JPS6384490A - プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ブラスミノーゲンアクチベーター前駆体（以
下、前駆体という）の産生増強方法に関する。更に詳し
くは、本発明は、ブラスミノーゲンアクチベーター前駆
体をコードするＤＮＡ配列を組み込んだベクターを用い
て形質転換させたヒト腎由来株化細胞を培養して、ブラ
スミノーゲンアクチベーター前駆体を生産するに際して
、培地に少なくとも中性アミノ酸を含むことを特徴とす
るブラスミノーゲンアクチベーター前駆体の産生増強方
法に関する。

［従来の技術］ 本発明の前駆体はそのままでは不活性であるが、プラス
ミン処理することにより酵素活性を発現する、いわゆる
チモゲンの一種である。この前駆体はヒト腎細胞の無血
清培地中にて生成できる。本前駆体はアミノ酸４１１個
の鎖状構造を有しており、分子ｆｉ　５４．０００、フ
ィブリンに特異的な親和性を示し、従来のウロキナーゼ
とは全く異なる性質を有する。また、合成基質法では活
性が認められず、平板法で活性を示す（特開昭６Ｏ−６
２９８１）。

本前駆体は最近、遺伝子工学を応用した産生方法が展開
しつつある。例えば、本前駆体をコードするＤＮＡ配列
（特開昭６０−１８０５９１）　、そのＤＮＡ配列を組
み込んだベクターを用いて形質転換させた動物細胞（特
願昭６０−１７９６９１、そのＤＮＡ配列を組み込んだ
ベクターを用いて形質転換させたヒト腎由来株化細ｖｉ
（特願昭ｆ３（１−２９０３２５＞などが知られている
。

［本発明が解決しようとする問題点］ ところが、これらの形質転換細胞、特に大賢由来の株化
細胞を宿主に用いても、本前駆体の産生効率は充分であ
るとは言えない。また、ヒト以外の由来細胞を用いるこ
とは、異種蛋白が混入し除去しにくく、本来の糖鎖とは
異なるものがつく可能性があるため好ましくない。

そこで発明明各らは、上記目的を解決するために、前駆
体の産生増強について鋭意検討した結果、前駆体をコー
ドするＤＮＡ配列を組み込んだベクターを用いて形質転
換させたヒト腎由来株化細胞の培養培地中に、少なくと
も中性アミノ酸を含ませることにより、前駆体の産生を
向上できることを見いだし、本発明を完成した。

［問題点を解決するための手段］ （＋）　　前駆体産生細胞の：ｌ製 前駆体産生細胞の原料（宿主）としてヒト腎由来株化細
胞を用いる。

この宿主細胞の核内に前駆体発現用ベクターを挿入する
ことにより形質転換が行なわれる。

前駆体発現用ベクターは、発現系遺伝子として例えば５
Ｖ−４０に由来するエンハンサ−１初期プロモーター、
ポリアゾニレ−ジョンシグナル及び前駆体をコードする
遺伝子から構成される。又他の動物ウィルスや動物細胞
に由来するプロモーターなども使用できる。

形質転換は、シャーレに約５〜７　ｘ　１１０５ｃａｌ
ｌｓ１０　／　１００朧ｄｉｓｈの割合で宿主細胞を調
製し、これに前駆体発現用ベクターをＤＮＡ　ｉとして
２〜４μび加える。ＤＮＡを宿主細胞にとりこまぜた後
、培養を行い形質転換細胞の選別をおこなった。選別さ
れた細胞は、好ましくは、繊維状・粒状の細胞が付着可
能な培養用担体によって増殖される。

担体は、より好ましくは、プラスに荷電処理されたガラ
ス、ダクロン、テフロン、ナイロン、オルロン等が例示
される。この担体は、通常培地に対して、０．００１〜
０．５ｇ／Ｊ　、好ましくは０．０１〜０．２０グ／　
ｃｔｔｒ　３程度の密度で培養器に充填する。

（２）　　　前　　培　　養 コ（１）種細胞を２０万〜３０万ｃｅｌｌｓ　／ｌｄ植
え込み、培地（たとえば、ｔ＋ａｙｍｏｕｔｈ培地ある
いはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄＢｉｅｄ　ＨＥＭ培
地に熱不活化牛胎児血清２〜５　ｗ／ｖ％を添加したも
の）を用いて２〜３日間培養を続けた後、必要ならば培
地を新しく交換して継代培養し、細胞数を１００万〜２
００万ｃｅｌｌｓ　／ｌｄに調整する。

（３）　　　本　　培　　養 基本培地としては、たとえばＷａｙｍｏｕｔｈ培地ある
いは０ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＨＥＭ
培地にＯ，ＯＳ　〜０．２Ｗ／Ｖ％ヒト血清アルブミン
を添加した無血清培地が用いられる。

これに本発明の特徴である、中性アミノ酸が添加される
。中性アミノ酸としてはグリシン、アラニン、ロイシン
、イソロイシン、フェニルアラニン等の脂肪族アミノ酸
などが例示されるが、好適にはグリシンが用いられる。

添加量としては０．１〜２　Ｗ／Ｖ％が例示される。添
加量が、０．１％以下では産生能が十分上がらず、また
、３％以上では、毒性が上がって産生能向上にはマイナ
スとなるためである。また、有機酸またはその塩を併用
してもよい。

有ｍ酸としては炭素数３〜１８のものであれば特に限定
されない。通常は、カルボン酸、特に飽和または不飽和
脂肪族カルボン酸（就中、モノカルボン酸またはジカル
ボン酸）が好適に使用される。

当該有ｉ酸は置換基として、たとえば水酸基等を有して
いてもよい。かかる有機酸としては、フマル酸、コハク
酸、リンゴ酸、クエン酸、ステアリン酸、オレイン酸、
リノール酸、バルミチン酸、リルン酸、ミリスチン酸な
どが例示される。特に好適には、コハク酸などの脂肪族
ジカルボン酸が使用される。上記有ｎ酸の塩としては、
生理的に受は入れられる塩、たとえばアルカリ金属塩（
ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩
（カルシウム塩など）などを用いることができる。これ
らの有機酸もしくはその塩の添加Ｍとしては０，１〜３
　ｗ／ｖ％が例示される。

また他に添加物として公知であるラクトアルブミン氷解
物、トランスフェリン、インシュリン等のホルモンなど
を添加してよい。

培養は、例えば前駆体産生細胞５０万〜２００万ｃｅｌ
ｌｓ／ｍを一定に維持しながら、上記培地中で行って、
前駆体を産生させ、２〜３日毎に培養培地を新しく交換
する。そしてこの交換した培地中に存在する前駆体を回
収する。

なお、この培地中には空気（Ａｉｒ９５％、ＣＯ２５％
）を適宜導入（流速：１０〜５００ｍ／分）することが
好ましく、温度は２０〜３７℃が好ましい。

培地からの前駆体の回収は公知の手段を用いて行えばよ
く、例えば当該培地を遠心分離、減圧濃縮、塩析分画、
ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、アフ
ィニティクロマトグラフィーを、適宜組み合わせること
によって行われる。

