JPS6379897A - ポリヌクレオチドの保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、ポリヌクレオチド合成装置を用いてポリヌク
レオチドを合成するに際して、反応生成物であるポリヌ
クレオチドの保存方法に関する。

発明の技術的背景ならびにその問題点 近年に至って遺伝子工学に代表される分子生物学が急速
な発展をとげ、これに伴ってデオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）あるいはり小核酸（ＲＮＡ）を構成するポリヌクレオ
チドを合成しようと覆る試みが盛んに行なわれている。

ポリヌクレオチドは、アデニン、グアニン、シトシンあ
るいはチミンの４種の核酸ｇ、ａ　ｗとデオキシリポー
スとが結合してなるデオギシリ小ヌクレオシドにリン酸
が結合したヌクレオチドか、複数個連なった構造をｈ−
シており、このポリヌクレオチドを合成するには、リン
酸トリエステル法か従来採用されてさた。ところかこの
リン酸トリエステル法では５価のリン酸が用いられるた
め、活性が低いという問題点があった。

このため、ポリヌクレオチドを合成重るに際して、反応
活性に富む３価の化リン酸トリエステルを用いるホスフ
ァイト法が広く採用されるようになってきた。このよう
なホスフン・イ１〜法によりボリヌクレオチドを合成す
るには、通常、次のような４つの工程（ａ）〜（ｄ）が
必要でおる。

（ａ）担持体に結合されたヌクレオシドの５′位の保護
基であるトリチル基などを酸によって切断し、ヌクレオ
シドの５−位を水Ｍｌに変える工程（脱保護基工程）。

（ｂ）次いでこの水酸基に、テトラゾールなどによって
活性化されたＮ、Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト
などの、アデニン、グアニン、シトシンあるいはチミン
のいずれかの１が結合したアミダイトを反応させてホス
ファイトを形成させる工程（カップリング工程）。

（Ｃ）カンプリング工程で得られたホスフッ・イトをヨ
ウ素、テトラヒドロフラン、２，６−ルヂジン、水など
からなる試薬を用いて酸化する工程（酸化工程）。

（ｄ）カップリング工程で反応しなかったヌクレオチド
の５−位水酸基を、無水酢ｆＪａＪ３よびジメヂルアミ
ノビリジンなどからなるキャッピング液を用いて保護す
る工程（キャッピング工程〉。

上記の４つの工程は、脱保護基工程、カップリング工程
、酸化工程、キャッピング工程の順序で行なってもよい
が、場合によっては、脱保潟阜工程、カップリング工程
、キャッピング工程、酸化工程の順序で行なってもよい
。

そして上記のような４つの工程からなるポリヌクレオチ
ドの合成工程では、通常、上記の各工程の間にはアセト
ニトリルなどの洗浄液を用いた洗浄工程が挿入されてお
り、各工程が不純物の存在しない状態で進行するように
されている。

このような小すヌクレオチドの合成操作は手作業で行な
うには煩雑であるため、上記の各工程に必要な反応原料
、試薬、溶媒などを、自動的に順次反応器に供給し、次
いで排出するように構成されたポリヌクレオチド合成装
置が提案されている。

ところがこのようなポリヌクレオチド合成装置では、ポ
リヌクレオチドの合成反応が終了した後、反応系をアセ
トニトリルなどの洗浄液で洗’＜多して、この洗浄液中
に得られたポリヌクレオチドずなわらヌクレオチドオリ
ゴマーを保存していた。

ところが得られたヌクレオチドオリゴマーをアセトニト
リルなどの洗浄液中に保存しておくと、俊にヌクレオチ
ドオリゴマーを再び反応に利用しても効率よく鎖の延長
されたポリヌクレオチドを１？ることができないことが
、本発明者らによって見出された。

本発明者らは、この理由について鋭意検討したところ、
ｉｑられたヌクレオチドオリゴマーの５−末端は、通常
、ジメトキシトリチル樋などのトリチル基類によって保
へ隻されているが、ヌクレオチドオリゴマーの５−末端
を保δしているトリチル基類は、アセトニトリルなどの
洗浄溶媒中でｌ１１１！離してしまうことがおり、この
ため得られたポリヌクレオチドオーリゴマ−が安定に保
存８れないことを見出した。このような問題点を解決１
べくさらに検討したところ、ポリヌクレオチドの合成反
応を特定の工程で終了させ、得られたヌクレオチドオリ
ゴマーを特定液中に保存りればよいことを見出して、本
発明を完成りるに至った。

発明の目的 本発明は、上記のような従来技１＋トｉに伴なう問題点
を解決しようとするものであって、ポリヌクレオチド合
成装置を用いて合成されたポリヌクレオチドを、ポリヌ
クレオチド合成装置中にこのポリヌクレオチドかあまり
分解することなく高い保存率で安定に保存しつるような
、ポリヌクレオチドの保存方法を提供づることを目的と
している。

