｈｉｎｄｍ部位の存在ゆえに、２つ
のフラグメントが該挿入により生起した。この結果はま
た、ワクシニアウィルスＴＫ遺伝子に対するＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩＩ挿入物の定位を確証する。
（５，３，３，ワクシＸ　７−　ＬＡＶ／Ｈ丁ＬＶ［ｌ
　エンヘロープ組換え体のサウザンプロット検定［５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ’＞ 組換えウィルスゲノムの制限消化物中の２つの新規な１
（ｉｎｄｌ［Ｉフラグメントの同一性が、サウザンプロ
ット検定によって確認された。第７Ａ図に示されたもの
のようなアガロースゲル上で分解されたＤＮＡフラグメ
ントは、ニトロセルロースフィルターへ移され、そして
ＬＡＶ／Ｈ且Ｖ■エンベロープ配列に特異的なニック翻
訳プローブにハイブリッド形成された。第７Ｂ図に示さ
れるように、ハイブリッド形成は、５．４および３．２
にｂｐフラグメントにおいてのみ検知された。この結果
は、第６図に表わされるような組換え型ウィルスのゲノ
ム構造を確証するものである。
（５，４，組換え型ワクシニアウィルスによって感染さ
れた組織培養細胞におけるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエン
ベロープ関連タンパク質の発現） キメラＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ遺伝子を負う組
換え型ワクシニアウィルスは組織培養における細胞の感
染においてＬＡＶ／ＨｒＬＶＩ［Ｉエンベロープ関連タ
ンパク質を発現し得るものであることが示された。これ
らのタンパク質は、Ａ　Ｉ　ＤＳ患者からの血清と免疫
反応性であることがまた見出された。
（５，４，１，組換え型ワクシニアウィルスで感染され
た細胞において発現されたＬＡＶ／）′ＩＴＬＶＩＩエ
ンベロープ関連タンパク質のイムノプロット技術を用い
ての同定） 集密的Ｂ５Ｃ４０細胞の１００ｍｍディシュが、野生型
ワクシニアウィルスによっであるいはそれの組換え型誘
導体であるＶ−ｅｎｖ５もしくはｖ−ｅｎｖ２を用いて
１０のｍｏｉ（感染多重度）で感染された。感染は１２
時時間性することをなされ、この時点で細胞は採取され
、ＰＢＳで１度洗浄され、そして遠心分離により集めら
れた。感染細胞ペレットは、ラエムリ試料緩衝液［Ｌａ
ｅｌｌｌｌｌｌｉ　ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒｌ（ラ
エムリ、ニー、ケイ０．１９７０年、ネイチャー２２７
：６８０［Ｌａｅｌｌｌｌｌｌｌ　ｉ、υ、に、、１９
７０．Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０１）　Ｉ　ＩＪＩ
ｌ中に再懸濁されそして４分間煮沸することによって溶
解された。細胞溶解物の７５μｊアリコツト中の全ての
細胞性タンパク質は、７〜１５％勾配５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルにおける電気泳動によって分解された。
精製ＬＡＶピリオンの試料および模凝感染細胞溶解物の
アリコツトが比較対照として含有された。ゲルの成分は
、ニトロセルロースフィルターのシートに電気的に移送
された。フィルターは、最初に、ＰＢＳに５％脱脂粉乳
を加えたものの５ＩＩＪＲ中に室温にて３０分間インキ
ュベートされ、そして次ｆ、ＰＢＳに５％脱脂粉乳およ
びＡＩＤＳ患者からのヒト血清（熱不活性化血清の１：
１００希釈物）を加えたものの中に室温にて２時間イン
キュベートされた。フィルターは次にＰＢＳに０．０５
％トゥイーン２０［丁ｗｅｅｎ２０］（ポリオキシエチ
レン　ソルビタン　モノラウレート）を加えたものを用
いて５度洗浄され、そしてＰＢＳのみで１度洗浄された
。洗浄されたフィルターは、ヤギ抗ヒト■ｇＧ−ワサビ
ダイコンペルオキシダーゼ複合体の１　：　３０００希
釈物を加えた１％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ　　５ｍと
、室温にて２時間インキュベートされた。同じフィルタ
ーは、ＰＢＳに０．０５％トウイーン２０を加えたもの
で５回再び洗浄され、そしてＴ　Ｂ　Ｓ　（０，５ＨＮ
ａＣｌに２０ｍｔ４　　トリス−ＨＣｌ　［Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩＩを加えたもの、ｐＨ７，５）で１回洗浄された
。フィルター上に結合したワサビダイコンペルオキシダ
ーゼ複合体は、暗条件において室温にて１０分間クロロ
−ナフトール着色剤をフィルターと反応させることによ
って検知された（クロロ−ナフトール着色剤は、使用直
前に溶液ＡとＢを混合することによって調製された。溶
液Ａは冷却３０％メタノール２０ｙｄ！に４クロロ−１
−ナフトール６０ｍ３を加えたもの、溶液Ｂは冷却３０
％過酸化水素６０μｔに１Ｂ３１００　ｄを加えたもの
である。〉。ＡＩＤＳ患者血清中の抗体と反応したもの
であるフィルター上に結合したタンパク質は、着色剤の
ヤギ抗ヒトＪｇＧ−ワサビダイコンペルオキシダーゼ複
合体への結合を介して着色剤によって検知された。
この分析の結果は、第８Ａ図に表すように、ワクシニア
ウィルス組換え体ｖ−ｅｎｖ５はＡＩＤＳ患者からの血
清と特異的に免疫反応性である３つのタンパク質の１つ
の科を産生じたことを示すものであった。３つのタンパ
ク質は、ｅｎｖ遺伝子によって］−ド化されたと思われ
る、真正なＬＡＶ／ＨＴＬＶ　Ｉｌｌ糖タンパク質Ｏｐ
１５０．　ＱＤ’Ｉ　１０および１１１ｐ４１（ロビー
、ダブリュー、シー、ら、　１９８５．サイエンス２２
８：５９３〜５９５［Ｒｏｂｅｙ、　Ｗ、　Ｇ、　、　
１９８５．　Ｓｃ　１ｅｎｃｅ２２８：５９３−５９５
］　）と同様な電気泳動度を有していた。
これらのタンパク質は、模擬感染細胞あるいは野生型ワ
クシニアウィルス感染細胞においては産生されなかった
。推定開始メチオニンに関してコードする５°近位配列
およびＬＡＶエンベロープタンパク質の最初の４２アミ
ノ酸の欠失した組換え体ｖ−ｅｎｖ２は、先端を切った
大きさのタンパク質を産生するが、ＡＩＤＳ患者血清と
今だ免疫反応性である。おそらく、組換え体Ｖ−ｅｎｖ
２におけるｅｎｖ配列の翻訳は、この組換え体の形成に
おいて用いられたリンカ−配列から転写されたＡＵＧコ
ドンから開始される（第５．２．１節参照のこと。〉第
２の実施態様において、２つの細胞系（ＢＳＣ−４０お
よびＨｅＬａ　）がｖ−ｅｎｖ５およびｖ−ｅｎｖ２で
感染された。感染細胞溶解物中のＬＡＶ特異性タンパク
質は以下に述べるようなウェスターン［Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｌイムノプロットによって検定された。
ＢＳＣ−４０またはＨｅＬａ細胞の集密的細胞単層［ｃ
ｏｎｆｌｕｅｎｔ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ］が、１細胞当
り５０プラ一ク形成単位（ｐｆ’ｕ）の感染多重度（ｍ
ｏｉ）で、組換え型ウィルスｖ−ｅｎｖ５またはｖ−ｅ
ｎｖ２に感染された。感染の１２時間後に細胞はリン酸
緩衝食塩水中で２回洗浄され、ラエムリ試料緩衝液中に
再懸濁され、そして５分間煮沸された。感染細胞からの
タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）によって分解
され、ニトロセルロース膜へ電気的に移動され、そして
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ血清陽性個体からの貯蔵血清と
反応させられた。免疫反応性タンパク質は、クロラミン
−Ｔ法によって１２５１で標識されたプロティンＡによ
り検知された。第８Ｂ図において、第ル−ンおよび第５
レーンは模擬感染細胞からのタンパク質を、第２レーン
および第６レーンは野生型ワクシニアウィルス感染細胞
からのタンパク質を、第３レーンおよび第７レーンはｖ
−ｅｎｖ５感染細胞からのタンパク質を、第４レーンお
よび第８レーンはｖ−ｅｎｖ２感染細胞からのタンパク
質を含むものである。シヨ糖勾配精製ＬＡＶピリオンタ
ンパク質が比較対照（ＬＡＶ）として用いられそして、
エンベロープタンパク質ＱＤ１５０．　ＤＩ）１１０お
よび０ｌ）４１の位置は図示の通りである。分子量基準
はキロドルトン（にｄ）にて表された。
血清陽性個体からの貯蔵血清と免疫反応性である３つの
主要タンパク質は、ｖ−ｅｎｖ５感染細胞において検知
された（第８Ｂ図、第３レーンおよび第７レーン）。こ
れらのタンパク質の分子量は１５０にｌｊ、１２０にｄ
および４１　Ｋｄであると算出され、ＬＡＶエンベロー
プ糖タンパク質１１１１）１５０．　ＱＤ１２０および
１１１ｐ４１のものと同様であった。
組換え型ウィルスｖ−ｅｎｖ２はＬＡＶ／ＨＴＬＶｍｅ
ｎｖに関する推定信号配列の欠失したものであるが、分
子量９９Ｋｄ、６８にｄおよび４０Ｋｄの少なくとも３
つの免疫反応性ポリペプチドを産生ずることのできるも
のであった（第８Ｂ図、第４レーンおよび第８レーン）
。
（５，４，２，組換え型ワクシニアウィルスで感染され
たｍ′ＰＩＡにおいて発現されたＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
Ｉエンベロープ関連タンパク質の免疫沈降技術を用いて
の同定） 以下に述べられる免疫沈降検定は、本発明の組換え型ワ
クシニアウィルスで感染された細胞が、ＡＩＤＳ患者か
らの血清に特異的に免疫反応性であるタンパク質を合成
することを示した。
集密的Ｂ５Ｃ−４０１１１１胞の１００馴デイツシ１が
野生型ワクシニアウィルスによって、あるいはそれの組
換え休ｖ−ｅｎｖ５またはｖ−ｅｎｖ２によって、１０
の感染多重度（ｍｏｉ）で感染された。感染の９．５時
間後に、増殖培地が血清追補物を有しないメチオニン非
含有ＤＭＥＭに置き換えられた。
感染の１０時間後に、培地は［３５Ｓ］−メチオニン１
００μＣｉ／ｍｆｆを含有するメチオニン非含有ＤＭＥ
Ｍ　　２ｒｄに置き換えられ、そして標識化が３７℃で
２時間進行された。標識化期間の終了時点で、細胞はＰ
ＢＳで１度洗浄され、そして遠心分離により集められた
。細胞ペレットは溶解緩衝液（１％ＮＰ４０　（ポリオ
キシエチレン（９）ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール
）、０．５％デオキシ］−ル酸ナトリウム、０．ＩＨＮ
ａＣｌ、０．０１）１　トリス−ＭＣＩ　、　ｐｌ−１
７，４，１ｍＨＥＤＴへ）コｄ中に再懸濁され、そして
溶解物はエツペンドルフ　マイクロ遠心性Ｋｎ　ｔａ　
［Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ
ｌにおいて１分間遠心分離することにより清浄化された
。
免疫沈降は、対照集団からあるいはＡＩＤＳ患者からの
いずれかの熱不活性化ヒト血清５μρを細胞溶解物１０
０μｇに添加することによって行なわれた。４°Ｃで１
時間のインキ１ベーシヨンの後、活性化スタフィロコッ
カス・アウレウス［５ｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ　　ａｕ
ｒｅｕｓｌ細胞（バンソーピンセルズ、カルバイオケム
ーベーリング　コーポレーション、カリフォルニア州う
ジョーラｌＰａｎ５ｏｒｂｉｎ　ｃｅｌｌｓ、　Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、ＬａＪ
ｏ！Ｉａ、ＣＡｌ）６０μｇが添加され、インキュベー
ションが４℃でさらに１時間続けられた。免疫沈降複合
体は、４°Ｃにおいてエツペンドルフ　マイクロ遠心分
離機にて３０秒間遠心分離することによって集められ、
そしてＩＭ　　ＮａＣｌに０．１％ＮＰ−４０および０
．０１Ｍ　　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７゜４を加えたもの
の中で１度、さらにＲＩＰＡ緩衡液（１０ｍＭ　トリス
−ＨＣｌ、　ｐＨ７，２，０，１５ｔ４　ＮａＣ１，１
％デオキシ］−ル酸ナトリウム、１％トリトンＸ　１０
０［丁ｒｉｔ。
ｎ　Ｘ　１００１　（ポリオキシエチレン（９−１０）
ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール）、０．１％ラウリ
ル硫酸ナトリウム）中で２度洗浄された。洗浄された免
疫沈降物は、ラエムリ試料緩衝液５０μｐ中に再懸濁さ
れ、１分間煮沸されそしてエラペンドル７　マイクロ遠
心分離機において１分間遠心分離された。
上澄液中に存在する免疫沈降されたタンパク質は、１５
％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動に
より分析された。電気泳動の後、ゲルはクーマツシュブ
ルー染料［Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　ｄｙｅｌで
着色され、ナリチル酸ナトリウムで処理され（１Ｈサリ
チル酸ナトリウム中に室温にて３０分間）そしてフルオ
ログラフィーのために乾燥された。
この分析の結果は、第９Ａ図に示すように、組換え体Ｖ
−ｅｎｖ５は、ＡＩＤＳ患者血清と特異的に免疫反応性
であるタンパク質の１科を合成したことを示した。これ
らタンパク質は、１６０，１４０゜１２０．４２および
４０キロドルトン（ＫＯ）の見かけ分子量を有し、ＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｔ：関し報告されたエンベロープ
関連語タンパク質の見かけ分子量（ロビー、ダブル、ジ
ー、ら、　１９８５年、サイエンス２２８：　５９３〜
５９５［Ｒｏｂｅｙ、Ｗ、Ｇ、ｅｔ、ａｌ、、１９８５
，５ｃｉｅｎｃｅ２２８：５９３−５９５１　）とほぼ
一致するものであった。これらのタンパク質は模擬感染
および野生型ワクシニアウィルス感染細胞のいずれにも
表われず、またこれらは対照ヒト血清によって免疫沈降
されなかった。ｖ−ｅｎｖ２感染細胞において、見かけ
分子量９５ＫＤの先端を切られた（不完全な）タンパク
質が産生きれ、そしてＡＩＤＳ患者血清によって認識さ
れた。・ＬＡＶ／肘ＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ関連タンパク質
のこの先端を切られた形態は、この組換え体においてＬ
ＡＶ／肘ｔｖＢ挿入物に対し、５°近位に位置するリン
カ−配列によってコード化されるＡＵＧコドンから開始
されているように思われる。
（５，４，３，’）’）シニ７−　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ
ＩＩ組換え型ウィルスによって産生された［Ａシ／肘Ｌ
ＶＩＩＩエンベロープ関連タンパク質の３日−グル、コ
サミン標識づけ） 以下に述べられる放射性免疫沈降は、本発明のワタシニ
アーＬＡＶ／ＨＴＬＶＩｎ組換え型ウィルスがグリコジ
ル化エンベロープタンパク質を産生ずることを示した。
）（ｅｌａ　＠胞は、模擬感染（第９８図、レーン１お
よび５を参照のこと。）あるいは、それぞれ野生型ワク
シニアウィルス（レーン２および６）、組換え休ｖ−ｅ
ｎｖ５　（レーン３および７）または組換え休Ｖ−ｅｎ
ｖ２　（レーン４および８）で別々に感染された。なお
すべてにおいて、５０ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ｍｏ
ｉ）であった。３Ｈ−グルコサミン（２３ｍＣｉ／ｍｙ
て０．２５μｃｉ、アメルシャム［Ａｍｅｒｃｈａｍ］
　）が感染の４ないし１６時間後に培養培地に添加され
た。細胞は、リン酸緩衝食塩水で２度洗浄され、そして
０、ＩＭ　　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　　トリス−ＨＣｌ
ｐＨ７，４，１１１１Ｍ　　ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０
（ポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフ
ェノール）および０．５％デオキシコール酸ナトリウム
を含む緩衝液中に溶解された。細胞溶解物のアリコツト
は、正常ヒト血清（レーン１〜４）あるいはＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩ血清陽性個体からの貯蔵血清（レーン５〜８）
のいずれかと混合された。免疫反応性タンパク質は、プ
ロティンＡを担う固定化スタフィロコッカス・アウレウ
ス細胞によって沈降され、５ＤＳ−ＰＥＧＥで分解され
そしてフルオログラフィーによって検知された。
グルコサミンでの放射性同位元素標識づけの結果は、第
９６図のレーン７に示すように、ｖ−ｅｎｖｓ組換え体
産生タンパク質は、ＬＡＶ／肘［ｖ■エンベローブタン
バク質と同様に、またグリコジル化されたことを示した
。グリコジル化パターンにおける差異は、ＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶ■ピリオン糖タンパク質と比較した際の組換え体産
生タンパク質の電気泳動度におけるわずかな変化を説明
できるものであった。
信号ペプチドを欠いたタンパク質から期待されたように
、３Ｈ−グルコサミンとの窒素結合［Ｎ−１ｉｎｋｅｄ
］グリコジル化は、ｖ−ｅｎｖ５感染細胞において観察
されなかった（第９６図、レーン８）。
（５，４，４，’７クシニ７−　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
Ｉ組換え型ウィルスにより産生されたＬＡＶ／ＨＴＬＶ
Ｉエンベロープ関連タンパク質のパルス−チェイス免疫
沈降分析） ＬＡＶ／Ｈ且Ｖ［ｌの０ｆ）１５０が、これより外部タ
ンパク質［ｅＸｔｅｒｉＯｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｌ　（１
１）　１１０およびトランスメンブランタンパク質［ｔ
ｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｌ（Ｉｔ）
４１が誘導される前駆体であることが提唱されている。
以下に述べるパパルスーチェイス（［ｐｕｌｓｅ−ｃｈ
ａｓｅｌ　、パルス追跡）″免疫沈降検定は、ワクシニ
ア−ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ組換え体産生タンパク質である
１　５０ＫＤ、　１２０ＫＤおよび４１　ＫＤタンパク
質が、真正ＬＡＶ／ＨＴＬＶノｇｐ１５０．　ＱＤ”Ｉ
　１０およびＱｒ）４１に関して提唱されたものと同様
な前駆体−産物の関係を有していることを示す。
Ｈｅ１ａ　＠胞の集密的細胞単層が、野生型ワクシニア
ウィルス（第９Ｃ図レーン１〜６を参照のこと。
）、組換え体Ｖ−ｅｎｖ５　（レーン７〜１２）あるい
はＶ−ｅｎｖ２　（レーン１３〜１８）で、感染された
。なおすべてにおいて５０ｐｆｕ／細胞の感染多重度（
ｍｏｉ）であった。感染後１０．５時間で、細胞は、３
５Ｓ−メチオニン（８００Ｃｉ　／ｍｍｏ　１以上、ア
メルシャム）の１００μＣｉ／ｒｎｌで１５分間標識づ
けされた。標識づけ期間の終了時に、細胞は予め温めら
れた追跡培地（ダルベツコ修正イーグル培地に３ｍ’ｊ
／ｍｌし一メチオニン、５％ウシ血清、ならびに１００
単位／ｄペニシリンおよび１００μ９／ｄストレプトマ
イシンを加えたもの＞２ｄで洗浄され、そして培養器に
もどされる前に同じ培地１ｒｎｌを再供給された。その
後の種々の時間で、細胞は第５．４゜３節において予め
述べられたようにして洗浄されそして溶解され、細胞溶
解物からのタンパク質は、ＬＡＶ／肘［ｖ■血清陽性個
体からの貯蔵血清と免疫沈降された。免疫沈降されたタ
ンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分解されそして
フルオログラフィーによって検知された。それぞれの追
跡の持続期間は、以下の通りである５０時間（レーン１
゜７．１３）；０．５時間（レーン２．８．１４）　；
　１時間（レーン３．９．１５）　；　２時間（レーン
４．１０．１６）　；　６時間（レーン５．１１．１７
）および１２時間（レーン６、１２．１８）。
第９Ｃ図のレーン７〜１２に示される結果は、組換え体
産生１５０ＫＤ、１２０ＫＤおよび４１　ＫＤタンハク
質ニ関シ、真正ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｇｌ）１５０
　、１１１１）１１０およびＱｒ）４１と同様な前駆体
−産物の関係を示すものであった。１５０ＫＤタンパク
質のプロセッシングは、パルス−標識付後６時間までに
、１５０ＫＯタンパク質における５０％未満の放射能が
１２０ＫＤおよび４１ＫＤタンパク質中に追跡されたゆ
えに、Ｈｅ１ａ細胞においてゆっくりとしたかつ不十分
なものであると思われる。予備的結果は、このプロセッ
シングが、同じ組換え型ウィルスで感染したヒト末梢血
細胞のあるタイプにおいてより十分であることを示した
。これらの実験はまた、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎ
ｖに関する推定信号配列を欠失したＶ−ｅｎｖにおける
ｅｎｖ配列が、非修飾８５ＫＤ前駆体（７８０アミノ酸
）として発現され、そしてこれが９９ＫＤ中間体ヘプロ
セッシングされ、そして６８ＫＤおよび４０ＫＤポリペ
プチドに開裂されることをも示すものであった（第９Ｃ
図、レーン１３〜１８）。
（５，４，５，ワクシニア−ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ組
換え型ウィルスで感染された細胞の増殖培地におけるＬ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ関連タンパク質の存
在）以下の述べられる放射性免疫沈降検定は、本発明の
組換え型ワクシニアウィルスによって産生された免疫反
応性タンパク質が、真正ＬＡＶ／肘ｔｖＢエンベロープ
糖タンパク質のものと同様なパターンで発現されそして
プロセッシングされることのできるものであることを示
した。
１−１ｅｌａ　ｌａ胞の集密的細胞単層は、模擬感染（
第９Ｄ図　レーン１を参照のこと）、あるいはそれぞれ
野生型ワクシニアウィルス（レーン２）、組換え−１３
９一 体ｖ−ｅｎｖ５　（レーン３）あるいはｖ−ｅｎｖ２（
レーン４）により別々に感染された。なお、すべてにお
いて２０１）ｆｕ／細胞の感染多重度（ｍｏｉ）であっ
た。細胞は、３５８−メチオニン（８００Ｃｉ　／ｍｍ
ｏ　１以上、アメルシャム）の１００μＣｉ／ｍで、感
染後に１０〜１２時間標識づけされた。標識づけ期間の
終了時に、培地が除去され、そしてＬＡＶ／旧ＬＶｌｌ
ｉ血清陽性個体からの貯蔵血清との免疫沈降のための使
