JPS638560A - 免疫分析システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に免疫分析に関し、更に特にコロイド状
金を用いて実質的に均−系の免疫分析を行なうための新
しい系を提供する。

多くの人間の病気の状態は、抗体及び抗原、或いは配位
体を結合するパートナ−及び配位体の間の特異性にそれ
ぞれ及び相互に交換して依存する免疫分析技術に基づい
て同定される。過去１５年位にわたる所謂サンドウィッ
チ式及び競争式技術を用いる免疫分析技術の開発におい
ては実質的な量の誤差が存在した。サンドウィッチ式技
術は抗原の１つの抗体による固定化、続く検出しうる標
識を会合して有する第２の抗体の結合によるＷ激化を含
む。抗体を検出するための逆免疫分析（ｒｅｖｅｒｓｅ
　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）は同様であるが、但し抗原
を試料の抗体と反応させるために表面上に置く。競争式
技術は抗体と反応するためのエピトープ部位と１つだけ
有する抗原に対して有用である。

従って、また名称が意味するように、そのような技術は
固定化された抗体上の結合部位に対する抗原の、他の標
識された抗原との競争に依存する。

抗体の検出試験に対して必要な代替手段は明らかであり
、ここで更に詳細にｉｎする必要はない。

バッチ式ランダム評価、パネル、又はスタット（Ｓｔａ
ｔ＞法のいずれかで行なうことのできる高感度の技術の
開発は、実＠室において非常に重要である。好ましくは
そのような技術は本質的に均一系であり、即ち且つ本明
細書で使用するように該技術は分析中の反応後に成分を
物理的に分離する必要性がなく、１つの容器内だけで行
なわれよう。

本発明の１つの目的は高感度であり且つ本質的に均−系
である新規な免疫分析系を提供することである。

クロニン（Ｋｒｏｎｉｃｋ）の米国特許第３．９３９゜
３５０号及びそれに引用された参考文献は生化学的被検
体を液体試料における蛍光によって測定しうる免疫分析
系を記述している。クロニンは全内部反射という名称の
下で公知の物理的現象を用いる。この光学的現象は、光
が高屈折率の材料を通してその材料と低屈折率を有する
第２の材料との界面の方向に臨界角より大きい角度で向
った時、すべての光が、短い距離だけ第２の材料中を伝
播する諷微鏡的な極微小波を除けばその界面から反射さ
れる場合に起こる。この第２の材料は例えば分析を行な
う水又は他の水性媒体である。クロニンは、蛍光的に標
識された材料を界面に対して下方に且つ極微小波の場内
に持っていく場合、蛍光分子を活性化し、そして続いて
上に存在する溶液中に放射される蛍光を検出することが
できると記述している。しかしながらこのクロニンの系
は、系を検討する対象に適当ならしめるために蛍光標識
の変更によって容易に改変できない蛍光を見るものであ
る。励起振動数の波長に関する蛍光標識の特異性のため
に、系は臨界励起振動数を与える別個の光源に限定され
てしまう。今日までの多くの研究はＨｅ−Ｎｅレーザー
光源がその信頼性及び低価格並びに関連する光学系の低
価格のために好ましいことを示している。しかしそのよ
うな光源は）ｒｅ−Ｎｅレーザー出力光によって励起す
べき蛍光分子を適合せしめることに関１−て付随する難
点をもたらす。必要とされる有機、無機及び生物有機の
技術は免疫分析の分野において制御することが特に困難
である。更にクロニンの蛍光への依存は、蛍光分子の漂
白及び一般には蛍光分子励起波長の、良好な量子効率を
得るのに必要なレーザー出力波長との厳密な適合とに関
連した更なる欠点を付随する。

本発明の目的は、蛍光標識と関連した欠点及び励起源と
の適合性と関連した厳密性を回避する新規な免疫分析系
を提供することである。

本発明の他の目的は、照射源の選択に関してかなりの大
きい自由度を有しつつ全内部反射の理論を用いることで
ある。

ノラー（Ｎｏ１１ｅｒ）の米国特許第４，１８１．４４
１号はクロニンの系に類似した系を記述している。

しかしながらノラーは分析を液体試料における吸光度の
測定で行ない、これを生化学的被検体の存在と関係づけ
ることを教示している。ノラーの系はクロニンの系と異
なった物理的な理論を用いるけれど、吸光度の測定は大
きい光信号中の小さい差異が故に同様の貧弱なシグナル
−ノイズ比に供され、従ってそのような系は固有的に所
望以下の感度になってしまう 本発明の他の目的は、全内部反射（ｔｏｔａｌ　１ｎｔ
ｅｒｎａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）の現象によって
提供される利点を得つつも、吸光度の測定を用いること
を回避することである。

