JPS6368094A - フエノ−ル類配糖体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はフェノール類の共存下に植物の培養細胞を組織
培養することによりフェノール類配糖体を効率よく製造
する方法に関する。

〔従来の技術と問題点〕

フェノール類の共存下に植物の組織培養を行うことによ
ってフェノール類配糖体が製造できることはよく知られ
ている。例えば化粧料等に有用なアルブチンは植物の組
織培養を利用して得ることが出来ることも知られている
。例えばファイトケミストリー（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉ
ｓ−ｔｒｙ）　＋第１５巻、　１２２５頁（１９７６年
）には、チョウセンアサガオの細胞を培養する際に培地
にヒドロキノン、レゾルシンあるいはカテコールを１０
−　”Ｍの濃度で存在させて培養するとアルブチンある
いはｍ−又は０−ヒドロキシフエールβ−グルコシドの
フェノール配糖体が得られることが示されている。しか
し該方法では培地中のヒドロキノン等のフェノール類の
濃度は３．５ｍＭ以下と算出され小さく、また培地にお
ける培養細胞の濃度も新鮮な細胞重量で示して２４０ｇ
／　Ｉｔ以下と算出され低いことなどのためかアルブチ
ン等のフェノール配糖体の生産量は低く効率が悪いとい
う問題がある。配糖体の生産性を高くする方法として配
糖体め非糖部に対応するフェノール類の培地における濃
度を高くすることが考えられる。

しかし、従来採用されている培養方法においてはフェノ
ール類の濃度をあまり高くし過ぎると、細胞が死滅ある
いは生育阻害を受ける恐れもあり、このような見地から
従来法においては培地中のフェノール類の濃度を３．５
ｍＭを越えて高くしてフェノール類配糖体を得る方法は
試みられていない。

また一般に細胞濃度を高くして培養する方法についても
試みられていない。

〔発明の目的〕

本発明者等は植物の組織培養を用いてフェノール類配糖
体を製造する方法として、従来から知られている方法に
比べてフェノール類配糖体を効率良く工業的に生産でき
る方法、すなわち培養槽の単位容積当たりの該配糖体の
収量を大幅に増大して該配糖体を効率良く製造する方法
について検討した。

〔発明の概要〕

その結果下記方法を採用すれば前記目的を達成できるこ
とを見出し本発明を完成するに到った。

すなわち本発明の第１の方法によればフェノール類の共
存下に植物の組織培養を行うことによってフェノール類
配糖体を製造する方法において、液体培地中における培
養細胞濃度を２５０ｇ／ｌ以上（新鮮重量換算）、フェ
ノール頻濃度を５〜２０ｍＭ／７！となるように調整す
ることを特徴とするフェノール類配糖体の製造方法が提
供される。

また本発明における第１の発明の好適態様として連続的
な製造方法が第２の発明として提供される。すなわちフ
ェノールの共存下に植物の組織培養を行うことによって
フェノール類配糖体を製造する方法において、予め細胞
増殖培養帯域において、培養液の更新条件下。液体培地
中における培養細胞濃度を１００〜５００ｇ＃　（新鮮
重量換算）となるように培養細胞を連続的に増殖培養し
、かくして得られた培養細胞を反応培養帯域において培
養細胞濃度を２５０ｇ／　１以上（新鮮重量換算）、フ
ェノール類濃度を５〜２０ｍＭ／　ｌとなるように調整
しつつ培養細胞を連続的に組織培養することを特徴とす
るフェノール類配糖体の連続製造方法が第２の発明とし
て提供される。

〔発明の詳細な説明〕

１の　日の　　・箭゛日 本発明に係わるフェノール類配糖体の製造方法１よ植物
の組織培養を用いて培養細胞をフェノール類の存在下に
培養することにより行われるが、この場合の植物として
は、特に限定されず、例えばファイトケミストリー（Ｐ
ｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第１５巻。

１２２５頁（１９７６年）に示されているようにフェノ
ール類の存在下に植物細胞の代謝産物としてフェノール
類配糖体を作ることが従来から知られている植物である
ならば本発明の方法が適用可能である。

本発明ではこのような植物の中でも具体的にはアメリカ
チョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ　１ｎｎｏｘ＋ａ）
、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）等の
ナス科の植物、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ　ｍａｊ
ｏｒ））、ヒメッルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ　ｍ１ｎ
ｏｒ）等のキョウチクトウ科の植物、その他糸数の植物
を例示できほとんどの植物カルスが、このような配糖化
能力を持っているが、この中ではアメリカチョウセンア
サガオが特に好ましい。

本発明ではフェノール類配糖体を得るに当たっては、液
体培地を用いてフェノール類の存在下に前記植物の培養
細胞が組織培養される。この場合の組織培養について以
下詳述する。