用の前に、１２０００Ｘ９で２分間遠心分離することで
清浄化された。同じ血清によって免疫沈降された感染細
胞からのタンパク質は、“ペレット［Ｐｅ１ｌｅｔｌ”
と区画符号されたものにおいて示され、また培地からの
ものは“スープ［５ｕｐｅドと区画符号されたものにお
いて示される。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩのｇＩ）１１０に関して期待された
と同時に、組換え体産生１２０ＫＤタンパク質はまた感
染細胞培地においても検知された（第９Ｄ図、レーン３
）これらの結果は、組換え型ウィルスｖ−ｅｎｖ５がＬ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ遺伝子を発現し得、そし
て真正ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ糖タンパク
質と同じバターンにおいてプロセッシングされる免疫反
応性タンパク質を産生じ得ることを示すものであった。
信号ペプチドを欠くタンパク質に関して期待られたと同
様に、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ関連ポリペ
プチドは、ｖ−ｅｎｖ２感染細胞培地において全く検知
されなかった（第９図、レーン４）。
一方、ｖ−ｅｎｖ７で感染した細胞は、１３０ＫＤの先
端を切られたタンパク質を発現した。このタンパク質は
、［＾Ｖ／ＨＴＬＶＩエンベロープタンパク質のアンカ
ー配列を含むＣ末端２１７アミノ酸を欠いたものであっ
たこの先端を切られたタンパク質（ｏｐ１３０）は、ｏ
ｐｌｌｏあるいはそれの前駆体ｇｐ１５０より十分に増
殖培地中へ分泌された（第９Ｆ図）。同時に、ｇｐ１３
０は、開裂部位がこの先端を切られたタンパク雪上に今
だ存在しているにもかかわらず、ＱＤｌｌ　０へと十分
にプロセッシングされないものである。
（５，５，ワタシニアＬＡＶ／旧ＬＶＩＩ　ｅｎｖ組換
え型ウィルスの免疫力） キメラＬＡＶ／ＨＴＬＶＩｌｊ　ｅｎｖ遺伝子を負う組
換え型ウィルスは、マウスと類火霊長類の一種の２つの
株の中においてＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩに対する一次免
疫応答を引き出すことが可能であるということを示した
。
（５，５，１，マウス中（７）９　クシニア　ＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩｅｎｖ組換え体の免疫原性） 組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ５とｖ−ｅｎｖ
２によって発現されるタンパク質の免疫応原性が検査さ
れた。以下に概要される実験は［Ａν／肘［ｖ■の主要
な糖タンパク質に対する免疫応答を引き出すこれらの組
換え型ウィルスの能力についてさししめすものである。
マウスの２つの株（１つは近交系（ｃ５７Ｂ１６Ｊ　）
であり、そして１つは遠縁交配系（１（Ｒ）である。）
は組換え型ウィルスｖ−ｅｎｖ２あるいはｖ−ｅｎｖ５
を接種された。すべての動物は接種時において第５〜７
週齢であった。接種の４つのルートが使われた。
すなわち￥蹟、尾の乱刺、鼻腔内および腹腔内である。
足踵接種は、それぞれの後の足踵に、組換え型ウィルス
２５μ、１！　（５ｘｌＯ６ｐｒｏ）注射することによ
ってなされた。尾乱刺は二股針を用いて尾の基底部にお
いて皮膚を粗面とし、組換え型ウィルス１０μｇ（２ｘ
ｌＯ７ｐｆｕ）を乱刺された表面上へ適用することによ
ってなされた。鼻腔内接種は、マウスの鼻に組換え型ウ
ィルス１０μρ（２×１０７ｐｆｕ）を置き、そしてマ
ウスに接種物を吸息させることによってなされた。ｌＩ
！腔内注射はマウスの腹腔中へ組換え型ウィルス１０１
１．１！（２ｘｌＯ７ｐｆｕ）を注射することによって
なされた。すべてのウィルス株と希釈物は、第５．１．
１節で述べられたように調製された。個々のマウスから
の血清試料は接種後２週間間隔で集められ、そして、次
に述べるような酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）
とウェスタンプロット分析の両方によって分析された。
（５，１，１，１，ＥＬｔＳＡにより示されるワクシニ
アしＡＶ／ＨＴＬＶＩｕ　ｅｎｖによって免疫処置され
たマウスの血清転化） ６週間血清試料におけるＥＬＩＳＡデータを第１表に要
約した。組換え休ｖ−ｅｎｖ２およびｖ−ｅｎｖ５はそ
れぞれ０５７Ｂ１６Ｊマウスの９５％および１００％を
血清転化した。ＩＣＲマウスに関しては、血清転化の割
合は、Ｖ−ｅｎｖ２に関して４４％、またｖ−ｅｎｖ５
に関して１００％であった。最も高い平均ＥＬＩＳＡ力
価ならびに全体の血清転化は尾の乱刺によって免疫処置
されたマウスにおいて与えられた。
（以下余白） 第１人 キメラＬＡＶ／ＨＴＬＶ　ＩＩ　ｅｎｖ遺伝子を負う組
換え型ウィルスを接種したマウスの血清−化 組換え型ウィルス　接種のルート　接種したマウスの血
清転化Ｉ　　ＣＲＣ５７Ｂ１６Ｊ Ｖ−ｅｎｖ２　　　　　足ｖｉ３／３　　　　　４１５
尾の乱刺　　　３／３　　　　　４１５鼻腔内　　　　
０／３　　　　　４１５腹腔内　　　　実施せず　　　
　３１５Ｖ−ｅｎｖ５　　　　　足蹴　　　　　４／４
　　　　　５１５尾の乱刺　　　３／３　　　　　５１
５鼻腔内　　　　３／３　　　　　４１５腹腔内　　　
　実施せず　　　　５１５＊　付髄する本文中において
述べられるようなＥＬＩＳＡによって測定された血清転
化はそれぞれのグループにおいて接種されたマウスの全
数に対する血清転化されたマウスの数として表わされる
。
ＥＬＩＳＡデータは以下のようにして得られた。
すなわち精製化、不活性化ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩウィ
ルス粒子を炭酸塩緩衝液（５０ｍ）ｆ炭酸ナトリウムｐ
Ｈ９，６）によって希釈し９６−ウェル微小力価プレー
ト［９６−ｖｅｌｌ　　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔ
ｅｌ　（１０μＪ）　／ウエル不活性化ＬＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩＩ　Ｏ，２μｇが含まれる。）に添加した。
結合は４°Ｃで一晩続けてなされた。未結合タンパク質
は、吸引されそして最初に２００μり／ウェルのＰＢＳ
＋５％脱脂粉乳で、そしてさらに４％ショ糖溶液３００
μｍ／ウェルで洗浄された。過剰なショ糖溶液を吸引で
除いた後、プレートは室温で（１時間）乾燥された。次
に２．５μｔのマウス血清試料を含む５μｍのＰＢＳが
それぞれのウェルに加えられ、３７℃で１時間反応がな
された。インキュベーション期間の終了時にウェルは５
回ＰＢＳ＋０．０５トウィーン２０（ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノラウレート）で洗われた。ヤギ抗マウ
スワナビダイコンペルオキシターゼ５０μＪｌ　（ＰＢ
Ｓ＋０．０５％トウィーン２０中の１：５，０００希薄
物）がそれぞれのウェルに加えられ、３７℃−１４’６
　− で４５分間反応がなされた。ＰＢＳ＋０．０５％トウイ
ーン２０によって５回洗浄した後、クエン酸−〇−フエ
ニレンジアミンペルオキシターゼ［Ｃｉ　ｔｒａｔｅ−
ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄ　ｉａｍｉｎｅ−ｐｅｒｏｘ　
ｉｄｅ１Ｍ質が加えられた。該基質は次のように作られ
た。すなわち０゜２９４ｇナトリウムニ水和物＋０．５
３７９リン酸ナトリウムニ塩基結晶体［ｄｉｂａｓｉｃ
　ｃｒｙｓｔａ＋コが１０ｄの水に溶解され、塩酸によ
ってＩ）Ｈ５に調整された。２μｐの３０％過酸化水素
水と４ＩＱのＯ−フェニレンジアミンが使用直前に加え
られた。
プレートは室温で暗条件下にて３０分間インキュベート
される。反応は、１００μ」の１，３規定硫酸をそれぞ
れのウェルに加えることによって停止され、そして４９
０ｎＭにおける反応混合物の吸光度が測定された。
第１表の結果は、接種されたマウスの総計に対する血液
陽性のマウスの比で表わされる。血清試料は、接種の６
週間後に集められＥＬＩＳＡによって分析された。５匹
の接種されないマウスからの血清試料は比較対照として
用いられた。対照−１４７＝ グループに関する平均ＥＬＩＳＡ力価はＩＣＲとＣ５７
Ｂ１６Ｊマウスに対してそれぞれ０．０２１±０．００
５と０．０１７±０．０１０であった。対照グループよ
り３標準偏差高いＥＬＩＳＡ力価を与えた免疫処置され
たマウスからの血清試料は、陽性として得点された。
（５，５，１，２，ウェスタンイムノプロット検定によ
って示される真性ＬＡＶ／ＨＴＬシ■エンベロープ糖タ
ンパク質に対する血清転化マウス産生抗体）組換え型ウ
ィルスを接種されたマウスが真正ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
Ｉ型エンベロープ糖タンパク質に対する抗体を産生する
ことを示すために免疫処置されたマウスからの血清試料
が以下のようなウェスタンイムノプロット技術によって
分析された。第５〜７週齢の雄性遅発系マウス（Ｃ５７
Ｂ１６Ｊ）　、ジャクソンラボラトリー［Ｊａｃｋｓｏ
ｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ］が二股針を用いて尾の基底
部に形成した表皮剥離へ２×１０７ｐｆｕの組換え型ウ
ィルスを含む１０μｇの接種材料を与えることによって
構成される尾の乱刺によって免疫処置された。動物は、
接種８週間後に眼窩後より採血され、そして血清が使用
するまで冷凍保存された。リン酸緩衝食塩水（０，２％
ＮＰ−４０および３％脱脂粉乳を加えたものの中で５０
（１希釈された血清試料のアリコントは、Ｓ　Ｄ　Ｓ−
Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅによって分解され、そして電気的に移送
することによってニトロセルロースフィルター上に固定
化されたＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩウィルス粒子タンパク質
と反応させられた。これらの血清によって認識されたＬ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩタンパク質は、アルカリホスター
ゼに接合したヤギ抗マウス免疫グロブリンによって検知
された。
尾の乱刺によって組換え型ウィルスを接種されたＣ５７
Ｂ１６Ｊマウスからの８．週間血清試料結果を第１０図
に示す。組換え型ウィルスで免疫されたすべての動物は
、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ糖タンパク質ｏ
ｐ４１と反応する抗体を産生した。Ｖ−ｅｎｖ５で免疫
処理されたいくつかの動物からの血清はまた、０１）１
５０およびＱＤ’Ｉ　１０をも認識するものであり、こ
れは、この組換え型ウィルスの、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ
Ｉのすべての主要な糖タンパク質に対する免疫応答を引
き出す能力を示すものであった。
（５，５，２，類火霊長類におけるワタシニアＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩ組換え体ｖ−ｅｎｖ５の免疫原性〉ワクシ
ニアＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ組換え体Ｖ−ｅｎｖ５の免
疫原性は、２つの類火霊長類種において研究された。
すなわち、マカク舎ファシキュライエス［）ｆａｃｃａ
ｆａｓｃ　ｉｃｕ　Ｉａｒｉｅｓｌとチンパンジーであ
るａ以下の文節において述べられるｖ−ｅｎｖ５が双方
の種において体液及び細胞媒介免疫を引き出し得るもの
であることを示すものであった。
（５，５，２，１，ｖ−ｅｎｖ５で免疫処置されたマカ
ク猿における体液応答） 若年から成人までの９匹の尾長化マカク（マカク団ａｃ
ｃａ］、短尾猿）、マカク・ファシキュライエス［）ｉ
ａｃｃａ　−ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｅｓ］は、ワタシニ
アＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ組換え体ｖ−ｅｎｖ５の免疫
原性の研究に使われた。すべての動物はワクシニアウィ
ルスおよびＬＡＶ／ＨｒＬＶＩｎに対する抗体の不在、
そしてシミアン［３１ｍ１ａｎｌＴ−リンパ球もしくは
シミアンエイズウィルスまたはこれらのウィルスに対す
る抗体の不在に関して予めスクリーニングされた。４匹
の猿はｖ−ｅｎｖ５　２ｘ１０８ｐｆｕで、そして４匹
は２Ｘ　１０７ｐｆｕの同じウィルスで接種された。−
匹の動物は、２Ｘ１０７ｐｆｕ比較対照組換え型ウィル
ス（ワクシニア−単純ヘルペスｇＤ１組換え体Ｖ−Ｈ３
ｐＤ１）で接種された。すべての動物は、皮膚の乱刺に
よって接種された。血清及びヘパリン加血液試料が接種
に先立って集められ、また接種後、４週間、６週問およ
び８週間目に集められた。初回接種から１０週間後、す
べての動物は、同じウィルス２Ｘ１０８ｐｆｕの二次接
種を与えられた。すべての動物は実験の進行を通してワ
クシニア感染に弗型的な自己治癒性皮膚病変と正常な生
理学的指示症状を示した。体液応答はＥＬＩＳＡおよび
ウェスタンプロット検定によって分析された。
ＥＬＩＳＡ分析に関しては、血清試料は、３％脱脂粉乳
と０．２％　ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）ｐ
−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール）を含むＰＢＳで５０
倍に希釈され、そして微小力価ウェル上に固定されたＬ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩウィルス粒子タンパり質と反応さ
せられた。ＥＬＩＳＡの手順は、用いられた第２抗体が
ワサビダイコンペルオキシターゼと接合したヤギ抗ヒト
抗体であることを除いては第５．５．１．１節で説明さ
れたものと同一のものであった。第１１図に示した結果
は、２匹の動物のみは初回接種の後に血清転化がみられ
たが、すべての動物は２次接種後に血清転化したことを
示すものである。
いかなる抗体が免疫処置された動物より生じるかを測定
するために、２次接種後、４週間目に集められた血清試
料がウェスタンプロットにより分析された。２つの定形
式が、２つのエンベロープ糖タンパク質、ｇｐ４１およ
びＯｐｌ　１０の最適な検知のために用いられた。Ｄｐ
４１の最適な検知に関して、血清は、ＰＢＳに３％未低
温殺菌ミルクおよび０．２％　ＮＰ−４０を加えたもの
で５０倍に希釈され、ニトロセルロースフィルター上に
固定化された精製ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩウィルス粒子
タンパク質と室温で１時間反応させられた。フィルター
はＰＢＳに０．２％　ＮＰ−４０を加えたものの中にお
いで１　：２０００希釈度のアルカリホスファターゼ接
合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体（ザイムド［Ｚｙｍｅ
ｄｌ、カリフォルニア州）と反応させられた。
ｇｐｌｌｏの検知に関して、血清はＰＢＳに３％末低温
殺菌化ミルクを加えたもので５０倍に希釈され、そして
ニトロセルロースフィルター上に固定化された精製ＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶウィルス粒子タンパク質と反応させられた
。フィルターは、ＰＢＳに０．０５％トウイーン２０を
加えたもので洗浄され、そしてさらにＰＢＳ緩衡液中に
おいて１：２０００希釈度のアルカリホスファターゼ接
合ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体（ザイムド、カリフォ
ルニア州）と反応させられた。それぞれの手順において
、最終洗浄の後に、Ｏ，ＩＭ　　ＮａＣｌおよび５１１
１ＭＭＱ　Ｃｌ　２を含む０．１Ｍ　　トリス（ｐ）ｆ
９．５）の中において第２抗体反応が行われた。スイル
ター上の抗原に結合した抗体は０．１Ｍトリス（ｐＨ９
，５）０．１Ｍ　　ＮａＣｌ、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　
、０゜３３ｍ５／ｌｄブロモ−クロロ−イントリス　ホ
スフェートおよび０．　１７１１Ｆｌ／ｍｌのニトロ−
ブルー−テトラゾリウムを含む溶液とフィルターを反応
させることによって検知された。フィルターが色原体と
反応させられた後、それらは水ですすがれ、空気乾燥さ
れそして撮影された。
第１２８図に示すように、２つの接種をうけたすべての
動物は、ＤＩ）４１と強力な抗体反応を示した。加えて
これらの動物のうちの４匹は、Ωρ１１０と強力に反応
する抗体をもまた産生じた。
合わせて第１２Ａ図に示す結果は、組換え体Ｖ−ｅｎｖ
５が、マカク猿においてＬＡＶ／朋ＬＶＩＩＩ特異性エ
ンベロープ抗体の産生が可能であることを示すものであ
る。
（５，５，２，２，ｖ−ｅｎｖ５で免疫処理’；５ａｔ
＝マカクにおける細胞媒介免疫応答） 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、Ｖ−ｅｎｖ５または単純
ヘルペスウィルス糖タンパク貿Ｄ　（Ｖ−Ｈ８ＶＱｄｌ
　）を発現する比較対照ワタシニア組換え型ウィルスで
の二次陵内接種後、４週間目に得られたマヵクのヘパリ
ン加血液よりフィコルーハイバーク［Ｆｉｃｏｌｌｈｙ
ｐａｑｕｅｌ遠心分離によって単離された。ＰＢＬは、
また、ただ一度ｖ−ｅｎｖ５で予防接種されたマカク８
１から、および予防接種されなかったマカクから単離さ
れた。ＰＢＬは１０％熱不活化正常ヒト血清を追補され
たＲＰ）Ｉ１１６４０培地（ジブコ［ＧＩＢＣＯ］、ニ
ュー］−り州グランドアイランド）中に懸濁され、そし
てｏ、ｉｙ培地の最終容量において１×１０５のＰＢＬ
が丸底９６ウエルプレートのウェル中に移された。それ
ぞれのウェルは紫外（ＵＶ）光線不活化ｖ−ｅｎｖ５　
（υＶ不活化前において１×１０６ｐｆｕ／ｍｅ）　、
アルイＬ；！ＬＡＶ／旧ＬＶＩＩ感染されたＣＥＭ細胞
（ＨＬＡ　ＯＲ陰性Ｔ細胞性白血病系の１つ）の上澄液
からショ糖勾配遠心分離２サイクルによって精Ｉｉ！さ
れた非分裂ＬＡＶ／Ｈ且ＶＩ［Ｉ（１＃Ｉｇ／ｄ、約１
×１０５ＴＣＩＤ５０）が加えられた。刺激の６日後に
、それぞれのＰＢＬウェルは６時間にわたって１μＣｉ
　　３ＨＴＤＲ（３Ｈ−チミジン、ニューイングランド
ヌクレア［Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ］
　、？サスセッツ州ボストン）で標識され、細胞は採取
され、そして取込まれた３Ｈ−Ｔｄ　ＲのＣｐｍが４つ
の複製ウェルの平均値として測定された。刺激指数は刺
激された細胞中に取込まれた３Ｈ−ＴｄＲのｃｐｍを刺
激されていない細胞中に取込まれたｃｐｍで割ることに
より算出された。
（以下余白） 第２人 ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ糖タンパク質に発
現するりクシニア組換え型ウィルスでの免疫処置後のマ
カク６７　　　Ｖ−ｅｎｖ５　　１，５８６　７．４６
５　４．７　　６０．４１５　　３Ｂ、１６８　　Ｖ−
ｅｎｖ５　　２，２４５　９，０７５　４．０　２Ｂ、
６３８　　１２．８７４　　　Ｖ−ｅｌｌＶ５　　１，
５Ｂ５　４，７３２　３．０　２１，４８７　　１３．
６７５　　　Ｖ−ｅｎｖ５　　　５８１　１８，６４５
　１４．９　３７，８４７　　１４．１７６　　Ｖ−ｅ
ｎｖ５　　２，４７９　５．９８７　２．５　　３Ｂ、
６５７　　１４．８８０　　　Ｖ−ｅｎｖ５　　１，０
７７　１３，９２２　１２．９　２４，７５２　　２３
．０８１　　　Ｖ−ｅｎｖ５　　　９６５　３，９６５
　４．１　　４０，５７２　　４２．０８２　　　Ｖ−
ｅｎｖ５　　２，５８１　８，５８０　３．３　４６，
８４７　　１８．１７３　　　Ｖ−Ｈ３ＶｇＤＩ　　　
　Ｂ１２　　５５３　１．０〜５Ｂ、２１７　　９１．
９２６　　　な　　　し　　　２，９１１　　１，８２
２　　１．０〜　２，２４０　　　　１．０〜＝　１５
７　− 第２表に示したように、ｖ−ｅｎｖ５のただ一回の接種
をうけたナンバー８１のマカクを含むすべてのマカクは
、試験管内におけるＬＡＶ／肘Ｌｖ■刺激の特異的応答
において増殖するリンパ球を産生じた。
それに対して、ワクシニア−単純ヘルペス組換え体Ｖ−
１１ＳＶＯＤＩを受けた動物７３からのリンパ球は、単
にワクシニアウィルスによる刺激にのみ応答し、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶＩＩによるものには応答しなかった。免疫処
理されていない比較対照動物は、いずれの抗原に対して
応答するリンパ球も産生しなかった。さらにまた、ｖ−
ｅｎｖ５で免疫処置されたマカクからのリンパ球の応答
は、Ｖ−Ｈ３ＶＯＤＩで予防接種されたマカク７３から
のものと同程度であった。それらの結果は、マカク猿に
おける組換え型ウィルスによるＬＡＶ／肘ＬＶＩＩＩ遺
伝子の発現は試験管内あるいは生体内でのＴＩａ胞媒介
免疫応答を抑制しないことを示した。
免疫されたマカクからのリンパ球のいかなる亜群がＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩによって刺激されたかを測定するた
めに、我々は、活性化ＴＩＩＩＩ胞および８Ｈ胞におい
て存在するＩＬ−２レセプターの発現に関し、２色免疫
螢光検定によって刺激されたＰＢＬを調べた。ＣＤ４と
ＣＤ８の抗原は丁細胞において存在し、そしてＣＤ　２
０　（Ｂｐ３５）抗原はＢ細胞において存在する。第３
表に示される結果は、ＩＬ−２レセプターを発現するウ
ィルス刺激化ＰＢＬのほとんどすべては、ＣＤ４または
ＣＤ８抗原もまた発現するが、ＣＤ　２０　（Ｂｐ３５
）を同時発現するのはわずか１．５％〜２％にすぎない
ことを示すものである。この結果は、刺激されたリンパ
球は、■細胞であることを示すものである。
（以下余白） 一　　１６０　− 第３表の結果は、以下のようにして得られた。
すなわちＰＢＬは、インターロイキン２レセプター（Ｊ
Ｌ−２Ｒ）　に対する藻紅接合モノクロナール抗体２Ａ
３（ベクトンーディツキンソン　インコーホレーテッド
、カリフォルニア州マウンテンビュー［Ｂｅｃｔｏｎ−
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｉｎｃ、）ｆｏｕｎｔａｉｎ　
