JPS6368100A - 生物培養基内とくに血清中のデオキシリボ核酸およびリボ核酸系ウイルス性ゲノムの検出方法および検出装置 - Google Patents

生物培養基内とくに血清中のデオキシリボ核酸およびリボ核酸系ウイルス性ゲノムの検出方法および検出装置

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JPS6368100A
JPS6368100A JP62110397A JP11039787A JPS6368100A JP S6368100 A JPS6368100 A JP S6368100A JP 62110397 A JP62110397 A JP 62110397A JP 11039787 A JP11039787 A JP 11039787A JP S6368100 A JPS6368100 A JP S6368100A
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ウィルス粒子により汚染されるおそれのある
生物培養基試料中でのＤＮＡおよびＲＮＡ系つィルス性
ゲノムの検出に関する。
特に、本発明は、血清のような血液誘導体中のウィルス
検出に適用される。
〔従来の技術〕
輸血の除土ずる大きな問題点の一つに、ウィルスによる
汚染問題がある。この危険性を予知するため、供与体側
で集めた血液試料を系統的に分析して、ウィルスの偶然
存在の有無の判定が行われる。この試料は、分析がマイ
ナス結果を与える時のみ利用される。
この種の汚染を生ぜしめるウィルスは、主としてヘパタ
イトＢウィルス、および非Ａ非Ｂヘパタイト（肝炎）ウ
ィルスである。
たとえば米国では、ヘパタイトＢウィルス保持体の個体
数は、約ａｏｏ、ｏｏｏと見込まれている。ここで考慮
の対象となるのは、５ｉｄａ　（キンゴジカ族）の発見
であり、公知のごとく、他のウィルスは。
輸血により転移される。ここで問題となるのは、個体群
中広く流布している巨大細胞ウィルスのことであり、そ
の問題理由は、成人集団の７０％は、このウィルスの抗
体を示すためである。
〔発明が解決しようとする問題点〕
ところが、現在輸血に際し採用される試験法は、単特異
性であり、ウィルスの知られる時しか検出できない。非
Ａ、Ｂヘパタイトウィルス群も検出がむづかしいが、そ
の理由は、ウィルス群が現状まだ識別されていないこと
による。
なお、従来のテスト法の感度では、汚染された血清体の
検出には役に立たない。
欠陥血清を追試するテスト法としては、以下のものが挙
げられる。
０　ウィルス抗原の検出テスト この例は、ヘパタイトＢ（Ｂ肝炎）の検出テストに該当
し、このものの表面抗原（ＨＢｓ）を凝集反応技術、放
射線免疫技術、または免疫酵素技術を用い測定する。
０　特異性抗体の検出テスト この実例は、抗−ＬＡＶまたは抗Ｔ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　ＩＩ
Ｉ　（Ｓｉｄａ試薬）抗体、抗−巨大細胞ウィルス抗体
の検出方法の場合に相当する。
０　ウィルス酵素の活性度テスト この実際例は、Ｂ肝炎ウィルスのＤＮＡポリメラーゼの
検出の場合に当る。
０　進行性肝炎のあかしとなる非特異性酵素活性度テス
ト この実際例は、トランスアミナーゼの服用量決定の場合
に相当し、非Ａ、Ｂ肝炎については、感度悪くかつ特異
性の劣るテストである。
○　特定ウィルスゲノムを特別検出できる雑種形成テス
ト この実際例は、Ｂ肝炎ウィルスゲノムの検出に当る。
この結果、上記の測定法どのものでも、非Ａ、非Ｂ、肝
炎ウィルス（単、複）を正しく　ｎ＋ｑり得ないし、ま
た、それぞれのテストでは、一つのタイプのウィルスし
か検知できず、また、検出感度も劣るように思われる。
研究すべきウィルスの数が多く、また、ある種ウィルス
の特性データに欠けることから、輸血に際し２つの大き
な問題点が出てくる。
まず第１に、それぞれの血清について行うテスト数は一
層増大するが、このことは、その都度各タイプのウィル
ス（Ｂ肝炎ウィルス、巨大細胞性ウィルス、逆ウィルス
、等）ごとに特定テストを行わねばならぬからである。
なお、この種の試験　−法の経費高も、輸血の際に伴な
う技術的、経済的制約に付加され困難性を高めている。
なおまた、上記試験法の他に、検討ウィルスの種類と無
関係に、抽出、精製操作後ウィルス核酸の検出を行うこ
とが提唱されている。
本試験法は、Ｂ肝炎症状の血清中、ウィルス性ＤＮＡの
検出に利用される。同時にこの方法は、宿主を汚損する
ＤＮＡの加水分解、被覆の破壊、ウィルス被膜の破壊、
ウィルスＤＮＡの抽出、抗ＤＮＡ多分枝系抗体を用いた
、放射線免疫検出後行うポリ・Ｌ・リジン被覆支持体上
への吸着にも関係してくる。
本発明の目的は、ウィルスゲノムにより汚される可能性
ある生物培養基中、ＤＮＡ、ＲＮＡ系ウィルス性ゲノム
の多特異性検出方法を提供することにある。
また別の目的としては、実施しやすく、自動化の容易な
検出方法を提供することにある。
さらに別の目的としては、とくに限定して言えば、血清
中のＤＮＡ、ＲＮＡウィルスゲノムの多特異性検出を可
能とする方法の実施にある。