［発明の効果］ 本発明の方法により、本前駆体の産生は従来の方法に比
べて活性比で約１．２〜２倍程度増強することができる
。

［実施例］ 以下に本発明を具体的に説明する。しかし、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

参考例１（組換えＨＫＧ細胞の調製〉 （１）　　ｍＲＮ　Ａの単離・精製 ■　使用細胞 ウロキナーゼを産生ずるヒト腎由来株化細胞から全ＲＮ
Ａを抽出するため、まずこの細胞を５％ＦＣ３を含むダ
ルベツコのＭＥＭ培地中で培養し辷後、培地を１％ＦＣ
８を含むダルベツコのＭＥＭ培地に変換し、さらに１０
〜１５時間の培養を行った。この時期の細胞２〜５　Ｘ
　１０９個をトリプシン処理によって集め、全ＲＮＡを
抽出した。

■ＩＩＩＲＮ　Ａの回収 特開昭５８−１４８８９９　（出願人　株式会社ミドリ
十字）において開示された方法を用い、アフリカッメガ
エル卵母細胞へのインジェクションによりウロキナーゼ
の活性がみられた１９〜２０ｓの大きさのｍＲＮＡを精
製した。

（２）−重鎖ｃＤ　Ｎ　Ａの合成 ｃＤ　Ｎ　Ａの合成は、主としてＨａｒｕｉｎ、　Ｐ、
　Ｉｔ４．　ｅｔａｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、、　　２５３．２４８３−２４９５　（１９７８）及
びＨａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
　１９８２．の報告を基に行った。

■　表１に示した反応混合液に６５℃、５分間加熱後氷
上にて急冷したウロキナーゼｍＲＮＡを２０μり加え、
エツベンドルフチューブ内でよく混ぜた後、氷上に放置
した。

（以下余白） 表　　　　１ ■　４６℃、１０分〜１２分の反応により、−本鎖目の
ＣＤ　Ｎ　Ａの合成を行った。

■　この反応混合液に０．５　ＨＥＤＴＡ　　（１）Ｈ
８，０）、２０μβを加えることにより反応を終了させ
た。

■　反応混合液に等ｌ　（２００μｇ）のフェノール／
クロロホルム溶液を加え、ポルテックスにて攪拌後、１
０．ＯＯＯｒｐｍ　１３分間の遠心を行い、その上層（
水層）を分取した。下層のフェノール層にはざらに等損
のセファデックスＧ　−１００緩衝液（１０１１Ｈトリ
ス−ＨＣρ　ｐＨ８，０，１ｍＨＥＤＴＡ　、　１００
ｍＨＮａ　ＣｆＪ）を加え、再度抽出を行った。両者の
水層を混合し、この反応液に８０％グリセリンを６０μ
ｇ加えた。

■　セファデックスＧ　−１００カラムに反応混合液を
アプライし、Ｇ　−１００緩衝液で溶出した。

溶出液は１フラクション５滴ずつ分画した。

■　各フラクションをチェレンコフ　カウントで測定し
、放射活性のピーク部分を集めた。

■　１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、１０μ３
のｔＲＮＡ、２容のエタノールを添加し、−８０℃で２
０分冷却した。

■　遠心（１５，ＯＯｒｐｍ、１０分）にて沈澱を集め
、これを減圧上乾燥した。

■　沈澱ヲ３００μＪｌの０．ＩＮ　　ＮａＯＨ溶液に
溶解し、７０℃、２０分間インキュベートした後水冷し
た。

（ＩＤ　　ＩＮ　　ＨＣｊ溶液（約３０μＮ）を添加し
て中和した。中和後、２μρをサンプリングしてその放
射活性を測定した。

■　１０μｑのｔＲＮＡを添加し、エタノール沈澱を行
った。遠心後沈澱を集め、これを減圧下で乾燥した。

［株］　かくして−重鎖ｃＤ　Ｎ　Ａの合成が完成した
。

−重鎖ＣＤＮＡの合成ωは、−重鎖ｃＤ　Ｎ　Ａ−ＩＩ
ＲＮＡハイブリッドをＧ−１００カラムクロマトグラフ
イーによって回収し、これをアルカリ熱処理してｌｌｌ
ＲＮＡを分解除去した後求めた。その結果、３．６５μ
ｑのウロキナーゼ−重鎖ｃＤＮΔを得た。

（３）二本鎖目のＤＮＡの合成 二本鎖目のＤＮＡの合成は、まずＤＮＡポリメラーゼＩ
でＤＮＡ合成し、その後逆転写酵素を用い、ＤＮＡ鎖の
延長を行った。

■　−重鎖ＣＤＮＡ１００μｇを２×反応混合液（表２
）で懸濁した。

表　　　　２ ■　６０℃で２分間インキュベートした後、遠心（１５
，００Ｏｒ１１ｍ　、　　２．５分）し、上清を取った
。

■　沈澱に５０μｇの水を加え、■の操作を繰り返し、
両者の上清を混合した。

■　ＤＮＡポリメラーゼｌ　クリノーフラグメント５０
ＵｎｉｔＳを添加し、全はを２００μＮとした。

■　１５℃で一夜インキユベートした。

■　０．２８　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）溶液を２０μ
ρ添加して反応を停止した後、等容（２２０μｍ）のフ
ェノール／クロロホルム溶液を加え、混合し遠心した。

上層を分取し、フェノール層を２２０μρのＴＥＷ衝液
（１０ｍＨトリスーＨＣｆＪｐＨ８，０、１ｍＨＥＤＴ
Ａ）ｔ’再抽出シタ。

■　両者の水層を集め、８０％グリセリンを６０μｇ添
加した。

■　セファデックスＧ−１００カラムにアプライし、Ｇ
　−１００緩衝液で溶出した。溶出液は、１フラクショ
ン５滴ずつ分画した。

■　各フラクションをチェレンコフカウントで測定し、
放射活性のピーク部分を集めた。この液２μｍを１０ｄ
のＡＣ８ＩＩに混ぜ、放射活性を測定し、残りの液に５
μ９のｔＲＮＡ、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液を添加し、エタノール沈澱を行った。