液体培地としては、従来から知られている植物の組織培
養に使用されている培地が使用できる。

該培地として具体的には無機成分、炭素源および植物ホ
ルモンを必須成分とし、これにビタミン類を添加し、更
に必要に応じてアミノ酸類を添加した培地である。該培
地の無機成分としては、窒素、リン、カリウム、ナトリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガ
ン、亜鉛、ホウ素、モリブデン、塩素、ヨウ素、コバル
ト等の元素を含む無機塩を挙げることができ、具体的に
は硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リ
ン酸１水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸
第１鉄、硫酸第２鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、モリブデ
ン酸ナトリウム、酸化モリブデン、ヨウ化カリウム、硫
酸亜鉛、ホウ酸、塩化コバルト等の化合物を例示できる
。

該培地の炭素源としては、ショ糖等の炭水化物とその誘
導体、脂肪酸等の有機酸およびエタノール等の１級アル
コール等を例示できる。

該培地の植物ホルモンとしては、インドール酢酸（ＩＡ
Ａ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、Ｐ−クロロフェノキ
シイソ酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２
，４−Ｄ）等のオーキシン類およびカイネチン、ゼアチ
ンおよびベンジルアデニン等のサイトカイニン類を例示
できる。

該培地のビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビ
タミンＢＩ）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリド
キサール、ピリドキサミン、パントテン酸カルシウム、
アスコルビン酸（ビタミンＣ）、イノシトール、ニコチ
ン酸、ニコチン酸アミドおよびリボフラビン（ビタミン
Ｂ２）などを例示できる。

該培地のアミノ酸類としては、例えばグリシン、アラニ
ン、グルタミン酸、システィン、チロシン、およびリジ
ンなどを例示できる。

本発明で使用される液体培地は、通常は、前記無機成分
を約０．１μＭないし約１００ｍＭ、前記炭素源を約１
ｇ／ｌないし約１００　ｇ　／ｌ、前記植物ホルモンを
通常は０．０１μＭないし１０００μＭ、好ましくは１
μＭないし１００μＭの範囲含有し、前記ビタミン類を
約０．１ｍｇ／　Ｉｔないし約１５０ｍｇ／　Ｉｔおよ
び前記アミノ酸類を０ないし約１０００ｍｇ／　Ｉｔ含
ませて使用されることが望ましい。

このような各成分を含む培地として具体的には、従来か
ら知られている植物の組織培養に用いられている培地、
例えばムラシゲ・スクーグ（’６２）ＣＭｕｒａｓｈｉ
ｇｅ　＆Ｓｋｏｏｇ　）の培地、リンスマイ・１？−・
スクーグ（ＲＭ−１９６５）　　ＣＬｉｎｓｍａｊｅｒ
　＆　Ｓｋｏｏｇ）の培地、ホワイト（’６３）（讐ｈ
ｉｔｅ　）の培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ　）の
Ｂ−５培地、三井のＭ−９培地等に前記した炭素源およ
び植物ホルモンを添加し、更に必要に応じて前記したビ
タミン類、アミノ酸類を添加して調製される培地を例示
でき−るが、本発明ではこの中でも特にリンスマイヤー
・スクーグ又はムラシゲ・スクーグの培地を用いで調製
される培地が好ましい。なお、上記した従来公知の培地
の組成に関しては、例えば、性向、中高、古谷著の「新
植物組織培養Ｊ　Ｐ３Ｂ６〜Ｐ３９１、朝倉書店、１９
７９年に記載されている。

本発明では前記液体培地を用いて前記植物の培養細胞が
フェノール類の存在下に培養されるわけであるが、この
場合の培養は以下の条件のもとに行われる。すなわち本
発明では液体培地における培養細胞の濃度が細胞の新鮮
な重量で表して２５０ｇ＃！以上であって、フェノール
類の液体培地における濃度が５〜２０ｍＭ／　Ｉｔとな
るように調整されなければならず、このため適宜フェノ
ール類が培養槽に連続的又は非連続的に供給されて組織
培養が行われる。ここでフェノール類は後述するように
培養細胞に取り込まれて消費され、細胞の有する糖と生
化学的に反応してフェノール類配糖体が生成される。

本発明で使用される培養細胞は前記植物の葉、茎、根、
花芽などの組織を前記培地を用いて通常方法により組織
培養することにより得られる。またこのようにして得ら
れる培養細胞を更に引き続いて同様に組織培養して得ら
れる培養細胞も使用出来る。

本発明では培養中の培養細胞の濃度は細胞の新鮮な重量
で表して２５０ｇ／　Ｉｔ以上の条件で培養が行われる
が、この場合の新鮮な重量とは通常以下の方法によって
求められる培養細胞の重量である。

