JPS639826B2

JPS639826B2 -

Info

Publication number: JPS639826B2
Application number: JP14634678A
Authority: JP
Inventors: Shosaku Numa; Kohei Hosaka; Kosei Tanaka
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1978-11-27
Filing date: 1978-11-27
Publication date: 1988-03-02
Also published as: JPS5574791A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は長鎖アシル、コエンザイムＡ、シンセ
ターゼ（本明細書においてはアシルCoAシンセ
ターゼと略す。EC.6.2.1.3）およびその製造方法
に関するものである。アシルCoAシンセターゼは生体内における脂
肪酸酸化の第一段階に位置する重要な酵素であ
り、下記の反応に関与する。 C_oH_2o+1COOH＋CoA＋ATP →C_oH_2o+1COCoA＋AMP＋ピロ燐酸 …〔〕その所在はラツトの肝臓、大腸菌、バチルス属
の細菌、酵母等で知られているが膜結合性の酵素
であり、かつ不安定であるため、これ迄種々の精
製が試みられてきたが純粋な標品として取り出す
ことは出来なかつた。例えばデイー、サミユエル（D.Samuel）等は
ユーロピアンジヤーナル、オブバイオケミス
トリー（European Journal of Biochemistry）
12巻576〜582ページ（1970年）においてエシエリ
ヒア、コリ（Escherichia coli、以下E.Coilと記
す。）のアシルCoAシンセターゼを精製している
が単一蛋白には精製されておらず、又蛋白質当り
の比活性も低い。又ジエイ、バー、タナ（J.Bar.Tana）等はバ
イオケミカル、ジヤーナル（Biochemical
Journal）122巻 353〜362ページ（1971年）にお
いてラツトの肝臓のミクロソームから、上記長鎖
アシルCoAシンセターゼを精製しているが、こ
こでも単一性は電気泳動的に問題であり、又比活
性も低い。本発明者等は動物起源の長鎖アシルCoAシン
セターゼの精製方法について鋭意検討を続けた結
果、細胞中のミクロソーム及びミトコンドリアに
別個に存在する該酵素を、それぞれ極めて比活性
が高く、かつ電気泳動的に単一な上記酵素を取得
することが出来た。すなわち、本発明の要旨は、 (1) 次の物理化学的性質を有する長鎖アシル
CoAシンセターゼ (i) 基質特異性炭素数10〜20の直鎖脂肪酸に主として作用
する。 (ii) 至適 PH7.1〜9.6 (iii) PH安定性 6.1〜8.0（４℃、36時間） (iv) 至適温度 35℃ (v) 温度安定性 35℃以下 (vi) 活性化剤 K⁺、NH₄ ⁺及びMg⁺⁺イオン阻害剤 Cu⁺⁺イオン、EDTA (vii) 分子量約77000 （S.D.Sデイスク電気泳動法） (viii) アミノ組成リジン6.4％、ヒスチジン1.7％、アルギニ
ン4.7％、アスパラギン酸9.4％、スレオニン
5.4％、セリン6.5％、グルタミン酸13.3％、
プロリン4.3％、グリシン9.6％、アラニン7.4
％、バリン6.5％、メチオニン2.3％、イソロ
イシン5.7％、ロイシン9.8％、チロシン2.6
％、フエニルアラニン4.7％（上記16ケのアミノ酸の全量を100％とした
時のモル％）および (2) アシルCoAシンセターゼを含有する動物組
織を破砕して細胞顆粒部分を界面活性剤処理に
より該酵素を可溶化する工程及び可溶化した該
酵素をアフイニテイー、クロマトグラフイーに
より夾雑蛋白質より分離する工程を含むことを
特徴とする上記アシルCoAシンセターゼの製
造方法に存する。本発明の１つの特色はアフイニテイー、クロマ
トグラフイーによる該酵素の夾雑蛋白からの分離
にある。本発明の更に一つの特徴は得られた該酵素が非
常に純粋であり、かつ比活性が従来ものと比べて
極めて高いということである。すなわち前述のE.