また他の目的として、この検出方法を実施する装置の提
供が挙げられる。
〔問題点を解決するための手段〕
この方法は、まず、ウィルス粒子により汚染を受けるお
それのある生物培養基試料内のＤＮＡ、ＲＮＡ系ウィル
スゲノムの検出方法に関し、原則的に以下の操作で構成
されている。
０　非ウィルス循環ＤＮＡおよびＲＮＡ核酸を消化し、
かつ、ウィルス性核酸を保存するごとく試料を処理する
こと。
０　被覆をこわし、ウィルス被膜を破壊することにより
、処理試料からウィルス性核酸を抽出し、ついで、この
抽出核酸を変性させること。
０　抽出、変性ウィルス核酸を集積すること。
〇　この集積核酸を検出すること。
この検出方法は、Ｂ肝炎、非Ａ、非Ｂ肝炎、巨大細胞ウ
ィルス、ＬＡＶウィルスおよび５ｉｄａＨＴ　Ｌ　Ｖ　
ＩＩＩ、およびその他すべてのウィルス粒子の検出に適
用できる。
この発明によれば、ＤＮＡおよびＲＮＡウィルス性ゲノ
ムの検出は、このゲノムを含む可能性ある生物培養基各
種のものに適用される。
対象となる生物培養基には、主として動物源、とくに人
の血中誘導体、特に血清、尿、母乳、涙液、唾液、脳を
髄液、羊水、糞便、等が対象として挙げられる。
同様に、樹液のごとき植物質生物培養基を考えることも
できる。
なお、水洗は、乳製品、水等の食料品のごとき生物培養
基にも適用できる。
なお別種培養基例として、ワクチン、培養時の浮上物等
も挙げられ、ワクチンの場合は、その汚染の有無を判定
するのにこの方法を利用する。
なお、血清のごとく、蛋白質に富む生物培養環境試料に
この方法を適用する場合、非ウィルス性循環核酸の消化
処理後およびウィルス性核酸を抽出する以前に、中間操
作段階を持たすと好都合である。この中間操作というの
は、処理試料を精製して含有蛋白質を試料中に維持させ
ることを目的としている。
ウィルスを含まぬ汚染核酸の消化分解操作は、ＤＮナー
ゼとＲＮナーゼとを加え、生じた混合物を反応させたの
ち、この混合物に、ＲＮアジンを添加させるにある。こ
の操作により、生物培養基環境とくに血清から、たとえ
ば血清内循環の非ウィルスの汚染核酸が除去される。
試料内蛋白質をとりのぞく目的で中間精製方法に頼る場
合、この方法に、溶離緩衝液を使い減圧または加圧圧力
差のもとに、ゲル薬包上での溶離濾過工程を組み込むと
好都合である。この結果、遠心分離による面倒な操作に
たよる必要はない。
ウィルス性核酸の抽出、変性操作は被覆およびウィルス
被膜を破壊し、ウィルス性核酸を部分的に脱蛋白させか
つ変性するに好適な抽出混合物とともに前処理試料と培
養することにより有利に進行する。
抽出、変性させたウィルス核酸を集めるには、たとえば
ポリアミド膜またはナイロン膜（正荷電のナイロン６６
のごとき）を用いて濾過操作を行う。
さらに、好ましくは、ゲル薬包を用いた濾過、ウィルス
性核酸を集める操作は、真空ポンプまたは濾過の二操作
を促進させる別の方法に継続依存するに越したことはな
い。
最後に、検出操作は、検出信号を緩解するに好適な物質
を用い、この物質を集積したＤＮＡまたはＲＮＡに対し
親和性を示す他の物質と共役結合させて有利に進行させ
る。
この発明の好ましい実施態様では、この緩解目的の物質
は、無色で可溶性基質を、その場で沈殿析出する着色生
成物に転換しやすい一種の酵素を用いている。
本発明はまた、以下の構成物質を用いた本操作を実施す
る検出装置に関する。
Ｏ処理生物培養基試料を受は入れやすくした少く−１：
）− とも−組の液だめを有する上部支持体。
０　上部支持体の下方に密着し、少くとも、上部支持体
の液だめに対応する１組の貯槽を備え、この貯槽が抽出
混合物を受は入れる構成の下部支持体。
０　多液だめとこれに対応する貯槽間に設けた気密連結
手段。
０　液だめ内の試料と貯槽内部間に圧力差を与え、試料
を貯槽中に吸引させる構成の保持手段。
この装置の別の特徴として、上部支持体を上下両面で仕
切り、多液だめの形状を通常の円筒形とし、底部をろう
斗状とし、このろう斗を、上部支持体の下面に対し、カ
ニユーレにより突出させた構造を持たせている。
多液ためは、その底部に膜をとりつけた円筒管形状を有
する薬包を受けいれやすくさせ、したがってこの薬包に
より、測定すべき試料の蛋白質を保持するに好適なゲル
が得られるごとく構成する。
この発明の検出装置の他の特徴として、下部支持体を上
面と下面により仕切り、各貯槽は上記」二面内にある口
金により導通され、上記口金は、−１ユ１６一 部、下部支持体を相互に密着させた時、上部支持体に対
応する液だめカニユーレを受は入れやすくしている。
またこの発明装置の別の特徴として、少くとも１組の管
路を各貯槽に接続し、上記管路を一方では口金付近にお
いて、他方では下部面で導通させ、これにより、貯槽の
内外圧力差を保持していることである。
この発明の他の特徴によれば、この装置は別に、下部支
持体を保持しやすく、また、この支持体とともに、適当
な手段で減圧可能の室を形成しゃすくした底板を有して
いる。
この発明では、各貯槽に集めたウィルス性核酸を回収す
る目的で、下部支持体が底板上で反転位置がえでき、こ
の際底板と、反転位置にある下部支持体間に中間支持体