［株］　遠心（１５，ＯＯＯｒｐｍ　、１０分）にて沈
澱を集め、これを減圧下で乾燥し、ｄｓｃＤＮＡを得た
。

ｄｓｃＤＮＡの収量は、５．３μ９であった。

以下逆転写酵素を用いた二本鎖目ＤＮＡの合成延長を行
った。

（４）逆転写酵素を用いた二本鎖目ＤＮＡの合成延長 ■　得られたｄｓｃＤＮＡを２０μｍの水に溶かし、更
に表３の反応混合液３０μ９を加え、両者を混合した。

（以下余白） 表　　　　３ ■　この混合液を４２℃で６０分間インキュベートした
。

■　０．２８　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）溶液を５μρ
加え、反応を終了させた。

■　等信（５５μｇ）のフェノール／クロロホルム溶液
を加え、除蛋白を行った。

■　これ以後ポリメラーゼ■を用いたｄｓＣＤ　Ｎ　Ａ
の合成と同様〔（３）の■〜［相］〕の操作を行い、次
の５ｈｅｎｋ、　Ｔ、　Ｅ、等に準じたＳ１ヌクレアー
ゼによる一本鎖ＤＮＡ部分の消化処理（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７２゜９
８９　（１９７５）参照）へと進んだ。

（５）８１ヌクレアーゼによる一本鎖ＤＮＡ部分の消化 ■　ｄｓｃＤＮＡを１００μρの８１ヌクレアーゼ用緩
衝液（０，３Ｍ　　Ｎａ　ＣｆＪ、　３０ｍＭ酢酸ナト
リウム（ｐｔ１４．５）、３ｍＨ２ｎＣＪ１２）に懸濁
し、３７℃、３０分間の保温にて完全にｄｓ　ＣＤＮＡ
を溶かした後、０．５ユニツトの８１ヌクレアーゼ（Ｐ
Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社製）を添加した。

■　３７℃、３０分間の反応後、さらに２ユニツトの８
１ヌクレアーゼを加え、さらに１５分間反応さけた。

■　０．２８　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）溶液を２０μｐ
加え反応を停止し、さらに１２０μｍのフェノール／ク
ロロホルム溶液を加え、除蛋白を行った。

■　フェノール層をＴＥｕｉ液を用い再抽出した後、両
者の水層を混合し、エタノール沈澱を行い、ｄｓＣＤＮ
Ａを得た。

（６）　ｄｓ　ｃＤ　Ｎ　Ａのシヨ糖密度勾配遠心処理
得られたｄｓｃＤＮＡを次いでショ糖密度勾配遠心（３
８，００Ｏｒｐｍ　、　４℃）にかけて分子堡の大きな
両分だけを集めた。第２図にウロキナーゼｄｓ　ｃＤＮ
Ａ　（（図中６−＠Ｔ−表示した）の超遠心沈降パター
ンを示した。同時にマーカーとして、グロビンｄｓｃＤ
ＮＡ（図中ムームで表示した）の沈降パターンも示した
。フラクション６〜１５の大きなＣＤＮＡ画分を集め、
これをラージｄｓ　ｃＤＮＡとした。このラージｄｓｃ
ＤＮ／Ｍ２には７２２ｎｇであった。

（７）　ｄｓ　ｃＤ　Ｎ八へのポリ（Ｃ）ティルの付加
ウロキナーゼｄｓｃＤＮＡの大きさは平均１，５００ｂ
ｐｒあると想定し、Ｎｅ１ｓｏｎ　ａｎｄ　Ｂｒｕｔｌ
ａｇ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、旦４１
−５０．１９７９）の方法に準じてＣ−テイル反応を行
った。Ｃ−ティル反応は、ｄｓＣＤＮＡの３′ＯＨ末端
に、１５〜２０個のポリ（ｃ）テイルが付加されるのが
理想である。水油穴では、５ユニツトのターミナルトラ
ンスフェラーゼを用い、３７℃にて反応を行った。その
結果、約２０個のＣ−テイルが付加した。

別に調製した大腸菌プラスミドｌ）Ｂ　Ｒ３２２のＰｓ
ｔＩ部位に同様に約１５個のポリ（Ｇ）ティルを付加し
た。さらにこれら両者を等モル混合し、高いイオン強度
下で７０℃から３７℃へ緩やかな冷却によりアニーリン
グを行った。

（８）トランスフォーメーション アニーリングしたＤＮＡをＬｅｄｅｒｂｅｎｇ　ａｎｄ
Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｒｉｏｌ、　１１９．１
０７２〜１０７４　（１９７４）の方法に準じて大腸菌
ＲＲＩ株に導入しトランスフオーメーションを行い、約
７０．０００個のテトラサイクリン耐性株が得られた。

得られたトランスフォーマントのアンピシリン感受性を
レプリカ法で調べた。その結果、全トランスフォーマン
トの９０％以上、約６０，０００コロニーが、ｃＤＮＡ
が挿入されたと考えられるＡＩ）、ＴＣを示した。

（９）ウロキナーゼ遺伝子のクローニングウロキナーゼ
ｃＤ　Ｎ　Ａをり色−ニングするため、公知の床高分子
量型ウロキナーゼのアミノ酸配列（ＧＩＪｎＺｌ（！ｒ
　ｅｔ　ａｌ、、　　ＨＯＤＤｅ　ｓｅｙ＋ｅｒ’ｓ　
Ｚ　Ｐｈｌ／ＳｉＯＩＣｈｅｍ、　　３６３．　１１５
６〜１１６５　（１９８２）、　５ｔｅｆｆｅｕｓ　ｅ
ｔａｌ、　　Ｈｏｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　　
Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　　３６３゜１０４３−１
０５８．１９８２）に基づいてオリゴデオキシリボヌク
レオチドを合成し、これをハイブリダイゼーションプロ
ーブとしてトランスフォーマントのスクリーニングを行
った。

■　合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブ プローブとして用いた１４−塩基の合成オリゴデオキシ
リボヌクレオチド混合物（以下プローブと呼ぶ）は、日
本ゼオン社より購入した。

表４は、用いたプローブの塩基配列とこれに対応するウ
ロキナーゼのアミノ酸配列を示している。

用いたプローブは人尿高分子量型ウロキナーゼＢ鎖のア
ミノＭ７３〜７７に対応する。又、表４から明らかな様
にプローブは８種のオリゴヌクレオチドの混合物である
。

（以下余白） 表　　　４ ヒトウロキナーゼｃＤＮＡの単離用の プローブ アミノ酸　　　　７３　７４　７５　７６　７７配　　
列　　　　　ＮＨ２−Ｇｌｕ　　−Ｎｅｔ　　−Ｌｙｓ
　　−Ｐｈｅ　　−Ｇｌｕ　−Ｃ００ＩＩ ＧＡＡ　−３’ ４−ｍａｒ 混合物　　　３’　　−ＣＴ’　−ＴＡＣづ■１−＾Ａ
６−ＯＣＡ ＣＴ−５’ （注）中段にはアミノ酸配列に対応するｍＲＮＡの可能
な全配列を示す。下段は、このｆｆ１ＲＮ　Ａに相補的
なプローブＤＮＡの塩基配列を示す。

なお、プローブのアミノ１１７７　（Ｇ　Ｉｕ）コドン
のうち、第三塩基はプローブＤＮＡに含まれていない。

■　５′末端を３２ｐでラベルしたプローブの調製ω　
プローブ５′−末端の３２Ｐラベルプローブは５’　−
ＯＨとして合成されているので〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ（
アマ−ジャム、ＰＢ１０２１８）と、Ｔ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼとで５′末端を３２ｐでラベルした。