すなわち培養槽中にある培養細胞の全量を濾布をひいた
ヌツチェにとり、水洗ポンプなどで５分間濾過を行い、
培養細胞以外の培養液を除いたときの組織培養物の重量
である。このようにして求められる培養細胞の新鮮重量
物は植物によっても異なるが通常は含水率が８０〜９５
ｗｔ％である。

本発明では液体培地中における培養細胞の濃度を２５０
ｇ／　４２未満にして培養を行った場合には目的と子る
培養細胞の代謝産物であるフェノール類配糖体の培養槽
の有効単位容積光たりの収量が特に反応させるフェノー
ル類の添加量を増加させた際に低下するので、本発明で
は細胞濃度を２５０ｇ／ｌ以上にして培養が行われる。

本発明では培養細胞の濃度の上限については特に規定は
しないが、通常は５００ｇ／　ｊ！以下で行われる。と
いうのは培養細胞の濃度を５００ｇ／ｌを越えて高くし
た場合には、スラリー濃度が高くなり培養液の攪拌、混
合が不充分となるために効率良く酸素供給を行うことが
困難となり、培養中に培養細胞の壊死などが起こって正
常な培養が困難となり易いからである。また酸素の供給
を充分にしようとして攪拌を激しくすると培養細胞の損
傷が起きるので通常５００ｇ／　１以下で行われる。

本発明方法のように培養細胞濃度を２５０ｇ／　＃以上
にして培養する方法によれば、フェノール類配糖体を製
造するための反応時間を短縮できるという利点もある。

すなわち原料のフェノール類が配糖体に変換される割合
（変換率）と培養時間との関係を見た場合、例えば第１
図に示す如く、細胞濃度を高くして培養すると通常は該
変換率が頭打ちとなるまでの培養にとって実質的に有効
な培養時間を短くすることができるため、同一の培養槽
を用いてフェノール類配糖体を製造する場合、同一時間
内でもバッチのサイクル数を細胞の低濃度培養法に比べ
て多くでき、従って効率良くフェノール類配糖体を製造
できる。

本発明ではフェノール類は液体培地におけるその濃度が
５〜２０ｍＭ／　ＩＩ、好ましくは８〜１８ｍＭ／１と
なるように培養槽に連続的又は非連続的に供給される。

フェノール類濃度が５ｍＭ／ｊｉ！未満の場合には、細
胞濃度を２５０ｇ／ｌ以上に高（して培養してもフェノ
ール類配糖体の培養槽の単位容積光たりの収量が向上せ
ず、又該濃度を２０ｍＭ／６を超えて高くすると培養細
胞が生育障害を受けて死滅するなどするため本発明では
フェノール［？Ｗ度を前記範囲に保って培養が行われる
。

本発明ではフェノール類の培養槽への投与方法としては
、培養の最初にフェノール類を前記濃度範囲になるよう
に培養槽に仕込み、培養の進行と共にフェノール類が消
費されるのに対応して連続的または非連続的に適宜量の
フェノール類を加えて前記濃度範囲に保つようにする方
法を用いてもよい。あるいは培養の開始直後はフェノー
ル類濃度を５ｍＭ／／２以下と低くして培養細胞をフェ
ノール類共存の環境に適宜時間馴しませた後、フェノー
ル類濃度を逐次高めて本発明の濃度範囲内にしてフェノ
ール類をその消費量に応じて連続的又は非連続的に適宜
加えて培養する方法を用いることもできる。本発明では
フェノール類を液体培地に５〜２０ｍＭ／／あるいはそ
れ以上の濃度になるように溶かして、この溶液を液体培
養中のフェノール類の消費に応じて適宜培養槽に追加す
ることかできる。また本発明の培養槽においては後述す
る第１槽の細胞増殖培養槽の場合と同様にフェノール類
を前記濃度範囲で含む液体培地を更新させながら培養す
る方法を用いることもできる。

培養槽における培養時間は通常は数時間ないし数日であ
り、培養時の温度は通常は２０〜３０℃である。

本発明のフェノール類配糖体について若干説明すると、
該配糖体は培地に加えたフェノール類が培養細胞中に取
り込まれて、このフェノール類が培養細胞中の糖と培養
細胞含有の酵素を触媒として生化学的に反応してフェノ
ール類に糖が配糖した代謝産物である。用いる培養細胞
の種類によっては培養細胞に含まれる糖類の種類として
異なるものもあるので、基質として同じフェノール類を
使用しても異なるフェノール類配糖体を得ることが可能
である。