ルンドストロム（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ　）の米国特許第
４゜５２１．５２２号は反射とブリュースター（！１ｒ
ｅＩＩ＋５ｔａｒ）角の使用に基づく他の免疫分析を教
示している。この系は異なる光学的現象に基づくも、）
−〇あり、入射平面に偏光された光線を界面、例えばプ
ラスチックと液体間に形成される界面に向わせて、その
ような光がブリュースター角で界面に入った時強い光線
を液体中に透過せ１−ぬるというものである。ブリュー
スター角において、光は実貫的に反射しない。

ブリュースター角は２つの材料の屈折率並びに偏光の方
向の関数である。ルンドストロムは、界面における生化
学的層の生長時にブリュースター角の条件が乱されて、
特にブリュ−スター角よりも小さい角度において光反射
を増大させると述べている。悪いことにルンドストロム
の分析は、光線の液体中への透過が光散乱を発生させ、
斯くして偽りの信号をもたらすため洗浄工程を伴って始
めて効果的に行なえる。

本発明の他の目的は、光散乱を利用するが、光がブリュ
ースター角で界面に向うときに当然起こる光の液体中へ
の透過によって発生する光散乱を回避することである。

従って本発明の他の目的はブリュースター角の条件を用
いないことである。

本発明の種々の観点及び本質によれば、散乱された全内
部反射（ＳＴＩＲ）を、水性溶液中で決定すべき特別な
配位体の存在の尺度として利用する免疫分析系が用いら
れる。本発明は一部全内部反射と関連した臨界角の同定
に依存する。この角度は主に入射光波の向う材料例えば
プラスチックの屈折率及び免疫分析を行なう材料例えば
水性溶液の比較的低い屈折率の関数である。これは２つ
の材料間の界面に垂直な線から測定され、従ってその最
大値９０°は界面の平面内にある。

プラスチックを通って、水性試料及びプラスチック材料
によって形成される界面に、臨界角で向う光は、光のプ
ラスチック内での全内部反射をもたらすであろう。現実
の世界における材料が完全でないことは認めるところで
あり、従って入射光を臨界角よりも数置大きい角度で、
最も好ましくは約６°大きい範囲で界面に向わせて全内
部反射という基本的条件に適合するように保証すること
は好適である。そのような角度において、好ましくはレ
ーザーからの入射平行光は、プラスチックの表面に平行
な且つ表面から約ｙ４人の極微小波（ｅｖａｎｅｓｃｅ
ｎｔ　ｗａｖｅ　）の伝播を除いてプラスチック内で完
全に内部反射する。同様に界面における平滑な表面は最
適な信号の品質に対して好適である。クロニクの技術を
含む通常の蛍光技術と異なって、本発明の分析系は、許
容しうる光散乱を与えるために粒子径を用いる光源に適
合するように容易に調節しうる（或いはその逆も可能で
ある）ので、光の波長に関して自由度がある。蛍光分子
は励起波長に関して簡単には調節できない。

最も理想的には光源はＨｅ−Ｎｅ光源であるが、異なる
波長の他のレーザーも使用でき、発光ダイオード及び他
の非レーザー光源を含む他の光源も提案できる。

本発明の免疫分析系は更に１つの重要な相違はあるもの
の、通常の免疫分析技術に依存する。本発明では、理想
的には溶液よりも高い屈折率、最も好ましくは第１の光
透過性材料例えば前記例のプラスチックよりも高い屈折
率を有する粒状の標識を用いる。そのような粒子は例え
ば赤血球、高屈折率表面を有する他の材料例えば金属材
料、及び非金属物質例えばガラス又はプラスチック例え
ばラテックス粒子などを含む。最も好ましくはコロイド
状金が溶液相の免疫学的に活性な成分に対する標識とし
て使用される。標識としてのコロイド状金は例えばリュ
ーベリングの米国特許第４゜３１３．７３４号から公知
であるけれど、特に均−系における検出と関連した難点
のために、非凝集と関連するその標識の使用は今日まで
殆んど行なわれていない。今回驚くことに、５ＴＩＲと
コロイド状金との独特な組合せが非常に効果的で高感度
の均−分析系を与えるということが本発明者によって発
見された。これは主にコロイド状金粒子のＦｉ微小波と
の相互作用によると思われるが、確実なものではない。

