JPS637755B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はDL―アミダーゼ活性を有する微生物
の、Ｌ―アミダーゼ活性を促進させる方法に関
し、種種のＬ―アミノ酸の製造に利用することが
できる。 （従来技術） 光学活性なアミノ酸のうち、天然タンパク質あ
るいはペプチドホルモンを構成しているものの多
くはＬ―型であり、また、人間にとつて必須な20
種のアミノ酸もＬ―型である。従つて、Ｌ―アミ
ノ酸を選択性よく製造しようとする試みは多くあ
る。しかし、従来の光学活性アミノ酸の製造技術
は発酵法によるものが多く、発酵法では、微生物
の代謝産物の中からアミノ酸を分離、精製しなけ
ればならない。微生物の代謝産物は蛋白質、ペプ
チド、炭水化物、脂質等の混合物であり、これら
の中からアミノ酸を分離、精製することは、多く
の工程と手間がかかるという問題がある。 この問題を解決する一つの方法として、アミノ
酸の合成中間体であるアミドを酵素的に加水分解
し、Ｌ―アミノ酸を製造する方法が知られてお
り、この方法に利用されるＬ―アミダーゼを産生
する微生物の存在も知られている。一方、DL―
アミダーゼを産生する微生物も知られているが、
これはそのまま上記の方法に利用することはでき
ない。 （発明の目的） 本発明は、DL―アミダーゼ活性を有する微生
物の培養条件を検討することにより、Ｌ―アミダ
ーゼ活性が、Ｄ―アミダーゼ活性よりも大きくな
り、Ｌ―アミドを優先的にＬ―アミノ酸に変換さ
せうる酵素活性を持つ微生物を培養する方法を提
供することを目的とする。 （発明の構成） 本発明者らは、多くの微生物について検討した
結果、多くのＬ―アミダーゼ活性を有するものと
DL―アミダーゼ活性を有するものを見出した。
これらのうちDL―アミダーゼ活性を有するもの
はＬ―アミダーゼ活性を有するものよりＬ―体生
成活性が高いものもあつた。従つて、本発明者ら
はDL―非特異的な微生物について、Ｌ―特異性
のみを残し、かつＬ―アミダーゼ活性の高い微生
物を得るため、培養条件を種々検討した結果、本
発明を完成した。 即ち本発明は、シユードモナス属、バチルス
属、スタフイロコツカス属、およびマイコバクテ
リウム属に属するDL―アミダーゼ活性を有する
微生物を培養するに際し、培地中の窒素源とし
て、0.05ｇ／以上のポリペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、肝臓エキスあるいは尿素より選ば
れる一種以上の有機物を用いることを特徴とする
Ｌ―アミダーゼ活性の促進法である。 本発明者らはDL―アミダーゼ活性を有する微
生物の培養条件について、PH、温度、炭素源、窒
素源、微量成分などの効果について種々検討した
結果窒素源が、アミダーゼ活性に最も大きな影響
を与える事を見いだした。即ち、DL―アミダー
ゼ活性は培地にアミドを加えて培養することによ
り促進された。培地に添加するアミドはアセトア
ミド、プロピルアミド、ブチロアミド等も効果的
であつたが、好ましくは目的とするＬ―アミノ酸
の合成中間体であるDL―アミド、Ｄ―アミドあ
るいはＬ―アミドを用いるのが良い。しかし、こ
のようなアミドを添加した培地により培養した菌
株はDL―アミダーゼ活性が誘導される事が多く、
目的とするＬ―アミダーゼ活性のみを促進する事
は極めて困難であつた。 ここで本発明者らは、更に検討の結果、前述の
アミド以外の窒素源をさらに培地中に添加するこ
とによりＤ―アミダーゼ活性とＬ―アミダーゼ活
性の比Ｄ／Ｌは０〜１／１に変る事を見いだし
た。即ち、培地中の窒素源を選択する事によりＤ
―アミダーゼ活性をゼロとし、Ｌ―アミダーゼ活
性のみを有する菌体を得ることもできた。 なお、本発明においてアミド類の添加は、使用
する微生物のDL―アミダーゼ活性が元来低い場
合には、とくに有効であるが、DL―アミダーゼ
活性の高い微生物を使用する場合には、添加せず
とも本発明の効果を達成することができる。 本発明において、DL―アミダーゼ活性を有す
る微生物とは、シユドモナス属、パチルス属、ス
タフイロコツカス属、あるいはマイコバクテリウ
ム属等に属する公知の微生物を使用することがで
きる。 培地中の窒素源として加えるポリペプトン、酵
母エキス、肉エキス、肝臓エキスあるいは尿素等