coliの該酵素では最も精製された段階においても
電気泳動的に単一ではなく又比活性も106mU/mg
蛋白と低い。しかるに本発明の方法で精製されたラツトの肝
臓の該酵素は電気泳動的にも全く単一であり、か
つ比活性も50〜100倍と極めて高い。以下に本発明を詳細に説明する。本発明のミクロソーム及び重ミトコンドリアに
存在する二種の直鎖アシルCoAシンセターゼの
理化学的性質は次の様である。（以下ミクロソー
ム及び重シトコンドリアのアシルCoAシンセタ
ーゼをそれぞれ、アシルCoAシンセターゼＡ及
びＢと呼ぶ。）酵素の理化学的性質 (1) 作用２種の酵素の作用は前述〔〕の反応を触媒す
るものであるが、その証明は以下の通りであ
る。本酵素をCoA、ATP、Mg⁺⁺存在下にＵ−
¹⁴C−ラベルした基質パルミチン酸カリウムに
作用させて、水溶性の生成物のTLCからパル
ミトイルCoAの生成が確認された。又上記反応系でヒドロキシラミンを添加しパ
ルミチン酸カリウムを基質とした条件下で反応
を行ない、その生成物のシリカゲル、クロマト
グラフイーにおいてもパルミトイルヒドロキサ
ム酸の生成が確認された。この事実から生成物
の一つはパルミトイルCoAであることが確認
された。又上記反応におけるAMPの生成は後述(4)力
価測定法の方法２での標準反応系においてミオ
キナーゼを添加しない場合はNADHの酸化が
起らないことにより確認された。 AMPの生成量と添加パルミチン酸及び添加
CoAの化学量論的関係は吸光度法においてパ
ルミチン酸及びCoAの添加量が制限因子とな
る条件下では添加量と生成AMP量間上１：１
の関係が認められる。これ等の結果よりアシルCoA、シンセター
ゼは前述の反応を行なうことが確認された。 (2) 基質特異性表−１の通りである。飽和、不飽和にかかわ
らず炭素数10〜20の直鎖脂肪酸には作用する。 (3) 至適PH及び安定PHの範囲 (4)の力価測定法の項で用いた標準反応液を用
いPH6.2〜7.1は燐酸カリウム緩衝液、PH7.1〜PH
8.8はトリス塩酸緩衝液、PH8.8〜10.2はグリシ
ン−NaOH緩衝液を用いて測定した結果、至
適PHは7.1〜9.6と広範囲であつた。一方、PH安定性については酵素液を2mMト
リトンＸ−100（商標名；ローム、アンド、ハー
ス社製、主成分イソオクチルフエニルポリエト
キシアルコール以下：活性剤Ｔと呼ぶ）及び
2mMメルカプトエタノールを含む0.1M燐酸カ
リウム緩衝液（PHは6.1、7.4、8.0及び9.0）で
４℃で36時間透析した後、内液の活性を標準条
件下で測定した結果、上記PHでは、両酵素共
6.1〜8.0では全く失活していなかつたが9.0では
５％の活性しかなかつた。 (4) 活性の測定法 (i) アイソトープ法バニスとトーブ（Banis and Tove）の方
法（バイオキミカ、エ、バイオフイジカ、ア
クタ（Biochimica et Biophysica Acta）
210〜220頁（1974年）を基本とした。すなわ
ち反応液はトリス塩酸緩衝液（PH8.0）
20μmol、ジチオスライトール1μmol、
ATP3μmol、MgCl₂3μmol、KCl30μmol、
Ｕ− ¹⁴C−パルミチン酸カリウム（0.2μCi／
mol）0.2μmol、活性剤T0.32μmol、
CoA0.2μmol、それと酵素液で全量0.2mlとし
た。35℃で１分間予熱した後CoAを添加す
ることにより反応を開始し、10分後イソプロ
パノール−ｎ−ヘプタン−1MH₂SO₄40：
10：１を2.5ml添加して反応を停止させた。
未反応の遊離脂肪酸はヘプタンで抽出除去し