ＶｉｅＷ、ＣＡｌ）ならびにＣＤ２０に対するフルオレ
セイン接合、モノクロナール抗体（ジェネテインク　シ
ステムズ　コーポレーション、ワシントン州シアトル［
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐ、５ｅａｔ
ｔｌｅ、ＷＡＩ）、ＣＤ８に対するＧ１０−１　（ジュ
ネティック　システムズ」−ポレーション、ワシントン
州シアトル）、あるいはＣＤ４に対するＴ４ａ（オルソ
　ディアグノティックス　コーポレーション、ニューシ
ャーシー州ラリトン［０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ、Ｒａｒｉｔａｎ、Ｎ。
月）によって同時に染色された。抗体は修正ＦＡｃ３Ｉ
Ｖソーター［ＦＡｃ３ＩＶ　５ｏｒｔｅｒｌ　（ベクト
ンーディツキンソン　カリフォルニア州マウンテンビニ
ｚ　−［ｅｃｔｏｎ−ｏｉｃｋｉｎｓｏｎ、　ＭＯＵｎ
ｔａ　ｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ｃ、　Ａｌ　）を用いて流量
微量螢光測定によって分析されたりンバ球における力価
測定より予め決められた飽和濃度で使われた。定量的２
色分析は、以前に詳しく述べられた（レドベター、ジエ
イ、エイ、ら。
１９８４年、パースベクティプズ　イン　イムノジエネ
ティクス　アンド　ヒストコンパティビリティ６、１１
９〜１２９［Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、Ｊ、Ａ、、ｅｔ、ａ
ｌ、、１９８４．Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｈｉｓｔｏｃｏ
ｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ、６１１９−１２９］）のよう
にして行われた。前方で右の角度の散乱ゲートはリンパ
芽球と実質的数の小リンパ球を含むように調整された。
値はＩＬ−２Ｒ±細胞の総計に関する値、およびＣＤ４
、ＣＤ８あるいはＣＤ　２０　（Ｂｌ）３５）を同時に
発現するＩＲ−２Ｒ＋細胞に関する値を示す。
Ｔ細胞は、抗原刺激に伴ない、Ｔ細胞とＢ細胞の分析お
よび／または増殖を促進することができ、かつエイズウ
ィルスを含む多様なウィルスによって感染された細胞を
溶解可能な天然キラー細胞を活性化することができるリ
ンフ才力イン含有ＩＬ−２を産生ずる。我々は、それゆ
え予防接種されたマカクからのＴ細胞がＬＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩＩＩによる刺激に従いＩＲ−２を産生ずるかどうか
を問うた。
この目的のために２つの実験を行った。実験１に関して
は、ＰＢＬは、ワクシニアウィルスのＷＲ株によって形
成されたｖ−ｅｎｖ５あるいはＶ−Ｈ３ＶｇＤ１による
二次皮肉免疫処置の４週間後のマカクのヘパリン加血液
より単離された。実験２に関しては、２Ｘ　１０”　ｐ
ｆｕのｖ−ｅｎｖ５、Ｖ−Ｈ３Ｖｇ旧あるいは、ウィル
スのニューヨークシティ　ボード　オブヘルス　ワクチ
ン株によって形成されたｖ−ｅｎｖＳ組換え体（Ｖ−ｅ
ｎｖ５ＮＹ）の初回皮肉免疫処置の４週間後のマカクか
ら単離された。ＰＢＬは、１０％熱不活化正常ヒト血清
によって追補されたＲＰ）ｌＩｉ６４０培地中に懸濁さ
れ、そして２ｘ１０５ＰＢＬは丸底９６ウエルプレート
のウェル中に移された。紫外光線不活性化ｖ−ｅｎｖ５
（ｕｖ光線不活性化前においてＩＸ　１０６ｐｆｕ／ｄ
　＞　マタハｌｉ製ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　（１μ９
　／ｄ）が次いでウェルに加えられた。刺激の２日後、
上澄液が複製ウェルから採取され、そして分析試験に先
立って２４時間の間Ｉ「−２を免かれて洗浄されたＩ　
Ｌ−２依存Ｃ丁ＬＬ−２細胞（Ｓ、シリス博士、イミュ
ノックス　コーポレーション、ワシントン州シアトル［
叶、Ｇ１１ｌｉｓ　Ｉｍｍｕｎｅｙ　Ｃｏｒｐ。
５ｅａｔｔ　ｌｅ、　Ｗ、　Ａｌによって与えられた〉
の増殖を支持するそれらの能力に関して試験された。上
澄液とのインキュベーションの最後の６時間の間、細胞
は３Ｈ−Ｔｄ　Ｒで標識され、そして細胞中に取込まれ
た３Ｈ−Ｔｄ　Ｒの量が測定された。上澄液中に存在す
るＩＲ−２活性の単位は、Ｃ丁ＬＬ−２細胞の増殖にお
ける組換え型ヒトＩＬ−２（ジリス博士によって与えら
れた）の効果を試験することによって得られる標準曲線
から画かれるように計算された。結果を第４表に示す。
（以下余白） ｌ拷 されたマカクからのＰＢＬによるＩＲ−２産生。
６８　　　　　　ｖ−ｅｎｖ５　　０　　　　　１６．
０　　、　　１２４．０７４　　　　　　ｖ−ｅｎｖ５
　　０　　　　　　９．０　　　　５２．’０７３　　
　　　　Ｖ−Ｈ３ＶＩＩＩＤＩ　　　Ｏ０１０Ｂ、０２
６　　　　　　　な　　　し　　　Ｑ　　　　　　　　
　０　　　　　　　０゜実験２二 ０３　　　　ｖ−ｅｎｖ５　０　　　　１４．４　　　
５８．８０５　　　　ｖ−ｅｎｖ５ＮＹ　　Ｏ１Ｂ、８
　　　３３．３４９　　　　ｖ−ｅｎｖ５ＮＹ　　Ｏ７
，１２６，７５２ｖ−ｅｎｖ５ＮＹ　　Ｏ２，４，２７
，６５９ｖ−ｈｓｖｊｏｔ　　ｏ　　　　　Ｏ２７，６
２６な　　　し　　　０　　　　　　　　０　　　　　
　　　０２７　　　　　　　な　　　し　　　０　　　
　　　　　０　　　　　　　　０第４表中の実験１の結
果は、ｖ−ｅｎｖ５で二度の免疫処置されたマカクより
得られる、Ｖ−ｅｎｖ５またはＬＡＶ／Ｈ丁ＬＶ［ｌ刺
激されたＰＢＬからの上澄液は、ＩＬ−２依存細胞系で
あるＣ丁ＬＬ−２′細胞の増殖を引き起こすこれらの能
力によって示されるように、Ｉ　Ｌ−２を含むものであ
ったことを示すものである。同様に、第４表中の実験２
において示されるようにＩＬ−２は、ｖ−ｅｎｖ５で一
度免疫されたマカク３からの、および同様の組換え体（
シーｅｎｖ５ＮＹ、第５．３節参照）の“ワクチン′″
株で１度免疫された３匹のマカクすべてからの、Ｖ−ｅ
ｎｖ５またはＬＡＶ／ＩＩＴＬＶＩＩＩ刺激されたＰＢ
Ｌの上澄液に検知された。これに対して、ワクシニアＨ
３ＶｇＤＩ組換え型ウィルスで免疫処置されたマカク７
３および５９からのＰＢＬはＶ−ｅｎｖ５テの刺激後ニ
（７）ミＩＬ−２を産生し、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩでの
刺激後には産生しなかった。免疫処置されなかったマカ
ク２６および２７は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩおよび組換え
型ワクシニアウィルスのいずれの刺激後においても検知
可能なＩＬ−２を産生じなかった。ヘルパー／インデュ
ーサー活性を有する初代Ｔ１′Ｊｌｌ胞は、抗原刺激後
にｌ−２を産生ずるゆえ、これらの結果は組換え型ウィ
ルスで免疫処置されたマカクにおける、ＬＡＶ／肘ＬＶ
Ｉ［Ｉを認識するヘルパーＴ細胞の存在を示すものであ
る０ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ抗原に対する
抗体を産生ずるためのＢ・リンパ球の分化におけるこれ
らの相当な役割に加えて、これらＩＬ−２産生性丁細胞
は、細胞障害性Ｔリンパ球やナチュラルキラー細胞など
のような、ウィルス感染細胞を殺し得るエフェクター細
胞の分化および／または増殖において含まれ得る。
（５，５，２，３，ｖ−ｅｎｖ５ＮＹｒ免疫処置−ｓれ
たチンパンジーの体液応答〉 幼若令の２匹のチンパンジーを５Ｘ１０８ｐｆｕのＶ−
ｅｒｌＶ５１１１Ｙ、すなわちｖ−ｅｎｖ５　ｒワクチ
ン」株で以内に接種した。−匹の動物は、ｖ−ｅｎｖ５
ＮＹと同じ親のワタシニア株（Ｖ−ＮＹ）から構成され
、同一力価のりクシニア−単純ヘルペスＱＤ組換え休Ｖ
−Ｈ３Ｖ（１０１ＮＹを以内に接種された。動物すべて
を初回免疫処置から８週間後に同一投与量の二次接種を
行なつた。血清サンプルを次の免疫処置から２週間に１
度採取し、ＥＬＩＳＡおよびウェスタン　プロット［Ｗ
ｅＳｔｅｒｎ　ｂｌＯｔ］法でＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ
−特異抗体に関し検定した。動物はすべてワクシニアウ
ィルス感染に典型的な自己治應性皮膚病変と正常な生理
的指示症状を実験の進行を通して示した。
チンパンジー血清におけるエリザ（ＥＬＩＳＡ）方法は
マカク血清用に使用される方法と同一であった。
第５表に示す結果は、両実験動物（１２４および１４９
）が初回免疫処置からＢ週間までに血清転化し、抗体レ
ベルが二次免疫処置後連続して上昇したことを示す。比
較動物（１３４）は血清陰性にとどまった。
（以下余白） 免疫処置された動物体中で検出されたＬＡＶ／ＨＴＬＶ
■特異抗体がエンベロープ糖タンパク質順に対して指向
したことを示すために、ウェスタン　プロット（Ｗｅｓ
ｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）法により同一血清を分析した。使
用された方法は（ＪＤ４′！抗体検知に関して最適化さ
れ、またマカク血清の分析用に使用されたもの同一であ
った。第１３図に示された結果は、双方の予防接種分れ
た動物体中に作られたＬＡＶ／ＨＴ、ＬＶ特異抗体が事
実エンベロープ糖タンパク質に対するものであり、これ
らの抗体レベルが二次免疫処置後に増加したことを示す
。
（５，５，２，４，ｖ−ｅｎｖ５ＮＹで免疫処置された
チンパンジーにおける細胞仲介免疫応答）第５．５．２
．．３節に記載された同一動物から単離された末梢血、
リンパ球（ＰＢＬ）は、これら動物における細胞−仲介
免疫応答を示すために使われた。ＰＢＬは、組換え型ワ
クシニアウィルスでの初回の陵内接種の４週間後、フィ
コルーハイバーク（Ｆｉｃｏｌ　Ｉ−ｈｙｐａｑｕｅ）
遠心分離によりヘパリン加血液から単離された。Ｐ、Ｂ
Ｌを、ウェル当り１×１０　細胞で、９６ウエルを有す
るプレートにおいて、１０％熱不活性化正常ヒト血清お
よびペニシリン／ストレプトマイシンで補足されたＲＰ
Ｍ１１６４０培地中に接種した。非分裂ＩＡＶ／ＨＴＬ
ＶＩＩ［（５μｇ／ＩＩｄりまたは精製ＬＡＶ／旧［ν
ｍからレンズマメ　レクチン　りロマトグラノイーで単
離したＬＡＶ／ＨＴＬＶ■エンベロープ糖タンパク質類
（１μｇ／ｍ！＞を、その後ウェルに加えた。６日後、
細胞中に取込まれた３日−チミジンを液体シンチレーシ
ョン計測により測定した。
第６表に示されるように、ｖ−ｅｎｖ５ＮＹで免疫処置
した両動物（１２４および１４９）からのリンパ球は、
ＬＡＶ／旧［Ｖ■ピリオンまたは精製エンベロープタン
パク質（ｅｎｖ）のいずれかの刺激に応答して増殖した
。反対に、ワクシニア−単純ヘルペス組換え体Ｖ−Ｈ３
ｑＤＩＮＹ　ヲ受ケタ動物１３４は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ
Ｉ［を認識するリンパ球類を産生じなかった。
チパンジーのすべてからのＰＢＬは、植物凝集素（フィ
トヘマグルチニン（ＰＨＡ　２μｙ／ｄ＞刺激に続いて
高レベルの３Ｈ−チミジン取込み（３８，８７０〜１０
９，７９０ｃｐｍ）を、また、Ｘ線照射されプールされ
た異種移植ヒトＰＢＬでの刺激後、高レベルの３日−チ
ミジン取込み（４２，１７２〜１２．０６７ｃｐｍ）を
示した。非免疫処置化チンパンジーからのＰＢＬがワク
シニアウィルス刺激に応答して増殖しなかったが、Ｖ−
ｅｎｖ５免疫処置およびＶ−Ｈ３ＶｐＤＩＮＹ免疫処置
チンパンジーからのＰＢＬはワクシニアウィルスに応答
して強い増殖性を示した。
さらに、第１〜４表および第１１〜１３図に示される結
果は、（ａ）組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ５
およびその対応するワクチン株であるＶ−ｅｎｖ５ＮＹ
は、二種の類火霊長類、すなわちマカクおよびチンパン
ジーにおいてＬＡＶ／ＨＴＬＶＪＩ［特異体液および細
胞仲介免疫応答を引き出すことができ、そして（ｂ）組
換え型ウィルスは、試験管内［１ｎｖｉｔｒｏｌまたは
生体内［ｉｎ　ｖｉｖｏコにおいて下細胞仲介免疫応答
を抑制しなかったということを示す。
（５，６，ワクシニアウィルスのｖ−ＮＹ株で形成され
た組換え体の減少した神経毒性） ２５〜５０ｕｆＪに５Ｘ１０７１）ｆｕを含むウィルス
のアリコツトを５匹のマウスから成るグループに大脳内
的に注射した（ＩＣＲ株）。死亡率を接種１０日後に評
価した。
第１人 ワタシニア組換え体で大脳内に接種されたマウス死亡重
接　　　　種　　　　　　　死亡／注射された数ｖ−Ｎ
Ｙ　　　　　　　　　　　　　　　０１５ｖ−ｅｎｖ５
ＮＹ　　　　　　　　　　　　　０１５ｖ−ｅｎｖ２Ｎ
Ｙ　　　　　　　　　　　　　０１５Ｖ−ｅｎｖ７ＮＹ
　　　　　　　　　　　　　Ｏ１５痘痢ワクチン（Ｗｙ
ｅｔｈ）　　　　　　　３１５ｖ−ｅｎｖ５　　　　　
　　　　　　　　５１５Ｖ−ｅｎｖ２　　　　　　　　
　　　　　５１５ｖ−ｅｎｖ７　　　　　　　　　　　
　　５１５食塩水　　　　　　　　　　　　　０１５Ｍ
７表に示された結果は、プラーク精製された組織培養誘
導ワクシニアウィルス（株Ｖ−ＮＹ）およびその誘導体
ｖ−ｅｎｖ５ＮＹＳｖ−ｅｎｖ２ＮＹおよびＶ−ｅｎｖ
７ＮＹがＷＲａおよびその誘導体と比較して神経毒性を
減少したことを示す。ニューヨーク　シティ−ボード　
オプ　ヘルス株は痘痕ワクチンとして使用されているの
で、この株に基づく組換え体は、ヒトに使用するワクチ
ンの開発にはさらに好適のはずだ。
（６，実施例：バキユロウイルスｇａｇ組換え体）次の
実施例において、各種のプラスミドベクターは、ＡｃＮ
ＰＶの転写制御配列に関して下流に位置するＬＡＶ／１
ｔＴＬＶＩＩｌ　（ｌｌａｏコード化配列音配列るキメ
ラ遺伝子を含有して形成された。
Ａｃ　ＮＰＶポリへドリンプロモーターおよびＬＡＶ／
ＨＴＬＶｍ　ａａｃ＋コード化配列音配列キメラ遺伝子
は、生体内組換えを通じてＡｃＮＰＶゲノム中に挿入さ
れた。そのような組換え型ウィルスは同定され、精製さ
れ、そしてウィルス株は感染組織培養細胞から調製され
た。免疫反応性［＾Ｖ／Ｈ且ｖ■ＱａＱ関連タンパク質
は、試験管内で組換え型ＡｃＮＰＶにより産生きれられ
ることが判った。組換え型ウィルスで感染した細胞は、
陽性免疫ケイ光を示すことが判った。最終的に、組換え
型ＡｃＮＰＶで感染した細胞からの溶解物は、エイズ（
ＡＩＤＳ）患者からの血清で試験した場合にエリザ（Ｅ
ＬＩＳＡ）検定法において陽性であった。本発明のこの
実ＩＭ態様における各段階の詳細な説明は、下記の分節
に示される。
（６，１，一般的手順〉 （６，１，１，細胞およびウィルス） スポドプテラ・フルジペルダ（５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　
　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、クローンｓｆ９はアメ
リカン　タイプ　カルチャー　コレクション【Ａ丁ＣＣ
Ｎｏ、ＣＲ１１７１１）から得られ、３．３９ｍ／Ａの
イーストオレー　ト［ｙｅａｓｔｏｌａｔｅｌ　（タイ
プＤ　［Ｄｉｒｃｏｌ）、３．３ｇｍ／１のラクトアル
ブミン　加水分解物（ディフコ）、１０％胎児ウシ血清
、０．０６ｇ１１１／ｆＪペニシリンおよび０．１９ｍ
／ｆＪス１−レズ１〜マイシンを含むブレースのアンテ
ラエア（Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ａｎｔｈｅｒａｅａ　）培地
（ジブコ、ケージ−バイオロジカル［ＧｉｂＣＯ，にＣ
ａ；ｏ＋ｏｇｉｃａ＋ｓｌ）で増殖さゼた（丁ＮＭ−Ｆ
Ｈ培地〉。細胞は２８℃で増殖された。アウトグラファ
　カルフォルニ力（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　　ｃａｌｉ
ｆ。
ｒｎｉｃａ　）核多角体病ウィルスを、ロイ　ミラー博
。
士（デパートアンド　オブ　ジュネティクス　アンド　
エンドモロシー、ユニバーシイティ　オブジョージ７．
ジョーシア州３０６０２アセンズ（ｏｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｅｎｔｏｍｏｌ
ｏｇｙ、ｔＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｅｏｒｇｉ
ａ、　Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ　３０６０２）］から得、１
％アガロースおよび０．８ＸＴＮＭ−ＦＨを含むＳｆ９
細胞上でプラーク精製した。ウィルス株はＴＮＭ−ＦＨ
中で希釈した。
（６，１，２，ＤＮＡの調製、制限および修飾）制限酵
素類をベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ［Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　Ｉｎｃｌから購入し、制限消化条件は製造業者から
指示されたものであ−）／７−、、Ｔシ１す「ア・−Ｉ
　ＩＩ　ＤＮＡ・１ぐ１ｊメラーゼのクレノウノノグメ
ン１〜１．１、ｂυＩＩＩ　Ｍのトリス−Ｍ　ＣＩ　（
１）８７．４）、６ｍＭのＭＣＩＣｊ２、１０ｍＭの２
−メルカプトエタノール中で３７℃で３０分１２００ユ
ニツト／ｍｅの割合で使用された。
トランスフェクション用のウィルス性ＤＮＡは、ミラー
、エル、ケイ０．ミラー　ディー、ダブリュ、およびサ
ーファ−、ピー、　［）ｆｉｌｔｅｒ、Ｌ、に、。
）ｆｉｌｔｅｒ　Ｄ、Ｗ、ａｎｄ　５ａｆｅｒ、Ｐ、］
の次の方法を使用し野生型ウィルスの非閉塞ウィルス（
ＮＯＶ）から調製された：　ＮＯＶ粒子は、２５％のシ
ョ糖、５１１１ＭのＮａＣｐおよび１０ｍＭＥＤ丁Ａの
クッションを介して５℃で１時間９０．０ＯＯＸ　９で
遠心分離することにより上澄液からペレット化された。
上澄液を除き、ウィルスペレットを０．５Ｉｎ！！溶解
バッフｙ−−（１０ｍ）１　トリス、　ｐＨ７，６，１
０ｍ）Ｉ　ＥＤＴＡ、０．２５％５ＯＳ）に再懸濁した
。ウィルスペレットは再懸濁された後、プロティナーゼ
Ｋが最終濃度５００μ３／ｌｔｄ！まで加えられ、必要
な攪拌をしながら３７℃で一夜（約１６時間）インキュ
ベートされた。
ＤＮＡは、フェノール：クロロホルム：イソアミル　ア
ルコール（２５：２４：１）の同容積で抽出された。
ＤＮＡを１／１０容積の３Ｍ＃酸ナトリウム（ｐＨ５）
および２倍容積の冷エタノールを加えて一２０’Ｃで沈
降させた。ペレット化の後、ＤＮＡをトランスフェクシ
ョンまたは制限酵素分析への使用前に７０％エタノール
で洗浄し、乾燥し、丁Ｅ（１０ｍ）ｌトリス、１關ＥＤ
ＴＡ、　ｐＨ７，５）に再懸濁させた。
プラスミドＤＮＡを、次のサマーズ、エム。
デユーおよびスミス、ジー、イー、　［ＳＵｍｌｌｌｅ
ｒＳ、Ｍ、Ｄ。
ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｅ、　］のマキシプレップ［
ｍａｘｐｒｅｐ］法を使用して調製した：適切な抗生物
質を追補した１ｍｌのルリア　ブロス（Ｌｕｒｉａ　Ｂ
ｒｏｔｈ）を新たに調製したプレートからの細菌細胞の
単コロニーで接種した。３７℃で１２〜１８時間のイン
キュベーション後、１ｄの培地を５００〜１０００ＩＩ
ＪＩ！フラスコ中の２００ＩＩＪ！！の［Ｂに抗生物質
を加えたものに移し、攪拌培養器中（３７°Ｃ）で−夜
（１２〜１８時間）インキュベートした。２００ｄの培
地を遠心用容器に移し、２．５０Ｏｒｐｍで１０分間遠
心分離した。上澄液を除去後、各細胞ペレットを３０Ｉ
ｉｄ！のステッド緩衝液［５ＴＥＴ　ｂｕｆｆｅｒｌ（
８％のショ糖、０．５％のトリメンＸ−１００，５０ｍ
）ＩのＥＤＴＡ（ｐＨ８，０１１０ｍＭのトリス−Ｊ）
　、　ｐＨ８，０］に室温で再懸濁し、１２５ｄのフラ
スコに移した。その後、３ｄの”ｌ０ｍ１／ｌｉｄ！リ
ソチーム（ステッド緩衝液中に新たに調製された）を混
合のために渦動される各フラスコに加え、室温で約５分
間インキュベートした。その後、各フラスコを、細胞が
凝固し始め、かつ白く変化するまで、フレーム全体を直
接おだやかに渦巻攪拌したく約５秒に１度）。−１１泡
が生成すると、フラスコを沸騰水ウォーターバスに４５
秒間移し、その後フラスコを氷つイーターバスで２分間
またはそれ以上冷却した。粘性混合物を５０ｄの丸底遠
心分離用試験管に徐々にそそぎ、調製用遠心分離機で５
Ｗ２８日−ター（ベックマン　カリフォルニア州）を使
用して１Ｂ、　ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分離した。
各試験管から上澄液を注意深く、１容積のイソプロパツ
ールとして容積のエタノールを加えた使い捨てポリプロ
ピレン遠心用試験管にそそぎ、ＤＮＡを一８０℃で２０
分間（または−２０℃で２時間またはそれ以上）沈降さ
せ、その後２，５ＯＯＸｇで１５分間またはそれ以上遠
心分離機にかけた。アルコールを除去後、２．５−の抽
出緩衝液（１１当り：１２．１ｇのトリス（Ｔｒｉｍ）
、３３．６ｇのＮａ２ＥＤＴＡ２Ｎ２０，１４．９ｇの
ＫＣＩ、ｐＨ７，５）をペレットに加え、その後試験管
の底から溶解物を離すため渦巻攪拌を行なった。１００
μρの１０＃Ｉ５Ｆ／ｍｅリボヌクレアーゼＡ　（０，
１Ｘ且に溶解し、１０分間沸騰水で前処理した）を加え
、３７°Ｃで３０分間インキ１ベートした。約２００μ
ｑのプロティナーゼＫを各試験管に加え、約３０分間４
０〜５０℃でインキュベートし、その時に２５０Ｍｇの
１０％サーコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）を加え、インキ
１ベーシヨンを３時間またはそれ以上続けた。Ｃ３ＣΩ
勾配を調製するために、ＤＮＡ溶液１ｄ当り８０１の１
０＃Ｉｇ／ｄ臭化エチジウムを各試験管に加えた。その
後、ＤＮＡ溶液１威当り’１．０’４ｇのＣｓ　Ｃ１を
各試験管に加え、溶解させるために徐々に渦巻攪拌を行
なった。クイック−シール（Ｑｕｉｃｋ−３ｅａｌ　１
Ｈ）試験管に移した後、上部バンドが直線状およびニッ
ク化ＤＮＡから成り、下部バンドが共有結合性の閉環Ｄ
ＮＡから成る二つの十分に分離された目に見えるＤＮＡ
のバンドをもたらすように、７０゜Ｉ　　Ｔｉ固定角ロ
ーター中で５５．０００ｒｐｍで１６時間平衡となるま
で遠心分離機にかけた。下部バンド（共有結合性の閉環
ＤＮＡ）を集め、水を加え各試験管容積を約６ＩｉＪ！
！とじた１５彪のポリプロピレン遠心分離用試販管に入
れた。臭化エチジウムを等容積のイソアミルアルコール
を使用してＤＮＡから抽出し、ピンク（上部）相を除去
し、かつ捨てた。上部相が無色、底（ＤＮＡ’）相が透
明および無色となるまで抽出を繰り返した。約５ｄのＤ
ＮＡ溶液を、２容積の無水エタノールを加えた各試験管
中に残すべきである（もしそうでなければ、水を最終容
積５ＩｎＩｌまで加える〉。ＤＮＡを一２０℃で一夜あ
るいは一８０℃で１０分間沈降させ、２，５００Ｘｇで