ラベル条件は、　Ｐ−ＡＴＰと５′　−ＯＨ末端のモル
比を５：１として以下の様な反応系で行った。

反応液 プローブＤＮＡ　　　６〜８０ｐｍｏ１５’　　−０ｆ
ｆ末端※１１０×キナーゼ緩衝液　　　　　　　　２μ
ｐＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ　　１μｍ※２（７
−３２Ｐ）ＡＴＰ　　５’　　ＯＨ末Ｇ１１ｆ（７）５
ＸＩＩＩＯ＋ Ｈ２Ｏ総量２０μｐとする量 反応は３７℃で６０〜１２０分間行う。反応終了後、１
μρの０．５ＨＥＤＴＡ溶液（１）［８，０）、３５μ
ρの１Ｍ塩化ナトリウム（１０ｍＨトリスー）Ｉ　ＣＪ
Ｉ　、ｐｌ＋７．２．１　ｍＨＥＤＴＡ溶液中）および
１０．５μｊｌの１　ｒＩｔｇ／ｄｔＲＮ　Ａ溶液を加
えて終量３５μｍとし、７０℃、３分間の熱処理でポリ
ヌクレオチドキナーゼを失活させて反応を終了させた。

（０）　　３２Ｐ−ラベル化プローブの精製０項で調製
した反応混合物をＮＡＣ３−５２のミニ−カラム（ＢＲ
Ｌ）にかけて、３２Ｐ−ラベル化プローブを精製した。

この様にして精製したプローブＤＮＡの比活性は約１．
Ｏｘ　１０９ｃｐＨ／μｇＤＮＡである。

■　コロニーハイブリダイゼーション 前記作成したプローブを用い、Ｈａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ
ａｌ、　Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、　１９８２の方法に準じてコロニーハイブ
リダイゼーションを行い、ウロキナーゼＣＤＮＡのスク
リーニングを行った。

前記的７０，０００個のトランスフォーマントのうち約
１０．０００個について、〔γ−３２Ｐ〕でラベルした
合成プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーション
を行った結果、比較的強くハイブリダイズしていると思
われる６５コロニーを選出した。これらの６５コロニー
をフィルターに再度固定し、同一のプローブを用いて再
スクリーニングを行った結果、４つのコロニーがプロー
ブＤＮＡと極めて強くハイブリダイズした。この様にし
て選出された４コロニーにライて、Ｂｉｒｎｂｏｉｍと
Ｄｏｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｃｓ、
、ヱ、　１５１３．１９７９）に準じてプラスミドＤＮ
Ａ　（各々をｐＵＫｌ、２．３及び４と命名）を調製し
、ＣＤＮＡの大きさを判定した。ｐＵ　Ｋ　１は４コロ
ニー中最大のｃＤＮＡを有し、約１，９００ｂ１１であ
った。１）ＵＫ３及び４はこれより小さく、それぞれ約
１　、３００ｂｐと約１，１５０ｂｐであった。又、ｐ
Ｕ　Ｋ　２は最小のｃＤ　Ｎ　Ａで約１７０ｂｐであっ
た。

（１０）制限酵素地図の作成 前項で選択した４個のコロニーが保持する各プラスミド
のうち、ＣＤＮＡの大きなｐｌＪ　Ｋ　１　。

ｐＵ　Ｋ　３及びｐＵ　Ｋ　４の３つのプラスミドＤＮ
Ａに含まれるｃＤＮＡの制限酵素地図を作成し比較検討
した。

使用した制限酵素は、ＡｃｃＩ　、　Ａ　ＩｕＩ　、　
ＡｖａＩ　。

ＡｖａＩ［、ＢａｍＨｌ、　Ｂｃｌｌ、　Ｂ（ＩＩｌ、
　Ｂ（ＩＩＩＩ。

ＢｓｔＥＩ［、Ｃ１ａ１．ＥｃｏＲＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ。

ＨａｅＩ［［、Ｈｉｎｃ　Ｉ［、Ｈｉｎｄ　Ｉ［［、Ｋ
ｐｎｌ、　ＮｃｏＩ。

ＭｌｕＩ、Ｐｓｔｌ、Ｐｖｕｎ、ＲｓａＩ、５ａｃＩ。

５ａｌＩ、５ａｕ９６Ｉ、５ｃａＩ、Ｓｍａｌ、５ｔｕ
Ｉ。

Ｘｂａｌ、ＸｈｏＩであり、反応時に使用した各制限酵
素の緩衝液を表５に示した。

なお、ＡｖａＩはＲｓａ工緩画液、ＳａＣ■はＫｐｎ緩
衝液、５ｔｕＩ、Ｓａｔ及びＸｈｏＩはＢａｍＨＴ緩函
液、ＮＣ０Ｉ及び５ＣａＩはＢ（ＩＩＩ緩衝液、そして
ＭｌｕＩはｌ−１ｉｎｄｌｌＩ緩衝液を使用した。

（以下余白） 表　　　５ まず、各プラスミドを種々の制限酵素で切り、次に各制
限酵素部位の距離を求めた。各プラスミドをＥＣ０ＲＩ
で切断すると、ｐＵＫｌとｐＵ　Ｋ　４では全く同じ大
きさの断片（４２０ｂｐ）が見られ、またＢａｍ１−Ｉ
ＩとＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩとｐＳｔＩの２重消化を
行うと、ｐ　ＵＫｌとｐＵ　Ｋ　３に全く同じ大きさの
断片が見られた。そこでｐＵＫｌとｐＵ　Ｋ　４におい
てはＥｃｏＲＩ部位を重ねて、またｐＵ　Ｋ　１とｐＵ
　Ｋ　３においてはＢａｌｌｌＨＩ部位を基準にとって
、伯の制限酵素部位を調べていくと、ｐＵ　Ｋ　１とｐ
ＵＫ３及びｐすに４のｃＤＮＡ上の制限酵素部位の位置
が一致した（第３図）。

これらの結果から、Ｉ）ＵＫｌ、０ＵＫ３及びｐＵ　Ｋ
　４に挿入されているｃＤＮＡは制限酵素地図からみて
同一のものであると考えられる。そこで１）ＵＫｌおよ
びｐＵ　Ｋ　４の一部のＤＮＡ塩基配列を決定し、アミ
ノ酸配列を検討した。その結果、その配列は公知の床高
分子量型ウロキナーゼのアミノ酸配列と一致した。