本発明の方法に係わるフェノール類として具体的にはフ
ェノール、サリチル酸、クレゾール等のｍ個フエノール
、ヒドロキノン、レゾルシン、力テコール等の二価フェ
ノールを挙げることができるが、この中ではヒドロキノ
ン、レゾルシン、カテコール中でも特にヒドロキノンが
好ましい。また本発明に係わるフェノール類配糖体の糖
部として具体的にはβ−Ｄ−グルコース、α−Ｄ−グル
コース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の
培養細胞が含有している糖を示すことができ、この中で
はβ−Ｄ−グルコースが好ましい。本発明に係わるフェ
ノール類配糖体として具体的にはアルブチン（ｐ−ヒド
ロキシフェニル−β−グルコシド）、サリチン（サリチ
ルアルコールβ−ローグルコシド）、イソサリチン（０
−ヒドロキシベンジルβ−Ｄ−グルコシド）、ヒドロキ
シフェニルβ−グルコシド、カルボキシフェニルβ−グ
ルコシドを例示できる。この中ではアルブチンが好まし
い。

２の　　の貝　・ｉ゛ 本発明では前記方法によってフェノール類配糖体を植物
の組織培養を利用して作ることができる。

この場合培養は回分式あるいは連続式であってもよい。

工業的には培養を連続式で行うことが好ましく、前述し
た本発明の第２の方法に係わる発明が提供される。以下
該方法について詳述する。

本発明に係わるフェノール類配糖体の連続製造方法にお
いては、細胞増殖培養帯域における培養細胞の培養を例
えば細胞増殖培養槽（第１槽）を用いて、又反応培養帯
域における培養を例えば反応培養槽（第２槽）を用いて
行うことができる。

以下この方法について説明する。先ず細胞増殖培養槽（
第１槽）について説明する。

細胞増殖培養槽においては栄養基質濃度を所定の濃度に
調整した液体培地が該培養槽に連続的又は非連続的に供
給される一方、該培養槽の他方より培養液を連続的又は
非連続的に抜き出して該培養槽中の培養液を更新させな
がら、該培養槽における培養細胞の濃度が細胞の新鮮な
重量で表して１００〜５００ｇ／６の範囲にあるように
培養して培養細胞が増殖培養される。

本発明に係わる細胞増殖培養槽を用いた培養方法は、本
出願人に係わる特願昭６１−１６８３８号で提案した植
物の高密度培養方法と同じ方法によって行　　Ｃ うことができる。本発明では第１槽における培養細胞の
濃度については前記範囲で行われるが、第１槽において
得られる培養細胞を原料としてこれを反応培養槽（第２
槽）に供給して前記した第１の発明方法に係わる条件と
同じ条件、すなわち第２槽における培養細胞の濃度を２
５０　ｇ　／　１）以上の条件のもとに培養細胞の培養
を行ってフェノール類配糖体を製造することから、第１
槽における培養細胞の濃度としては前記範囲の中でも２
５０　ｇ　／１以上とすることが好ましい。第１槽にお
いて培養細胞の濃度を１００〜２５０ｇ／ｌとして培養
した場合には、第１槽の培養細胞を第２槽へ移す際に培
養液を適宜量除去することにより第２槽における培養細
胞の濃度を前述の如＜２５０ｇ／Ｉ１以上とすることが
できる。このときの除去された培養液は第１槽へ循環使
用することができる。

本発明では第１槽における培養細胞の濃度は前述の如＜
１００〜５００ｇ／／の範囲にあるようにして培養が行
われるわけであるが、この点について説明すると、該濃
度が通常の組織培養において採１　リ 用されているような１００　ｇ　／　１２未満の低い濃
度で培養を行う方法では、培養槽の単位容積あたりの培
養細胞の収量が低くなる。従って第１槽の細胞増殖培養
槽において得られた培養細胞を第２槽の反応培養槽に移
してフェノール類配糖体を製造しようとすると、原料と
なる培養細胞の量が不足し、又、重量を確保するために
は第１槽の培養槽の個数あるいは容積の増大を計るなど
しなければならず培養の効率が悪くなる。該理由から第
１槽における培養細胞濃度を１００　ｇ　／ｌ未満とす
ることはフェノール類配糖体を工業的に製造する上で好
ましくない。また第１槽において培養細胞の濃度を５０
０　ｇ　／　７！を越えて高くすると、第１の発明方法
においてフェノール類配糖体製造時の培養細胞の濃度に
関して示したのと同じく細胞が壊死する等の理由により
好ましくない。以上の点から本発明に係わる細胞増殖培
養槽においては培養細胞の濃度は１００〜５００ｇ／ｆ
の範囲で行われる。

本発明に係わる第１槽の細胞増殖培養槽においては、培
養細胞の濃度が前記範囲にあるようにして、培地の栄養
基質濃度を所定の濃度に調整した液体培地を細胞増殖培
養槽に連続的または非連続的に供給する一方、細胞増殖
培養槽の他方より培養液を連続的または非連続的に抜き
出して、該培養槽中の培養液を更新させながら組織培養
が行われる。培養液の更新は連続的であっても非連続的
であってもよい。

ここで栄養基質とは、前述した第１の発明方法で使用す
るのと同じ液体培地の培地成分であって、前記した無機
成分、炭素源、植物ホルモン、ビタミン類およびアミノ
酸類である。