２０分間ペレット化した。アルコールを全て除去した後
、５００μｍの０．１ＸＴＥを各ペレットに加え、その
後６５℃で１０分間またはそれ以上再懸濁させた。ＤＮ
Ａは、４°Ｃで貯蔵できる。
プラスミドＤＮＡをまた、マニアチス等の記載のように
調製した（マニアチスら、　１９８２年、モレキュラー
　クローニング、コールド　スプリングハーバ−ラボラ
トリ−（８６９６頁）［ＭａｎｉａｔｉＳ　ｅｔａｌ、
、１９８２．Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃ
ｏ１ｄ　ｓｐｒａｎｇ　）（ａｒｂＯｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１）ｐ、８６９６）］）　、　ＤＮＡリガー
ゼをニュー　イングランド　バイオラポス（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入し、５０１１
１Ｍのトリス−ＨＣＩ　（１）８７．８）、１０ｍＭの
Ｍｃ＋ＣＩ２．２０ｍＭのＤＴＴ、１　　ｍＭのＡＴＰ
中におイア　１０．０００ユニツト／ｄの割合で使用し
た。ＤＮＡのアガロースゲルに基づく分析はマニアチス
らの記載のようであった［マニアチス等、　１９８２．
モレキュラー　クローニング、コールド　スプリング　
バーバーラボラトリ−団ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、
、１９８２．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ
１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　）（ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）コ　。
（６，２，ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｇａｇ遺伝子のコ
ード化配列に連結したＡｃＮＰＶプロモータを含むプラ
スミドベクターの形成） 次の分節では、ＡｃＮＰＶ転写調節配列に先んじられか
つポリヘトリンＤＮＡへ続＜　ＬＡＶ／旧ＬＶ［（（Ｊ
ａＱ遺伝子コード化配列を有するプラスミドベクターの
形成について記載する。これら組換え型プラスミドベク
ターは、その後生体内組換えを通じてバキュロウィルス
ゲノムに１ＡＶ／ＨＴＬＶＩ　ＱａＱコード化配列配列
入するために使用された。下記の分節ニオイテ、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｏａｐコ−＞：化配列（第１４図参
照）をｐＫｓ−５、すなわちラムダＪ１９（ウエインー
ホブソン、ニス、ら、　１９８５．セル４０：９［Ｗａ
ｉｎ−ＨＯｂＳＯｎ、　Ｓ、　、　ｅｔ、ａｌ、　、　
１９８５．　ｅｅｌ　１４０：９］　）のサブクローン
から精製し、ＤＡｃ−ｔＪａｇｌ（第１５図参照）を形
成するため、ｔ）Ａｃ６１０に含まれるバキュロウィル
スポリヘトリンプロモータに対し下流においてプラスミ
ドＡｃ６１０中に挿入した。
この形成において、ｔＡｖ／Ｈｒｔｖｍ特異ヌクレオチ
ド配列は、キメラ遺伝子を形成するポリヘトリンプロモ
ーターに先立たれ、そしてポリヘトリン遺伝子配列へと
続く。
前述のように、ｐＫｓ−５は、ｐＵＣｌＢの３ｓＢおよ
びＫｐｍＩ部位にクローン化されたラムダＪ　１９ニ含
マレルＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物の３
，１４８の塩基対５ＳｔＩ−＋ＫＩ）ｍＩフラグメアン
からなる。それは、Ｊ１９の旦旦■制限フラグメントを
ｆ）ＬＪＣ１８の３ｓＢ部位にクローニングすることに
より０８丁−１を形成し、これを次にＫ　ｐｎ　Ｉで消
化し再連結することにより得られた。このＤＮＡはエシ
ェリキア・コリを形質転換するために使用され、プラス
ミド１）ＫＳ−５が単離された。
Ｉ）ＫＳ−５に含まれるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ￥ｆ異ＤＮ
Ａは、［＾Ｖ／Ｈ丁ＬＶＩ［Ｉゲノムにおいてヌクレオ
チド２２４に位置する５Ｓｔｌ部位からヌクレオチド３
３７２に位置するＫｌ）ｎＩ部位までである（ウエイン
ーホブソン。
ニス、ら、　１９８５年、セル４０　：９　；第１４図
参照［悼ａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ、Ｓ、、ｅｔ　ａｌ、、
１９８５．Ｃｅ１ｌ　４０：９］）。
１０μｓのＤＫＳ−５は、ＨｉｎＣＩＩおよび３Ｓｔｌ
により完全に消化され、生じたフラグメントは１％低融
点アガロースゲルｌこおいて分解された。１８１８塩基
対フラグメント（約０．２μｇ）は、ゲルから切除され
た。このフラグメントは、第１４図に示されるようにヌ
クレオチド数２２４番か。
ら２０４２番までのＬＡＶ／）ＩＴＬＶｉ特異配列を含
んでいた。
それは完全ＯａＯ遺伝子に関するコード化領域を含む。
５μ９のＤＡｃ６１０は、錫■および錦Ｉで完全に消化
され、１％低融点アガロースゲルで分画化された：ＤＮ
Ａバンドく約０．４μｇ）はゲルから切除されたく第１
５図参照）。
双方のゲル切片を６５°Ｃで１０分間溶解し、３μρの
１８１８塩基対しＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ特異フラグメン
ト（ＨｉｎｃＩ［および５ｓｔＩで消化された）を、全
容積４０μρにおいて、１μｇのＤＡｃ６１０（Ｓ　ｍ
ａ　Ｉおよび旦旦■で消化された）に連結した。
２３℃（室温）で１６時間インキ１ベーシヨンした。そ
の後連結混合物を６５℃で１０分間加熱し、ニジＩリキ
ア・コリ株ＨＢ１０１を形質転換するために用いた。ア
ンピシリン耐性被形質転換体からのプラスミドＤＮＡは
、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ挿入物の存在を試験された。この
プラスミドｐＡｃ−ｇａｇｌの構造を第１５図に示す。
（６，３，キメ７ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ＱａｌｌＪ
ｉ伝−ｊＪｆｌｌＡ工型バキュ口型バキュロウィルスａ
ａｌ　）の形成）ＡｃＮＰＶをプラーク精製し、Ｓｆ９
細胞細胞層殖させた。野生型Ａｃ　ＮＰＶ　　ＤＮＡを
単離し、前記のようにｐＡｃ−ｇａｇｌを精製した（第
６．１．２節参照）。
キ）（うＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ［（ｌａＱ配列のＡｃＮＰ
Ｖゲノム中への挿入は、ｐＡｃ−ｇａｇｌ中のｇａｇ配
列がＡｃＮＰＶコード化配列により側面を接せられると
いう事実により可能とされる生体内組換えにより達成さ
れた。ｐＡｃ−（ｌａ（］１プラスミドＤＮＡと野生型
Ａｃ　ＮＰＶ　　ＤＮＡとの同時トランスフェクション
は、プラスミド上のポリヘトリン配列とＡｃＮＰＶゲノ
ム中の相同配列との間に組換えを起こさせた。キメラ遺
伝子の挿入は、側面に接する配列における二重組換えの
結果として生じた。かかる組換え体は、ＡｃＮＰＶポリ
ヒドリン遺伝子中遺伝人中れたキメラ遺伝子を保有し、
結局閉塞体を産生できないであろう。組換え体プラーク
は、閉塞ウィルスの欠除に関する視識観察により選択さ
れ得る。
１μ９のＡｃ　ＮＰＶ　　ＤＮＡ、５μ７のｐＡｃ−ｇ
ａｇｌおよび１５μｇの仔つシ胸ＪＩＩＩＤＮＡを混合
し、エタノール沈降を行なった。沈降物を７０％エタノ
ールで洗浄し、組織培養フードのもとて空気乾燥し、４
３７ｔ１．ＱのＨ２Ｏに再懸濁した。ＧａＣ１を０．２
５Ｍ加えた（　６３．ｕ　、１１の２８　ＣａＣＬ。
をＨ２Ｏ中の４３７１のＤＮＡへ〉。５００／ｊＪ）の
２ＸＨＥＢＳを通して空気をバブリングしながら、ＤＮ
Ａ溶液を滴加した。（１滴／４秒）。２ＸＩ（ＥＢＳは
、１ｄ当り、１６７＋１！？のＮａ　Ｃ＋　、２ｍ５Ｆ
のＤ−グルコース、０．７５ｍ’ｊのＫＣＩ　、０．５
ｍ５ＦのＮａ　　ＨＰＯ”　１２Ｈ２０，９，５ｍｌの
ＨＥＰＥＳ（回７．１）を含む。混合物を室温で３０分
閲インキ１ベートし、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ’）
および抗生物質（イーストオレートまたはラクトアルア
ミン加水分解物はない）を含む２ｄのブレース（Ｇｒａ
ｃｅ）の昆虫培地中の３Ｘ１０６ｓｆ９細胞を含む６０
馴ｍ織培養デイツシ１に加えた。［）ＮＡ溶液を細胞に
滴加し、そのデイジタ１を２８℃で４時間インキュベー
トした。その阻を４−のブレース培地＋ＦＢＳ＋抗生物
質ですすぎ、ブレース培地十ＦＢＳ＋抗生物質＋２０％
ジメチルスルホキシドで９０秒間インキュベートした。
そのプレートを完全培地で３回すすぎ、４ｄの完全培地
で２８℃にてインキュベートした。５日後、上澄を集め
、１０００Ｘ　ｇで５分間清澄化した。
ウィルス株は、５ｆ９ＩＩＢ胞上で力価を測られ、非閉
塞プラークは目視により同定された。非閉塞プラークは
選り出され、さらに二度再プラークされた。これらのプ
ラークは５ｆ９ＩＢ胞において増殖され、ウィルス株が
調製され、その後の特性化のために使用された。組換え
体の形成は第１６図に図示される。
（６，４，１１換え型バキュロウィルスにより感染を受
けた組織培養細胞におけるＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　（
ｌａ（ｌ関連タンパク質の発現） キメラＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　（ｌｌａＱ遺伝子を負
う組換口型ＡｃＮＰＶは、ＬＡＶ／１（ＴＬＶＩｕ　ｇ
ａａＭ連ＲＩ’４八およびタンパク質を、組織培養中の
細胞の感染において発現することが可能であった。これ
らタンパク質もエイズ（ＡＩＤＳ）患者血清と免疫反応
性であること−１９０＝ も判った。
（６，４，１，Ａｃ−ａａａｌテ感染シタ細ａ　Ｇ：　
オｃｔ　ルＬＡＶ／１（ＴＬＶＩＩＩ　ｇａｇ特異ＲＮ
Ａの同定）Ｓｆ９細胞（約１０７セル／デイツシユ）の
１００履デイツシユを感染多重度（ｍ０１モイ）４で野
生型Ａｃ　ＮＰＶまたはその組換え体Ａｃ−ｇａｇ１で
感染した。感染後２４時間で細胞を採集し、０．１５Ｍ
のＮａ　Ｃ１，０，０１Ｍのトリス−ＨｃＩ、１）Ｈ７
，２で２度洗浄した。ポリ７デニール化ＲＮΔを文献に
従い単離した（パーチオ、エイ、エフ。
とファリード、ジー、シー、１９７９年、ジャーナルオ
ブ　ピロロジ−２９ニアＢ３〜７６９［Ｐｕｒｃｈｉｏ
、Ａ、Ｆ。
ａｎｄ　Ｆａｒｅｅｄ、　Ｇ、　Ｃ，、１９７９，Ｊ、
　Ｖｉｒｏｌ、２９ニア６３−７６９］　）。
ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドグル（レー
ラッハ、エッチ、ら、　１９７７、バイオケミスト！Ｊ
　−１６：４７４３〜４２５１［Ｌｅｈｒａｃｈ、）１
．、ｅｔ　ａｌ、、１９７７゜Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　１６：４７４３−４２５１１）上で分画化し、ナイ
ロン　フィルター（ハイボンド［Ｈｙｂｏｎｄ］　）に
移し、紫外線照射した。フィルターを０．９ＭのＮａ　
Ｃ１，５０１１１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）
、５ｍＭのＥＤＴＡＳｏ、１％のＳＤＳ、４メデンハー
ドト５（４ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ）、０．４ｍ！ｉ／ｄ
（Ｄ　ｔＲＮＡ、０．２５ｍ９／ｒｉｄ！の仔ウシ胸腺
りへＡ、５０％のホルムアミド中で４２°Ｃ１１６時間
の間、３２ｐ−標識化ｐＫｓ−５ＤＮＡにハイブリッド
形成した。フィルターを０．１％　ＳＯ８，０，２５ｘ
ｓｓｃ中、６５℃で３０分間、４回洗浄し、ライテニン
グ　プラス（Ｌｉｃ＋ｈｔｅｎｉｎｇ　Ｐｌｕｓ）増度
スクリーンを使用するクロネックス［Ｃｒｏｎｅｘ１４
　Ｘ線フィルムに露光した。第１７図は、２，２キロベ
ースペアの主要バンドが、組換え型ＡｃＮＰＶ感染１ｍ
感染１検胞中れ、野生型感染細胞中には検出されないこ
とを示す。
（６，４，２，免疫沈降技術を使用する組換え型バキユ
ロウイルスで感染された細胞において発現したＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩ　（ｌａｌｌｌ関連タンパク質の同定）
下記の免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉ
ｏｎ）検定法は、本発明の組換え型バキユロウイルスで
感染し　　　。
た細胞が、エイズ（ＡＩＤＳ）患者血清と特異的に免疫
反応性であるタンパク質類を合成することを示す。
５ｆ９細胞を６０履デイツシユ（５ｘ１０６細胞／デイ
ツシユ）上に接種し、Ａｃ−ｇａｇｉ中の野生型ＡｃＮ
ＰＶで感染した。感染後２４．４８および７２時間に、
培地をメチオニンを含まない培地と置換え、細胞を２８
℃で３０分間インキュベートした。この後、その培地を
１００μＣｉ／ｓ　［３”Ｓ　］メチオニンを含みメチ
オニンを含まない培地で置換え、２８℃で２時間標識化
した。
標識時間終了時に、細胞を０．０１Ｍのトリス−１−（
ＣＩ（１）８７．２）、０．１５ＭのＮａＣ１で２度洗
浄し、遠心分離により集めた。各６０ｍｍディツシュか
らの細胞ペレットを１ｄの溶解緩衝液（１％のＭＰ−４
０（ポリオキシエチレン（９）ｐ−ｔｅｒｔ−オクチル
フェノール）　、０．５％のデオキシコール酸ナトリウ
ム、Ｏ，ＩＨのＮａＣ１，０，０ＩＨのトリス−ＨＣｌ
　（ｔ）８７．４））に再懸濁させ、その溶解物をｉ　
ｏｏ　、　０ＯＯＸ　ｇで３０分間遠心分離にかけ透明
にした。
免疫沈降法は、対照集団またはエイズ患者のいずれかよ
りの熱不活化ヒト血清４μｇを、５００ｄの細胞溶解物
に加えて行なった。４°Ｃで１．５−　１９３　一 時間インキュベートシた後、８０μ」の活性化スタフィ
ロｍｌッカス・アウレウス［５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓａｕｒｅｕｓ］　＠胞（パンソーピン　セルズ、カ
ルどオケムベーリング　コーポレーション　カリフオリ
ニア州う　ジヨウ［Ｐａｎ５Ｏｒｂｉｎ　Ｃｅ１ｌＳ、
ＣＣ０Ｉｂ１ＯＣｈｅ　Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、、
Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡＩ）を加え、ざら１４℃で１．
５時間インキュベートを続けた。免疫沈降複合体をソー
パルＡ　３８４　［５ｏｒｖａｌ　ｌ　Ａ３８４］ロー
タ中、４℃で５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して集め
、１ＭのＮａ　Ｃ１＋０．１％のＮＰ−４０＋０゜０１
Ｍトリス１−ＩＣＩ　、ｐ　Ｈ７，４で一回、リパ（Ｒ
ＩＰＡ）緩衝液（１０ｍ）ｌのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ
７，２，０，１５）１のＮａＣ１，１％のデオキシコー
ル酸ナトリウム、１％のラウリル硫酸ナトリウム、１％
のトリトン（丁ｒｉ　ｔｏｎ）Ｘ−１００）で３回洗浄
した。洗浄した免疫沈降物を８０μ（のラエムリ（ｔａ
ｅｍｍｌｉ）試料緩衝液に再懸濁し、１分間煮沸し、ソ
ーパルＡ３８４０−ター中、５０ｏｏｒｐｍで５分間遠
心分離にかけた。上澄液中の免疫沈降タンパク質を１０
％　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動
で分析した。電気泳動後、そのゲルをクーマツシュ（Ｃ
ｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルー染料で染色し、サリチル酸ナ
トリウム（１Ｍのナリチル酸ナトリウム中、室温で３０
分間）処理し、フルオログラフィのために乾燥した。
成熟ＱａＱタンパク質（２４，０００ドルトン、ｐ２４
；１６、０００ドルトン、　ｐ１６　；　１４．０００
ドルトン、ｐ１４）がより大きな５５，０００ドルトン
の前駆体タンパク質からプロセッシングされることが提
唱されている。第１４図は、分子量６７、０００ドルト
ン、５５．０００ドルトン、４０．０００ドルトン、３
４．０００ドルトン、３２．０００ドルトンおよび２４
．０００ドルトンのタンパク質がエイズ患者血清により
特異的に免疫沈降されたことを示す。
いかなる前駆体／産物の関係が第１８図に記載のどのよ
うな免疫反応性タンパク質の間に存在するかどうか決定
するため、パルス−チェイス実験を行なった。Ｓｆ９細
胞を上記のように感染した。
感染後２４時間で細胞を５分間［３５Ｓ］メチオニンで
標識化した：細胞を完全培地で洗浄し、完全培地で２，
４および８時間インキュベートした。
これらの時間において、細胞を収獲し、免疫沈降法を行
なった。免疫沈降タンパク質を上記のように１０％　５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分画化した。第１９
図は、この実験のフルオログラムを示す。このデータは
、Ｉ）６７．Ｄ５５．Ｄ４０゜Ｄ３４およびＤ３２が５
分後標識を取込むことを示した。８時間追跡の後、標識
がＤ６７およびｐ５５において減少し、Ｄ３４において
増加する。
１）４’０における放射標識量は相対的に一定である。
（６，４，３，Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ、４ｋｌ；ルＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩＩ　ａａａ関連タンパク質の同定） 各々１０７ｓｆ９ＩＩＢ胞ヲ含ム１０（Ｉｌ（７）　１
００ｔｒｍディツシュをＡｃ−ｇａｇｉで感染させた。
感染後２４時間で、細胞を収獲し、０．０１Ｍのトリス
ＨＣＩ　　（１）Ｈ７，２）、０．１５ＭのＮａ　Ｃ１
中で２度洗浄し、そして３度凍結解凍した。細胞を氷上
で５分間、０．５％のＮＰ−４０を含む２／ＩＪ！！の
ＰＢＳで分裂させた。溶解物を１０００Ｘ　ｇで１０分
間遠心分離にかけ、上澄液を除いた。４ｄの炭酸塩緩衝
液（５０ｍ１４の炭酸ナトリウム、ρ８９．６）を加え
、その混合物をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｌｆ）
遠心分離機で２０分間回転した。上澄液を除き、第３表
に示すように炭酸塩緩衝液中に希釈した。これら溶解物
は、４℃で一夜、９６−ウェル微小力価プレートを被覆
するために使用された（５６μｐ／ウエル）。３００μ
（の阻止試薬（５％の脱脂粉乳。
０．０１％（Ｍ−メＯサール、０．０１％消泡剤Ａ、　
ｌ０ＸＰＢＳ中）を各ウェルに加え、室温で４５分間イ
ンキュベートした。阻止試薬を吸引除去し、阻止試薬中
の５０μｍの１：１００希釈ヒト血清を各ウェル（加え
た。ウェルに加える前に、希釈血清（エイズ患者血清ま
たは正常ヒト血清）は３７℃で４５分間インキュベート
された。
各ウェルを３７℃で１時間反応させた。その後、各ウェ
ルを塩化ナトリウム＋トゥイーン２０（ポリオキシエチ
レン　ソルビタン−モノラウレート）で３回洗浄した。
１００μｍのヤギ抗ヒト　ワサビダイコン　ペルオキシ
ダーゼ接合体（０，０１％のチメロソールを含む正常ヤ
ギ血清中で１：１００希釈）を各ウェルに加え、３７℃
で１時間反応させた。
プレートを洗浄し、１００μ、０／ウエルの緩衝化基質
十色素原試薬を加えた：緩衝化基質は、過酸化水素、ク
エン酸、およびリン酸緩衝液であり、色素原試薬はジメ
チルスルホキシド中のテトラメチルベンジジンである。
プレートを室温で３０分間インキュベートした。１００
μＩ／ウエルの３Ｎ硫酸を加えて反応を止めた。反応混
合物の吸光度を６３０μｍにおける参照吸収にもとに４
５０μｍで測定した。それらの結果を第８表に示す。Ｔ
Ｒ１、Ｙ”−１，ＣＦ２２ＣおよびＣＦ９はエイズ患者
血清であり、２．１６，２１および４８は正常なヒト血
清である。
（以下余白） 結局、第１７〜１９図および第８表に示された結果は、
組換え型バキュロウィルスが（ａ）挿入ＬＡＶ／ＨＴＩ
ＶＩＩ　ｆＪａｇ遺伝子ヲ信子シ、（ｂ）　カカ６Ｍ４
ｘｉ子産物を修飾またはプロセッシングさせ、（Ｃ）エ
イズ患者血清に特異的に免疫反応性である抗原タンパク
質を産生することが可能なことを示す。
（７，実施例：９９９２７０８０組換え体）以下の実施
例において、ワクシニアウィルスの転写調節領域に対し
て下流に位置するＬＡＶ／１ｌＴＬシ■ＣＪａＱコード
化配列よりなるキメラ遺伝子を含むプラスミドベクター
が形成された。ワクシニアウィルス７．５にプロモータ
ーおＪｌ−ヒＬＡＶ／肘ＬＶＩ［ｌ　ｏａｇ配列を含む
キメラ遺伝子は生体内組換えによりワクシニアウィルス
のゲノムに挿入された。このような組換え型ウィルスは
、同定されかつ精製され、またウィルス株は感染した組
織培養細胞から調製された。タンパク質に関連する免疫
反応性ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ＱａＱは、生体内で組
換え型ワクシニアウィルスにより産生されることが示さ
れた。本発明の本実施態様における各段階の詳細な記載
は、下記の項において提供されている。本実施態様で使
用される一般的な方法は、第５．１項に記載されている
とおりである。
（７，１，ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ　ＱａＱ遺伝子（７）
＋−ト化配列に連結したワクシニアウィルスプロモータ
を含むプラスミドベクターの形成） ｇａｇ」−ド化配列を含む種々の長さのＬＡＶ／１ｌＴ
ＬＶ■ゲノムに連結したワクシニアウィルス７．５にプ
ロモーターを含む５種のプラスミドベクターが形成サレ
タ。ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　１ｌｌａＯＤ−ド化配列
の源はうムタＪ　１９　（ｌａｍｂｄａ　Ｊｌ９）　［
ウエインーホブソンら（Ｗａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　ｅｔ
　ａｌ）セル（Ｃｅ１１）４０：１９８５］の２つの関
連ナブクローンであるｐＫｓ−５および１）Ｓ　Ｓ　−
５であった。プラスミドｐＫ　Ｓ　−５は、ｐｕｃｉａ
の相当部位に挿入さ、ｔＬ　ｆｃ　ＬＡＶ／ＨＴＬＶ　
ｌｌｌＤＮＡの３１４８の塩基対旦即Ｉ→、股凹Ｉ（ヌ
クレオチド番号２２４〜３，３７２）フラグメントを含
んでいる。
プラスミドｐＳＳ−５は、ｐｕｃｉａの相当部位に挿入
されたＬＡＶ／肘ＬＶＩ［ＩＤＮＡ（７）　５，１０７
塩Ｍ対３ｓＬＪ→５ａＩＩ（ヌクレオチド番号２２４〜
５２２１　’）フラグメントを含んでいる。ｐＫＳ−５
またはｐ３８−５から誘導された種々の長さのＱａＱコ