確かに経験では、下層の固体よりも漸次高屈折率を有す
る粒子は一般に漸次光を散乱することが示唆されている
。下層の固体よりも小さい屈折率の粒子は、それが水性
媒体のそれに等しくないならば光を散乱するであろうが
、そのようなものはそれ程好適でない。

通常のサンドウィッチ式技術の場合を想定すると、１つ
の免疫グロブリン又は配位体を結合するパートナ−は表
面に固定化され、検すべき抗原又は池の配位体を結合す
る。次いで（又は同時に又は予じめに）、配位体上の第
２のエピトープ部位に向き且つコロイド状金で直接又は
間接に標識された第２の免疫グロブリンが配位体に結合
し、所謂「サンドウィッチ］を形成する。この配列にお
いて、コロイド状金の存在はｆ！微小波の伝播を妨害し
て散乱光を生じさせ、これが光増巾器又は池の光センサ
ーでの検出により対応する信号を与える１本発明の他の
重要な観点は検出器の物理的位置を含む。検出器は理想
的には臨界角より大きい角度において及び光源の方向へ
散乱して戻る光だけが検出できる位置に存在する。この
結果この位置は理想的には全液体媒体内における偽りの
散乱光の検出を回避する。

本発明の他の特徴は、免疫分析が拡散律速であり、特に
温度依存性でないということである。これは、温度の小
さな変化が単位時間当りの分析結果に広い変化もたらす
ので温度の制御が厳密であるＥＬＩ　ＳＡ及び種々の他
の免疫分析技術との大きな違いである。

今回驚くことに、これらの要素の組合せの結果として、
コロイド状金での分析技術と従来関連した複雑な装置を
必要としないで迅速且つ高感度の結果が均一の環境で得
られるということが本発明者によって発見された。

５ＴＩＲの原理を具現化する装置は、メレスーグリオ（
Ｍｅｌｌｅｓ−Ｇｒｉｏ）からの等近影フリント（ｆｌ
ｉｎｔ）ガラス・プリズム、０ｌ−ＰＥＳ−００７型を
用いて作られる。プリズムを一面を水平にして支持体上
に取りつけた。ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　）から
商品名イミュノロン・ツー（ＩＭＭｔｌＮＯＬＯＮＴＷ
Ｏ）　　（スチレン）として入手しうるミクロ慴滴定井
戸（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｗｅｌｌ）の形の抗体をコ
ーティングしたキュベツトを、標準的な顕微鏡用オイル
により水平のプリズム表面に光学的に結合させた。そし
てキュベツトの底表面の部分を臨界角から６°の角度で
照射するのに５ミリワツＩ・のベリラム−ネオン・レー
ザー［ツーゲス（Ｈｕｇｈｅｓ）　３２２５−）（−Ｐ
Ｃ］を使用した。

最初にプリズム上に光学的に取付けられたコーティング
してないキュベツトを、掃査型電子２Ｍ鏡（Ｓｃａｎｎ
ｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、
第２巻、９〜３１頁（１９８１年）、シア社（Ｓｅａｒ
　ｆｎｃ、、八ＨＦ、０’　ｆｌａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇ
ｏ）に従って製造される粒径的３０〜５０ｎｍのコロイ
ド状金のゾル及び血清の混合物を含んでなる散乱水性媒
体で満すことによって臨界角を決定した。次いでキュベ
ツト内に見えるレーザー光線路が光学的に消えて、実質
的にすべての入射光がキュベツト−液体界面で反射する
まで、即ち臨界角で起こることが知られた内部反射現象
まで入射光の軸に直角の軸に沿ってプリズムを回転した
。光学的に取りつけられたキュベツトを有する表面を通
る垂線とレーザー光線との間の臨界角を測定し、プリズ
ムを水平表面を与えるように再び設置し、そして臨界角
＋６°に等しい角度でプリズムを通って表面を内部的に
照射するようにレーザーを調整した。スチレン液体界面
の平面に平行な電場を有して配列された偏光をもつ偏光
レーザーが使用されるけれど、そのようなレーザーは好
適なだけであり、必ずしも必要ではない。確かに実質的
にいずれかの平行照射源が役に立つであろう。同様にプ
リズムは簡便であるけれど、照射を水性固体界面に向わ
しめるいずれかの光学的カップリング装７７７　（ｃｏ
ｕｐｌｉＢ　ｄｅｖｉｃｅ）が使用できて、全内部反射
をその界面で達成することができる。