また栄養基質濃度が所定の濃度に調整された培養液とは
、前述したように無機成分を約０．１μＭ〜約１００ｍ
Ｍ、炭素源を約１〜約１００ｇ／ｌ植物ホルモンを約０
．０１〜１０００μＭ１好ましくは１〜１００μＭ、ビ
タミン類を約０．１〜約１５０ｍｇ／　１２、アミノ酸
類をＯないし約１０００ｍｇ／ｌの濃度範囲に調製した
液体培地である。本発明では細胞増殖培養槽に供給され
る培地成分の濃度を前記範囲になるように調整した液体
培地については、通常は新鮮な液体培地を用いることが
好ましいが、該培養槽から抜き出された培地の栄養基質
濃度を調整してからこれを再度循環使用する方法を行っ
ても差し支えない。循環使用する場合には培養液中の細
胞の代謝によって生じる老廃物を適宜除去する処理を行
うことが好ましい。

本発明では培養液を更新させながら組織培養を行うに当
たっては、培養槽中の培養液の量を■〔ｌ〕、培養槽に
供給する液体培地の量をＦＣｌ／ｄａｙ　）として、Ｆ
　／　Ｖ　（ｄａｙ−’）で定義される培地更新率と培
養細胞の比増殖速度μ（ｄａｒ’）の関係がμ≦Ｆ／Ｖ
＜２０μの範囲にあるようにして植物の組織培養を行う
ことが好ましい。ここで比増殖速度μ（ｄａｒ’）とは
以下の方法によって定義される量である。培養槽におけ
る培養細胞の量をＸｏと維持して、増殖した培養細胞を
槽外に排出した場合、を時間（日）後に槽外に排出され
た培養細胞の量をＹｔとすると比増殖速度μは次式で定
義される。

Ｙｔ そしてμのもつその物理的意味は（ｔｉｍｅ−’）の次
元をもち、μΦ値が大きいほど培養細胞の増殖が速いこ
とになる。

本発明では比増殖速度μΦ値は組織培養される植物の種
類によっても異なるが通常０．０２〜０．４〔ｄａｙ−
１〕、好ましくは０．０５〜０．２　（ｄａｙ−’）の
範囲にあるようにして組織培養が行われる、本発明にお
いては、培地の栄養基質の濃度が所定の濃度に調整され
た液体培地を細胞増殖培養槽に連続的または非連続的に
供給する際の供給量ＦＣβ／ｄａｙ　］はμ≦Ｆ／Ｖ＜
２０μの式を満足するようにして決めることが好ましい
ことは前述した通りである。本発明では培地更新率Ｆ／
Ｖの値としては通常０．０２〜８　（ｄａｙ−’）の範
囲にある。

本発明では培養槽の他方より培養液を連続的または非連
続的に抜き出す場合、培養中の細胞増殖培養槽における
培養細胞の濃度を前記した１００〜５００　　（ｇ／７
りの範囲にあるようにして培養液が抜き出され更新され
る。

また本発明ではこの第１槽の細胞増殖培養槽からは培養
液だけではなく培養細胞も抜き出されて第２槽の反応培
養槽へ供給される。培養液を抜き出す場合には特願昭６
１−１６８３８号に示したような排出管にフィルターを
装着したものを用いて培養液のみを培養槽へ抜き取る方
法を用いることもできる。また、培養細胞と共に適宜量
の培養液を第２槽に移すこともできる。

本発明では培地更新率（Ｆ／Ｖ）が比増殖速度μより極
端に大きい２０μ≦Ｆ／Ｖの場合には、組織培養物の黒
化、壊死などの悪影響が通常おこり易い。そこで本発明
では、細胞増殖培養槽においては培地更新率（Ｆ／’Ｖ
）をμ≦Ｆ／Ｖ＜２０μの範囲で制御することによって
組織培養を行うことが特に好ましい。

本発明においては、細胞増殖培養槽の他方より連続的又
は非連続的に抜き出される培養液の量としては、通常は
前述した培養槽に供給される培養量Ｆ　（１２／ｄａｙ
　）に相当する量であるが、必ずしもこの量に限定され
ることは無く、例えば前記したＦ／Ｖ＜μの条件で培養
している場合には必要に応じて培地の抜き出し量をＦ　
（ｊ！　／ｄａｙ　）よりも適宜量増しても差支えない
。

本発明では前記方法によって細胞増殖培養槽から得られ
る培養細胞を、反応培養槽（第２槽）における培養細胞
の濃度が細胞の新鮮な重量で表して２５０　ｇ　／　１
以上となるように、適宜量連続的又は非連続的に第２槽
へ移し、第２槽におけるフェノール類の濃度が５〜２０
ｍＭ／　１）の範囲にあるようにフェノール類を存在さ
せてこの移した培養細胞を培養することにより、該フェ
ノール類に培養細胞に含まれる糖が配糖した配糖体が得
られる。この場合の第２槽における培養方法には、先の
第１発明方法の所で説明したのと同じ方法によって行わ
れる。