ード化配列配列プラスミドＤＧＳ６２に挿入され、該プ
ラスミドは非反復３ｍａ１部位から下流に位置する非反
復ＥＣ０Ｒ）部位を有することを除いて１）Ｇ　Ｓ　２
０　（）（ａｃｋｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８４
．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、４９：８５１〜８６４）と同一
である（第２０図参照）。ρＧ５６２に挿入されたＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩＩ特異性配列は、すべてｇａΩ遺伝子の
開始コドンから７６塩基対上流に位置する工ｈａＩ（旦
朋Ｄｌｌ）部位（ヌクレオチド２５７）で開始する。プ
ラスミドＤＶ−ＱａｆＪ１．　ＤＶ−ＱａＱ２．　ＤＶ
−１ｌｌａ０３．１）ｖ−１１１ａ０４およびｐｖ−ｇ
ａｇ５は、このＴｈａ１部位からそれぞれ旦ＣＯＲＩ　
（４１９４における）、Ｋ朋Ｉ　（３３７２における）
、旦並ＲＶ（２５２３における〉、比重Ｉ（１９７５に
おける）またはＢＯＩＩＩ　（１６４２における）部位
までのＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ特異性配列を含む。
下記の各プラスミドの形成は、第２０図を参照すること
により明確となる。
ｐｖ−ｇａｇｌの形成： ５μ９のプラスミドＩ）ＳＳ−５ＤＮＡを制限酵素１加
■および旦ＣＯＲｌで完全に消化させた。
得られたフラグメントを、１％のＬＭＰ寒天グルにおい
て分解させた。ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ　ＱａＱコード化
配列配列する３、９ｋｂｐのフラグメントを単離し、予
め３ｍａｌおよびＥＣ０ＲＩで消化させておいたＤＧＳ
６２　　ＤＮＡに連結させた。連結混合物は、■シエリ
キア・コリ）−１８１０１を形質転換するのに使用され
、そしてアンピシリン耐性クローンが選択された。個々
のコロニーからのプラスミドは、制限分析および連結点
での旦ＣＯＲｌの再生により３．９ｋｂρ挿入の存在が
試験された。得られた形成物は、ＱａＱおよびプロテア
ーゼ（ｐｒｔ　）遺伝子の完全コード化配列、ならびに
ヌクレオチド４１９４番の旦ＣＯＲＪ部位までのρ０１
読み取り枠の主要部分を含むものである。
ｐｖ−ｇａｇ２の形成： ５μ９のプラスミドｐＫｓ−５ＤＮＡを制限酵素Ｔｈａ
Ｉおよび５ＩＩｌａＩで完全に消化させた。
ｐＫｓ−５の３ｍａ■部位は、Ｋｌ）ｎＩに隣接してお
り、該畑■部位は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩから誘導さ
れた挿入配列と１）ＬＩＣ１８プラスミド多重クローニ
ング部位との間の結合点である。得られたフラグメント
を、１％のＬＭＰ寒天ゲルにおいて分解させ、ソＬ、　
Ｔ　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｐａｇコード化配列配列
する３゜２　ｋｂｐのフラグメントを単離し、予めＳｍ
ａＩで消化させ、ＣＩＡＰで処理したＤＧＳ６２　　Ｄ
ＮＡに連結させた。連結混合物は、■シエリキア・コリ
Ｈ８１０１を形質転換するのに使用され、そしてアンピ
シリン耐性クローンが選択された。個々のコロニーから
のプラスミドは、３．１ｋｂｐの７ラグメントの存在が
試験され、かつ挿入物の配向が制限分析により測定され
た。得られた形成物であるｐｖ−ｇａｇ２は、完全Ｑａ
Ｑ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子およびヌクレオチド３３
１２番のＫ　Ｉ）ｎ　Ｉ部位までのポル（ｐｏｌ）読み
取り枠の主要部分を含んでいる。
ｐｖ−ｇａｇ３の形成は、ｐＫｓ−５のＴｈａＩおよび
ＥＣ０ＲＶ消化によって生じた２、３ｋｂｌ）フラグメ
ントを３ｍａｉ部位でｐＧｓ６２に挿入した以外はｐｖ
−ｇａｇ２の場合と同様であった。最終形成物であるｐ
Ｖ−ＱａＱ３は、完全Ｄａｇおよびプロテアーゼ遺伝子
およびワクシニアウィルス丁に３ｉ伝子の３゛一部分に
融合したポルの小部分を含んでいる。
ｐｖ−ｏａｐ４の形成： ５μ９のプラスミド９８３−５　　ＤＮＡを３ｓｔＩお
よびＢｃｌＩで完全に消化させた。しＡＶ／ＨＴＬＶｎ
ｌｑａｇ配列を含む結果的に得られたフラグメントを精
製した。このフラグメントを、５ＳｔＩおよびＢａｍＨ
Ｉで予め切断したプラスミドベクターｐｌｃ１９Ｒ［？
−シ１ら（）（ａｒｓｈ　ｅｔ　ａｌ、）、１９８４゜
ジエン（Ｇｅｎｅ）３２：４Ｂ１〜４８５］に連結させ
て中間体プラスミドを形成させた。ｌ）Ｉ　Ｃ１９Ｒの
Ｂａ［［Ｉ）（Ｉ部位へのｇａｇ配列の挿入は、ＬＡＶ
／ＨＴＬＶ　Ｉ［Ｉ配列におけるＢｃｌ　Ｉ部位のこの
多重部位クローニングベクターにおけるＥＣｏＲｔ部位
への並置状態を生じる。
この中間の形成物の制限酵素Ｔ　ｈａ　■およびＥＣｏ
Ｒｔによる消化は、５Ｉ１１ａＩおよびＥＣｏＲＩ部位
におけるプラスミドＩ）ＧＳ６２へ急速に挿入し得る１
、７２ｋｂｐのフラグメントを発生した。最終生成物で
あるｐＶ−ｑａｇ４は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ　Ｑａ（］
遺伝子の全ておよびワクシニアウィルスＴＫ遺伝子の３
一部分に融合したプロテアーゼ遺伝子の一部分を含んで
いる。
プラスミドｐｖ−ｏａｑ５の形成は、ｐＶ−ｑａ（１４
と同様な２段階法を用いて行なわれた。ＤＳＳ−５の５
マイクログラムを制限酵素３ＳｔｌおよびＢ（Ｉｔ狂で
消化サセタ。ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ　Ｑａｇ配列を含む１
．４２ｋｂＤのフラグメントを単離し、１％ＬＭＰ寒天
ゲル上で精製し、そして５ｓｔｔおよびＢｇｌ［部位で
プラスミドＤＩＣ１９Ｒに挿入した。Ｂ（＋ｌＩ［部位
におけるｇａｇ配列のｐＥＣ１９Ｒ上の相当部位への連
結は、（ａ）　ｇａｇ読み取り枠と同相の停止コドンの
発生および（１））多重クローニング部位プラスミド上
の隣接するＥＣｏＲＩ部位に対するＢ（１１１［の並置
状態を可能にする。ついで、この中間形成物は、Ｔｈａ
ＩおよびＥＣ０ＲＩで消化された。ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ
ＩＩＱａＱ配列を含む１．３９ｋｂｐの７ラグメントを
精製し、５ＩＩＩａＩおよびＥＣＱＲＩ部位でプラスミ
ドｐＧｓ６２に連結させた。得られるプラスミドである
ｐｖ−ｇａｇ５は枠内翻訳停止配列に連結したＣＪａＱ
（ＢＱ１１Ｉ部位まで）のコード化配列の全てではない
が大部分を含んでいる。
（７，２，キメラＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　（ｌｌａＵ
遺伝子を含む組換え型ワクシニアウィルスの形成） プラスミドベクターｐｖ−ｏａｏｌ、　ｐｖ−ｇａＱ２
．　ＤＶ−ＤａＱ３゜ｐｖ−ｇａｇａおよびｐｖ−ｇａ
ｇ５からワクシニアウィルスグノムへのキメラＬＡＶ／
ＨＴＬνｍ　ｐａｐ遺伝子の挿入は、ｖ−ｅｎｖ５ｆ３
よびＶ−ｅｎｖ２の形成に用いられたのと同じ方法で行
なわれた（５．３項参照〉。以下の実施例において、す
べての組換え型ウィルスは、プラーク精製したニューヨ
ーク・シティ・ボード・オブ・ヘルス株（ＮｅＷ　Ｙｏ
ｒハＣ１ｔｙ　Ｂｏａｒｄ　ｏｒ　Ｈｅａｌｔｈ　５ｔ
ｒａｉｎ）（ｖ−ＮＹ、第５．１．１節参照）により形
成させた。
ＴＫ−組換え体が選択され、そして次の特定化に使用さ
れるウィルス株に増殖する前に３回プラーク精製を行な
った。０Ｖ−ＱａＱｌ、ρＶ−ｇａ０２．　ｐｖ−ｇａ
ｇ３．　ｐｖ−ＱａＱｌおよびｐｖ−ｇａｇｓから誘導
された組換え型ウィルスは、それぞれｖ−ｐａｐｌＮｙ
、　ｖ−ｐａｐ遺伝子、　Ｖ−Ｑａ０３ＮＹ、　Ｖ−Ｑ
ａＱ４ＮＹおよびｖ−ｏａｐ５ＮＹとして呼称された。
（７，３，組換え型ワクシニアウィルスにより感染され
た組織培養細胞におけるＩＡν／ＨＴ［ｖｍｇａΩ関連
タン関連タンパクシ 上記キメラＬＡＶ／）ＩＴＬＶｍ　ｐａｐ遺伝子を負う
組換え型ワクシニアウィルスは、組織培養における細胞
の感染においてＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　（ＪａＱ関連
タンパク質を発現し得る。これらの組換え体のいくつか
は、前駆体ＱａＱタンパク質であるｐ５５を成熟タンパ
ク質ｐ２５およびｐ１８にプロセッシングすることがで
きる。これらのタンパク質は、ＡＩＤＳ患者血清および
／またはＱａＱタンパク質ｐ２５および１）１８に対す
るモノクローナル抗体に対して免疫活性であることが見
出された。
６０＃デイツシユ中の集密的Ｂ５Ｃ−４０１Ｉａ胞は、
１ＱＩｌｌＯｉ（感染多重度）で別型ワクシニアウィル
ス（Ｖ−ＮＹ）によりあるいはその組換え誘導体である
Ｖ−ＱａＱｌＮＹ、　Ｖ−ＱａＱ２ＮＹ、　Ｖ−ＱａＱ
３ＮＹ、　Ｖ−ＱａＱ４ＮＹまたはｖ−ｇａｇ５ＮＹで
感染された。感染は１２時間進行し、その時点で該細胞
は回収され、ＰＢＳで１回洗浄され、かつ遠心して集め
られた。感染細胞ペレットは、０．３ｍのラエムリ（ｔ
ａｅｍｌｉ）試料緩衡液に再懸濁させ、かつ４分間煮沸
して溶解させた。
２０μｍの細胞溶解物中の全細胞タンパク質は、１５％
　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分
解された。精製されたＬＡＶ／肘［シウィルス粒子の試
料および模凝感染細胞溶解物のアリ」ットは比較対照と
して含められた。
ゲルの内容物は、ニトロセルロースフィルターのシート
に電気移転した。最初該ノイルターはＡＩＤＳ患者血清
であるいはｇａｇタンパク質ρ２５およびＩ）１８に対
するモノクローナル抗体の組合わせのいずれかと反応し
た。強く洗浄したのち、フィルターは、患者血清が使用
された場合には、アルカリホスフォターゼ接合（ＡＰ−
接合）ヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体、またはマウスモ
ノクローナル抗体が使用された場合にはＡＰ−接合ヤギ
抗マウス免疫グロブリン抗体のいずれかと反応する。第
１および第２の抗体反応および洗浄の条件は第５．４．
１節に記載したとおりである。
第２の抗体反応後の最終洗浄は、０．１Ｍ　　ＮａＣ１
および５ｍＭＭＱＣＩ２を含む０．１Ｍトリス（ｐＨ９
，５＞中で行なわれた。フィルター上の抗原に結合した
抗体は、該フィルターを０．１Ｍのトリス（１）Ｈ９，
５）　、０．１　ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣ１２，
０，３３〜／威のブロモクロロインドリルホスフェート
および０．１７ｆｆｉｇ／ｄのニトロブルーテトラゾリ
ウムを含有する溶液と反応させることにより検出された
。フィルターを色原体と反応させたのち、これらは水洗
いされ、空気乾燥されかつ撮影された。
この分析の結果を第２１図に示す。組換え体Ｖ−ｇａｇ
ｌＮＹおよびｖ−ｑａａ２ＮＹは完全ｇａｑおよびプロ
テアーゼ遺伝子を含んでいる。これらの組換え体は、Ｌ
ＡＶ／ＨＴＬＶ　Ｉｕ　ノ主要タンハク質であるＩ）５
５，９４０゜１）２５およびＣ１８と同時移動する、し
＾Ｖ／旧ＬＶＩ関連タンパク質のひとつの科（ｆａｍｉ
　ｌｙ）を発現した。
これらのタンパク質は、ＡＩＤＳ患者血潰（第２１８図
）および９２５および１）１８に対するマウスモノクロ
ーナル抗体（第２１Ａ図）の両者と免疫反応性である。
組換え体ｖ−ａａａ３ＮＹは、ｑａｇおよびプロテアー
ゼ遺伝子の両者を含有するが、そのポル読み取り枠はワ
クシニアＴＫ遺伝子のカルボキシ末端部分と相中で連結
されている。ｖ−ｇａｇ３ＮＹも初代のＱａＱ遺伝子信
子ρ５５を発現できる。しかしながら、Ｖ−１１１８０
３ＮＹで感染した細胞溶解物中のｐ５５に対してＣ２５
および１）１８は少ないので、ｐ５５のプロセッシング
はＶ−ＱａＱＩＮＹおよびｖ−ｇａｇ２ＮＹよりもより
不十分なものと思われる。組換え体Ｖ−Ｃ）ａＱ４ＮＹ
は、完全ＣＪａＱ遺伝子を含むが、プロテアーゼ遺伝子
の１部分のみが含まれる。それは、サイズにおいてρ５
５と同様なＬＡＶ／ＨＴＬシｍ関連タンパク質を合成し
た。組換え体ｖ−ｇａｇ５ＮＹはＱａＱ遺伝子の部分の
みを含み、４３ＫＤの先端の切断されたタンパク質を発
現した（第２１Ｃ図）。Ｖ−ｇａｇ４ＮＹおよびｖ−ｇ
ａｇ５ＮＹの両者はそれらの初代ｆＪａＱ関連タンパク
質を十分にプロセッシングしないように見えたが、それ
らの産物はρ２５およびρ１８に対するモノクローナル
抗体に対して免疫反応する。
要約すれば、そのプロセッシング能力（違いがあるとは
いえ、五つの組換え体は、ＬＡＶ／）ＩｒＬＶＩＩＩコ
アタンパク質の主要なエピトープを含む免疫反応性−２
１１＝ タンパク質を発現し得る。
（８，実施例：バキユロウイルスエンベロープ組換え体
） 以下の実施例において、プラスミドベクターは、ＡｃＮ
ＰＶの転写制御配列に関して下流に位置するＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶｕｌエンベロープコード化配列よりなるキメラ遺
伝子を含むものが形成される。ＡｃＮＰＶポリへドリン
プロモーターおよびＬＡＶ／ＨＴＬＶ■エンベロープコ
ード化配列を含むキメラ遺伝子は、生体内組換えにより
、ＡｃＮＰＶのゲノムに挿入された。組換え型ウィルス
は、同定されかつ精製され、そしてウィルス株は感染ｗ
ｉ胞上澄みから調製した。免疫反応性ＬＡＶ／旧ＬＶＩ
［［エンベロープ関連タンパク質は、試験管内で組換え
型バキユロウイルスにより産生きれることが示された。
本発明の本実施態様における各段階の詳細な記載は、次
の分節に提示されている。本実施態様で使用される一般
的な方法は、第６．１節に記載されているとおりである
。
（８，１、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ遺伝子
のコード化配列に連結したＡｃＮＰＶプロモーターを含
むプラスミドベクターの形成） ＬＡＶ／肘ｔｖＢエンベロープコード化配列は、エンベ
ロープ関連タンパク質を発現することが示された組換え
型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ５の形成に使用された
ρｖ−ｅｎｖ５　（第５．３節参照）から精製された。
ｐｖ−ｅｎｖＳ中のエンベロープコード化域は、５°近
位の未翻訳配列の９６塩基対および３“近位の未翻訳配
列の２２３塩基対とともに、両端の旦ａｍＨ１部位によ
り接せられた。このプラスミド（丙部旦堕ＨＩ部位をも
含む）の制限酵素旦ａｍ）ｌ　ｌによる部分消化は、Ｌ
ＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ特異配列のみを含む２．９ｋｂｐ
の７ラグメントを発生した。このフラグメント（約０．
５μ３）を１％ＬＭＰ寒天グルにより分解し、そしてこ
れから精製させ、かつ予め３μｍ）−１１で線状化し、
ＣＩＡＰで処理された０、５μｇのプラスミドベクター
１）Ａｃ６１０に連結させた。
この連結混合物は、エシェリキア・コリ株ＨＣＩ　００
０に形質転換させるために使用され、そしてアンピシリ
ン抗生コロニーが選択された。個々の被形質転換体から
のプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ハ、ＬＡＶ／１−ＩＴＬＶＩ
ＩＩ　エンベロープ配列（すなわち１．βａｍＨＩ消化
による２、３ｋｂｐおよび０．５４ｋｂｐのフラグメン
トの発生）の存在および挿入物の配向に試験された。
正しい配向に挿入されたＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩ［エンベ
ロープ配列を有するプラスミドは精製されかつｐＡｃ−
ｅｎｖ５と定義された。この構造は第２２図に画かれて
いる。
（８，２，キメ７ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ
遺伝子を含む組換え型バキュロウィルスの形成）キメラ
しＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ遺伝子のへＣＮＰ
Ｖゲノムへの挿入は、第６．３節に説明したように生体
内組換えにより達成される。ＡｃＮＰＡ　　　ＤＮＡ（
ＩＪＩｌｇ）ｌ）Ａｃ−ｅｎｖ５　　　ＤＮＡ（５ｍｇ
）および仔つシ胸線ＤＮＡ（１５１１１ｇ）のＳｆ９細
胞へのトランスフェクションは、同筒に記載の方法によ
り行なわれた。４ｄの完全培地λこよる２８℃での五目
間のインキ１ベーシヨン後、上澄みを集め、ｉｏｏｏｘ
ｇで１０分間清澄化した。このウィルス株をｓｆ９細胞
上で力価測定を行ない、組換え型ライルスが最初にサマ
ース、エム、ディ、およびスミス、ジー、イー、（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ、）］、Ｄ、ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｇ、Ｅ、
）のプラークハイブリッド形成検定法により、次のとお
り同定された。
５ｆ９１１１１胞を血清を含まないＴＮＭ−Ｆｌ−（培
地中の２．５Ｘ１０６細胞／プレートの密度で６０Ｘ１
５＃の培養プレート上に接種した。細胞を付着させたの
ち、培地を除去し、１ｍｌの希釈ウィルス接種物を各プ
レートに添加した。２７℃での１時間のインキュベーシ
ョンの終期に全接種物を各プレートから除き、４或のＬ
ＭＰ寒天オーバーレイを徐々に各プレートの縁部に加え
た。オーバーレイが固化したのち、プレートを湿ｎＭ境
下に４〜６日問あるいはプラークがうまく形成されるま
でインキュベーションを行なった。ついで、プレートを
非混測環境下に一夜あるいはそれ以上放置して乾燥を行
なった。充分乾燥したら、寒天オーバーレイを除去し、
プレート上に残存する細胞の上に乾燥したニトロセルロ
ースフィルターを置いた。４７ｍの円形の小ワツトマン
（Ｗｈａｔｍａｎ＞　３　ＭＭ紙を溶液Ａ　（０，０５
）１のトリス−ＨＣｌ、ｐｌ−１７，４，０，１５Ｈの
ＮａＣ１）で飽和させ、プレート上のニトロセルロース
フィルターの上に置いた。プロッティング後、該ニトロ
セルロースフィルターを注意しながら除去し、溶液Ｂ（
０，５ＨのＭａｉｌ、　１．５８のＮａＣｌ　）で飽和
させた小ワツトマンフィルター上に置いた（細胞側上）
。２〜３分間後に該ニトロセルロースフィルターをペー
パータオル上で空気乾燥し、溶液Ｃ（１，ＯＭのトリス
−ＨＣｌ、　ＤＨ７，４，１，５）１のＮａＣｌ　）で
飽和させた小ワツトマンフィルターに移した。２〜３分
間後（、ニトロセルロースフィルターをペーパータオル
上で空気乾燥し、溶液Ｄ（０，３）１のＮａＣ１゜０．
０３）１のクエン酸ナトリウム〉満たしたペトリ皿中に
ゆるやかに浸漬して洗浄した。ついで、ペーパータオル
上で除去し乾燥し、真空中で２時間にわたって、８０’
Ｃ焼成した。このフィルターをプローブとして３２ｐ−
標識化１）ＲＳ　−３にハイブリッド化した。組換え型
ウィルスを取出し、ｓｆ９細胞上で再び力価測定を行な
った。これらは、３回以上プラーク精製されそして、次
の研究用のウィルス株の調製に使用された。
（８，３，組換え型バキュロウィルスＡｃ−ｅｎｖ５に
より感染された組織培養細胞（おけるＬＡＶ／ＨＴＬＶ
Ｉエンベロープ関連タンパク質の発現） キメラＬＡＶ／）ｌＴＬＶｍエンベロープ遺伝子を負う
組換え型Ａｃ　ＮＰＶは、組織培養内の細胞の感染にお
いて［Ａシ／ＨｒＬＶｍエンベロープ関連タンパク質を
発現し得ることが示された。これらのタンパク質は、Ａ
ＩＤＳ患者血清と、まｔ：　ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　
エンヘロープ糖タンパク質（Ｉｔ）１１０および１１１
１）４１を限定するモノクローナル抗体と免疫反応する
ことが見出された。
１００ｍのディツシュに接種されたＳｆ９細胞（１ＸＩ
Ｏ７）は、５ｍｏｉで野生型ＡｃＮＰＶまたはそのＩ！
１換え体Ａｃ−ｅｎｖ５で感染させた。感染後、２８時
間で、この＠地は、血清追補物を有しないメチオニン非
含有培地で置換えられ、３０分間インキュベートされた
。この期間後、この培地を１００μＣ１／Ｉｎ！！の［
３５Ｓコメチオニンを含有するメチオニン非含有＠Ｊｔ
！１２ｍ１で置換え、そして標識化を２８℃で２時間行
なった。標識化の終期に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、
第５．４．２節に記載したように１ｄの溶解後緩衝液中
に再懸濁させた。免疫沈降を、ＡＩＤＳ患者血清ならび
にＱＤｌｌｏまたはＱＤ４１に対するマウスモノクロ−
太ル抗体を用いて第５．４．２節に記載したように行な
った。
第２３図に示すように、この分析結果は、組換え型ウィ
ルスＡｃ−ｅｎｖ５が１５０ｋＤの１種のＬＡＶ／旧Ｌ
ＶＩＩＩエンベロープ関連タンパク質を申越的に合成し
たことを示している。ワタシニア組換え体Ｖ−ｅｎｖ５
により合成され、かつＡＩＤＳ患者血清ならびにＱｌ）
１１０および０ｐ４１に対するモノクローナル抗体と免
疫反応性であるＱＤ１５０と同時移動するので、このタ
ンパク質はグリコジル化前駆体エンベロープタンパク質
ｇ０１５０を表わす。この分子のプロセッシングは、２
時間の標識化期間にｇｏｌｌｏまたは（ＩＩ）４１が検
出されなかったので、効果的ではない。しかしながら、
ＱＤＩ　１０およびｇ＋）４１の両者の主要なエピトー
プが該前駆体に存在するので、このタンパク質は診断剤
としてまた免疫剤として価値がある。
（９，微生物の寄託） 表示したプラスミドを担持する下記のエシェリキア・コ
リ株は、アメリカ合衆国イリノイ州ペオリア（ＰｅＯｒ
ｉａ）のアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・
コレクション［Ａｇｒｉｃａｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＮＲ
ＲＬＨに寄託され、かつ下記の寄託番号が付されている
。
エシエリキ　　株　プラスミド　寄託番号ア・コリ に１２．　　　　ＨＣｌ００Ｏｐｖ−ＥＮＶＩ　　ＮＲ
ＲＬ　Ｂ−１８００３に１２．　　　　　　　　ＨＣｌ
００Ｏｐｖ−ＥＮＶ２　　　　ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８０
０４に１２．　　　ＭＣ１００Ｏｐｖ−ＥＮＶ５　　Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−１８００５に１２．　　　　　　　　ＨＣ
ｌ００Ｏｐｖ−ＥＮＶ７　　　　ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８
１１０に１２．　　　　　　　　ＨＢＩＯＩ　　　　　
１）Ｖ−（Ｊａ（１１ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１１１に１