た。水層を２回８mgのパルミチン酸を含んだ
２mlのヘプタンで洗い、水層の放射能を測定
した。上記条件下で１分間に1μmolのパルミトイ
ルCoAを生成する酵素量を1Uと定義した。方法２反応式〔〕において生成するAMPを酵素
的に測定する方法である。すなわち、100μmol Tris・HCl緩衝液
（PH8.0）5μmolジチオスライトール、
1.6μmol活性剤Ｔ、10μmolATP、
15μmolMgCl₂、150μmolKCl、0.1μmolオレ
イン酸カリウム、0.6μmolCoA、0.2μmolフ
オスフオ・エノール・ピルビン酸カリウム、
0.16μmolNADH、20μgミオキナーゼ、30μg
ピルビン酸キナーゼ、30μg乳酸脱水素酵素、
アシルCoAシンセターゼ任意量を１ml中に
含む反応液を標準反応液とするCoA以外の
成分を含む反応液を35℃に１分予熱し、これ
にCoAを添加して反応を開始し、NADHの
減少による334mmの吸光度の減少速度を求め
る。上記条件下で１分間に1μmolのAMPを生
成させる酵素量を1Uとする。方法２による
活性は方法１による活性の1.6倍である。 (5) 作用適温の範囲方法１で所定温度で15分間反応させた結果25
℃の活性を100とすると両酵素共35℃で200、で
あり従つて作用適温は35℃である。 (6) 温度安定性 ATP10mMを含む緩衝液Ａ中で酵素を15分
所定の温度にした後の活性を測定した結果両酵
素共25℃での活性を100とすると35℃、100、45
℃、26であつた。 (7) 活性化剤及び阻害剤両酵素共、K⁺、NH₄ ⁺及びMg⁺⁺イオンによ
り活性化される。15mMのMg⁺⁺の活性を100と
すると同一濃度でMn⁺⁺60〜80、Co⁺⁺、Ca⁺⁺、
Zn⁺⁺は20〜30％又15mMのCu⁺イオンにより完
全に、又EDTAにより阻害される。 (8) 精製方法ミクロソームのアシルCoAシンセターゼは
動物の肝臓のホモジエネートの遠心上清を
13000Gで20分遠心分離した上清を更に
230000G60分超遠心分離した沈澱画分を界面活
性剤たとえばトリトンＸ−100（商標名、主成
分、イソオクチルフエニルポリエトキシアルコ
ール以下活性剤Ｔと呼ぶ。）で可溶化した後、
アフイニテイ、クロマトグラフイー（たとえば
ブルーセフアロースCL−6B商標名フアーマシ
ア、フアインケミカルズ社製）を行ない吸着さ
れた酵素を10mM、ATP0〜0.8M NaClで溶出
し、その後必要に応じてポリエチレングリコー
ル分画、ハイドロキシ、アパタイト、クロマト
グラフイー、フオスフオセルロース、クロマト
グラフイーにより精製する。又重ミトコンドリ
ア画分の酵素の精製は基本的には上と同様であ
るが13000G20分の遠心分離の沈澱画分を用い
ること、及び安定化のためにすべての場合25
（重量／容量）％ジメチルスルホキサイド（以
下DMSOと略す。）を存在させることが必要で
ある。なお精製法の詳細は実施例１及び２に示
した。 (9) 分子量 2mM活性剤Ｔを含む酵素液で測定した。ドデシル硫酸ソーダ及び２−メルカプトエタ
ノール処理した酵素の電気泳動易動度から分子
量は両酵素共77000である。 (10) アミノ酸組成

【表】 6N−塩酸で110℃、20時間分解後の分析値で
ある。数字は上記16ケのアミノ酸の全量を100
％とした時のモル％で示した。 (11) 結晶構造本酵素は結晶状に得られていないため、結晶
構造は不明である。 (12) その他の性質 (i) アシル、アクセプターの特異性 CoAが最も良く、ミクロソームの酵素で
はKm＝0.026mM、ミトコンドリアの酵素で