発明の８！！は 本発明に係るポリヌクレオチド合成装置にお【Ｊるポリ
ヌクレオチドの保存方法は、ポリヌクレオチド合成反応
に必要な反応原料、試薬、溶媒などを所定の順序で反応
器に給液し、次いて排出りるように構成されたポリヌク
レオチド合成装置を用いてホスファイト法により合成さ
れたポリヌクレオチドをポリメクレオＪ−ド合成技買中
に保ｑ７Ｉるに際して、ポリヌクレオチド合成反応をキ
ャッピング工程で終了させ、得られたポリヌクレオチド
をキャッピング工程で用いたキャッピング液中に保存す
ることを特徴としている。

本発明に係るポリヌクレオチド合成装置にｊ＞（するポ
リヌクレオチドの保存方法では、ポリヌクレオチド合成
反応をキャッピング工程で終了させ、得られたポリヌク
レオチドをキャッピング液中で用いたキャッピング液中
に保存しているため、１岑られたポリヌクレオチドを、
このポリヌクレオチドがあまり分解することなく高い保
存率で安定に保存しうる。

発明の詳細な説明 以下本発明に係るポリヌクレオチド合成装置にｄ５ける
ポリヌクレオチドの保存り法について、具体的に説明覆
る。

まず、本発明で用いられるポリヌクレオチド合成装置の
一例について、図面を参照しながら説明すると、図中符
号１は不活性カス（窒素ガス）のホンへ、２は溶＾リビ
ン、３〜６は試薬ビン、７〜１０ｉ、を原料ビン、１１
は反応器、１２は制御手段である。

ボンベ１に充填されているＮ２ガスは、調圧弁１３、デ
ィストリビュータ１４ａを杆Ｃ溶剤ビン２、試薬ビン３
〜６、原料ビン７〜１０に送られ、該Ｎ２ガスの圧力に
より溶剤、試薬、原料が流路１４ｂ（１ｓφ程度の細い
チューブからなる）を経て反応器１１に送られる。また
Ｎ２ガスはオリフィス１５、流路１４ｂを経て反応器１
１に送られる。オリフィス１５は、Ｎ２ガスにより反応
器１１内でバブリングするときオーバーフローしないよ
うにＮ２ガスの流量を制限する役割を果している。Ｎ２
ガスは、通常、モレキュラシーブス等の乾燥剤により乾
燥され、フィルタでろ過された後、用いられている。不
活性ガスとしては、Ｎ２ガスのほかに、ヘリウム、アル
ゴンなどを使用づることかできる。

溶剤ビン２にはアセトニトリルなどの溶剤、試薬ビン３
にはトリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸なとの脱保護基剤、
試薬ビン４にはヨウ素、テトラじドロフラン、２，６−
ルヂジン、水などからなる酸化剤、試薬ビン５には無水
酢酸とジメチルアミノピリジンとの混合物などのキャツ
ピング剤、試薬ビン６にはテトラゾール、テトラヒドロ
フラン、アセトニトリルなどからなる活性化剤がぞれぞ
れ充填されている。また原料ビン７、原料ビン８、原料
ビン９、原料ビン１０には、それぞれアデニン（Ａ）、
グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ＞を
塩基として含むホスホアミダイト（ヌクレオチド試薬）
と溶剤とからなる溶液が充填されている。

試薬ビン３，４．５の入口側にはそれぞれ逆止弁１６．
１７．１８が設けられていて、脱保護基剤、酸化剤、キ
ャツピング剤の然気やミストが流路１４ｂを逆流して他
のビン内に流入りるのを阻止するようになっている。

流路’１４ｂには電磁弁１９か設けられ、また流路１４
ｂのビン２〜１０の出口側にはそれぞれ電磁弁２０〜２
８が設けられ、また流路１４ｂの反応器１１の底部側と
頂部側にはそれぞれ電磁弁２９〜３２が設けられている
。これら電磁弁１９〜３２は制御手段（プログラマブル
コントローラ）１２により制御されて開閉するようにな
っている。

電磁弁１９は二方弁で通電時に聞き、また電磁弁２０〜
３０は三ノｉ弁で通電時に点線部分か実線部分と連通し
、また電磁弁３１．３２は三方弁で通電時に実線状態か
ら点線状態に切り替わる。

次に、このようなポリヌクレオチド合成装置の一般的な
操作す法について説明Ｊると、反応操作に際しては、ま
ず、反応器１１内に例えばチミンヌクレオシド（丁）を
結合させた多孔質ガラスの担持体（サポート）を充填し
、次いで制御手段１２を動作させると、該制置手段１２
に６２定したプログラムの内容に従って電磁弁１９〜３
２が順次開閉されて、ラインバージ工程→洗浄工稈→脱
保４基工程→洗）１）工程→カツブリングエ桿→洗浄工
程→酸化工程−洗浄工程→キャッピング工程→洗）ｐ工
程が行われる。