を挿入し、がっ、濾過膜を下部支持体と中間支持体間に
挿入できる構造としている。この濾過用膜は、各種貯槽
内のウィルス核酸を真空濾過して回収する目的のもので
ある。
〔実施例〕
以下に本発明の検出方法と、その装置につきさらに詳細
に説明する。
検出装置は通常、平行六面体形状の上部支持体（１０）
から構成され、この六面体は、」二面（１２）、下面（
１４）、対向側面（１６）と（１８）、さらに別の対向
側面（２０）と（２２）で囲まれている。上部支持体（
１０）の厚肉中には、一定間隔に液だめ（２４）を設け
る。実施例第２図では、支持体中、四列六組の液だめ（
竪形）が備わる。
多液だめ（２４）は、１対の円筒部分（２６）を有し、
その上部は上面（１２）に向は開口し、その下部は、ろ
う斗状の底部（２８）に連結し、このろう斗は、カニユ
ーレ（３０）により底部に延長し、下面（１４）の個所
から張り出している。
液だめ（２４）は、それぞれ、一般に円筒状の薬包（３
２）を収納し、このものの下部（３４）は、対応する液
だめ（２６）に嵌入しやすい構造とし、上部（３６）は
、下部（３４）より外径を大きく取っている。
薬包（３２）には環状縁（３８）をとりつけ、支持体（
１０）の上面（１２）と接合しやすくさせる。薬包（３
２）は内径一定とし、下部にフィルター（４０）をとり
つける。この結果、各薬包（カートリッジ）（３２）は
、適当量のゲル（４２）を収納することができる。
下面（１４）の周縁にはリブ（４４）をとりつけ、対応
する溝（４６）との嵌め込みを容易にしている。溝は、
下部支持体（５０）の上面（４８）の周縁に設ける。下
部支持体はさらに、下面（５２）、対向側面の一方側（
５４）　（５６）、対向側面の他方側（５８）と（６０
）で囲むようにする。
支持体（５０）の内側は加工して、２４組の貯槽（６２
）がそれぞれ液だめ（２４）に対応して、とりつけ得る
ごとくする。各貯槽には、円筒部（６４）をとりつけ、
その下部は底面（６６）に接し、上部は、円錐部分（６
８）に連結する。この円錐部は円筒状受口（７０）に接
続し、この部分は上面（４８）に開口させる。
支持体（１０）と（５０）とを相互に重ね取つけた場合
（第３図参照）、多液だめ（２４）のカニユーレ（３０
）は、対応する貯槽（６２）の受口（７０）内に挿入さ
れ、これにより、対応する薬包内のゲル（４２）の濾過
混合物を回収することができる。
濾過操作を行うには、一方で、受口（７０）近くの貯槽
（６２）内に、他方支持体（５０）の下面（５２）内と
接続する導管（７２）を各貯槽（６２）に連結する。こ
の導管（７２）をとりつけるには、下面（５２）の所か
ら各ドリル孔端部が貯槽（６２）の円錐形部（６８）の
レベルにくる深さまで、数個の一方孔をあける。
ついで、数個の水平孔（７６）をあける。穴あけは、側
面（５８）と（６０）からはじめる。ついで、孔（７６
）を（７８）で示すごとくふさぎ、貯槽（６２）が孔（
７４）とだけ通ずるごとくする。
支持体（１０）と（５０）との気密性を保つには、シリ
コン薄板（８０）を支持体（１０）の下面（１４）と支
持体（５０）の上面（４８）間に取りつけると好適であ
り、このシリコン薄板により、カニユーレ（３０）用の
２４の通路が保証される。
支持体（５０）の下面（５２）には、周縁溝（８２）を
設け、底板（８６）の周縁フランジ（８４）上での支持
体（５０）の′気密嵌め込みを容易にする。
この底板（８６）は、通常平行六面体状であり、外部は
下面（８８）を備え、垂直対向側面（９０）と（９２）
、＝２０＝ および他の１組の垂直対向側面（９４）と（９６）とで
囲まれている。底板（８６）の内側はくり抜き、−室（
９８）を収納し、減圧装置に連結した継手（ｉｏｏ）を
介し、減圧状態を保持しやすくさせる。
第３図で示す装置により、２４組の薬包（３２）中の２
４個の試料を同時に濾過し、濾液は各貯槽（６２）内に
集め、この中に、前もって抽出、変性混合物（１０２）
を収納することができる。
この方法の後段階処理では、上部支持体（１０）および
薬包カートリッジ（３２）を取り外し、下部支持体（５
０）を挿入支持体（１０４）のはめこみにより、底板（
８６）上で反転取りつけとする。
この挿入支持体（１０）は、通常平行六面体状をなし、
上面（１０６）、下面（１０８）、一方何の対向面（１
１０）と（１１２）、他方側の対向側面（図示せず）と
により囲まれている。面（１０６）と（１０８）の周縁
にはそれぞれ溝（１１４）と（１１６）とを設け、それ
ぞれリブ（４６）と、フランジ（８４）と協動しやすく
させている。
挿入支持体（１０４）には、円錐形の２４の連結通路を
設け、高所から低所に向け、ラッパ状に開放させる。
別態様として、この通路は、円筒形構造とすることがで
きる。各通路（１１８）の上方開口部（１２０）は、反
転位置に対応する貯槽（６２）の受口（７０）に向き合
っている。各開口部（１２０）は、円環面気密継手（１
２２）により保持されている。なお、濾過膜（１２４）
を挿入支持体（１０４）と下部支持体（５０）間に、反
転位置のもとで挿入する。
第４図では、各貯槽（６２）の内容物を減圧下で濾過す
る構成を示すが、これにより、膜（１，２４）上に貯槽