はKm＝0.028mMであつた。又、CoAに対しデフオスフオCoAは約70
％、パンテテインは約50％4′−フオスフオパ
ンテテインは30〜40％であつた。 (ii) ヌクレオチド−5′−燐酸に対する特異性
ATP及びdATPのみが有効、ミクロソーム
の酵素はKm＝2.38mM、ミトコンドリアの
酵素はKm＝2.27mM、10mM濃度では
dATPはATPに対し約30％の活性同濃度で
GTP、UTP、CTP、dTTP、ITPは不活性
であつた。なお、アシルCoAシンセターゼＡ，Ｂの違い
の１つは安定性でありＡは安定であるがＢは不安
定である。第１図に両者の安定性のグラフを示し
た。又両者の違いの第２点はＢがDMSOで安定化
するのに対しＡはDMSOの安定化作用がない点
である。なお上記の性質の記載における酵素Ｂのデータ
は全て25％DMSO溶液中での値である。本酵素を公知のアシルCoAシンセターゼと比
較する。従来、動物起源のアシルCoAシンセターゼと
してはジエイ、バー、タナ等による前述の報告及
びメソツド、イン、エンザイモロジー
（Methodsin Enzymology、Ｊ、Ｍ、Lowenstein
編、Academic Press 1975）35巻 117〜122ペ
ージ）がある。上記報告の酵素と本発明の二つの
酵素を比較すると前者は分子量が168000で分子量
28000のサブユニツトから成り至適PHも8.2〜8.4
と狭く、又基質特異性はオレイン酸に対しては作
用が弱く、最も強いパルミチン酸の1/3程度であ
る。又比活性も250nmolパルミチン酸CoA／分、
mg蛋白である。一方後二者は分子量は約77000単
一のポリペプチドでサブ、ユニツト精造は持たな
い。又至適PHは7.1〜9.0と非常に広く、又基質特
異性についてはオレイン酸に対してはパルミチン
酸とほぼ同等の活性を有する。さらに比活性も
25μmolパルミチン酸CoA／分、mg蛋白と前者の
約100倍高い。従つてこれらの性質より本発明の
２種の酵素は起源は同じであるが性質の全くこと
なつた別の新規なアシルCoAシンセターゼであ
ると考えられる。次に本酵素の製造法について説明する。本酵素を製造する原料としては動物の肝臓、脂
肪組織が用いられる。すなわち、ラツト、マウ
ス、ニワトリ、牛、豚等が適当である。これらの肝臓を細砕した後更にホモゲナイザー
等により十分に組織を破壊した後、遠心分離によ
り細胞破片等を除去してその上清を集める。（粗
抽出液）この上清を更に13000G20分程度遠心分離し、
その上清はからはミクロソームの酵素を又、沈澱
からは重ミトコンドリア画分の酵素が得られる。
この上清は更に超遠心よりミクロソーム画分を沈
澱させて集める。次にこの細胞顆粒部分を含む上澄液について界
面活性剤処理を行ない顆粒から該酵素を遊離させ
る。この操作に先立つて、この上澄液を超遠心処
理により一度顆粒画分を沈澱させ適当な緩衝液に
けん濁させたものに対し上記処理を行うことも出
来る。使用される界面活性剤としては胆汁酸類たとえ
ばコール酸ソーダ、デオキシコール酸ソーダ等、
非イオン性界面活性剤たとえばポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアル
キルフエノールエーテル類、ポリオキシエチレン
アルキルエステル類、ソルビタンアルキルエステ
ル類、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエ
ステル類等に属する界面活性剤である。これ等のうち好ましい界面活性剤は非イオン性
界面活性剤、例えばポリオキシエチレンアルキル