光検出器［ハンママツ（ｌｌａｍｍａｍａｔｚｕ）Ｇ　
１７４７型当ダイオ−トコを、臨界角以上の、但し９０
”より小さい角度において、レーザー光源の方へ散乱し
て戻ってくる光を検出するように物理的にレーザーの近
くの位置に配置した。この位置では、界面が不完全であ
っても分析に先立って最小のレーザー光が検出される。

斯くして臨界角以上の光検出器の配置は、溶液中を伝播
する光、例えば無関係な起源によって誘導される直射光
又は２次光散乱が検出器に達しえないということを保証
するために非常に重要であると思われる。関連する利点
として、これは試料の色又は濁り且つ液体界面に存在す
る泡の影響を非常に減少させる。

光検出器からの電気信号を高利得電流増巾器［キースリ
ー−ｘレフトロメーター（ＫｉｅｔｈｌｙＥｌｅｃｔｒ
ｏＩＩｌｅｔｅｒ）　６１０−　Ｃ型］に電気的に連結
し、その出力をストリップ・チャート記録計で記録し或
いはコンピューター・データ・アクイジション系（ａｃ
ｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ）　［ＨＰコントロ
ーラー３４９７Ａ、ＨＰ９８３６コンピユータ］でデジ
タル的に記した。次いで反応速度を記録計のチャート上
でグラフ的に決定し或いは簡便にはコンピューターを用
いて決定した。

及ｌ匠Ｌ−ｈＣＧサンドウィッチ式分析抗ｈＣＧ抗体を
コーティングしたキュベツト（［単重な物理的吸着によ
ってコーティング）を、オイルをコーティングしたプリ
ズム上に位置させ、レーザーをキュベツトの中心で内部
的に反射するようにした。このキュベツトに分析緩衝液
（１％の牛の血清アルブミン、ＩＭＮａＣｌ及び１，５
μｐ１ｇ／、ｍｌのマウスのＩｇＧを含有する０、０１
Ｍ燐酸塩で緩衝されたＰ　Ｈ７，４の食塩水）３５μｌ
を添加した。次いでコロイド状金（寸法的４４　ｎ　ｍ
　）を結合した非封鎖性（ｎｏｎｂｌｏｃｋｉＢ　＞抗
ｈＣＧ抗体５０μｌを添加し、ピペットでの吸引により
混合した。次いでキュベツトに血清試料又は血清に基づ
く標準物［ギルフォード（Ｇｉｌｆｏｒｄ）　］　２５
μｐを添加し、混合した。散乱信号の強度をストリップ
・チャート記録計とデジタル・データ・アクイジション
系で記録した。反応速度を最初の５分間平衡化させて系
を直線的にし、次いで次の５分間動力学的に測定した。

未知の血清試料の反応速度（例えば信号の傾斜）を標準
物の反応速度と対比してｈＣＧ濃度を比較した。結果は
次の通りであった： １克１　　　住１の　、　任二の単位）ＯｍＩＵ　　　
　　　　　１．００ １０ｍＩＵ　　　　　　　　７．４３ ２５ｍＩＵ　　　　　　　１６．３３ ５０ｍＩＵ　　　　　　　３２．０３ １００ｍＩＵ　　　　　　　６８．６７２００ｍ１Ｕ　
　　　　　　　　　　１３０．９７ｍ−抗体に対する試
験（逆ｈＣＧサンドウィッチ式分析） ｈＣＧ抗原をイミュノロン・キュベツト上にコーティン
グし、実施例１における如く油分コーティングしたプリ
ズム上に位置させた。ｈＣＧのコーティングされたコロ
イド状金（約４５ｎｒｒ＋）５０ノｌｌを、実施例１に
記述したように分析）１ｉ液３５μｌと一緒にキュベツ
トに添加し、混合した。