から送り出される抽出、変性のウィルス核酸を保持する
ことができる。この場合、導管（７２）は。
貯槽（６２）の内部と外気とを連結する役をし、これに
より濾過を行なうことができる。
上記した装置の使用方法を示すと、っぎのとおりである
。
まず、ことなる血清試料中含有のＤＮＡ、ＲＮＡ汚染核
酸の消化分解からはじめる。
各血清試料のたとえば１ｍｆｌ中、Ｍｇ　＋＋イオン存
在下に、５０　μｇ／ｍ　ＱのＤＮナーゼと３０　ｐ　
ｇｅｍ　ＱのＲＮナーゼとを加えて処理操作し、得られ
た混合物を、常温で約３０分間反応させる。ついで、各
血清をＲＮアジンで処理し、ＲＮナーゼを確実に全部破
壊させる。
上記処理した各血清試料をひきつづき薬包（３２）に導
入し、試料中含有の蛋白質を保持させる目的のゲル（４
２）で上記カートリッジ（３２）を満たす。
使用する濾過用ゲルは、たとえばファルマシア社（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）製セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ
）Ｓ３００のものがあり、これにより迅速な濾過と粗分
離が可能である。その根櫨は、ウィルス粒子はたとえば
（数十から数百）百方ドルトンのごとく、きわめて分子
量の高いこと、この粒子はゲルの死容積中で当然溶離さ
れると考えられることによる。
セファクリル５３００は、ビサクリルアミドとデキスト
リンとの一種の混合物であり、かなり硬質の多孔性網目
を有し、この網目中では分子群は、その分子量が低いほ
どそれだけ効果的に捕集される。
低分子量の分子は、比較的長い流路で速度が拘束され、
最終的に溶離を受ける。このゲルは、１０，０００〜１
　、５００　、０００ドルトン分子量の分子を分離する
ことができ、含有Ｋａｖに従えば、それぞれ０．８〜０
．１の値を示す。
各薬包に対し、血清ＩＩＩＩＱを加え、これを吸引溶離
させる。底板（８６）中の室（９８）は負圧に保つ。
溶離には、トリス５０　ｍ　Ｍ　、　２５　ｍ　Ｍ　Ｎ
ａＣ１，１０ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ２、緩衝液１　ｍｌ（ｐ
Ｈ８，０）を用いる。
各薬包内にゲル（４２）を保持する役割のフィルター　
（４０）は、ポリアミド系の膜、たとえばトリペット・
工・ルノー（Ｔｒｉｐｅｔｔｅ　ａｔ　Ｒｅｎａｕｄ）
社製市販のブルテクス（Ｂｌｕｔｅｘ）膜（メツシュ径
１２５　μｍ）で構成されたものが好適である。
各薬包の出口からの溶離液は、対応する液だめ（２８）
上に流下し、相当する貯槽（６２）中ヘカニューレ（３
０）を経由して導入される。
各貯槽中には、前もって、集積溶離液中に含有のウィル
ス核酸を抽出しやすくする混合物量を導入する。ここで
対象となるのは、フォルムアミドのごとき変性剤に頼る
被覆、およびウィルス被膜で保護された核酸抽出用の変
性抽出混合物のことである。
ここで好ましい混合物は、フォルムアミド（７０％）１
００ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　ＮａＣ１０，２Ｍから成
るものであり、フォルムアミドの役割りは、水素と蛋白
質およびＤＮＡとの結合を同時に破壊すること、さらに
、この蛋白質とＤＮＡとを変性させることにある。
ＥＤＴＡは、蛋白質および核酸構造体に含まれる２価の
イオンを捕集するとともにヌクレアーゼ中の補因子マグ
ネシウムを閉じ込める役をする。
この結果、ＤＮアーゼの痕跡が存在する場合は、このも
のは確実に変性を受け、不活性化される。
各貯槽（６２）に含まれる混合物は、約３時間３７℃の
ちとで培養する。この場合、１分間手動がくはんののち
、装置または下部支持体（５０）のみを培養器内部に置
くだけで十分である。
培養を終えたのち、下部支持体（５０）を反転させ、第
４図に示すごとく、支持体を膜（１２４）を挿入した中
間支持体（１０４）上に据える。この膜は、変性　　　
　□を受けた核酸を集め得るように選定する。この目的
に、多種の膜、たとえばポリアミドまたはナイロン質、
ニトロセルローズ質、ＤＥＡＥセルローズ質、酢酸セル
ローズ質、ガラス繊維質、ポロ繊維質等の膜を使用して
もよい。
好適な一実施例としては、ニュー・イングランド・ニュ
ークリヤー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ
）社製、ジェーヌスクリーン（Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ
）名で市販されている膜を使用する。
ボア径が０．２２〜０．４５μｍである荷電ナイロン６
６製膜も対象となる。他の膜実施例は、シュライヘル・
工・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ｅｔ　５ｃｈｕ
ｅｌ］、）社製、ニドラン（Ｎｙｔｒａｎ）市販名のも
のである。この系統の膜であれば、膜がプラス荷電され
ているため、ニトロセルローズ膜に比し、３倍もウィル
ス性核酸を固定することができる。
なお、対象となる固形膜の利用も考えられるが、この場