フエノールエーテル類である。特に好ましい界面活性剤は活性剤Ｔである。そ
の添加量は用いられる微生物の種類、活性剤の種
類等により異なるが通常0.1〜1.0w/v％である。この様な活性剤による該酵素の可溶化処理は通
常30分〜２時間行なう。温度は低温たとえば０〜
10℃好ましくは０〜４℃である。この時可溶化に伴なう失活を防ぐ為処理液中に
燐酸緩衝液、メルカプトエタノール等の酵素の保
護剤及びEDTA等を添加しても良い。この様な条件下で可溶化された該酵素は超遠心
により顆粒画分より上澄として分離される。次に、この該酵素含有液をアフイニテイー、ク
ロマトグラフイーにより精製する。この際の吸着
体としてはADP、ATP、CoA等に親和性を持つ
酵素を特異的に吸着するものが選ばれる。すなわち、その構造の一部に、リガンドとして
ADP、及び／またはCoAと構造類似性を有する
部分を持つものである。ここでいう構造類似性とは、ADP、ATP及
び／またはCoAの関与する反応にあずかる酵素
に親和性を持ち特異的に吸着する性質をいう。こ
の様なADP、ATP及び／またはCoAと構造類似
性を有する物質としては式() で示される１−アミ−４（4′−アミノフエニルア
ミノ）−アンスラキノン−２，3′−ジスルホン酸
ソーダや下記の一般式()を有するチバクロン
ブルー（Cibacron blue）F3G−Ａ（商標名チ
バガイギー社製）（以下リガンドＣという）があ
げられる。（式中 R₁＝Ｈまたは−SO₃Na R₂＝SO₃NaまたはＨ）これ等を構造類似性を損わない様な方法で支持
体に結合させたものが本目的のための吸着体とし
て好ましい。スペーサーとしては、この際特に必要ではない
が挿入しても差支えない。次にこれ等のリガンドの支持体としては特に限
定されるものではないが孔径（pore size）の大
きいこと、リガンドとの結合条件の温和なこと、
機械的強度の大きいこと、化学的に安定なこと、
蛋白質の非特異的吸着が少ないこと等の点から多
糖類や多孔性ガラスが望ましい。多糖類としては
デキストラン、及びその架橋物、アガロース及び
その架橋物等が特に好ましくまたビーズ状のもの
は取り扱いが容易である。これ等のアフイニテイー、クロマト用の吸着体
として最も好ましいものは一般式() （式中、R¹およびR²は、何れか１つが水素原子、
残りの１つが−SO₃Na基を、Ｘは多糖残基を表
わすものとする。）で示されるものであり、このような吸着体として
市販されているものとしては、ブルーセフアロー
スCL−6B（商標名、フアーマシアフアインケ
ミカルズ社製以下B.S.と略す）がある。これは前
述のリガンドＣをリガンドとし、支持体はセフア
ロースCL−6B（商標名：フアーマシアフアイ
ンケミカル社製、主成分：架橋アガロース）で
ある。該酵素含有液を上記アフイニテイー吸着体カラ
ムに吸着後、カラムにATP、ADP、AMP、
CoA等を含有する緩衝液を流すと蛋白質は溶出
してくるが、この蛋白画分には活性はない。次に
このカラムに上記ATP含有緩衝液に塩化ナトリ
ウムの0.8M液でカラムを処理すると蛋白質が分
離溶出してくる。この時該酵素は単一ピークとなつて溶出する。上記結果から該酵素のクロマトグラフイーによ
る分離は単にアフイニテイのみならずイオン交換
もミツクスされたクロマトグラフイー分離による
ものであると思われる。かくして得られた該酵素液は相当に高い比活性
を有しこの操作のみでも、殆んどの夾雑蛋白は除
去されるが更に必要に応じて精製を行なつてもよ
い。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフイ
ー更にはフオスフオセルロースカラムクロマ
トグラフイー等が適当である。この様な方法で得られたアシルCoAシンセタ
ーゼは極めて純粋でありSDS電気泳動においても
単一バンドを与えた。次にアシルCoAシンセターゼＢの精製方法に
ついて述べる。重ミトコンドリア画分は粗抽出液を13000G20
分遠沈した沈澱画分として集められるが、この画
分に終濃度が25％（重量／容量）となる様に
DMSOを添加し、前記ミクロソームの酵素と全
く同様の条件下で可溶化以下の操作を行なえば良
い。この際すべての操作において常にDMSO25
％濃度を維持する必要がある。該酵素は前記反応式で示した如く遊離脂肪酸か
ら当量のAMPを生成するが、このAMPを下記の
反応系により測定すれば酵素法により、血中の遊
離脂肪酸を測定することが出来る。（臨床化学４
巻２号179ページ、1975年、日本臨床研究会、参
照）従つて本発明の酵素は血中の遊離脂肪酸測定に
用いる診断用酵素として極めて優れたものであ
る。又、生化学試薬として重要なラベル化されたア
シルCoAはラベル化された脂肪酸から該酵素を
用いることにより極めて有利に製造することが出
来る。実施例１（アシルCoAシンセターゼＡの精製）全ての操作は０〜４℃で行なつた。約200ｇ／匹前後のWistor系のオスまたはメス
のラツト30匹より肝臓を摘出し（300〜400ｇ）、
包丁で予め細かく切りきざんだ後３倍量（容量）
の0.25M冷蔗糖液と混ぜて、テフロンホモゲナイ
ザーで３回程上下してホモゲナイズする。次にこ
のホモジエネートを600G10分間遠心分離し上清
を集め沈澱は再度３倍量の0.25M冷蔗糖溶液を混
ぜてホモゲナイズし、上清を集める。この操作を
もう一度繰り返し、全上清を集めた後13000G20
分遠心分離し、この沈澱部分は重ミトコンドリ
ア、画分とする。一方上澄は更に230000Gで１時
間遠心分離し、その沈澱画分をミクロソーム画分
とする。以下ミクロソーム画分の精製について述べる。ミクロソームの0.25M蔗糖けんだく液を終濃度
が活性剤Ｔ、燐酸カリ緩衝液（PH7.4）、２−メル
カプトエタノール、EDTAについてそれぞれ
8mM、50mM、5mM及び1mMとなる様な溶液
とする。この時の蛋白濃度は８mg/mlこの溶液を
氷水中で１時間保つた後230000G、60分超遠心し
てこの上清部を取る。次にこの上清部を2mM活性剤Ｔ、5mM2−メ
ルカプトエタノール溶液５倍量で希釈した後、
2mM活性剤Ｔ、2mM2−メルカプトエタノール
を含む20mM燐酸カリ緩衝液（以下緩衝液Ａと呼
ぶ）で平衡化したB.S.（2.6×17.5cm）に吸着せし
めた。吸着カラムをカラムの５倍量の緩衝液Ａで洗浄
後カラムの５倍量の10mMATPを含む緩衝液Ａ
で洗浄し、次にカラムの８倍量の10mMATP、
0.8M食塩を含む緩衝液Ａで溶出する。この時の
流速は10−15ml/hrとし、比活性が3.9U/mg以上
の画分を集める。次に上記B.S.処理により集めた酵素液に0.7倍
量の50％（重量／容量）ポリエチレングリコール
（平均分子量6000）を添加し１時間ゆつくり撹拌
した後、230000Gで30分超遠心して沈澱を50mlの
緩衝液Ａにけん濁し、テフロンホモゲナイザーで
１〜２回泡立てない様に注意しながら、ホモゲナ
イズする。次にこれを氷浴中で30分間ゆつくりとマグネテ
イツクスターラーで撹拌した後230000G30分超
遠心した後、その上清を取り緩衝液Ａで平衡化し
たSephader Ｇ−10（商標名：フアーマシアフア
インケミカルズ社製）のカラム（５×25cm）を通