２．　　　　　　　　ｔｔＢｌｏｌ　　　　　ｐＡｃ−
ｇａｇｌ　　　ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１０５に１２．　
　　ＮＦ１８２９　　ｐＡｃ−ｅｎｖ５　ＮＲＲＬ　Ｂ
−１８１０９下記の組換え型ウィルスは、アメリカ合衆
国メリーランド州ロックウィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）
のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ａｃｔｉｏｎ）に寄託され、かつ下記の寄託番号が付さ
れている。
組換えウィルス　　寄　託　番　号 ｖ−ｅｎｖ２　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ
ＣＶＲ２１１４ｖ−ｅｎｖ５　　　　　　　ＡＴＣＣＶ
Ｒ２１１３ｖ−ｅｎｖ７　　　　　　　　　　　　　　
　　ＡＴＣＣＶＲ２１４８ｖ−ｅｎｖ５ＮＹ　　　　　
　　　　　　　　　ＡＴＣＣＶＲ２１４９ｖ−ｇａｏｌ
ＮＹ　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣＣＶＲ２１５
０Ａｃ−ｇａｏｌ　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴ
ＣＣＶＲ２１４７Ａｃ−ｅｎｖ５　　　　　　　　　　
　　　　　ＡＴＣＣＶＲ２１５１寄託された具体例は本
発明の一面の単なる説明を目的とするものであり、かつ
機能的に同等であるいかなる微生物ないしウィルスも本
発明の範囲内であるから、本発明は寄託された微生物な
いしウィルスによりなんらその範囲を限定されるもので
はない。事実、ここに示しかつ記載したこの他に本発明
の種々の変更は、前記記載および添付図面から当業者に
とって明白となる。このような変更は添付の特許請求の
範囲の範囲内に該当することが意図されている。
ヌクレオチドに与えられているすべての塩基対のサイズ
はおよそであり、かつ記述のためであることも理解され
るべきである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩの完全なプロウィルスゲ
ノム構造を表わすものである。斜線の範囲は読み取り枠
の領域を示すものである。群特異性抗原、逆転写および
エンベロープタンパク質をコード化するこのような領域
は、それぞれｇａｇ、ｐｏｔおよびｅｎｖと呼称される
。重複する読み取り枠は、交差斜線の範囲で示される。 数字は、ウィルス転写が始まる先端部位［ＣａｐＳｉｔ
ｅ］より下流の塩基対数に関するものである。制限部位
は以下のように印さ第２図は、プラスミドｐＲ８−３Ｄ
ＮＡ中に存在するＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ特異領域（旦
亜Ｒ１から旦打Ｉまで）のヌクレオチド配列を表わすも
のであり、完全ＬＡＶ／肘ＬＶＩＩＩエンベロープ遺伝
子（ヌクレオチト５７６Ｂ番カラ８３４．９番マチ）カ
、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ挿入物内に含まれている。ｐＶ−
ｅｎｖｌ　、ρｖ−ｅｎｖ２．およびｐｖ−ｅｎｖ５の
形成に用いられた制限部位が示されている。 エンベロープ遺伝子の完全アミノ酸配列が、ヌクレオチ
ド配列データから推論されるように、また示される。 第３図は、ワクシニアウィルスプロモーターより下流に
挿入された、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープタン
パク質コード化配列の一部を含むプラスミドの形成の図
解的表示である。ＬＡＶ／ＨＴＬＶｕｌエンベロープコ
ード化配列は、空白枠で表わされ、そしてワクシニアプ
ロモーターは影付は棒で表わされる。 ワクシニアプロモーター領域と［＾Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩ
エンベロープコード化配列の連結点でのヌクレオチド配
列は、図面のより下部に示される。下線付された配列は
、該キメラ遺伝子に関する推定開始コドンおよび解読枠
を示す。組換え体ｐＶ−ｅｎｖ２の翻訳された配列（Ｐ
ｒＯ−Ｖａｌ　）における第３番目および第４番目のア
ミノ酸は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩエンベロープコード化配
列のアミノ酸番号４３番および４４番に−−２２２一 致することに留意せよ。 第４図は、ワクシニアウィルスプロモーターより下流に
挿入された完全ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープタ
ンパク質を含むプラスミドの形成の図解的表示である。 ワクシニアウィルスプロモーターは、影付は棒で表わさ
れる。完全［Ａシ／ＨＴＬＶＩエンベロープコード化領
域を含むプラスミドｐｖ−ｅｎｖ５は、二段階において
形成された。該コード化領域の５°および３°部分は、
最初にＤＧＳ２０中へ別々にクローン化され、ＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ遺伝子の７ミノコード化末
端を含むｐｖ−ｅｎｖｉおよびＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ
エンベロープ遺伝子のカルボキシルコード化末端を含む
ｐｖ−ｅｎｖ２が形成された。これらの２つの部分は、
示されるように５ｔｕＩ部位で再連結された。 第５図は、ワクシニアウィルスプロモーターより下流に
挿入された、トランスメンブラン（アンカー）配列を欠
りＬＡＶ／旧ＬＶＩエンベロープタンパク質コード化配
列を含むプラスミドの形成の図解的表示である。プラス
ミドｐｖ−ｅｎｖ７は、二段階において形成された。ｐ
ｖ−ｅｎｖ５の５°部分がＤ２６中へ挿入され、先端を
切られたｅｎｖ遺伝子をもたらす枠内翻訳末端配列（丁
ＡＡ）を提供するところの中間体プラスミドであるｐｖ
−ｅｎｖ５／２Ｂが形成された。 丁ＡＡで終わる先端を切られた８ｎＶ配列は、次にρＧ
２０中へ挿入され、先端を切られたｅｒｌＶ遺伝子がワ
クシニア丁に遺伝子配列で側面を接されるｐｖ−ｅｎｖ
７が形成された。 第６図は、組換え型ワクシニアウィルスに関する形成お
よび選択を表わすものである。中黒棒は、ワクシニアウ
ィルスのチミジンキナーゼ（丁Ｋ）遺伝子を表す。この
ＴＫ遺伝子はプラスミドｐｖ−ｅｎｖｓＤＮＡ中にも存
在するが、プラスミド中においてはＴＫ遺伝子は、ワク
シニア７．５にプロモーター（影付は棒）およびＬＡＶ
／ＨＴＬシ■エンベロープコード化遺伝子（空白枠）か
らなるキメラ遺伝子によって、中断されている。細胞が
、ワクシニアで感染された後、ＬＡＶ／ＨｒＬＶＩエン
ベロープ遺伝子で中断されたＴＫ遺伝子を含む組換え型
プラスミドは、感染細胞中へ導入される。キメラ遺伝子
に側面より接するＴＫ遺伝子において生起する組換えは
、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロープ遺伝子をツクシ
ニアウィルスグノム中へ導入する。ＬＡＶ／ＨＴＬシ■
エンベロープ遺伝子を含む得られた組換え型ウィルスは
ＴＫ−である。 第７図は、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ遺伝子を含
む組換えｅｎｖ５および叶ｅｎｖ５ＮＹ、ならびにそれ
ぞれの親ワクよって生み出されたＤＮＡフラグメントは
、アガロースゲルにおける電気泳動によって分解され、
そしてバンドを視識化するために臭化エチジウムで着色
された。第７Ｂ図は、分解された制限フラグメントのニ
トロセルロースへの移動およびしＡＶ／ＨＴＬＶＩ［ｌ
エンベロープ配列に特異的なニック翻訳プ第８図は、ワ
クシニアーＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ組換え源か
らのタンパク質が、７〜１５％勾配５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルにおいて分解され、そしてニトロセルロー
ス紙へ電気的に移送された：ＬＡＶ／）ＩＴＬＶＩＩＩ
　ｅ　リ、ｔ　ンタンパク質（ＬＡＶ／肘ＬＶＩＩ））
；野生型ワクシニアウィルス感染細胞（訂ＶＶ）　；未
感染細胞（模凝）；組換え型ウィルスｖ−ｅｎｖ２によ
って感染された細胞（ｖ−ｅｎｖ２）あるいは組換え型
ウィルスｖ−ｅｎｖ５によって感染された細胞（ｖ−ｅ
ｎｖ５）。 ＡＩＤＳ患者血清に対し免疫反応性であるタンパク質は
、抗ヒトＨＩＧ抗体に複合されたペルオキシダーゼの作
用によって検知された。ＬＡＶ／）ＩＴＩＶｅｎｖ　Ｍ
伝子産物は、Ｏｐｌ　５０．　ＱＤｌｌ　０およびｇｐ
４１として示される。分子Ｍ基準はキロドルトンにて表
わされる。 第８Ｂ図は、２つの細胞型におけるワクシニア−［ＡＶ
／ＨＴＬＶＩＩＩ　ｅｎｖ組換え体によって発現された
タのいづれかより誘導されたタンパク質は、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドグル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に
よって分解され、そしてニトロセルロース紙に電気的に
移送され、ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ血清陽性個体からの貯蔵
血清と反応させられた：レーン１および５は模凝感染細
胞を表わし；レーン２および６は野生型ワクシニアウィ
ルスで感染された細胞を表わし；レーン３および７はｖ
−ｅｎｖ５で感染された細胞を表わし；そしてレーン４
および８はｖ−ｅｎｖ２で感染された細胞を表わす。免
疫反応性タンパク質は、１２５Ｉで標識されたプロティ
ンＡを用いて検知された。ＬＡＶ／旧ＬＶ■ｅｎｖｙ伝
子産信子、ＤＩ）１５０ＳＱＤ１１０およびＱＤ４１と
して示される。 第９Ａ図は、野生型ワクシニアウィルス（ＷＴｖｖ）あ
るいは組換え型ワクシニアウィルス（ｖ−ｅｎｖ２およ
びｖ−ｅｎｖ５　”）のいずれかで感染された細胞にお
い１０〜１２時間で３５３−メチオニンを用いて標識さ
れた。細胞溶解物中の標識化タンパク質は、対照ヒト血
清（Ｎ）あるいはＡＩＤＳ患者血清（１）のいずれかと
反応され、そして免疫複合体が、スタフィロコッカス・
アウレウス　プロティンＡにより沈降させ４れた。免疫
沈降されたタンパク質は１５％　５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルにおける電気泳動によって分解され、そして
フルオログラフィーによって検知された。分子量はキロ
ドルトンで示される。 第９６図は、本発明のワクシニア−しＡＶ／ＨＴＬＶＩ
ＩＩ組換え体によって発現された３Ｈ−グルコサミン（
レーン１および５）あるいは、野生型ワクシニアウィル
ス（レーン？および６）、Ｖ−ｅｎｖ５　（レーン３お
よび７）もしくはｖ−ｅｎｖ２　（レーン４および８）
で感染され、そして３日−グルコサミンで標識された。 細胞溶解物は正常ヒト血清（レーン１〜４）あるいはＩ
ＡＶ／肘［ｖｍ血清陽性個体からの貯蔵血清およびプロ
ティンＡと免疫沈降された。免疫沈降されたタンパク質
は５ＤＳ−ＰＡＧＥで分解された。 第９Ｃ図は、ワタシニアーＬＡＶ／肘ＬＶＪＩＩ組換え
体によって発現されたＬＡＶ／ＨＴＬＶＭエンベロープ
タンされるように野生型ワクシニアウィルス、ｖ−ｅｎ
ｖ５またはｖ−ｅｎｖ２で感染され、３５Ｓ−メチオニ
ンで標識され、そして追跡培地で洗浄された。以下の時
間間隔で、細胞は、洗浄され、溶解され、そしてＬＡＶ
／肘ｔｖ■血清陽性個体からの貯蔵血清で免疫沈降され
、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分解された二〇時間（レー
ン１，７．１３）　　；　Ｑ、５時間（レーン２゜８．
１４）　、１ｖＩｆＪ　（Ｌ／−ン３，９．１５）；２
時ｍ（Ｌ／−ン４、１０．１６）、１間（レーン５．１
１．１７）および１２時間（レーン６、１２．１８）。 レーンＭは１４Ｃ標識化分子量標準からなるマーカーを
表わすものである。 第９Ｄ図は、本発明の組換え型ワクシニア−しＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩＩウィルスで感染された細胞からの細胞中お
よび培地中に見い出されるしＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩエン
ベ（レーン１）、あるいは野生型ワクシニアウィルス（
レーン２）、ｖ−ｅｎｖ５　（レーン３）もしくはｖ−
ｅｎｖ２（レーン４）で感染され、そして３５ｓ−メチ
オニンで標識された。細胞は培地から分＠され、そして
溶解された。細胞溶解物（ペレット）および培地（スー
プ）はそれぞれ、ＬＡＶ／Ｈ且Ｖ［ｌ血清陽性個体から
の貯蔵血清を用いて免疫沈降された。免疫沈降されたタ
ンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥで分解された。 第９Ｅ図は、本発明の組換え型ワクシニアＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶ［ｌウィルスで感染されたｌ１ｌｌ飽からのＩｌｌ
胞中おある。組換え体ｖ−ｅｎｖ５は、完全ＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶ■エンベロープコード化配列を含むものであり、
一方、Ｖ−ｅｎｖ７は、トランスメンブラン（アンカー
）配列の欠失したしＡＶ／ＨＴＬＶＩ［ｌエンベロープ
コード化配列を含むものである。ｌ−１ｅｌａ　＠胞は
、模擬感染（レーン１）あるいは、野生型ワクシニアウ
ィルス（レーン２）、ｖ−ｅｎｖ５　（レーン３）もし
くはＶ−ｅｎｖ７　（レーン４）で感染され、そして３
５ｓ−メチオニンで標識された。細胞は培地から分離さ
れ、そして溶解された。細胞溶解物（ペレット）および
培地（上澄み液）はそれぞれ、ＬＡＶ／肘［ｖ■血清陽
性個体からの貯蔵血清を用いて免疫沈降された。免疫沈
降されたタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥで分解された。 第１０図は、ワクシニア−ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ組換
え型クシニアウィルスで免疫処置された。８週間後、血
清試料は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分解されそしてニ
トロセルロース紙へ電気的に移送されたものである［Ａ
Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩピリオンタンパク質と反応させられ
た。アルカリホスファターゼに複合されたヤギ抗マウス
免疫グロブリンが、マウス血清によって５忍識されたこ
れらの［Ａν／）Ｉ丁ＬＶｍタンパク質を検知するため
に用いられた。レーンａ−ｅは、ｖ−ｅｎｖ５を接種さ
れた５匹の個々のマウスからの血清試料を表わし、レー
ンｆ−ハはｖ−ｅｎｖ２を接種された５匹の個々のマウ
スからの血清試料を表わす。 ＬＡＶ／ＨＴＬν■血清陽性個体からの貯蔵血清（ＡＩ
ＤＳ）および未免疫処置Ｃ５７Ｂ１６．Ｊマウス（Ｎ）
Ｉｓ）が、それぞれ陽性および陰性対照として用いられ
た。 ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ　ｘ　ンヘｏ−プ糖タンパク質！Ｉ
Ｉｐ１５０、ｏｐｌｌｏおよび（ＪＤ４１の位置は示さ
れる。 第１１図は、組換え型ワクシニアウィルスＶ−ｅｎｖ５
で予防接種された短尾猿の血清転化を表わすヒストグラ
ムである。４匹の猿は、Ｖ−ｅｎｖ５の２Ｘ１０１）ｆ
ｕで、および４匹は２Ｘ１０７ｐｆｕで皮膚乱刺により
接種された。１匹は、対照であるワクシニア−単純ヘル
ペス００組換え体（Ｖ−Ｈ３ＶＩＩＩＤＩ　）の２Ｘ　
１０７ｐｆｕで接種された。初回接種の１０週間後に、
Ｎｏ、８１を除くすべての動物が、同じウィルスの２Ｘ
　１０８ｐｆｕの２次接種を受けた。 血清試料は、接種前（空白捧）；初回接種の４週間後（
斜線付けされた棒）：および２次接種の４週間後（中黒
捧）に集められた。血清転化は、標的抗原として精製Ｌ
ＡＶ／旧ＬＶＩＩＩピリオンを用いてＥＬＩＳＡによっ
て検定された。 第１２図は、第１１図に述べたと同様にワクシニア−Ｌ
ＡＶ／肘ｔｖｍ組換え型ウィルスｖ−ｅｎｖ５で予防は
、初回接種前（レーンｐｒｅ）および２次接種後４週間
目に集められた。血清のアリコツトは、５０倍【こ希釈
され、そして５ＤＳ−ＰＡ、ＧＥによって分解され、さ
らに２つのエンベロープ糖タンパク質ＱＤ１１０　（第
１２Ａ図）およびＱρ４１（第１２Ｂ図）の最適な検知
を与えるための定形式を用いて電気的に移送することに
よりニトロセルロースフィルター上に固定化されたＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶＩピリオンタンパク質と反応させられた。 短尾猿血清によって認識された［へＶ／Ｈ丁ｔｖ１１は
、アルカリホスファターゼに接合されたヤギ抗ヒト免疫
グロブリンによって検知された。ＬＡＶ／旧［ｖ■血清
陽性個体からの貯蔵血清（ＡＩＤＳ）が、陽性対照とし
て用いられた。真正ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　ヒリ、ｔ
　ン（ＡＩＤＳ）　ハ、比較対照トＬ／Ｔ操作された。 第１３図は、”）　’）　シニ、ｉ’ＮＹ−ＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶＩＩＩ組換え型ウィルスＶ−ｅｎｖ５ＮＹで免疫
処置されたチンパンＶ−ｅｎｖ５ＮＹの５Ｘ１０”で皮
肉的に接種され、一方１匹の動物は、同じ親ワクシニア
ーＮＹ株から形成されたワクシニア−単純ヘルペスｇＤ
組換え体であるｖ−Ｈ３ＶｇＤＩＮＹの同じ投与量で接
種された。すべての動物は、初回接種の８週間後に２次
接種を受けた。血清試料は、接種前（レーン１）、初回
免疫処置８週間後（レーン２）および２次免疫処置２週
間後（レーン３）に集められた。血清のアリコツトは、
５０倍に希釈され、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分
解され、ざらにＱρ４１の最適検知をもたらす定形式を
用いて電気的に移送することによってニトロセルロース
フィルター上に固定化されたＬＡＶ／ＨＴＬＶＪＩＩピ
リオンタンパク質と反応させられた。チンパンジーによ
って認識されたＬＡＶ／Ｈ丁Ｌシ■タしパク質は、アル
カリホスファターゼに接合されたヤギ抗ヒト免疫グロブ
リンによって検知された。ＬＡＶ／ＨＴＬＶＩ血清陽性
個体からの貯蔵血清（ＡＩＤＳ）が、陽性対照として用
いられた。 第１４図は、プラスミドρＫＳ−５ＤＮＡ中に存在する
ＬＡＶ／肘ｔｖＢ特異領域（ＳＳｔＩからに凹Ｉまで）
のヌクレオチド配列を表わすものであり、完全ＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩ　ＱａＱ遺伝子（ヌクＬ／オチト３４０
１ｉカラ１８３５１ｔ　マｒ　）　４．１：、ＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩＩ挿入物中に含まれる。ｐＡｃ−ｇａｇｉ
の形成において用いられた制限部位が示される。該ヌク
レオチド配列データから推定されるような、ＱａＱ遺伝
子の完全アミノ酸配列がまた示される。 第１５図は、へｃ　ＮＰＶプロモータより下流に挿入さ
れたＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　（ｌａｇタンパク質コー
ド化配列を含むプラスミドｐＡｃ−ｇａｇｔの形成の図
解的表示である。ｐＡｃ６１０クローニングベクターは
、ポリヘトリン遺伝子プロモーターに相当するヌクレオ
チド配列を含み、そして転写開始部位より下流に位置す
るクローニング部位によって中断された５゛リ一ダー配
列および３゛ポリヘトリン配を含有する一８番の位置で
のクローニング部位は、ＥｃｏＲＩ　、　５ｓｔＩ　、
　ＳｍａＩ　　（ＸｍａＩ　）　、ＢａｍＨＩ、Ｋ堕Ｉ
および２即Ｉである。旦酊Ｉ、Ａ匹Ｉおよび）ｌｉｎｅ
ｌＩは非反復ではない。Ｋ　ｐｎ　Ｉもしくは旦ｇＨｃ
関する部位は存在しない。 第１６図は、組換え体Ａ　ＣＮ　Ｐ　Ｖ　（Ａｃ−ｐａ
ａｌ　）に関する形成および選択を図解的に示すもので
ある。 影付は棒は、ポリへドリンプロモーターおよび５゜リー
ダー配列を示す。中黒棒は、バキュロウィルスのポリヘ
トリン遺伝子を表わす。この遺伝子の１部は、ＬＡＶ／
ＨＴＬＶＩＩ　ｇａｐコー　ト化領域（空白捧）によっ
て中断されて、プラスミドＤＡｃ−ＱａＱＩ　　Ｄ　Ｎ
Ａ中に存在する。細胞ハＬＡＶ／ＨＴＬＶＩＩＩ　０ａ
ＯＩ伝子に：よって中断されたポリヘトリン遺伝子の１
部を含む組換え型プラスミドＤＮＡで、野生型ＡｃＮＰ
Ｖ　　ＤＮＡと組合せて、同時トランスフェクションさ
れる。キメラ遺伝子の側面に接するポリヘトリン配列に
おいて生起する組換えは、ＡｃＮＰＶゲノム中へＬＡＶ
／ＨＴＬＶｍ　ｆ）ａＱ遺伝信子列ヲ導入する。 第１７図は、野生型ＡｃＰＮＶおよびＡｃ−ｇａｇｌで
感染されたスポドプテラ・フルジペルダ「並列ｏ　　ｐ
ｔｅｒａ　　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａコ細胞から抽出すｈ
　ｔ：　Ｒ第１８図は、組換え型バキュロウィルスＡｃ
−ある。タンパク質は、感染後２４時間（レーン１゜２
）で、４８時間（レーン３，４）でおよび７２時間（レ
ーン５，６）で２時間の間［３５Ｓ１メチオニンで標識
された。ｍ胞溶解物中の標識化タンパク質は、対照ヒト
血清くレーン１，３．５）あるいはＡＩＤＳ患者血清（
レーン２．４．６）のいずれかと反応させられ、そして
免疫複合体は、スタフィロコッカス舎アウレウス　プロ
ティンＡによって沈降された。免疫沈降されたタンパク
質は、１０％　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおい
て電気泳動することにより分解され、そしてフルオログ
ラフィーによって検知された。 第１９図は、本発明の組換え型ＡｃＮＰＶで感染された
細胞中【二見い出されるＬＡＶ／旧ＬＶｍｇａｐ関う・
フルジペルダ（ｓｆ９）細胞は、Ａｃ−ｇａｇｌで感染
され、そして感染後２４時間目に５分間パルス標識され
た。細胞は次に完全培地で洗浄され、そして完全培地で
０時間（レーン１．２）、２時間（レーン３，４）、４
時間（レーン５，６）および８時間（レーン７．８）イ
ンキュベートされた。これらの時間で、細胞は洗浄され
、溶解され、そしてＩＡＶ／１ｌＴＬＶＩＩＩ血清陽性