合は真空焼成を行う必要なく、また、タンポンだけに頼
ることもない。さらに、上記膜は、集積核酸の比色分析
が行われやすい利点がある。
膜（１２４）を用いた濾過操作は、はとんど真空を持た
せぬ状態で約５分間行なう。
２７一 ついで、支持体（５０）をとり外し、濾過膜（１２４）
を回収する。つづいてこの膜を、その上に集められる核
酸存在の有無をたしかめる目的で、分析にかける前に乾
燥させる。
ウィルス性核酸の検出には、多数の方法、とくに検出信
号を緩解する好適な、しかも、ＤＮＡまたはＲＮＡに親
和性ある物質と共役させた物質の利用を含めた方法が挙
げられる。
検出信号を緩解させる好適物質としては、アルカリホス
ファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
、グルコース−オキシダーゼ等の酵素、■１２′−のご
とき同位元素、フルオロクロム、コロイド金等がある。
ＤＮＡまたはＲＮＡに対する親和性物質には、プロタミ
ン、ポリ−リシン、スペルミン、スペルミジン、抗ＤＮ
Ａおよび抗ＲＮＡ（多分枝糸または単分枝系）抗体、蛋
白ヒストン、金属イオン等がある。
本発明の好ましい実施例中、緩解用物質として、無色、
可溶物質を、その場で沈降する着色生成物に転化するに
適した、一種の酵素が挙げられる。
この場合の好適実施例では、あらかじめ乾燥した膜を、
ひきつづき約３０分、膜の非特定位置、すなわち、ウィ
ルス性核酸で占められていない膜位置を閉塞するに適し
た溶液で飽和させる。この飽和操作には、膜を飽和溶液
中に浸漬するか、この飽和溶液を膜を通して濾過すれば
よい。
たとえばこの飽和溶液は、３７０■／ｍｌの牛乳蛋白、
ＢＳＡ（牛の血清アルブミン）３７■／ｍｌ、緩衝液５
０ｍＭ、トリス−ＨＣ１ｐＨ８中０．３％トウイーン、
ＥＤＴＡｌｍＭ、ＮａＣＮａＣ１２５ＩＩＩ　Ｅ　Ｎ緩
衝液）等の溶液とすることができる。つぎに膜を、ペプ
チド結合を利用して、アルカリホスファターゼ分子に結
合させたプロタミン、またはポリーＬ−リジン溶液と接
触させる。
この際の培養は、常温下で約１５分かけて行なう。
アルカリ性プロタミンホスファターゼは、」二記の緩解
用溶液中で希釈し、ついで膜を０．３ｚブリツグ０．５
ＭＮａＣ１（２０ｍ　ｆｉ　／ｃｃ）溶液を用い濾過洗
浄する。
−例として、比色装置を用いて測定するが、この公知の
比色分析では、アルカリホスファターゼを用い、りん酸
ナフトールをナフトールに転換させる。この場合、ナフ
トールは、ファスト−赤と呼ばれる生成物を還元し、無
色で可溶の基質を、即沈降性の着色、不溶の生成物に転
換できる。
他の比色方法は、ＢＣＩＰ　（りん酸−５グロモー４−
クロロー３−インドリル）、およびＮＥＴ　（テトラゾ
リウムニトロ−ブルー）を用いることである。
読み取り操作は、肉眼または反射鏡を用いて行なう。膜
（１２４）で効率的にウィルス核酸を集める場合は、濾
過の際、求める核酸の存在を示す着色しみが検出される
。
公知のごとく、集積した核酸の識別は、別方法、とくに
混成りＮＡ検出方法による。
したがって、Ｂ肝炎ウィルスの場合、ＤＮＡをゾンデを
使って検知できるが、ここで問題となるのは、検討すべ
きウィルス特異テストである。
本発明には、幾多の修正が可能である。たとえば、あら
かじめ処理済みの試料の精製は、磁性ゲルと溶離液とを
永久磁石を使って混合させ行なう。
たとえば磁性ゲルは、Ｉ　Ｂ　Ｆ　＊ｆ’ＪＭａｇｎｏ
ｇａ］の名の市販品を使用する。
本発明の方法および装置について開発された実施態様と
して、ラムダファージが挙げられるが、この方式は、事
実多くの利点を持っている。
まず、培養と滴定が容易であり、これにより、収量を増
し、既定量を血清中に導入することができ、そのバクテ
リオファージの大きさは５０ｎｍ程度であり、最小ウィ
ルス（約１０数ｎｍ）の下限値を示し、人に対し病原体
としてはたらかない。
このファージ・ラムダ（ラムダ−バクテリオファージ）
を使用するウィルス濾過、抽出装置の収率は６０％程度
である。化学的マーク操作のゾンデで得られ、ついで、
フィルター上に保持されるＤＮＡで混成される感度のも
とでは、約１ピコグラムのＤＮＡまで検出することがで
きる。
アルカリホスファターゼに共有原子結合したプロタミン
系列を介して得られるラムダ・バクテリオファージＤＮ
Ａの直接検出程度は、検出ＤＮＡにして１０フエムトグ
ラムであるが、この測定系であれば、５〜１０フエムト
グラムのＤＮＡまたはＲＮＡを検出するとかできる。
本発明の方法は、長持異性であることと、さらに、１０
μｇ　／　ｍ　Ｑ、濃度に至るまで、血清中に存在する
遊離ＤＮＡまたはＲＮＡの測定は、この方法で誤差を生
ずるようなことはない。
混成技術によるＨ　Ｂ　ｓ抗原、およびウィルスＤＮＡ
の陽性血清の場合、本発明の結果は、プラスと出ている
。
同時に、マイナスＨＢ　ｓおよびウィルスＤＮＡ血清を
検査したところ、本発明によれば、マイナス結果を示し
た。
本発明による方法は、従来の単特異性テスト方法にくら
べ大変感度がすぐれている。その感度閾値は、１０３〜
１０’ウイルス粒子／ｍｌであり、一方、従来のテスト