し蛋白質を含む全画分を集める。次にこの画分を緩衝液Ａで平衡化したハイドロ
キシアパタイトＣカラム（２×16cm）に吸着させ
カラムの２倍量の緩衝液Ａで洗浄後カラムの５倍
量の緩衝液Ａと同量の2mM活性剤Ｔ、5mM2−
メルカプトエタノールを含む0.4M燐酸カリ緩衝
液（PH7.4）を用いた直線的なグラジエント条件
下で10ml/hrの流速で溶出させ15mlずつ分画する。
酵素は0.05M〜0.15Mの燐酸の濃度の画分で単一
ピークとなつて溶出されるので比活性９U/ml以
上の画分を集める。次にこの画分をダイヤフロ
ー、メンブレン、フイルター（アミコン、フア、
イースト社製）PM−30で50ml迄濃縮し、緩衝液
Ａで平衡化したセフアデツクスＧ−10、カラム
（５×25cm）を通して脱塩酸、同一緩衝液で平衡
化したフオスフオセルロースＰ−11（商標名：
フアツトマン社製）のカラム（２×10cm）に吸着
させ、カラムの５倍量の緩衝液Ａで洗浄後、カラ
ムの５倍量の緩衝液Ａ及び同量の2mM活性剤Ｔ
及び5mMの２−メルカプトエタノールを含む
0.3M燐酸カリ緩衝液（PH7.4）の間で直線的にグ
ラジエントをかけた溶液で10ml/hrの流速で溶出
を行ない、５mlずつ分画した。活性は燐酸濃度が
0.05〜0.15Mの間に単一ピークとなつて溶出され
るので比活性20U/ｇ以上の分画を集めた。この画分はSDS、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動においてRf＝0.465に完全に単一なバンドを
示し（第２図）純粋なアシルCoAシンセターゼ
であることがわかつた。表−２に上記方法における各段階でのデータを
示す。実施例２（アシルCoAシンセターゼＢの精製）実施例１において得られた重ミトコンドリア画
分を終濃度がそれぞれ下記の様な溶液にけん濁さ
せる。（PH7.4燐酸カリ、緩衝液50mM、２−メル
カプトエタノール5mM、EDTA1mM、
DEMSO25％（重量／容量））０℃１時間可溶化
前処理後、230000Gで60分超遠心を行ない沈澱を
集め、これについて実施例１と同様の方法で可溶
化以後の処理を行なつた。ただし常に25％（重
量／容量）DMSOを含む系を用いる点のみ実施
例１とことなつた。フオスフオ、セルロース処理後の純粋酵素の電
気泳動図を第２図に、又各精製段階でのデータを
表−２に示した。参考例１実施例１の方法で精製されたアシルCoAシン
セターゼを用いて脂肪酸量を測定した。反応液１
ml当り所定量のオレイン酸カリウム100μmolトリ
スHCl緩衝液（PH8.0）、5μmolジチオスライトー
ル、1.6μmol活性剤Ｔ、10μmolATP、
15μmolMgCl₂、150μmolKCl、0.2μmolホスホエ
ノールピルビン酸カリ、0.15μmolNADH、20μg
ミオキナーゼ、30μgパイルベート、キナーゼ、
30μgラクテート、デヒドロゲナーゼ、精製アシ
ルCoAシンセターゼ4μgを含む液を分光光度計
（エツペンドルフ1101M型）のセルに入れ、35℃
１分間予熱した後、0.3μmolのCoA溶液を添加し
て（全液量0.5ml）反応を開始しNADHの減少に
伴なうO.D.334nmの変化をレコーダーの記録から
読み取つた。反応液中のオレイン酸カリウムと△
O.D.334nmの関係は第３図の如くオレイン酸量０
〜25nmの間では良い直線性が得られた。参考例２参考例１と同様の方法を用いて10nmol量の各
種直鎖脂肪酸と△O.D.334nmの関係を求めた。結果は表−３の如く△O.D.334nmの理論値
0.246、（アツシユ、ウー、ベルグメイヤー（H.U.