マウスのモノクロナール抗ｈＣＧを含有する標準物（ｐ
Ｈ８，３ヘベス／トリス０．２２５Ｍ＋Ｏ１５％ＢＳＡ
で希釈）２５μｌを添加し、混合した。

平衡化のために５分遅らせた後、速度を実施例１におけ
る如く測定した。抗ｈＣＧの濃度を１０μｇ　／　ｍ　
１まで増加させるにつれて、光散乱の速度の増加が観察
された。この濃度以上では速度が減少し、予想されたフ
ック（ｈｏｏｋ）効果を示しな（例えば標識された及び
固定化された抗原が存在する抗体のすべてを受は入れる
のに不十分であった）。

データは以下の通りであった： マウスのＩＣ濃庁（ｎ）　；１の傾　く子穴の′５５１
−０ｎ　　　　　　　　　８．０２ Ｌｏｎｇ　　　　　　　　１０．２７ １ＱＱｎｇ　　　　　　　　１２．３５１μｇ　　　　
　　　　７５．８４ １０μｇ　　　　　　　　９１．３９ １００μｇ　　　　　　　　３７．００夫夏１支−抗原
をコーティングしたキュベツトを用いる競争式試験 次の工程に従い、チロキシン（Ｔ、）をＢＳＡに共有結
合させてＢＳＡ分子当り約２０のＴ４分子とした。Ｔ、
−ＢＳＡ共役体はＢＳＡをＴ、ＭＣ１即ちＬ−チロキシ
ニル−４−（Ｎ−マレイミド−メチル）−シクロヘキサ
ン−１−カーボネ−１・と、ＢＳＡのアミノ基によるＴ
、ＭＣのマレイミド基へのｐＨ９〜１０における求核付
加反応によって結合させることから製造した。Ｔ、ＭＣ
は中性ｐＨにおけるアミド化により、Ｌ−チロキシンを
用いることによりＳＭＣＣ１即ちサクシムイミジル−４
−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート［ピアース・ケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ）　］から誘導体化した。ｐＨ７に調
節した０、ＯＩＭ切酸塩緩衝液中Ｔ、−ＢＳＡ共役体０
．１７ｍｇ／ｍ１の００ｍ１を室温で１８時間培養する
ことによって市販のストリップ型゛？イクロ滴定井戸に
Ｔ、ＢＳＡ共役体を吸収させた。

井戸を０．２５Ｍヘベス／トリス緩衝液（０，０５％Ｎ
ａＮｚ、０．１５Ｍ　ＮａＣＩをｐＨ８，３で含有）で
３回洗浄した０次いで井戸をヘペス／トリス桜衝液＋１
％ＢＳＡ０．２ｍＮと共に室温テア２時間培養した。次
いで井戸をへヘス／緩衝液榎街液で３回洗浄し、そして
使用するまで４℃下に緩衝液と共に貯蔵した。

平均直径４０ｎｍのコロイド状金を前述した方法によっ
てモノクローナル抗Ｔ　４’　Ｉ　ｇ　Ｇでコーティン
グした。ストリップ型井戸のキュベツトを実施例１にお
ける如くプリズムに取つけ、０，０２％ＮａＮ、及び２
％の牛のガンマグロブリンを含有するｐＨ７，４のＰＢ
Ｓ６５μ！をキュベツトに添加し、続いて同一の緩衝液
中Ｔ４標準物１０μｌを添加した。次いで抗Ｔ、抗体で
コーティングしたコロイド状金２５μｌをキュベツトに
添加し、混合した。平衡化期間の後、反応速度を測定し
た。

予想されるようにＴ、濃度の増大を、次のように散乱戻
り光信号からの減少した信号速度と関連づけた： エエＱＬＫン鷺Ｖ↓ｙ　　俳３Ｊ１几１　　モ二の一゛
１ｑ）０　　　　　　　　　　５１．１ ２　　　　　　　　　　４１．９ ４　　　　　　　　　　２５．３ ８　　　　　　　　　　　９．０８ １２　　　　　　　　　　　６．５１ ２４　　　　　　　　　　　２．９６ 支Ｗ肚先−抗原でコーティングしたコロイド状金を用い
る競争式試験 イミュノロン・ストリップ型井戸のキュベツトに抗ジゴ
キシン（ｄｉｇｏｉｘｉｎ）　５　Ｊ−Ｌ　ｇ　／　ｍ
ｌ及びＯｌＬＭ　　ＫＰＯ，０，１ｍ４をＰ　Ｈ７，４
でコーチイン平均直径４０ｎｍのコロイド状金粒子を、
Ｔ、Ｗ。