（１１）ウロキナーゼｃＤ　Ｎ　Ａの塩基配列の決定前
項によってプラスミドがウロキナーゼＣＤＮＡを含むこ
とが確認できたので、次にＨａｘａｎ＋　−Ｇｉｌｂｅ
ｒｔ　　（Ｖクサムーギルバート）法（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５６０
〜．１９７７）を用いてＣＤＮＡ塩基配列及びアミノ酸
配列を決定した（配列工）。得られたＣＤ　Ｎ　Ａ塩基
配列から考えられる可能なアミノ酸配列を既知の人尿ウ
ロキナーゼのアミノ酸配列と比較した結果、次項で詳細
に記述する様にこれらのＣＤ　Ｎ　Ａが２０アミノ酸か
ら成るシグナルペプチドを含む総計４３１個のアミノ酸
から成るｐｒｅｐｒｏ−ウロキナーゼをコードする、ｃ
ＤＮＡであることが明らかとなった。

（１２）ウロキナーゼのアミノ酸配列 （ａ）　　ｃＤ　Ｎ　Ａが真にウロキナーゼｃＤＮＡで
あるか否かの判定は、得られた塩基配列からアミノ酸配
列を求めて（配列■）、これを既知の人尿ウロキナーゼ
のアミノ酸配列と照合することで行った。

下記配列（Ｉｒ）は人尿高分子量型ウロキナーゼの八−
及びＢ−鎖の全アミノ酸配列を示している。

海　工　勇　へ湧　寸至　ｊと　φ己　曲と　凶Ｅ＋ｌ
？ｃ−１＋　へら　！弓　Φロ　　Ｑω　０の一部　　
−−＜〉−一一一 シーフェンシングによって得られたｃＤ　Ｎ　Ａ塩基配
列を人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列〔配列（■）〕と
比較した結果、ｐＬＩＫｌ及び４はいずれもウロキナー
ゼ前駆体ｃＤＮ△の一部を含んでいることが明らかとな
った。

下記配列（Ｉ［ｌ）は、個々のフラグメントのシーフェ
ンシングの結果に基づいて作製したウロキナーゼアミノ
酸配列をコードするｃＤＮ△の５′−末端から３′−ノ
ンコーディング　リージョンまでの全塩基配列を示して
いる。

（以下余白） （ｂ）以下本発明によって得られたウロキナーゼアミノ
酸配列をコードするｃＤ　Ｎ　Ａの構造について述べる
。

（イ）　５′−ノンコーディング　リージョンとシグナ
ルシーフェンス 配列（Ｉ＞及び（１）から明らかなように、蛋白合成の
開始］トンであるＡＴＧ（Ｍｅｔ）の上流には、少なく
とも７９ｂａｓｅｓから成る５′−ノンコーディング　
リージョンがある。又、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）から始まる最
初の２０アミノ酸は、人尿ウロキナーゼのアミノ酸配列
〔配列（■）〕には見られないことから、ウロキナーゼ
分子の細胞外への分泌に必要なシグナルペプチドである
と判明した。

更に、２１番目のアミノ酸、Ｓｅｒに始まるアミノ酸配
列は、人尿ウロキナーゼの八−鎖のアミノ酸配列に一致
した。

このことから、今回得られたｃＤＮ△は、２０アミノ酸
から成るシグナルペプチドを有するウロキナーゼ前駆体
（ｐｒｅｐｒＱ−ｔｌｒｏｋ　ｉ　ｎａｓｅ、以下ｐｒ
ｅ　−ＵＫと略す）をコードするＣＤＮＡ　（ｐｒｅ　
−ＬＪＫＣＤ　Ｎ　Ａ　）であることが明らかである。

（ロ）ウロキナーゼ前駆体の開裂部位 人尿つ０キナーゼは、Ａ−及びＢ−鎖の二本鎖であるが
、これは当初ｐｒｏ−ＬＩＫとして合成されたつＯキナ
ーゼ前駆体分子が細胞外へ分泌された後、プロテアーゼ
などの作用によって２次的に二本鎖へ開裂するものと考
えられる。ｐＵ　Ｋ　１のＣＤＮＡのシーフェンシング
によりこのことが確かめられた。

配列（ｎ）において、人尿ウロキナーゼのＡ鎖のカルボ
キシル末端のアミノ酸配列（配列（ＩＩ）の１５７番目
のアミノ酸であるｐＨｅ）に続いてＬＶＳが存在し、更
にＢ−鎖のアミノ末端である１１〇−Ｉ　ｌｅ−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｇ　Ｉｙ−・・・のアミノ酸配列が認められる。

このことは、人尿ウロキナーゼが当初はしｙｓを介して
八−及びＢ−鎖の結合した一重鎖ウロキナーゼ（ｓｉｎ
ｇｌｅ−ｃｈａｉｎ　ｐｒｏ−Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）と
して合成され、Ａｒｇ−ｐｈｅ−しｙｓ−１ｌｅ−１ｌ
ｅ部で開裂すること、開裂に際してＬｙｓは欠失するこ
とを示している。

Ｑ９　　カルボキシル末端とＣＤＮＡの３′−ノンコー
ディング　リージョン 配列（Ｉ）及び（Ｉｌｌ）には本発明より得たＣＤＮＡ
の５′−ノンコーディング　リージョン、コーディング
　リージョン及び３′−ノンコーディング　リージョン
の一部を示している。配列（Ｉ）及び（ＩＩＩ）に示す
ように、この塩基配列ではＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−
Ｌ　ｅｕといった人尿高分子固型ウロキナーゼＢ−鎖の
カルボキシル末端に一致するアミノ酸配列が読み取られ
、その下流に蛋白合成終止コドンであるＴＧＡが存在す
る。従って、人尿高分子母型ウロキナーゼのカルボキシ
ル末端と本発明によって得られたそれは同一で、プロセ
シングにより欠失されるようなポリペプチドは存在しな
いと考えられた。

一方、３′−ノンコーディング　リージョンは制限酵素
地図から考えて、長大と思われる３′−ノンコーディン
グ　リージョンについてはそのごく一部しかシーフェン
シングを行っていないが、現在得られている３′−ノン
コーディング　リージョンは約８５０ｂｐである。しか
し、この中には真核生物のｍＲＮＡの３′−末端に特徴
的なｐｏｌｙ（八）配列が含まれていないことから、３
′−ノンコーディング　リージ゛ヨンはもっと長大であ
ると考えられる。

（１３）ウロキナーゼ全コーディング　リージョンを含
むプラスミドの作成 １）Ｕ　Ｋ　１およびｐＵ　Ｋ　４を制限酵素ト１ｉｎ
ｄｌ。

ＢｇｌＩＩで消化した。）（ｉｎｄｌＩＩ及びＢｏｌＩ
Ｉによる消化は３７℃、１〜２時間行った。ｐＵＫｌが
らは約５．３ｋｂの断片を単離し、一方、ｐＵ　Ｋ　４
がらは約１．２ｋｂの断片を！１１Ｉ！ｔシた。次に７
４−ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（６６ＩＩＩＨトリス−
ＨＣＮ　　ｐＬｌ７．６．６６１１１８　　Ｍ（］　Ｃ
ｊ　２　、１０ｍＨジチオスレイトー）Ｌｔ、０．５ｍ
ＨＡＴＰ）と１０ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ中で
前記の断片を２０℃で２時間反応させＩｉｇａｔｉｏｎ
シた。以上の工程は第４図に示した。第４図に於いて、
ＥはＥＣ０ＲＩを、Ｈは）ｌｉｎｄＩ［Ｉを、Ｂは３μ
ｍＨＩを表す。