個体からの貯蔵血清（レーン２．４．６．８）あるいは
正常ヒト血清（レーン１，３，５．ハと免疫沈降された
。タンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動によって分解された。 第２０図は、ＱａＣＪコード化配列を含む種々の長さの
［Ａν／）ＩＴＬＶＩＩＩゲノムに連結されたワクシニ
アウィルス７．５にプロモーターを含む、５つのプラス
ミドＤＶ−ＱａＣ）１．　ＤＶ−ＱａＱ２．　ＤＶ−Ｄ
ａＣ）３．　ＤＶ−ＱａＱ４および０Ｖ−ＱａＱ５の形
成を図解的に表わすものである。 これらの形成に用いられたＤＧＳ６２クローニングベク
ターは、ｐＧｓ２０（第３図参照）と、ＤＧＳ２０の非
反復３ｍａ１部位より下流に位置する非反復ＥＣ０Ｒ１
部位を有する以外は同一のものである。 第２１図は、組換え型ワクシニアしＡＶ／ＨＴＬＶ［ｌ
ウィルス（ｖ−ａａｑｌＮＹ、　ｖ−ｃ＋ａａ２ＮＹ、
　ｖ−ｃ＋ａａ３ＮＹ、　ｖ−ｃ＋ａｑ４ＮＹおよびＶ
−（ｌａ（１５１’ｌＹ）もしくは親ワクシニアウィル
ス（ｖ−ＮＹ）のいずれかで感染された細胞中、および
模専である。精製ＬＡＶ／ＨＴＬＶｕｌピリオンの試料
は酵〆旧ｔｖｍ＞は、陽性対照として含まれるものであ
った。集密的Ｂ５Ｃ−４０輻飽は、１０の感染多重度（
ｍｏｉ）で感染された。感染は１２時時間性することを
なされ、そしてその時間にて、細胞は採取されそして溶
解された。全部のｌ１ｌｌ胞性タンパク質は、５ＤＳ−
ＰＡＧＥによって分解され、そして電気的に移送するこ
とによってニトロセルロース上に固定された。該フィル
ターは、（１）アルカリホスファターゼに接合されたヤ
ギ抗ヒト免疫グロプリンを用いて次に検知されるもので
あるＡＩＤＳ患者血清（第２１Ｂ図）、あるいは］２）
アルカリホスファターゼｌＪ接合されたヤギ抗マウス免
疫グロブリンを用いて次に検定されるものである、Ｑａ
ｇタンパク質ｐ２５およびρ１８を限定するマウスモノ
クローナル抗体（第２１八図および第２１Ｃ図）と反応
された。 第２２図は、ＡｃＮＰＶポリへドリンプロモーターより
下流に挿入された完全［＾Ｖ／ＨＴＬＶＩＩＩエンベロ
ープコード化配列を含むプラスミドｐＡｃ−ｅｎｖ５の
形成を図解的に表わすものである。ｐＡｃ６１０クロー
ニングベクターは、上記第１５図において述べられてい
る。 第２３図は、組換え型ベキ１０ウイルスＡｃ−ある。模
擬感染細胞（模擬）および親バキ１０ウィルス株（＾ｃ
−ＮＰＶ）は比較対照として含まれる。 感染ｓｆ９細飽によって発現されたタンパク質は感染後
２８時間目で２分間３５ｓ−メチオニンで標識された。 細胞溶解物中の標識化タンパク質はＡＩＤＳ患者血清と
あるいは、Ｄρ１１０もしくは！１１１）４１を限定す
るマウスモノクローナル抗体と反応され、そして免疫複
合体は、スタフィロコッカス・アウレウス　プロティン
Ａを用いて沈降された。免疫沈降されたタンパク質は、
５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分解され、そしてフルオログ
ラフィーによって検知された。 特許出願人　　　　　オンコーグン 代理人　　弁理士　　八　１）幹　Ｍ（他１名）（す し− Ｏコ の 一 ５ｌ−ｑρ４１ 一一一−，，，，’−−、、、、、−Ｊ！ＪＬ像Ｃを７
７シニアウイル人て灸ノ更刃ｎζにヘマカ７声）うり菰
禰１人付のＩＥＬＩＳＡ　力Ａ面目予め液友 ＦＩＧ、ＩＩ Ｆ／Ｇ／７ ＦＩＧ　Ｉ８ １　　２３４５６７ｇ ＦＩＧ、／９

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエピトープに関連するペ
    プチドまたはタンパク質がウィルスで感染された宿主に
    発現されるように遺伝子発現を規制する第２のヌクレオ
    チド配列の制御下にあるＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエピト
    ープまたはその抗原部分をコード化するヌクレオチド配
    列からなるゲノムを有する組換え型ウィルス。 （２）ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエピトープをコード化す
    るヌクレオチド配列が、ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエンベ
    ロープ遺伝子または抗原ペプチドもしくはタンパク質を
    コード化するそれの任意の部分のヌクレオチド配列から
    なるものである特許請求の範囲第１項に記載の組換え型
    ウィルス。 （３）エンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列が、実質
    的に第２図においてヌクレオチド番号５７６７〜８５４
    ９として画かれているようなヌクレオチド配列または抗
    原ペプチドもしくはタンパク質をコード化するそれの任
    意の部分からなるものである特許請求の範囲第２項に記
    載の組換え型ウィルス。 （４）感染宿主中に発現されるペプチドまたはタンパク
    質がＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエンベロープエピトープま
    たはその任意の抗原部分と関連するものである特許請求
    の範囲第１項に記載の組換え型ウィルス。 （５）エンベロープエピトープが実質的に第２図におい
    てアミノ酸残基番号１〜８６１として画かれるようなア
    ミノ酸配列を有するペプチドもしくはタンパク質または
    その任意の抗原部分からなるものである特許請求の範囲
    第４項に記載の組換え型ウィルス。 （６）エンベロープウィルスよりなる特許請求の範囲第
    １項ないし第５項のいずれか一つに記載の組換え型ウィ
    ルス。 （７）ワクシニアウィルスよりなる特許請求の範囲第６
    項に記載の組換え型ウィルス。 （８）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１１３が
    付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ５
    またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学された
    誘導体である特許請求の範囲第７項に記載の組換え型ウ
    ィルス。 （９）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１１４が
    付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ２
    またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学された
    誘導体である特許請求の範囲第７項に記載の組換え型ウ
    ィルス。 （１０）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１４８
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ
    ７またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学され
    た誘導体である特許請求の範囲第７項に記載の組換え型
    ウィルス。 （１１）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１４９
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ
    ５ＮＹまたはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学
    された誘導体である特許請求の範囲第７項に記載の組換
    え型ウィルス。 （１２）バキュロウィルスよりなる特許請求の範囲第１
    項ないし第５項のいずれか一つに記載の組換え型ウィル
    ス。 （１３）角多核体病ウィルスよりなる特許請求の範囲第
    １２項に記載の組換え型ウィルス。 （１４）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１５１
    が付されている組換え型バキュロウィルスＡｃ−ｅｎｖ
    ５またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学され
    た誘導体である特許請求の範囲第１２項に記載の組換え
    型ウィルス。 （１５）裸のウィルスよりなる特許請求の範囲第１項な
    いし第５項のいずれか一つに記載の組換え型ウィルス。 （１６）アデノウィルスよりなる特許請求の範囲第１５
    項に記載の組換え型ウィルス。 （１１）バクテリオファージよりなる特許請求の範囲第
    １項ないし第５項のいずれか一つに記載の組換え型ウィ
    ルス。 （１８）ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエピトープをコード化
    するヌクレオチド配列が、ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのｇａ
    ｇ遺伝子または抗原ペプチドもしくはタンパク質をコー
    ド化するそれの任意の部分のヌクレオチド配列からなる
    ものである特許請求の範囲第１項に記載の組換え型ウィ
    ルス。 （１９）ｇａｇ遺伝子ヌクレオチド配列が実質的に第１
    ４図においてヌクレオチド番号３４０〜１８３５として
    画かれているようなヌクレオチド配列または抗原ペプチ
    ドもしくはタンパク質をコード化するそれらの任意の部
    分からなるものである特許請求の範囲第１８項に記載の
    組換え型ウィルス。 （２０）感染宿主中に発現されるペプチドまたはタンパ
    ク質がＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのコアタンパク質のエピト
    ープまたはその任意の抗原部分と関連するものである特
    許請求の範囲第１項に記載の組換え型ウィルス。 （２１）エピトープが実質的に第１４図においてアミノ
    酸残基番号１〜５００として画かれているようなアミノ
    酸配列またはその任意の抗原部分からなるものである特
    許請求の範囲第２０項に記載の組換え型ウィルス。 （２２）エンベロープウィルスよりなる特許請求の範囲
    第１８項ないし第２１項のいずれか一つに記載の組換え
    型ウィルス。 （２３）ワクシニアウィルスよりなるものである特許請
    求の範囲第２２項に記載の組換え型ウィルス。 （２４）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１５０
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｇａｇ
    １ＮＹまたはその変異体、組換え体もしくはその遺伝子
    工学された誘導体である特許請求の範囲第２３項に記載
    の組換え型ウィルス。 （２５）バキュロウィルスよりなる特許請求の範囲第１
    ８項ないし第２１項のいずれか一つに記載の組換え型ウ
    ィルス。 （２６）角多核体病ウィルスよりなる特許請求の範囲第
    ２５項に記載の組換え型ウィルス。 （２７）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１４７
    が付されている組換え型バキュロウィルスＡｃ−ｇａｇ
    １またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学され
    た誘導体である特許請求の範囲第２５項に記載の組換え
    型ウィルス。 （２８）裸のウィルスよりなる特許請求の範囲第１８項
    ないし第２１項のいずれか一つに記載の組換え型ウィル
    ス。 （２９）アデノウィルスよりなる特許請求の範囲第２８
    項に記載の組換え型ウィルス。 （３０）バクテリオファージよりなる特許請求の範囲第
    １８項ないし第２１項のいずれか一つに記載の組換え型
    ウィルス。 （３１）ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエピトープに関連する
    実質的に純粋な抗原ペプチドないしタンパク質。 （３２）エピトープがＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのエンベロ
    ープ糖タンパク質エピトープよりなるものである特許請
    求の範囲第３１項に記載のペプチドないしタンパク質。 （３３）アミノ酸配列が実質的に第２図においてアミノ
    酸残基番号１〜８６１として画かれているようなアミノ
    酸配列またはそれの任意の抗原部分からなる特許請求の
    範囲第３２項に記載のペプチドないしタンパク質。 （３４）ペプチドないしタンパク質が、該ペプチドない
    しタンパク質が培養細胞により発現されるように遺伝子
    発現を規制する第２のヌクレオチド配列の制御下にある
    ペプチドないしタンパク質をコード化するヌクレオチド
    配列を含む培養細胞から精製されたものである特許請求
    の範囲第３２項または第３３項に記載のペプチドないし
    タンパク質。 （３５）培養細胞が微生物よりなるものである特許請求
    の範囲第３４項に記載のペプチドないしタンパク質。 （３６）微生物が細菌よりなるものである特許請求の範
    囲第３５項に記載のペプチドないしタンパク質。 （３７）微生物が酵母よりなるものである特許請求の範
    囲第３５項に記載のペプチドないしタンパク質。 （３８）培養細胞が動物細胞系である特許請求の範囲第
    ３４項に記載のペプチドないしタンパク質。 （３９）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１１３
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ
    ５またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学され
    た誘導体で感染された動物細胞により産生されてなる特
    許請求の範囲第３８項に記載のペプチドないしタンパク
    質。 （４０）ＡＴＣＣに寄託されかつ受付番号ＶＲ２１１４
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ
    ２またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学され
    た誘導体で感染された動物細胞により産生されてなる特
    許請求の範囲第３８項に記載のペプチドないしタンパク
    質。 （４１）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１４８
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ
    ７またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学され
    た誘導体で感染された動物細胞により産生されてなる特
    許請求の範囲第３８項に記載のペプチドないしタンパク
    質。 （４２）ＡＴＣＣに寄託されかつ受付番号ＶＲ２１４９
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ
    ５ＮＹまたはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学
    された誘導体で感染された動物細胞により産生されてな
    る特許請求の範囲第３８項に記載のペプチドないしタン
    パク質。 （４３）培養細胞が昆虫細胞系である特許請求の範囲第
    ３４項に記載のペプチドないしタンパク質。 （４４）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１５１
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスＡｃ−ｅｎ
    ｖ５またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学さ
    れた誘導体で感染された動物細胞により産生されてなる
    特許請求の範囲第４３項に記載のペプチドないしタンパ
    ク質。 （４５）エピトープがＨＬＶ／ＨＴＬＶIIIのコアタン
    パク質エピトープよりなるものである特許請求の範囲第
    ３１項に記載のペプチドないしタンパク質。 （４６）アミノ酸配列が実質的に第１４図においてアミ
    ノ酸残基番号１〜５００として画かれているようなアミ
    ノ酸配列またはその任意の抗原部分からなるものである
    特許請求の範囲第４５項に記載のペプチドないしタンパ
    ク質。 （４７）ペプチドないしタンパク質が、該ペプチドない
    しタンパク質が培養細胞より発現されるように遺伝子発
    現を規制する第２のヌクレオチド配列の制御下にあるペ
    プチドないしタンパク質をコード化するヌクレオチド配
    列を含む培養細胞から精製されたものである特許請求の
    範囲第４５項または第４６項に記載のペプチドないしタ
    ンパク質。 （４８）培養細胞が微生物よりなるものである特許請求
    の範囲第４７項に記載のペプチドないしタンパク質。 （４９）微生物が細菌よりなるものである特許請求の範
    囲第４８項に記載のペプチドないしタンパク質。 （５０）微生物が酵母よりなるものである特許請求の範
    囲第４８項に記載のペプチドないしタンパク質。 （５１）培養細胞が動物細胞系である特許請求の範囲第
    ４７項に記載のペプチドないしタンパク質。 （５２）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１５０
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスｖ−ｇａｇ
    １ＮＹまたはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学
    された誘導体で感染された動物細胞より産生されてなる
    特許請求の範囲第５１項に記載のペプチドないしタンパ
    ク質。 （５３）培養細胞が動物細胞系である特許請求の範囲第
    ４７項に記載のペプチドないしタンパク質。 （５４）ＡＴＣＣに寄託されかつ寄託番号ＶＲ２１４７
    が付されている組換え型ワクシニアウィルスＡｃ−ｇａ
    ｇ１またはその変異体、組換え体もしくは遺伝子工学さ
    れた誘導体で感染された動物細胞より産生されてなる特
    許請求の範囲第５３項に記載のペプチドないしタンパク
    質。 （５５）ペプチドないしタンパク質が化学的に合成され
    たものである特許請求の範囲第３１項、第３２項、第３
    ３項、第４５項または第４６項に記載のペプチドないし
    タンパク質。 （５６）ウィルスが予防接種されるべき宿主において疾
    患を起すことなく感染性である特許請求の範囲第１項な
    いし第５項のいずれか一つに記載のウィルスよりなる生
    ウィルスワクチン製剤。 （５７）ウィルスがエンベロープウィルスよりなるもの
    である特許請求の範囲第５６項に記載の生ウィルスワク
    チン製剤。 （５８）エンベロープウィルスがワクシニアウィルスで
    ある特許請求の範囲第５７項に記載の生ウィルスワクチ
    ン製剤。 （５９）特許請求の範囲第８項に記載のワクシニアウィ
    ルスｖ−ｅｎｖ５の感染投与量よりなる生ウィルスワク
    チン製剤。 （６０）特許請求の範囲第９項に記載のワクシニアウィ
    ルスｖ−ｅｎｖ２の感染投与量よりなる生ウィルスワク
    チン製剤。 （６１）特許請求の範囲第１０項に記載のワクシニアウ
    ィルスｖ−ｅｎｖ７の感染投与量よりなる生ウィルスワ
    クチン製剤。 （６２）特許請求の範囲第１１項に記載のワクシニアウ
    ィルスｖ−ｅｎｖ５ＮＹの感染投与量よりなる生ウィル
    スワクチン製剤。 （６３）ウィルスが裸ウィルスよりなるものである特許
    請求の範囲第５６項に記載の生ウィルスワクチン製剤。 （６４）裸ウィルスがアデノウィルスよりなるものであ
    る特許請求の範囲第６３項に記載の生ウィルスワクチン
    製剤。 （６５）特許請求の範囲第２項ないし第５項のいずれか
    一つに記載の組換え型ウィルスと、特許請求の範囲第１
    ８項ないし第２１項のいずれか一つに記載の組換え型ウ
    ィルスとよりなり、両組換え型ウィルスは予防接種され
    るべき宿主において疾患を起すことなく感染性である多
    価生ウィルスワクチン製剤。 （６６）組換え型ウィルスがエンベロープウィルスより
    なるものである特許請求の範囲第６５項に記載の多価生
    ウィルスワクチン製剤。 （６７）各エンベロープウィルスがワクシニアウィルス
    よりなるものである特許請求の範囲第６６項に記載の多
    価生ウィルスワクチン製剤。 （６８）（ａ）特許請求の範囲第８項に記載のワクシニ
    アウィルスｖ−ｅｎｖ５、特許請求の範囲第９項に記載
    のワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ２、特許請求の範囲第
    １０項に記載のワクシニア ウィルスｖ−ｅｎｖ７または特許請求の範囲第１１項に
    記載のワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ５ＮＹおよび （ｂ）特許請求の範囲第２４項に記載のワクシニアウィ
    ルスｖ−ｇａｇ１ＮＹ の感染投与量よりなる多価ワクチン製剤。 （６９）医薬的な担体と混合して非感染状態の特許請求
    の範囲第１項ないし第５項のいずれか一つに記載の有効
    量のウィルスよりなる不活化ウィルスワクチン製剤。 （７０）医薬的な担体と混合して非感染状態の特許請求
    の範囲第６項に記載の有効量のエンベロープウィルスよ
    りなる不活化ウィルスワクチン製剤。 （７１）医薬的な担体と混合して非感染状態の特許請求
    の範囲第７項に記載の有効量のワクシニアウィルスより
    なる不活化ウィルスワクチン製剤。 （７２）医薬的な担体と混合して非感染状態の特許請求
    の範囲第８項に記載の有効量のワクシニアウィルスｖ−