方法による感度限界は、１０′′〜１０″ウィルス粒子
／ｒｎＱであった。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明による装置の側面図を、第２図は、第
１図示の装置の平面図を、第３図は、第２図のｍ−ｍ線
に沿った断面図を、第４図は、第３図に対応した反転装
置の断面図を、それぞれ示す。 （１０）上部支持体　　　　（１２）上部面（１４）下
部面　　　　　　（１６）対向側面（１８）対向側面　
　　　　（２０）対向側面（２２）対向側面　　　　　
（２４）液だめ（２６）円筒部分　　　　　（２８）底
部（３０）カニユーレ　　　　　（３２）薬　包（３４
）下　部　　　　　　（３６）上　部（３８）環状縁　
　　　　　　（４０）フィルター（４２）ゲ　ル　　　
　　　（４４）リ　ブ（４６）溝　　　　　（４８）上
面 （５０）下部支持体　　　　（５２）下　面（５４）対
向側面　　　　　　（５６）対向側面（５８）対向側面
　　　　　（６０）対向側面（６２）貯　槽　　　　　
　（６４）円筒部分（６６）底　面　　　　　　（６８
）円錐部分（７０）円筒状受口　　　　（７２）導　管
　５ｔ　−

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ウィルス粒子に汚染可能の生物培養試料中での遺
    伝子検出方法において、 非ウィルス循環のＤＮＡ及びＲＮＡを消化し、かつ、ウ
    ィルス粒子のウィルス性核酸を保存するごとく試料を処
    理する段階、 ウィルス被膜および被覆を破壊して処理試料からウィル
    ス核酸を抽出し、この抽出核酸を変性させる段階、 抽出、変性のウィルス核酸を集める段階、 集めたウィルス核酸を検出するべく、処理操作を行う段
    階よりなることを特徴とするＤＮＡおよびＲＮＡ系ウィ
    ルス性ゲノムの検出方法。
  2. （２）消化処理後、処理試料を精製して試料中に含まれ
    る蛋白質を保持する中間操作を行うことを特徴とする特
    許請求の範囲第（１）項に記載の検出方法。
  3. （３）非ウィルス汚染の核酸の消化を、試料にＤＮアー
    ゼとＲＮナーゼを加え、ついで生成混合物を反応させ、
    この混合物にさらにＲナシンを加えることを特徴とする
    、特許請求の範囲第（１）項または第（２）項に記載の
    検出方法。
  4. （４）Ｍｇ＾＋＾＋イオン存在のもとに、５０μｇ／ｍ
    ｌのＤＮナーゼの他に３０μｇ／ｍｌのＲＮナーゼを、
    約３０分間、周囲温度条件下で消化を行わすことを特徴
    とする特許請求の範囲第（３）項に記載の検出方法。
  5. （５）予備処理した試料を、緩衝培養基を利用し、圧力
    差のもとに、ゲル薬包上で溶離濾過精製することを特徴
    とする特許請求の範囲第（２）項乃至第（４）項のいず
    れかに記載の検出方法。
  6. （６）ゲルをビスアクリルアミドとデキストリンとの混
    合物構成とし、溶離緩衝溶液をｐＨ８．０のトリス、Ｎ
    ａＣｌ、ＭｇＣｌ＿２混合物構成とすることを特徴とす
    る特許請求の範囲第（５）項に記載の検出方法。
  7. （７）予備処理した試料の精製に、永久磁石を利用した
    溶離時の磁性ゲルの混合物を使用することを特徴とする
    特許請求の範囲第（２）項乃至第（４）項のいずれかに
    記載の検出方法。
  8. （８）ウィルス性核酸の抽出および変性を、被覆および
    ウィルス被膜を破壊し、かつ、一部、ウィルス核酸を脱
    蛋白するとともに変性させるに好適の抽出混合物を用い
    て培養することにより行わせることを特徴とする特許請
    求の範囲第（１）項乃至第（７）項のいずれかに記載の
    検出方法。
  9. （９）抽出混合物の組成を、ホルムアミド７０％、ＥＴ
    ＤＡ１００ｍＭ、ＮａＣｌＯ＿４２Ｍとし、かつ、培養
    条件を３７℃温度下、約３時間とすることを特徴とする
    特許請求の範囲第（８）項に記載の検出方法。
  10. （１０）ウィルス性核酸を、たとえばポリアミド質膜を
    用いて濾過集積することを特徴とする特許請求の範囲第
    （１）項乃至第（９）項のいずれかに記載の検出方法。
  11. （１１）膜を乾燥後、その未使用膜部分をウィルス核酸
    で封鎖するに好適な溶液で飽和させることを特徴とする
    特許請求の範囲第（１０）項に記載の検出方法。
  12. （１２）検出操作として、検出信号の緩解に好適で、か
    つ、ＤＮＡまたはＲＮＡに対し親和性のある物質と適宜
    共役する物質を使用することを特徴とする、特許請求の
    範囲第（１）項乃至第（１１）項のいずれかに記載の検
    出方法。
  13. （１３）検出信号の緩解に好適な物質を、酵素、たとえ
    ば、アルカリ性フォスファターゼ、同位元素たとえばＩ
    ＾１＾２＾５、蛍光色素、コロイド金、等から選定する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項に記載の
    検出方法。
  14. （１４）ＤＮＡまたはＲＮＡに親和性を示す物質の一つ