フェノール　配　　の八 本発明の前記した第１の発明方法及び第２の発明方法に
よって培養された培養混合物から、例えば以下の方法に
よってフェノール類配糖体を分離することができる。

ろ過によって培養液と分けたカルスを送風乾燥機で乾燥
後、メタノールに浸透し超音波処理を行ってフェノール
類配糖体であるアルブチンを抽出した後、抽出液を濃縮
乾固し、固形物をアルブチンの飽和溶液となるように熱
水または熱エタノールに溶かし、熱時不溶物をろ別し、
ろ液を低温にすることによってアルブチンの結晶を得る
ことができる。

〔発明の効果〕

本発明の方法による植物の組織培養を用いたフェノール
類配糖体の製造方法によれば、従来法に比べて培養槽の
単位容積光たりのフェノール類配糖体の収量を増大させ
ることができ、また培養時間を短縮できるので該配糖体
を効率良く製造できる。また本発明方法によれば該フェ
ノール類配糖体の連続的製造が可能である。

〔実施例〕

以下本発明の方法を実施例によって具体的に示す。

実施例１ アメリカチョウセンアサガオの培養細胞をヒドロキノン
濃度を１０ｍＭにしたリンスマイヤー・スクーグの液体
培地と通気攪拌型培養槽を用いて細胞濃度が３００ｇ／
Ａとなるように仕込んで暗所で２５℃、１２時間培養し
たところ、アルブチンが仕込み培地の単位容積光たり２
５９３　ｇ　／　ｎ生成した。このときのヒドロキノン
のアルブチンへの変換率は９５％であり、乾燥細胞光た
りのアルブチンの収量は２１６ｍｇ／　ｇであった。

実施例２ 培養中、最初に仕込んだヒドロキノンの濃度が２ｍＭま
で低下した時点でさらに１０ｍＭ／７！相当分のビトロ
キノンを添加して培養を合計１２時間続けた以外は実施
例１と同様にして行った結果を表１に示した。このとき
の培養期間中における培地ヒドロキノン濃度の最大値は
１２ｍＭであった。

またこのときのヒドロキノン（ＨＯ）のアルブチンへの
変換率（培養を開始してから任意時間までに培養槽に最
初に供給したＨＱの全量のうち、その任意時間において
何％がアルブチンに変換されたかを示す）の経時変化の
様子を第１図のｆａ）に示した。

実施例３ 実施例２において培養液中のヒドロキノン濃度が４ｍＭ
／ｌに低下した時点で１０ｍＭ／ｌ相当分のヒドロキノ
ンを添加して培養を続け、その後ヒドロキノン濃度が８
ｍＭに低下した時点でさらに１０ｍＭ／ｌ相当分のヒド
ロキノン添加する操作を行った以外は実施例２と同様に
して培養を合計１２時間行った結果を表１に示した。

実施例４〜６ 実施例３でヒドロキノンをカテコール、レゾルシン又は
サルチル酸に変えた以外は該実施例と同様にして培養を
行い０−ヒドロキシフェニルβ−〇−グルコシド、ｍ−
ヒドロキシフェニルβ−Ｄ−グルコシド、又はサリチン
を表１に示した収量で得た。

比較例１〜２，５ 細胞濃度を２００　ｇ　／　４、培地のヒドロキノン濃
度を各々５＋＋＋Ｍ、１０ｍＭ及び３０ｍＭとした以外
は実施例１と同様にして培養を行った結果を表１に示す
。

なお比較例２においてヒドロキノンのアルブチンへの変
換率を実施例２と同様に第１図（ｂｌに示した。

比較例３，４ 細胞濃度を２００　ｇ　／　Ａとした以外は、実施例２
又は実施例３において同じ所定の濃度までヒドロキノン
濃度が低下するまでに要した時間と同じ時間間隔で同じ
量のヒドロキノンを添加して該実施例と同様にして培養
を１２時間行った結果を表１に示す。なお、比較例４の
場合はヒドロキノン３回添加直後のＨＱが２０ｍＭ以上
となるため細胞の障害が起こり、アルブチン収量が低下
したと考えられる。