（１４）ヒト腎由来株化ｍ胞におけるウロキナーゼの産
生 （ａ）細胞における発現用ベクターの作製原料プラスミ
ドとして、Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ（Ｈｏｌ
ｅｃ、　ａｎｄ　ｃｅｌｌ、　Ｒｉａｌ、、　３．２８
０−２８９　（１９８３））によって創作されたｐｃＤ
Ｖｌ及びｐＬｌ（第５図）を用いて、ｐｓＶ−Ｇｌ（第
６図）を作成した。

ｐｃＤ　Ｖ　１とｐＬ”Ｎ、ｔ、ｆｌＢＲ３２２ＤＮＡ
と５Ｖ４０ＤＮＡとのハイブリッドプラスミドであり、
ＰＬ、　Ｂｉｏｃｈｅｎｉｃａｌｓ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）社より入手した。

これらプラスミドへのウロキナーゼをコードするｃＤ　
Ｎ　Ａの挿入を容易にするため、ｐｃＤＶｌの）−１ｉ
ｎｄ　ＩＩＩ−ＫｐｎＩ部位にｐＬｌのＨｉｎｄｌＩ［
−ＰｓｔＩ断片を挿入し１）ＳＶ−Ｇ１を作製した。

すなわち、１）Ｌｌ　　４μグを表５の反応条件でｐｓ
ｔＩで消化後、突出する３′−末端をＴ４−Ｄ　Ｎ　Ａ
　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで削ってｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　
　（平滑末端）に変更した。その際の反応は反応混合液
（ｐＬ１４ｕ’ｉ、１０ｘ　Ｔ４　ｐｏｌｙｍｅｒａｓ
ｅ　ｂｕｙｅｒ　８μＢ　、　２ｒｎＨｄＮＴＰｓ溶液
４．０μｍ、ｄＨ２０７６μｐ）を６５℃、３分間、加
熱後急冷した後、Ｔ４　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
４　ｕ　ｆＪ　　（１０ｔＪ　）を加え、終１ａｏμｎ
とし、３７℃で５分間反応させた。反応終了後０．２５
８　ＥＤＴ八（ｐＨ８，０）８μｍ、！ｌ：　ｄＨ２０
８０，ｃｌ　ヲ加え、７エ／−ル処理を１回行った後、
水層を回収した。エタノール沈澱で、ＤＮＡを回収し、
減圧乾燥して、ＫｐｎＩ　　ｔｉｎｋｅｒ　Ｉｉｇａｔ
ｉｏｎに供した。ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、反応混合液
（ｄｒｉｅｄ　ＤＮＡ４ｕ９．５′−ＰＫｐｎＩ　　ｔ
ｉｎｋｅｒ　２ｕｆＪ　　（２μｇ）　、１０ｘｌｉｇ
ａｓｅｂｕｙｅｒ　２．ＯμｆＪ　ｄＨ２０）１８］ｕ
を６５℃、３分間加熱後徐冷し、Ｔ４　ＤＮＡ　　Ｉｉ
ｇａｓｅ　２μｆＩ（５ｔＪ）を加えて、１６℃で一夜
反応させた。反応終了後ＫｐｎＩ、ついでＨｉｎｄｌ［
［による消化を行い、５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＰＡＧＥ　）にかけて約６００ｂＤのＤＮＡ４ｕ
９片を回収した。

一方、ＨｉｎｄＩ［ＩとＫｐｎＩでｐｃＤＶｌを消化し
、１％Ａｇａｒｏｓｅ　ｏｅｌテ、約２．７ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を：５！４製し、そのうち１１００ｎを前記ｐ
Ｌ１由来の約６００ｂｌ）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片とＩｉｇａ
ｔｉｏｎした。ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、反応混合液（
ｐＬ１断片Ｄ　Ｎ　Ａ　１５０ｎｇ、ｐｃＤＶ１断片Ｄ
ＤＮＡ１００ｎ　、１ｏｘＴ＋　ＤＮＡｌｉｇａｓｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　１．０　ｕｆＪ　、　ｄＨ２０８μｐ）
にＴ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａ　１ｉｏａｓｅ２　ｕｆＪ　（
５，６ＬＩ　）を加え、１６℃で−夜反応させた。反応
液の　／２量を用いて大腸菌ＨＢＩＯ１の形質転換を行
った。

得られた形質転換体のうち１２コロニーを用いてプラス
ミドＤＮＡを調製し、各種制限酵素で消化して調べたと
ころ、いずれも目的のプラスミドをを含んでいる事がわ
かったので、そのうち１株からプラスミドＤＮＡを大量
調製して　ｐｓＶ−Ｇ１とし、その制限酵素地図の作製
（第６図）、ならびに５ａｌＩ−ＢｃｌＩ断片のＤＮＡ
塩基配列を求めた（下記配列（ＩＶ）参照〕。この結果
、得られたｐＳＶ−Ｇ１は、ＫｐｎＩ部位をクローニン
グ部位として上流に５Ｖ−４０ＤＮＡのｅａｒｌｙ　ｅ
ｎｈａｎｃｅｒ／　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｅｌｅｍｅｎｔ
および１ａｔｅ　５’　−ｓｐｌｉｃｉｎｇｊｕｎｃｔ
ｉｏｎが、下流には１ａｔｅ　ｐｏｌｙ（Ａ）ｓｉｇｎ
ａｌがそれぞれ配列し、初物細胞中での機能的なＩＩＩ
ＲＮ　Ａの合成に関与する諸要素が欠失なく配列されて
いると判定できた。

８１　　　８　　　　　　Ｓ 調　　　　　　　３　＝　　　　５　　　　　８（ｂ）
ベクターへのウロキナーゼｃＤ　Ｎ　Ａ配列の挿入 （１３）で得たｐＵ　Ｋ　３３をｐｓｔ工で部分消化し
、１．７にｂｐ断片を単離してｐｓＶ−０１に挿入した
。