    を、プロタミン、ポリ・エル・リジン、スペルミン、ス
    ペルミジン、抗ＤＮＡおよび抗ＲＮＡ抗体、ヒストン、
    金属イオン等から選択することを特徴とする特許請求の
    範囲第（１２）項または第（１３）項に記載の検出方法
    。
  15. （１５）アルカリ性フォスファターゼに結合のプロタミ
    ンを利用する、特許請求の範囲第（１２）項乃至第（１
    ４）項のいずれかに記載の検出方法。
  16. （１６）検出信号緩解用物質が、操作時沈殿する着色生
    成物に可溶でかつ無色の物質に転化するに好適な酵素で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第（１２）項乃至
    第（１５）項のいずれかに記載の検出方法。
  17. （１７）生物培養内の試料を、人または動物の生物体液
    、とくに血清、植物体生物液たとえば樹液、栄養食品、
    ワクチン等から選択することを特徴とする特許請求の範
    囲第（１）項乃至第（１６）項のいずれかに記載の検出
    方法。
  18. （１８）ウィルス粒子に汚染可能の生物培養試料中での
    遺伝子検出方法において、 非ウィルス循環のＤＮＡおよびＲＮＡを消化し、かつ、
    ウィルス粒子のウィルス性核酸を保存するごとく試料を
    処理する段階、 ウィルス被膜および被膜を破壊して処理試料からウィル
    ス核酸を抽出し、この抽出核酸を変性させる段階、 抽出、変性のウィルス核酸を集める段階、 集めたウィルス核酸を検出するべく処理操作を行う段階
    よりなることを特徴とするＤＮＡおよびＲＮＡ系ウィル
    ス性ゲノムの検出方法を実施するための装置であって、 生物培養の一試料の収納に好適な少くとも１組の液だめ
    （２４）を備える上部支持体（１０）と、上部支持体（
    １０）の下方に適合し、かつ、上部支持体（１０）の液
    だめ（２４）に通ずる少くとも一組の貯槽（６２）を有
    する下部支持体（５０）、及び抽出混合物（１０２）を
    収納する上記貯槽（６２）と、各液だめ（２４）とこれ
    に対応する貯槽（６２）との間に設けた密着接続装置（
    ３０）（８０）と、液だめ（２４）に収納の試料と貯槽
    （６２）間の圧力差を利用して、貯槽中に試料を固定す
    る手段（９６）（９８）と から構成したことを特徴とする検出装置。
  19. （１９）上部支持体（１０）を、上部面（１２）と下部
    面（１４）により仕切り、かつ、それぞれの液だめ（２
    ４）を通常の円筒形状とし、その底部（２８）をろう斗
    状とし、この部分をカニューレ（３０）を介し、上部支
    持体（１０）の下部面（１４）に対し突出させたことを
    特徴とする特許請求の範囲第（１８）項に記載の装置。
  20. （２０）それぞれの液だめ（２４）と、通常円筒管形の
    薬包（３２）とを適当な組み合わせとし、その底部にフ
    ィルター（４０）をとりつけ、上記薬包はゲルのごとき
    物質（４２）の収容に好適なものとし、これにより、試
    料の蛋白質を保持させることを特徴とする特許請求の範
    囲第（１９）項に記載の装置。
  21. （２１）下部支持体（５０）を、上部面（４８）と下部
    面（５２）とにより仕切り、かつ、それぞれの貯槽（６
    ２）を、上記上面（４８）中、口金（７０）により抜き
    とおす構造とし、上記口金（７０）が、上部支持体（１
    ０）と下部支持体（５０）とを相互に組み合わせる際、
    上部支持体（１０）に対応して液だめ（２４）のカニュ
    ーレ（３０）を収納しうるようにしたことを特徴とする
    特許請求の範囲第（１９）項に記載の装置。
  22. （２２）少くとも１組の管路（７２）を、各貯槽（６２
    ）と接続させ、上記管路を一方で貯槽の口金（７０）の
    近傍に、他方で下部面（５２）中に管通しすることを特
    徴とする特許請求の範囲第（２１）項に記載の装置。
  23. （２３）下部支持体（５０）と気密連結させ、この支持
    体とともに室（９８）とを構成させて適当な装置源を用
    い室（９８）を押し下げるようにできる底板（８６）を
    設けることを特徴とする特許請求の範囲第（２１）項に
    記載の装置。
  24. （２４）各貯槽（６２）内に集積したウィルス性核酸を
    回収するため、下部支持体（５０）を底板（８６）上に
    裏返しとりつけることができ、この底板（８６）と裏返
    し位置の下部支持体間に挿入支持体（１０４）を取りつ
    け、かつ、濾過膜（１２４）を低部支持体（５０）と挿
    入支持体（１０４）間に設けることを特徴とする特許請
    求の範囲第（２３）項に記載の装置。
  25. （２５）挿入支持体（１０４）を上部面（１０６）と下
    部面（１０８）により仕切り、この支持体により、円錐
    状または円筒状の複数導通路（１１８）を、上部から下
    部にラッパ状に形成させ、通路（１１８）の上部開口部