以上がポリヌクレオチド合成装置のＩＨで必る。

本発明では、このようなポリヌクレオチド合成装置を用
いてホスファイト法によりポリヌクレオチドを合成し、
得られたヌクレオチドオリゴマーをこのポリヌクレオチ
ド合成装置に保存づるに際して、ポリヌクレオチドの合
成反応をキャッピング工程で終了させ、ｊｑられたヌク
レオヂドオリゴマー（ポリヌクレオチド）をキャッピン
グ液中に保存りる。

この際用いられるキャッピング液としては、無水酢酸な
どの酸無水物、フェニルイソシアネート、ジエチルモノ
トリアゾロホスファイトなどが用いられ、また必要に応
じてＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン、Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアミノピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノビ」ワンな
どの塩基を併用（ることができる。このうらキャッピン
グ液としては、無水酢酸などの酸無水物と、Ｎ、Ｎ−ジ
メチルアミノピリジンなどの塩基との混合物が特に好ま
しく用いられる。

このようにポリヌクレオチド合成装置で合成されたポリ
ヌクレオチドを、キャッピング液中に保存すると、得ら
れたポリスクレオチドの５′末端を保舌するジメトキシ
トリチル基などの保ム５基類は、キャッピング液中に脱
離せず、したがって得られたポリヌクレオチドを高い保
存率で保存］ることか可能となる。

なお、以上の説明は、便宜上、デオキシリボ核酸を例に
挙げて行なったが、本発明のポリヌクレオチドにリボ核
酸などのその他の核酸類も含まれることはいうまでもな
い。

発明の効果 本発明に係るポリスクレオチド合成装置にｄ３けるポリ
スクレオチドの保存方法では、ポリヌクレオチド合成反
応をキャッピング工程で終了さぜ、１ｑられ！ごポリヌ
クレオチドを・４ニャッビングエｆ？で用いたキャッピ
ング液中に保存しているため、１ｄられたポリヌクレオ
チドを、このポリヌクレオチドがあまり分解することな
く高い保存率で安定に保存しうる。

以下に本発明を実施例（こより説明するか、本発明はこ
れら実施例に限定されるものではない。

実施例１ 図面に示１ようなポリヌクレオチド合成装置を用いて、
ヌクレオチドが３０個連々ったポリスクレオチドを合成
した。

この際、ポリスクレオチドの合成反応をキャッピング工
程で終了させ、５−末端かジメトキシトリチル基で保護
されたポリスクレオチドを、無水酢酸とＮ、Ｎ−ジメチ
ルアミノピリジンとの混合物からなるキャッピング液中
に室温で保存した。

１時間保存後、５時間保存後および２４時間保存後に、
それぞれ１ｑられたポリヌクレオチドを所定方法で後処
理（脱保護）し、生成物を高速液体クロマトグラフィー
にて分析して、ジメトキシトリチル基の付いたポリスク
レオチドの割合、りなわら保存率を測定した。

結果を表１に示す。

比較例１ 実施例１にＪ３いて、ポリスクレオチドの合成反応を、
キャッピング工程で終了させ、次いでアし１〜ニトリル
で反応系を洗浄し、得られたポリスクレオチドをそのま
まアセトニトリル中に保存した以外は、実施例１と同様
にした。

結果を表１に示す。

比較例２ 実施例１において、ポリスクレオチドの合成反応を、キ
ャッピング工程で終了させ、次いでアセトニトリルで反
応系を洗浄した後、アセトニトリルを除去した状態で、
得られたポリヌクレオチドを保存した以外は、実施例１
と同様にした。

結末を表１に示す。

表　　１ 表１から、ポリヌクレオチド合成反応をキャッピング工
程で終了させ、得られたポリヌクレオチドをキャッピン
グ工程で用いたキャッピング液に保存することによって
、高い保存率でポリスクレオチドを保ｑしうろことかわ
かる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で用いられるポリヌクレΔヂド合成装
置の説明図である。 １・・・ボンベ　　　２〜６・・・溶剤、試薬ビン７〜
１０・・・原料ビン　　１１・・・反応器１２・・・制
御手段

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）ポリヌクレオチド合成反応に必要な反応原料、試薬
   、溶媒などを所定の順序で反応器に給液し、次いで排出
   するように構成されたポリヌクレオチド合成装置を用い
   てホスファイト法により合成されたポリヌクレオチドを
   ポリヌクレオチド合成装置中に保存するに際して、ポリ
   ヌクレオチド合成反応をキャッピング工程で終了させ、
   得られたポリヌクレオチドをキャッピング工程で用いた
   キャッピング液中に保存することを特徴とするポリヌク
   レオチド合成装置におけるポリヌクレオチドの保存方法
   。