Bergmeyer）ツアイトシユリフトヒユアクリニ
ツシエヘミーウントクリニツシユビオヘ
ミー、（Zeitschrift Fur Klinische Chemie und
Klinische Biochemie）13巻507〜508ページ1975
年）に対し良く一致していた。

【表】

【表】【図面の簡単な説明】

第１図はDMSO非存在下でのアシルCoAシン
セターゼの安定性を示したグラフである。横軸は
０℃での経過時間（時間）、縦軸は０時間目の活
性を100％とした時の残存活性（％）を示す。ＡはアシルCoAシンセターゼＡＢはアシル
CoAシンセターゼＢＡ＋Ｂは両者を等活性ず
つ混合した場合の活性を示す。第２図はアシルCoAシンセターゼＡ及びＢのS.
D.S.ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。
Ａ，Ｂ及びＡ＋ＢはそれぞれアシルCoAシンセ
ターゼＡ，Ｂ及び両者の混合物を示す。 α，β，β′およびσはRNAポリメレースの種
類を表わす。第３図は、参考例１の脂肪酸量とODの関係を
表わすグラフで、横軸は脂肪酸量（nmoles）、縦
軸はODA334nmである。

Claims

【特許請求の範囲】１次の物理化学的性質を有する長鎖アシル
CoAシンセターゼ (i) 基質特異性炭素数10〜20の直鎖脂肪酸に主として作用す
る。 (ii) 至適 PH7.1〜9.6 (iii) PH安定性 6.1〜8.0（４℃、36時間） (iv) 至適温度 35℃ (v) 温度安定性 35℃以下 (vi) 活性化剤 K⁺、NH₄ ⁺及びMg⁺⁺イオン阻害剤 Cu⁺⁺イオン、EDTA (vii) 分子量約77000 （S.D.Sデイスク電気泳動法） (viii) アミノ酸組成リジン6.4％、ヒスチジン1.7％、アルギニン
4.7％、アスパラギン酸9.4％、スレオニン5.4
％、セリン6.5％、グルタミン酸13.3％、プロ
リン4.3％、グリシン9.6％、アラニン7.4％、バ
リン6.5％、メチオニン2.3％、イソロイシン5.7
％、ロイシン9.8％、チロシン2.6％、フエニル
アラニン4.7％（上記16ケのアミノ酸の全量を100％とした時
のモル％）２アシルCoAシンセターゼを含有する動物組
織を破砕して細胞顆粒部分を界面活性剤処理によ
り該酵素を可溶化する工程及び可溶化した該酵素
をアフイニテイー、クロマトグラフイーにより夾
雑蛋白質より分離する工程を含むことを特徴とす
る次の物理化学的性質を有する長鎖アシルCoA
シンセターゼの製造方法。 (i) 基質特異性炭素数10〜20の直鎖脂肪酸に主として作用す
る。 (ii) 至適 PH7.1〜9.6 (iii) PH安定性 6.1〜8.0（４℃、36時間） (iv) 至適温度 35℃ (v) 温度安定性 35℃以下 (vi) 活性化剤 K⁺、NH₄ ⁺及びMg⁺⁺イオン阻害剤 Cu⁺⁺イオンEDTA (vii) 分子量約77000 （S.D.Sデイスク電気泳動法） (viii) アミノ酸組成リジン6.4％、ヒスチジン1.7％、アルギニン
4.7％、アスパラギン酸9.4％、スレオニン5.4
％、セリン6.5％、グルタミン酸13.3％、プロ
リン4.3％、グリシン9.6％、アラニン7.4％、バ
リン6.5％、メチオニン2.3％、イソロイシン5.7
％、ロイシン9.8％、チロシン2.6％、フエニル
アラニン4.7％、（上記16ケのアミノ酸の全量を100％とした時
のモル％）３特許請求の範囲第２項記載の長鎖アシル
CoAシンセターゼの製造方法においてアフイニ
テイー、クロマトグラフイーがADP、ATP及
び／またはCoAの構造類似体をリガンドとする
アフイニテイ、クロマトグラフイーであることを
特徴とする方法。