１．７Ｋｂｐ断片の単離は、反応混合液（ＩＩＵ　Ｋ　
３３１０μ９．１０Ｘ　ＰＳｔＩｂｕｒｒｅｒ　５０μ
、１１　、ＰＳｔＩ　１０μＪ）、（６０Ｕ）、ｄｌ−
１ｚｏを加えて終但５００μｍ〕を、３７℃に保ち、反
応開始後、１０分、１５分および２０分で、それぞれ約
１６０μｍサンプリングし、６５℃、５分間加熱処理後
、それぞれの、反応液を混合して、１％アガロースゲル
にて電気泳動にかけ、１．７にｂｐ断片を約１０μ３回
収した。回収された約１．７にｂｐのうち約５μ３を用
い、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ処理で切断末端をｂｌｕ
ｎｔ　ｅｎｄ　　（平滑末端）にかえ）（ｐ、ｎｌｌ１
ｎｋｅｒをｌ１ＯａｔｉＯｎした。その後Ｋｌ）ｎＩテ
消化したｐｓＶ−ＧｌとＩｉｇａｔｉｏｎして、大腸菌
Ｈ８１０１を形質転換して、ｐＳＶ−Ｇ１−ｐｒｅ　Ｕ
　Ｋ　（第７図）を得た。

ｐｓ　Ｖ　−Ｇ　１−　ｐｒｅｕ　Ｋは、第８図に示す
様に、Ｓ　Ｖ　−４０のｍＲＮ　Ａ転写調節域の下流に
ｐｒｅ−ＵＫｃ　ＤＮＡの５’　−ｎｏｎ　ｃｏｄｉｒ
＋ｇｒｅｇｉｏｎ。

ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、　ｃｏｄｉｎｇ　ｒ
ｅｇｉｏｎ及び３′−ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉ
ｏｎが挿入されており、ヒト腎由来株化細胞などの適当
な受容量胞へＤＮＡを導入することでヒト−ｐｒｏ−Ｕ
ｒｏｋｉｎａｓｅの産生を行いつる。

（ｃ）　Ｄｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍａ
ｒｋｅｒを含むプラスミドＤＮＡの調製 上記ｐＳＶ−Ｇ１を用いて培養細胞を形質転換する際の
Ｄｏｍｉｎａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｍａｒｋｅｒ
として用いるプラスミドであるｐｓＶ−Ｇ１−Ｎｅｏ’
は、以下の様にして作製した。

Ｔｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドＤＮ　Ｅ　Ｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。

Ｐ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｐ、　Ｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｈｏ１ｅ
ｃ、　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔ、、　　１．
　３２７−３４１　　（１９８２））　　　（ＰＬ−Ｂ
ｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｃａ１社）をＢａ１１ＨＩと）ｌｉ
ｎｄＩ［［ｔ’消化後、ネオマイシン耐性遺伝子を含む
１．５ｋｂＤのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ
は４６ＮＴＰｓ存在下でＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ−ｐｏ
＋ｙｍｅｒａｓｅ　ｒ、　＋ａｒｇｅ　ｒｒａｇ＋ｎｅ
ｎｔ（にｌｅｎｏｗ　ｒｒａｇｍｅｎｔ）で切断末端を
平滑末端に変更した後にＴ４−ＤＮＡＩｉｑａｓｅによ
る反応でその末端に前述の様にしてＫ　ｐｎＩ　ｌ１ｎ
ｋｅｒを付加した。

Ｋ　ｐｎｌ：　ｌ１ｎｋｅｒ　Ｉｉｇａｔｉｏｎ後、Ｋ
１１ｎＩ　　６１ＪｒＤＮＡ［片を完全に消化し、ｌ１
ｎｋｅｒの付加された目的の約１．５ｋｂネオマイシン
耐性遺伝子を回収した。

回収したＤＮＡ断片は、そのうちｉｓｎｇを前述の様に
してＫｐｎＩで切断したｐＳ　Ｖ　−Ｇ　１２０ｎｇと
ｌｉｇａｔｅＬ、大腸菌１−１１３１０１を形質転換し
て目的のプラスミドｐｓｖ−Ｇ　１−Ｎｅｏ’　ｔＡＪ
り＜Ｆ７図）。

（ｄ）受容細胞（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ　ｃｅｌｌ）の調
製受容１８ｆ１１として、ヒト胎児腎より得たｐｒｉｍ
ａｒｙｃｕｌｔｕｒｅを継代培養して得られたヒト腎由
来株化細胞（ｎ−ＨＫＧ）を用いた。ＤＮＡのトランス
フェクションに用いる細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ処理
で細胞を集めた後培養液（５％ＦＣ８を含むダルベツコ
のＭＥＭ培地）に懸濁し、ファルコン＃　３００３（１
００ｒＩｖＲ＞培養シャーレに７　ｘ　１０５　ｃｅｌ
ｌｓ／　１０ａｅ　／　１００ｍシャーレで植え込んだ
。２４時間５％ＣＯ２−９５％ａｉｒのＣＯ２−１ｎｃ
ｕｂａｔｏｒで培養後、形質転換に用いた。この条件下
では、受容細胞として用いるヒト腎由来株化ｗｉ胞のウ
ロキナーゼ産生量は、２６．５ＩＵ／ｍｉ！／ｄａｙ　
（５例平均）である。

（ｅ）形質転換 長円等の方法（蛋白質核酸・酵素、２８　（１４）　。

１５６９〜１５８１．１９８３）に準じて調製したプラ
スミドＤＮＡ　（１）ＳＶ−Ｇ１−ＰｒｅＵＫ及びｐＳ
Ｖ−Ｇ１−Ｎ［ｌ　　（混合比率は１００：１））をＤ
ＮＡ量として２〜４１１’Ｊ／ｄおよびｃａｒｒｉｅｒ
　Ｄ　Ｎ　ＡとしテＳａ１ｍｏｎ　ｓｐｅｒｍ　　Ｄ　
Ｎ　Ａ　（ＰＬ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ１社）を２０１
１９／ｒｄ含有するＤＮＡ−Ｃａ　ＰＯ４微小沈澱液を
（ｄ）で調製したシャーレあたり１ｄずつ加えた。シャ
ーレを十字に動かして静置し、ＤＮＡ−Ｃａ　ＰＯ４微
小沈澱を細胞に吸着させた後、再び１ｎｃｕｂａｔｏｒ
で培養を開始した。６〜９時間時間項培地交換い、さら
に４８時間以上培養して、形質転換細胞の選別を行った
。

（ｆ）形質転換細胞の選別 ウロキナーゼ遺伝子は、自身では５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ
ではないため、真核細胞において、Ｇ−４１８耐性を与
えるＴｎ５由来のネオマイシン耐性遺伝子をｄｏｍｉｎ
ａｎｔ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒとして用い
（前述のｐｓ　Ｖ　−Ｇ　１−　Ｎ　ｅｏ’　）Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ等の方法（Ｊ、　Ｈｏ１ｃｃ、　ａｎｄ　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、、　１．３２７−３４１゜
１９８２　）に準じて細胞をＧ　−４１８含有培地（４
００μＪ／ｄ）で培養することによってトランスフェク
ションした細胞の選別を行った。なお、Ｇ　−４１８は
ＧｉｂＣＯ社１　（Ｇｅｎｅｔ　ｉｃ　ｉ　ｎ■）を用
いた。