スミス（Ｓｍｉｔｈ＞　、バイオケミストリー（Ｂｉｏ
ｃｈｅ＋ａｉｓｔｒｙ）　、９．３３１〜３３７　（１
９７０）の文献に示されている方法に従ってジゴキシン
−ＢＳＡ共役体（ＢＳＡ分子当りジゴキシン約５）１ｍ
ｇ　／　ｍ　１でコーティングし、次いで１：４に希釈
した。キュベツトにＭ、漬液（０，０１Ｍ　ＰＢＳ、１
．０Ｍ　　ＮａＣ１，１％　ＢＳＡ、ｐＨ７，６）ｊ５
μｌを添加し、続いて血清試料又は血清に基づく標準物
２５μｌ及びジゴキシンをコーティングしたコロイド状
金懸濁液５０ノ１βを迅速に添加し、混合した。次の５
分間中反応速度を測定し、結果を観察した。ジゴキシン
濃度の増大は次の如く反応速度の減少をもたらした。

０　　　　　　３７２、２９６ ０．２５　　　　　１２７、　８６ ０．５０　　　　　　３０、　２９ 火］Ｉ舛ｊ−一内部標準化した動力学的較正体分析間で
並びに井戸に添加される液体試剤間で井戸と井戸とで変
化があることは認識されていよう。これらの相違は動力
学的応答の変化に帰結し、これが補正をしなければ誤差
の結果を誘導する。

補正の１つの好適な方法は内部標準化された動力学的較
正体を用いることである。そうするためには、各分析の
開始時に低値の対照試料を井戸に添加し、そして試料の
同一井戸への添加に先立って反応速度を短時間監視する
。斯くして井戸の忌度を測定し且つその情報を用いて試
料の読みを補正し、これによって構造的な又は試剤コー
ティングの不均一性における相違を排除することにより
各井戸を補正するために対照試料を使用することができ
る。従って理想的には最初に対照試料を添加し、検出器
の出力値を監視することによって均一な速度での分析を
行なうことができる。関連する利点として、この方法は
複雑な分析を行なう必要がなく、この結果時間と試剤の
出費が節約できる。

そのような較正法は個々の試料の屈折率と非常に関連す
る粒子の光散乱効率に対して試料による変化も排除する
であろう。この方法の次の例は包含される本貫を示す。

成形したポリカーボネートのキュベツトに抗ｈＣＧ抗体
を吸着コーティングした。各キュベツトに分析用ｙＩｔ
ｒ液（実施例１から）１５０μ！、抗ｈＣＧでコーティ
ングしたコロイド状金（直径約４０ｎｍ）１００μｌ及
びギルフォードのストリップされた（Ｓｔｒｉｐｐｅｄ
）血清に基づ＜１０ｍＴＵ／ｍｅの較正体７５μβを添
加し、混合した。５分間の培養後、散乱光の強度の増加
速度（傾斜）を次の５分間で測定した。この較正の傾斜
を記録した後、ギルフォードの血清に基づく標準物７５
μｐを試料として添加し、混合し、５分間培養し、次い
で次の５分間で散乱光の傾斜を読んだ、各キュベツトの
真の補正された傾斜を次の方程式で計算した： 真の補正された傾斜紮［標準物の傾斜／ｌｌＩ２正体の
傾斜コー０．８８２に こに０．８８２６は６つの雰ｈｃａ５準物の平均の傾斜
をその各較正体の傾斜で割った値であった。

次の標準物の６つの反復試験のＣＶ（変化係数）を真の
補正された傾斜に基づいて計算し、これらの標準物の補
正されてない傾斜と比較した。データは次の通りであっ
た： １０ａｌＵ／旧　　　１８．３Ｂ　　　　　　　ｔｏ、
７９＄５０ｍ１Ｕ／旧　　　　　３０．３　１　　　　
　　　　　　　　２１．４２＄１００ｍ１Ｕ／旧　　　
１８．８６＄　　　　　　　　５．８８！２００ｓｌＵ
／Ｍｌ　　　　３３．６３＄　　　　　　　３０．８６
１すべての場合において、内部較正法を用いることによ
り、大きな精度と再現性の得られることが理解できる。