    （１２０）が、対応する貯槽（６２）の口金（７０）に
    対向するごとく構成さすことを特徴とする特許請求の範
    囲第（２４）項に記載の装置。
JP62110397A 1986-05-06 1987-05-06 生物培養基内とくに血清中のデオキシリボ核酸およびリボ核酸系ウイルス性ゲノムの検出方法および検出装置 Pending JPS6368100A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005519602A (ja) * 2002-03-14 2005-07-07 モー，ウルリヒ 培養／暴露装置、このタイプの装置を組み立てるためのキット、および原核生物を培養／暴露する方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8379991A (en) * 1990-09-14 1992-03-26 Astra Aktiebolag A novel method of generating clones for the expression of unfused proteins
US5780222A (en) * 1995-04-10 1998-07-14 Alpha Therapeutic Corporation Method of PCR testing of pooled blood samples
US5834660A (en) * 1995-04-10 1998-11-10 Alpha Therapeutic Corporation Method and system for testing blood samples
FR2753204B1 (fr) * 1996-09-11 1998-12-04 Transgene Sa Procede de preparation d'adn plasmidique
DE59711973D1 (de) * 1997-12-17 2004-11-04 Europ Lab Molekularbiolog Vorrichtung zur Durchführung chemischer Reaktionsfolgen
EP1353752A1 (de) * 2001-12-21 2003-10-22 Tecan Trading AG Vorrichtung und verfahren zum transferieren von fluidproben
PT103561A (pt) 2006-09-08 2008-03-31 Univ Nova De Lisboa Sistema de detecção e quantificação de matéria biológica constituído por um ou mais sensores ópticos e uma ou mais fontes luminosas, processo associado e respectivas utilizações
CN112592821B (zh) * 2020-12-23 2023-09-29 漳州海关综合技术服务中心 Rna病毒样品保存箱

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2125027A1 (de) * 1970-05-20 1971-12-02 Wilson Pharm & Chem Corp Vorrichtung zum Abtrennen von wäßrigen Lösungen aus Suspensionen
US4427415A (en) * 1979-01-05 1984-01-24 Cleveland Patrick H Manifold vacuum biochemical test method and device
US4526690A (en) * 1983-02-04 1985-07-02 Millipore Corporation Apparatus for nucleic acid quantification
US4623627A (en) * 1983-08-19 1986-11-18 Cetus Corporation Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same
GB8331071D0 (en) * 1983-11-22 1983-12-29 Karayiannis P Assay for dna/rna
GB8415998D0 (en) * 1984-06-22 1984-07-25 Janssen Pharmaceutica Nv Staining method

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005519602A (ja) * 2002-03-14 2005-07-07 モー，ウルリヒ 培養／暴露装置、このタイプの装置を組み立てるためのキット、および原核生物を培養／暴露する方法

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