    ｅｎｖ５よりなる不活化ウィルスワクチン製剤。 （７３）医薬的な担体と混合して非感染状態の特許請求
    の範囲第９項に記載の有効量のワクシニアウィルスｖ−
    ｅｎｖ２よりなる不活化ウィルスワクチン製剤。 （７４）医薬的な担体と混合して非感染状態の特許請求
    の範囲第１０項に記載の有効量のワクシニアウィルスｖ
    −ｅｎｖ７よりなる不活化ウィルスワクチン製剤。 （７５）医薬的な担体と混合して非感染状態の特許請求
    の範囲第１１項に記載の有効量のワクシニアウィルスｖ
    −ｅｎｖ５ＮＹよりなる不活化ウィルスワクチン製剤。 （７６）（ａ）ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIエンベロープ関連
    エピトープを発現する特許請求の範囲第２項ないし第 ５項のいずれか一つに記載の組換え型ウィ ルスと、 （ｂ）ＬＡＶ／ＨＴＬＶIIIのコア関連エピトープを発
    現する特許請求の範囲第１８項ないし第２１ 項のいずれか一つに記載の組換え型ウィル スと の有効量よりなり、各組換え型ウィルスは医薬的な担体
    と混合した状態で非感染性である多価不活化ウィルスワ
    クチン製剤。 （７７）各組換え型ウィルスはエンベロープウィルスよ
    りなるものである特許請求の範囲第７６項に記載の多価
    不活化ウィルスワクチン製剤。 （７８）各エンベロープウィルスはワクシニアウィルス
    よりなるものである特許請求の範囲第７７項に記載の多
    価不活化ウィルスワクチン製剤。 （７９）（ａ）特許請求の範囲第８項に記載のワクシニ
    アウィルスｖ−ｅｎｖ５、特許請求の範囲第９項に記載
    のワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ２、特許請求の範囲第
    １０項に記載のワクシニア ウィルスｖ−ｅｎｖ７または特許請求の範囲第１１項に
    記載のワクシニアウィルスｖ−ｅｎｖ５ＮＹと、 （ｂ）特許請求の範囲第２４項に記載のワクシニアウィ
    ルスｖ−ｇａｇ１ＮＹ との有効量よりなる多価不活化ウィルスワクチン製剤。 （８０）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第３２項または第３３項に記載の有効投与量のペプチ
    ドないしタンパク質よりなるものであるサブユニットワ
    クチン製剤。 （８１）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第３４項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８２）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第３５項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８３）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第３６項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８４）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第３７項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８５）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第３８項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８６）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第３９項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８７）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第４０項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８８）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第４１項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （８９）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第４２項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （９０）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第４２項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （９１）免疫原が医薬的な担体と混合した特許請求の範
    囲第４３項に記載の有効投与量のペプチドないしタンパ
    ク質よりなるものであるサブユニットワクチン製剤。 （９２）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドないしタンパク質 と、 （ｂ）特許請求の範囲第４５項または第４６項に記載の
    第２のペプチドないしタンパク質 と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （９３）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第４７項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （９４）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第４８項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （９５）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第４９項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （９６）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第５０項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （９７）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第５１項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （９８）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第５２項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （９９）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３項
    に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第５３項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （１００）（ａ）特許請求の範囲第３２項または第３３
    項に記載の第１のペプチドと、 （ｂ）特許請求の範囲第５４項に記載の第２のペプチド
    ないしタンパク質と の有効投与量を医薬的な担体と混合したものよりなる多
    価サブユニットワクチン製剤。 （１０１）ｐｖ−ｅｎｖ１よりなる組換えＤＮＡベクタ
    ー。 （１０２）特許請求の範囲第１０１項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる単細胞生物。 （１０３）特許請求の範囲第１０１項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる細菌。 （１０４）ＮＲＲＬに寄託されかつ寄託番号Ｂ−１８０
    ０３が付されているエシェリキア・コリまたはその変異
    体、組換え体もしくは遺伝子工学された誘導体よりなる
    特許請求の範囲第１０３項に記載のバクテリア。 （１０５）ｐｖ−ｅｎｖ２よりなる組換えＤＮＡベクタ
    ー。 （１０６）特許請求の範囲第１０５項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる単細胞生物。 （１０７）特許請求の範囲第１０５項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる細菌。 （１０８）ＮＲＲＬに寄託されかつ寄託番号Ｂ−１８０
    ０４が付されているエシェリキア・コリまたはその変異
    体、組換え体もしくは遺伝子工学された誘導体よりなる
    特許請求の範囲第１０７項に記載の細菌。 （１０９）ｐｖ−ｅｎｖ５よりなる組換えＤＮＡベクタ
    ー。 （１１０）特許請求の範囲第１０９項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる単細胞生物。 （１１１）特許請求の範囲第１０９項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる細菌。 （１１２）ＮＲＲＬに寄託されかつ寄託番号Ｂ−１８０
    ０５が付されているエシェリキア・コリまたはその変異
    体、組換え体もしくは遺伝子工学された誘導体よりなる
    特許請求の範囲第１１１項に記載のバクテリア。 （１１３）ｐｖ−ｅｎｖ７よりなる組換えＤＮＡベクタ
    ー。 （１１４）特許請求の範囲第１１３項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる単細胞生物。 （１１５）特許請求の範囲第１１３項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる細菌。 （１１６）ＮＲＲＬに寄託されかつ寄託番号Ｂ−１８１
    １０が付されているエシェリキア・コリまたはその変異
    体、組換え体もしくは遺伝子工学された誘導体よりなる
    特許請求の範囲第１１５項に記載の細菌。 （１１７）ｐｖ−ｇａｇ１よりなる組換えＤＮＡベクタ
    ー。 （１１８）特許請求の範囲第１１７項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる単細胞生物。 （１１９）特許請求の範囲第１１７項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる細菌。 （１２０）ＮＲＲＬに寄託されかつ寄託番号Ｂ−１８１
    １１が付されているエシェリキア・コリまたはその変異
    体、組換え体もしくは遺伝子工学された誘導体よりなる
    特許請求の範囲第１１９項に記載の細菌。 （１２１）ｐＡｃ−ｇａｇ１よりなる組換えＤＮＡベク
    ター。 （１２２）特許請求の範囲第１２１項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる単細胞生物。 （１２３）特許請求の範囲第１２１項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる細菌。 （１２４）ＮＲＲＬに寄託されかつ寄託番号Ｂ−１８１
    ０５が付されているエシェリキア・コリまたはその変異
    体、組換え体もしくは遺伝子工学された誘導体よりなる
    特許請求の範囲第１２３項に記載の細菌。 （１２５）ｐＡｃ−ｅｎｖ５よりなる組換えＤＮＡベク
    ター。 （１２６）特許請求の範囲第１２５項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる単細胞生物。 （１２７）特許請求の範囲第１２５項に記載の組換えＤ
    ＮＡベクターを含有してなる細菌。 （１２８）ＮＲＲＬに寄託されかつ寄託番号Ｂ−１８１
    ０９が付されているエシェリキア・コリまたはその変異
    体、組換え体または遺伝子工学された誘導体よりなる特
    許請求の範囲第１２７項に記載の細菌。
JP61225052A 1985-09-25 1986-09-25 後天性免疫不全症候群に関するワクチンおよび免疫検定法 Pending JPS6368075A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77990985A 1985-09-25 1985-09-25
US779909 1985-09-25
US905,217 1986-09-09
US842984 1997-04-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPS6368075A true JPS6368075A (ja) 1988-03-26

Family

ID=25117964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61225052A Pending JPS6368075A (ja) 1985-09-25 1986-09-25 後天性免疫不全症候群に関するワクチンおよび免疫検定法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPS6368075A (ja)
KR (1) KR870003192A (ja)
ZA (1) ZA867281B (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63207397A (ja) * 1986-10-16 1988-08-26 マイクロジェネシス，インコーポレイティド 組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞においてヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ遺伝子から誘導されたポリペプチド
JPH01500161A (ja) * 1986-04-08 1989-01-26 トランスジーン ソシエテ アノニム Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質、該糖蛋白質の製造方法及びワクチン
JPH02503916A (ja) * 1987-06-24 1990-11-15 プロテウス・モレキュラー・デザイン・リミテッド Ｈｉｖエンベロープ蛋白質に関連する合成ペプチド
JPH04506301A (ja) * 1989-10-13 1992-11-05 コノート　ラボラトリーズ　リミテッド エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造
JPH06510910A (ja) * 1991-11-08 1994-12-08 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー ネコ白血病ウイルスワクチン
JP2006209344A (ja) * 2005-01-26 2006-08-10 Glory Ltd 循環式硬貨入出金機

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01500161A (ja) * 1986-04-08 1989-01-26 トランスジーン ソシエテ アノニム Ａｉｄｓの原因ウィルスの糖蛋白質、該糖蛋白質の製造方法及びワクチン
JPS63207397A (ja) * 1986-10-16 1988-08-26 マイクロジェネシス，インコーポレイティド 組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞においてヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ遺伝子から誘導されたポリペプチド
JPH02503916A (ja) * 1987-06-24 1990-11-15 プロテウス・モレキュラー・デザイン・リミテッド Ｈｉｖエンベロープ蛋白質に関連する合成ペプチド
JPH04506301A (ja) * 1989-10-13 1992-11-05 コノート　ラボラトリーズ　リミテッド エイズ及びその他のレトロウイルス病用ワクチンの遺伝子工学による製造
JPH06510910A (ja) * 1991-11-08 1994-12-08 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー ネコ白血病ウイルスワクチン
JP2006209344A (ja) * 2005-01-26 2006-08-10 Glory Ltd 循環式硬貨入出金機

Also Published As

Publication number Publication date
KR870003192A (ko) 1987-04-15
ZA867281B (en) 1987-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
GB2181435A (en) Vaccines and immunoassays for acquired immune deficiency syndrome
AU636944B2 (en) Non-replicating recombinant-made retroviral particles used as antiviral agents and immunogens
Lu et al. Simian immunodeficiency virus DNA vaccine trial in macaques
CA2837748C (en) Siv and hiv vaccination using rhcmv-and hcmv-based vaccine vectors
US7744896B1 (en) HIV-1 Tat compositions
Griffiths et al. Hybrid human immunodeficiency virus Gag particles as an antigen carrier system: induction of cytotoxic T-cell and humoral responses by a Gag: V3 fusion
PL161448B1 (pl) Sposób wykrywania przeciwcial przeciwko wirusowi AIDS6 2 ) Numer zgloszenia,z którego nastapilo wydzielenie:268266 PL
Ahmad et al. Reduced virus load in rhesus macaques immunized with recombinant gp160 and challenged with simian immunodeficiency virus
Sodroski et al. Sequence of the envelope glycoprotein gene of type II human T lymphotropic virus
EP0400076B1 (en) A synthetic antigen evoking anti-hiv response
US5883081A (en) Isolation of novel HIV-2 proviruses
Winter et al. Recombinant BCG strains expressing the SIVmac251nef gene induce proliferative and CTL responses against nef synthetic peptides in mice
JP2000506727A (ja) 組換え生ネコ免疫不全ウイルスおよびプロウイルスｄｎａワクチン
PT100584A (pt) Vacina contra o virus da imunodeficiencia humana a base de uma proteina recombinante do envolucro do referido virus
Warner et al. Induction of HIV-specific CTL and antibody responses in mice using retroviral vector-transduced cells
FI114318B (fi) Menetelmä rekombinanttiadenovirusrokotteiden valmistamiseksi
JPS6368075A (ja) 後天性免疫不全症候群に関するワクチンおよび免疫検定法
Huisman et al. Feline immunodeficiency virus subunit vaccines that induce virus neutralising antibodies but no protection against challenge infection
JP4344805B2 (ja) 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン
PT95939A (pt) Processo de producao de particulas de hiv, tornadas recombinantes e nao replicativas, e de vacinas
AU608205B2 (en) Vaccines against acquired immune deficiency syndrome
Erbe et al. Cytolytic T lymphocytes specific for tumors and infected cells from mice with a retrovirus-induced immunodeficiency syndrome
Szabó et al. Reciprocal interactions between human cytomegalovirus and human T cell leukemia-lymphoma virus type I in monocyte-derived macrophages cultured in vitro
JPH05509232A (ja) 複製効率を増強するためのＨＩＶｎｅｆ遺伝子を含有する発現ベクター
Lea Cell-mediated immune response to equine infectious anemia virus