ｑ−ラテックス粒子を用いる競争式ｈＣＧ分析 イミュロン・ストリップ形井戸を実施例１に記述したよ
うにコーティングした。各井戸に分析緩衝液３５μｌを
添加しな。次いでストリップされた血清（ギルフォード
）に溶解したｈＣＧ２５μｌを添加し、混合した。５分
間の培養後に、「妊娠のためのオルトβ−ｈＣＧスライ
ド試験」のｈＣＧをコーティングしたスチレンラテック
ス（直径０．３７５７５ミフロンンオルト・ダイアグノ
スチツク・システム社（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃ　ＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ、）］　５０μｌを添加し
、そして混合した。反応速度を５分間平衡化させ、そし
て次の５分間で散乱光の信号の傾斜を計算した。結果は
次の通りであっな： ２２３．８７５　　ｍｌＵ／ｍ１　　　３．６１、３．
７６、６．０４　　　　　４．４フ２２．３８７　　　
　　　　８．９６．９．０２．９．２５　　　９．０８
２．２３８　　　　　　　１１８、１２２、１４４　　
　１２８２２３　　　　　　　１５Ｂ、　１６２、１８
７　　　１６９２２．３　　　　　１４８、１５７、１
９６　　　１６７２．２　　　　　１３８、１４２、１
６１　　　１４７及１匠ニ一赤血球粒子（直径約８ミク
ロン）を用いる直接的赤血球抗原試験 ポリカポネートのキュベツトに、ＲＨ因子試験に対する
抗Ｄ（抗Ｒｈｏ）及びＡＴｈＯ血液群試験に対する抗Ａ
を吸着コーティングした。人間の全血０．５ｍｌを遠心
分離にかけ、ｐＨ７，４の燐酸塩ＭＯＢ食塩水（ＰＢＳ
）５ｍｌに再懸濁させ、遠心分離にかけ、ＰＢ３２ｍｌ
に再懸濁した。この試料懸濁液３００μｌをコーティン
グしたキュベツトに添加し、そして混合した。２分間の
培養後に、散乱光の強度の傾斜を次の８分間又は１８分
間にわたって計算した。結果は次の通りであった：抗Ａ
をコーティングしたキュベツトにおける傾斜 Ａ−２６７（８分） Ａ＋　　　　　　　　２４０　　　（１８分）１３＋　
　　　　　　　　　　　−１８，６（８分）０　　　　
　　　　　　　　　　　　１４．９＜１８　分）抗りを
コーティングしたキュベツトにおける傾斜 ゛“　の血　型（ＲＨ型）　　−傾１仁咋Ｈ＞−Ａ＋　
　　　　　　　５６．６　　（１８分）Ｂ＋　　　　　
　　１０．２　　（１８分）０−Ｄ−（高ＲＨ＋）＊　
　３２．３　　（１８分）Ａ−４，３（１８分） ０−　　　　　　　　４．５　　（１８分）＊稀れな血
液型 本発明の精神又は範囲を実質的に逸脱しなくとも本発明
の系に対しである程度の物理的手加減を加えうろことは
同業者の容易に認識するところであろう。例えばキュベ
ツト及びプリズムの組合せ物はキュベツトのミクロ滴定
井戸がキュベツトの一部を形成するプラスチック製プリ
ズムと一緒に形成されている１つの合体単位であってよ
い、同様に臨界角以上６°の角度が最も好適であると判
明したけれど、照射源及び光検出器の光学的特性に依存
して臨界角以上のある変化がより最適であるかも知れず
、それが本明細書で言及した角度と同等であると見なし
うろことも認識されよう、更にキュベツトの側面又は底
部で測定を行なうこともできる。