の有機物は、0.05ｇ／以上の濃度で使用するこ
ととが好しく、それ以下では、本発明の目的であ
る微生物のＬ―アミダーゼ活性を促進する効果は
小さい。 なお、硫安、硝安等の無機の窒素源を加えた場
合も本発明と同様、Ｌ―アミダーゼ活性の促進効
果が見られたが、本発明の有機物の場合と比較す
ると満足なものではなかつた。又、本発明者等は
炭素源についても種々検討したが、アミダーゼ活
性に顕著な影響を及す炭素源は見られなかつた。
ただし、菌の生育を促進させるという観点からは
グリセリン等の添加が好結果を与えた。 （発明の効果） 本発明の培養条件により得られた菌株、または
菌株から抽出した酵素は、Ｌ―アミダーゼ活性の
高いものであり、この酵素を用いてDL―アミノ
酸アミドを基質として、加水分解反応を行えばＬ
―アミノ酸の収率は著しく増加する。 実施例 １ マイコバクテリウム アリウム（Mycobacteri
―um arium） 1FO―3153株を下記の表に示す
培地Ａを用いて２日間培養し、集菌後DL―バリ
ンアミドを基質として、基質濃度50mM、PH7.0
（0.05Mリン酸カリ緩衝液）、反応温度25℃で、ゆ
つくり撹拌させながら反応させた。24時間経過
後、反応液を高速液クロ法により分析した。分析
のカラムはキラルパツク（ダイセル化学工業株式
会社製）で、生成するアミノ酸のＤ体とＬ体を分
離定量出来るものを用いた。分析の結果、DL―
バリンアミドのＬ―バリンへの転化率は48％であ
り、Ｄ―バリンは検出されなかつた。比較のた
め、下記の表に示す培地Ｂを用いて培養し、上記
の同一条件で反応させた結果は、24時間の反応で
Ｄ―バリンとＬ―バリンの比Ｄ／Ｌは１／１であ
つた。

【表】 実施例 ２ バチルス サブチルス（Bacillus subtilis）
IFO―3134株を実施例１に示したＢ培地により27
℃で１週間培養して得た菌を(イ)とする。(イ)の一部
を種菌として、前記Ａ培地を用いて27℃で５日間
培養して得た菌を(ロ)とする。(イ)または(ロ)を用いて
実施例１と同様の条件で反応させた結果、24時間
後、(イ)を用いた系ではＤ―バリン、Ｌ―バリンの
濃度は夫夫14mMおよび7mMであつた。(ロ)を用
いた系では、Ｄ―バリンは検出されなかつたが、
Ｌ―バリンは7mMであつた。 実施例 ３ 実施例１のＡ培地のポリペプトンの変りに牛肉
エキスを入れた培地によりシユードモナス イオ
デイウム（Pseudomonas iodium）IFO―3558株
を27℃で２日間培養した菌株により実施例１）と
同様の反応を行つた結果、Ｌ―バリン濃度は
20mMであり、Ｄ―バリンは検出されなかつた。
また、別に、Ａ培地のポリペプトンの変りに尿素
を1.3ｇ、または酵母エキス10ｇを入れて培養し
て得た菌を用いた反応の結果もほゞ同様の結果を
得た。 実施例 ４ 実施例１のＡ培地によりスタフイロコツカス
アウレウス（Staphylococcus aureus）FDA―
209P株を27℃、５日間培養した菌株を用いて、
実施例１と同様の反応を行なつた。24時間後のＬ
―バリンの濃度は17mMであり、Ｄ―バリンは、
検出されなかつた。 比較例 １ 実施例１のＢ培地によりPseudomonas
iodiumIFO―3558株を27℃で５日間培養した菌
株を用いて実施例１と同様の反応を行つた。24時
間後のＬ―バリンとＤ―バリンの収率の比はＬ／
Ｄ＝２／１であつた。 比較例 ２ スタフイロコツカス アウレウス
（Staphylococcusaureus）FDA―209PをＢ培地
により27℃、５日間培養した菌を用いて、実施例
１と同様の反応を行なつた24時間後の結果ではＬ
体とＤ体の比Ｌ／Ｄ＝10／１であつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス（Pseudomonas）属、バチ
   ルス（Bacillus）属、スタフイロコツカス
   （Staphylococcus）属、およびマイコバクテリウ
   ム（Mycobacterium）属に属するDL―アミダー
   ゼ活性を有する微生物を培養するに際し、培地中
   の窒素源として、0.05ｇ／以上のポリペプト
   ン、酵母エキス、肉エキス、肝臓エキスあるいは
   尿素より選ばれる１種以上の有機物を用いること
   を特徴とするＬ―アミダーゼ活性の促進法。