４日おきに培地を交換し、Ｇ　−４１８耐性コロニーを
生育させ、１４日目に５０コロニー（Ｃｏ１ｏｎｉｅｓ
）を得た。これらの形質転換細胞を５％ＦＣ８を含むダ
ルベツコのＭＥＭ培地で生育させ、順次選別を行ってつ
Ｏキナーゼの産生量の高いと思われる細胞株を選択した
。

実施例　１ 参考例１により調製した組み換え１１にＧ細胞（ｒ−Ｉ
ＩＫＧ）を２０ｘ　１０４ｃｅｌｌｓ　／戒の濃度で熱
不活化ウシ胎児血清５　ｗ／ｖ％含有Ｗａｙｍｏｕｔｈ
培地に植え込み、３日間培養後、細胞数が１００　Ｘｌ
０４ｃｅｌｌｓ　／ｍｇトなった時点で、さらに、０．
１ｗ／ｖ％ヒト血清アルブミン、０．５Ｗ／Ｖ％グリシ
ン、０．５ｗ／ｖ％コハク酸ナトリウム含有Ｗａｙｍｏ
ｕｔｈ培地（無血清培地）に上記前駆体産生ｍ胞１００
　ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ　／ｒｔｄｌを植え直し、こ
の濃度を維持しつつ３日間培養した。培養液を遠心分離
し、沈澱には新しい培地を添加して培養を続けた。上清
中には前駆体く活性は１−当たり３００Ｕに相当）が含
まれていた。

本発明により得られた前駆体は、特開昭５８−１７０３
５４で開示したｒＩＩｍ素溶解酵素前駆体」と全く同一
の性質を有していた。

参考例　２ 実施例１により得られた前駆体を含む培養上清をｐＨ５
，５に調整した後、ＣＭ−５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０
に接触した。０．１６Ｍリン酸！！！ｉ液（ｐＨ５，５
）で吸着していた前駆体を溶出させた。

一方、前駆体で予め免疫しておいたマウスＢへＬＢ／Ｃ
の牌臓細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリ
コールにより融合させたハイブリドーマのうち、前駆体
に対する抗体産生の高いクローンを選択した。この融合
細胞の培養液から、前駆体モノクローナル抗体を回収し
た。このモノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性化５ｃｐｈ
ａｒｏｓｅ　４　Ｂ（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ社）に固定
した。

このモノクローナル抗体カラムを０．４ＭＮａ　（：、
ｎ含有０．ＩＭＩＪン酸緩衝液（ｐｔ１７．ｏ）　テ平
衡化し、これに前記の前駆体を含有する溶出液を接触し
た。０．４Ｍ　　ｐＪａ（：、ｎ含有０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）でカラムを洗浄した後、吸着してい
た当該前駆体を０．５Ｍ　　ＮａＣＪ）含有０．２Ｍグ
リシン−ＨＣＪ水溶液（ｐＨ２，５）で溶出させた。溶
出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し比活性が少なくとも
８０，０ＯＯＬＩ　／＃ｌ！Ｊの高度精製前駆体を得た
。

なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法より分子ｆｎ　５４．０００の１本の帯を示し
た。

実験例　１ 本発明による前駆体産生増強効果を見るために、前駆体
の産生量の比較実験を行った。第６表に示したようにグ
リシンの添加量はＯ〜３．Ｏｗ／ｖ％の範囲で設定した
。それ以外の条件は実施例１に準じて各群とも同様に行
った。産生量の指標として活性を測定した。

活性量の測定は、ｐ　−ＨＣＡ法により以下のように行
った。即ち、検体０．１ｍとプラスミン溶液（０，２ｃ
ｕ／　ｍｌ、ゼラチン緩衝液（ｐＨ８，６）でｉＩ製し
たもの）　　０．１１ｎ１を混合後、３７℃で１０分間
インキュベーションし、ｐ　−ＨＣＡ溶液（０，１ｍＨ
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　−＾ｒｇ　−ＨＣＡ）　１−を加え、
さらに３７℃で２０分間インキュベーションし、１８Ｖ
／Ｖ％酢酸を加えて反応を止めた後、ＥＸ（励起波長）
　　３７０ｎＩＲ，Ｅｍ（Ｉ光波長）４６０　ｎｍにて
螢光強度を測定した。その結果は、第６表および第１図
に示す通りであり、特に、ｒ−ＨＫＧはｎ−１１にＧに
比べ０．５％グリシン添加で高い添加効果が認められた
。

なお単位はＵ／−を用いた。ＵはつＯキナーゼ国際単位
であり、ＩＵ／蔵は検体１−につきプラスミン処理によ
って発現する繊Ｎ素溶解活性が１Ｕに相当することを意
味する。

第　　　　６　　　　表

【図面の簡単な説明】

第１図　グリシンの添加効果。○はｒ　−ＨＫＧ　。 ・はｎ　−ＩＩＫＧを表わす。 第２図　ｃＤＮＡの超遠心沈降パターン。 第３図ｐＵＫ　１　、　ｐＵＫ　３．　ｐＵＫ　４中に
挿入されている各ｃＤＮＡの制限酵素地図。 第４図　ｐＵＫ　ｉとｐＵＫ　４のｌｉｇａｔｉｏｎ　
（リゲーション）のフローシート。ＥはＥｃｏＲＩを、
Ｈは１Ｉｉｎｄｌ［ｌを、ＢはＢａｍＨ■を表わす。 第５図　ｐｃＤＶｌとＩ）ＬｌとのＩｉｇａｔｉｏｎ　
（リゲーション）フローシート。 第６図　ｐｓＶｌ−Ｇｌ制限酵素地図。 第７図　ｐＳＶ　１−０１−１）ｒｅＵＫ　及ｆｆ１）
ＳＶ　−０１−Ｎｅｏ　　の制限酵素地図。 第８図　１）ＳＶ　１−Ｇｌ−ｐｒｅｕにのｐｒｅＵＫ
　−ｃＤＮＡ近辺の構造。 ＮＣ：　ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎＳＳ：　
ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅＳＪ　：　５ｐｌｉｃ
ｉｎａ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ第１図 ２゛９ンンＡミＩＣ１（−（Ｗ／Ｖ））第　　２　　図 トツア　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＴＦＸ外ム第　　４　　図 第５図 （３２５にｂｐ） 第　　６　　図 第　　７　　図 ５Ｖ−４０Ａ（ｎ） 第　　８　　図 手続ネｆｌｉ正獣を 昭和６１年１１月１ｚ日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ブラスミノーゲンアクチベーター前駆体をコードするＤ
   ＮＡ配列を組み込んだベクターを用いて形質転換させた
   ヒト腎由来株化細胞を培養して、ブラスミノーゲンアク
   チベーター前駆体を生産するに際して、培地に少なくと
   も中性アミノ酸を含むことを特徴とするブラスミノーゲ
   ンアクチベーター前駆体の産生増強方法。