比較例６ 細胞濃度を３００　ｇ　／　Ｊ　、ヒドロキノン濃度を
３ｍＭとした以外は比較例１と同様にして培養を行った
結果を表１に示す。

比較例７ 細胞濃度を３００　ｇ　／　１とした以外は比較例５と
同様にして培養を行った結果を表１に示す。

天上■脱皿 前述の比較例と実施例で示された本発明の効果を以下の
説明によって更に明らかにする。

（１）　　比較例２と実施例１との関係について；両側
ともに培養槽に供給したフェノール類の総量、培養時間
は同じであるが、細胞濃度を２００ｇ／ｌから３００　
ｇ　／　７！と高くした実施例１ではフェノール類のア
ルブチンへの変換率が９１％から９５％に向上するため
アルブチンの培養槽単位容積当たりの収量は２４７７ｍ
ｇ／ｌから２５９３ｍｇ／ｌに向上する。なお単位細胞
当たりのアルブチン収量は３１０ｍｇ／ｎから２１６ｍ
ｇ／　Ｉｔに低下するが、酸価が低いということはそれ
だけ培養細胞にとってはアルブチンの生産能に余力があ
るということを意味している。

　Ｑ （２）　　比較例３と実施例１の関係について；（１）
の場合と同様にフェノールの供給総量、培養時間は同じ
であるにもかかわらず、細胞濃度を高くすると変換率が
６０％から８０％に高くなるためアルブチン収量は３２
６０ｍｇ／　Ｉ）から４３８５ｍｇ／ｐに増大した。

（３）比較例４と実施例３との関係について；比較例４
ではフェノールを逐次３回添加して培養を行っているが
、該比較例では細胞濃度が２００ｇ／ｉ！と低いために
培地中のフェノールの濃度が最大２２ｍＭまで高くなり
、細胞の損傷が起こるためかフェノール変換率が２７％
に低下した。これに対して細胞濃度を３００ｇ／ｌと高
くした実施例３では、比較例４と同じくフェノールを逐
次３回添加しても、フェノールの消費速度を速くできる
ので培地のフェノールの濃度は１８ｍＭ以下となりフェ
ノール変換率は６１％と高く、従ってアルブチン収量は
比較例４の２１９１ｍｇ／　（１に対して５００４ｍｇ
／　ｊ！と２倍以上にすることができた。

実施例７ （１）　　　オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ　ｊａｐｏｎｉｃ
ａ　）の培養細胞を１０−６Ｍの濃度で２．４−Ｄをホ
ルモンとして含むリンスマイヤーとスクーグの培地で図
１に示した細胞増殖培養槽（第１槽）を用いて培養した
。

培養装置は図１のようなＩＯＮの通気攪拌型培養槽で培
養液の取り出し口に細孔約０．４ｍｍ、濾過面積約１０
ｃＩＩＹのナイロンメツシュを装着し、細胞を含まない
培養液のみを培養槽外へ排出できるようにして培養を行
った。培養は２５℃で２週間続け、その間、培養細胞は
培養槽外へ排出せずに槽内へ蓄積させた。

またこのときの培養液の一日当たりの培地更新率Ｆ／Ｖ
の値は培養槽から排出される培養液のｗ：濃度が０．５
％となるように培養細胞の増殖に応じて０．３〜１．０
　　（ｄａｙ−’）の範囲で制御した。２週間の培養で
細胞増殖培養槽の培養液量の５倍量のリンスマイヤーと
スクーグの培地を供給した。２週間で細胞は約６．６倍
に生育し、３９５ｇ／Ｉｌの細胞濃度となった。

（２）　　　次に、容積１．５１の通気攪拌型培養槽を
用いて、これにヒドロキノン濃度がｌｏｍＭ　（１，１
ｇ／ｌ）となるようにしたリンスマイヤー・スターグー
の液体培地を１）仕込んだ反応培養槽に、先の細胞増殖
培養槽（第１槽）で得られた培養細胞のうち４００ｇの
培養細胞を移して該培地における培養細胞の濃度を新鮮
重量で表して４００ｇ／７！とじ、暗所、２５℃で１２
時間空気を通気しながら培養を続けた、培養終了後、濾
過によって培養液と培養細胞を分離し、培養細胞を乾燥
後メタノールに浸漬し超音波処理によって細胞中のアル
ブチンを抽出する処理によって得られたアルブチンのメ
タノール溶液を液体クロマトグラフで分析したところ、
培養槽に仕込んだヒドロキノンの９９％がアルブチンに
変化していることがわかった。この場合の培養終了後の
処理によって得られる乾燥させた培養細胞の全重量は１
６．６ｇでこのもののアルブチン含量は１６重量％、ア
ルブチン収量は２．７　ｇ　／　Ａであった。また培養
液の単位容積光たりおよび培養時間当たりのアルブチン
収量は５−４　ｇ　／　ｊ！−ｄａｙであり、アルブチ
ンの全収量は５．４ｇであった。