更に金、ラテックス及び赤血球のようなコロイド状粒子
が実施例において記述されているけれど、粒子とその特
別な寸法範囲は制限と見なすべきでなく、広い範囲の可
能性の単なる例示であるということも認識すべきである
。確かに、粒子の寸法は一般に液体媒体中の光の波長（
順次媒体の屈折率）を考慮して選択すべきであり、粒子
の屈折率は理想的にはその真の効果が系の共鳴の起こっ
た時に最も有利に得られる最適な信号となるように水性
媒体及び団体の屈折率を考慮して選択すべきである。こ
れらの複雑な相互の関係を理解するための現在の知識で
これを予測することは非常に困難であるけれど、実際の
最適化の操作は同業者にとって比較的簡単且つ容易であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水溶液中の配位体（ｌｉｇａｎｄ）又は配位体を結
   合するパートナーを検出するために光散乱する粒子で標
   識された免疫学的に活性な成分を用いる免疫分析系に使
   用するための装置において、 水性試料を受ける、水性試料より大きい屈折率を有する
   、容器、 照射するための光源、 該照射を容器及び水性溶液間の界面に向わせる光学的カ
   ップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）手段、該照射を臨界角
   に等しい又はそれより大きい角度で容器及び水性溶液間
   の界面に向わせるべく該光学的手段及び該光源と固定さ
   れた関係で該キュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）を受けるた
   めの照準設定（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）手段、及び 該臨界角以上で該光を散乱する粒子により散乱され且つ
   該光源の方向へ戻る光を受けるための光検出器、 を含んでなる該免疫分析系に使用するための装置。 ２、該光源が平行光源を照射し、また光学的カップリン
   グ手段が該容器に光学的に結合されたプリズムである特
   許請求の範囲第１項記載の装置。 ３、該光源がレーザーである特許請求の範囲第２項記載
   の装置。 ４、水性溶液中において配位体又は配位体を結合するパ
   ートナーを検出するための免疫分析系において、コロイ
   ド状金を該免疫分析における標識として用い、該免疫分
   析を極微小波の場で行い、該コロイド状金粒子の存在に
   よって該極微小の場で散乱された光を測定し、そして該
   コロイド状金で散乱された光を決定すべき配位体又は配
   位体を結合するパートナーの存在の関数として関係づけ
   ることを含んでなる該免疫分析系。 ５、水性溶液中の疑いのある配位体に特異的な第１の配
   位体を結合するパートナーを準備し、但し該第１の配位
   体を結合するパートナーを、該水性試料中において光散
   乱特性を有する粒子で標識し、 該第１の配位体を結合するパートナー及び該水性試料を
   光学的に透過性の材料の一面と組合せて該材料及び該試
   料間に界面を形成させ、但し該材料が、該水性試料と接
   触する該材料に結合し且つ該配位体を結合しうる第２の
   配位体を結合するパートナーを複数で有し、該光学的に
   透過性の材料が該水性試料の屈折率よりも大きい屈折率
   を有し、該界面を、該光学的に透過性の材料を通して、
   該材料に対して該材料内で全内部反射を与える角度で照
   射し、そして 該界面から散乱された光量を測定し、但し該散乱された
   光量が該分析媒体中に存在する配位体の量の関数である
   、 工程を含んでなる該配位体を含む疑いのある水性試料中
   の配位体の存在を決定する方法。 ６、該測定工程を該臨界角よりも大きい角度で行ない且
   つ実質的に戻り散乱光だけを検出する特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 ７、該配位体を結合するパートナーがモノクローナル又
   はポリクローナル起源の抗体であり且つ該配位体がそれ
   と特異的に反応する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、該試料中の決定すべき該配位体が抗体であり、また
   該材料に結合した該第２の配位体を結合するパートナー
   が該試料の抗体と特異的に反応する抗原又はハプテンで
   ある特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、該粒子がコロイド状金、ラテックス粒子、ガラス粒
   子、金属粒子、非金属粒子及び赤血球からなる群から選
   択される特許請求の範囲第５項記載の方法。 １０、該照射工程が該表面にヘリウム−ネオン・レーザ
   ーからの光を照射することを含んでなり且つ該粒子がコ
   ロイド状金粒子である特許請求の範囲第６項記載の方法
   。 １１、該第１の配位体を結合する粒子を、該水性試料を
   添加する前に該光学的に透過性の材料に添加する特許請
   求の範囲第５項記載の方法。 １２、該水性試料を、該第１の配位体を結合するパート
   ナーを添加する前に該光学的に透過性の材料に添加する
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 １３、該水性試料と該第１の配位体を結合するパートナ
   ーを、該光学的に透過性の材料と組合せる前に混合する
   特許請求の範囲第５項記載の方法。 １４、該粒子がコロイド状金である特許請求の範囲第５
   、１１、１２、及び１３項記載の方法。 １５、該測定工程を複数回行なって、該水性試料中の配
   位体の存在に関連づけうる評価を誘導する特許請求の範
   囲第５、１１、１２及び１３項記載の方法。 １６、該粒子がコロイド状金である特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。