実施例８ （１）　　　実施例１で示したのと同じ方法により、第
１槽の細胞増殖培養槽（培養液の量７０１）でアメリカ
チョウセンアサガオの培養細胞を増殖し、該培養槽中の
培養液中の細胞濃度が約４００ｇ／ｌとなった時点で新
たに増殖してその量を増した培養細胞を培養槽外へ抜き
出してこのときの第１槽における細胞濃度が３５０〜４
５０　ｇ　／　１２の範囲にあるように細胞の増殖を続
けた。該増殖方法によって第１槽からは培養細胞が新鮮
重量で表わして１４〜７０ｇ　／　Ｉｔ−ｄａｙの割合
で生産された。

（２）　　　第１槽で培養細胞を増殖する一方、第１槽
で生産される培養細胞を第２槽の反応培養槽（培養液の
量１０１）に供給して培養を行いアルブチンを連続的に
生産した。すなわち、第２槽にヒドロキノン濃度が１０
ｍＭ、ホルモンとして１０−６Ｍの２．４−Ｄを含むリ
ンスマイヤー・スフ−グの液体培地８１を仕込み、これ
に第１槽で得られた培養細胞３２００　ｇを仕込んで細
胞濃度を４００ｇ／Ｉｌとして２５℃、暗所で空気を通
気しながら培養を行った。培養中ヒドロキノンが細胞に
取り込まれて消費され培養液中のヒドロキノン濃度が低
下するが、ここでは培養の期間中、ヒドロキノン濃度が
１０ｍＭの新鮮なリンスマイヤー・スクーグの液体培地
を反応培養槽に約０．６７４！／ｈｒの割合で供給する
一方、該培養槽の他方から同量の培養液のみを抜き出し
〔培地更新率（Ｆ／Ｖ）は約２〕で培養を１時間行った
。培養終了後実施例１と同様に処理して分析した所、ア
ルブチンが全収量として５７．６ｇ得られた（乾燥細胞
量１２８ｇ　、アルブチン含量４５％）。この量を培養
槽中で占める培養液量および培養時間当たりで換算する
と７．２ｇ　／　ｊ！　−ｄａｙとなる。

該実施例の方法によれば第２槽の反応培養槽を複数個設
置して、第１槽より得られる培養細胞を第２槽に仕込む
時間を適宜ずらして培養を行うことにより、第１槽及び
複数個の反応培養槽を用いてアルブチンを半連続的に製
造することができる。

比較例８ 実施例日で示した第１槽の細胞増殖培養槽（７０＃）に
おいて核種の細胞濃度が約９０ｇ／ｌのときに、この培
養槽で生産される培養細胞を用いて第２槽の反応培養槽
（１０β）で細胞濃度２５０ｇ／１以上の条件で培養し
ようとしたが、この場合には第１槽で生産される培養細
胞の量が少ないため該条件を満たすことができず、第１
槽の培養槽の容量を更に２〜１０倍に大きくするか、該
培養槽の個数を２個以上に増す必要があり、経済的に効
率良くフェノール類配糖体を生産できないことを認めた
。

比較例９ 比較例８において第１槽の細胞濃度を約７００ｇ／ｌと
して培養を行った所、細胞は成育阻害をおこし壊死する
などしたため第２槽への細胞の供給ができずフェノール
類配糖体を製造できなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係わる培養方法（（ａｌ；実施例１〕
および細胞濃度を２００ｇ／４と低くした培養方法（（
ｂｌｉ比較例２〕によってヒドロキノン（ＩＩＱ）から
アルブチンをつくったときのｌ（Ｑ変換率の経時変化の
様子を示した図である。 第２図は本発明の第２の発明の方法に係わるフェノール
類配糖体の連続製造方法を示した図である。 １、培地導入管 ２、培地導入口 ３、培養液のみを排出させるフィルターを装着した開口
部 ４、培養液排出管 ５、酸素含有ガス通気管 ６、攪拌羽根 ７、培養混合物（組織培養物＋培養液）排出管８、加圧
流体送入口

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）フェノール類の共存下に植物の組織培養を行うこ
   とによつてフェノール類配糖体を製造する方法において
   、液体培地中における培養細胞濃度を２５０ｇ／ｌ以上
   （新鮮重量換算）、フェノール類濃度を５〜２０ｍＭ／
   ｌとなるように調整することを特徴とするフェノール類
   配糖体の製造方法。
2. （２）フェノール類の共存下に植物の組織培養を行うこ
   とによつてフェノール類配糖体を製造する方法において
   、予め組織培養帯域において、培養液の更新条件下、液
   体培地中における培養細胞濃度を１００〜５００ｇ／ｌ
   （新鮮重量換算）となるように培養細胞を連続的に増殖
   培養し、かくして得られた培養細胞を反応培養帯域にお
   いて培養細胞濃度を２５０ｇ／ｌ以上（新鮮重量換算）
   、フェノール類濃度を５〜２０ｍＭ／ｌとなるように調
   整しつつ培養細胞を連続的に組織培養することを特徴と
   するフェノール類配糖体の連続製造方法。