JPS644621B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコレステロール含有量の高い物質を製
造するためのリポ蛋白の精製方法及び体液のコレ
ステロール含有量を測定するためのコレステロー
ル標準物質（reference standerd）としての該高
コレステロール物質の使用に関する。 血清コレステロール濃度の測定は、それの上昇
した濃度がある種の疾病の診断において利用でき
るために重要である。例えば、血清コレステロー
ルの測定は冠状動脈疾患、真性糖尿病、ネフロー
ゼ、肝臓及び甲状線疾患、並びに内分泌障害によ
つて生じる代謝障害を予検するために使用されて
いる。 血清中のコレステロール濃度を測定可能にする
ための臨床化学的方法が開発されている。これら
の方法は一般にヒト血清及び有機塩を含有するコ
レステロール標準物質を成分として使用すること
を包含している。米国特許第4045176号には、ヒ
ト血清に高密度のヒトのリポ蛋白又は単離された
霊長類以外のリポ蛋白（例えば牛）を加えること
によりコレステロール対照基準物を製造する方法
が記載されている。 米国特許第3764556号には、ヒトの血漿の脂質
に富んだ部分を単離しそして馬、牛又はヒトの血
清を加えることにより脂質対照試料を製造する方
法が記載されている。 米国特許第3260648号には有機可溶化剤を含有
する凍結乾燥されたヒトの血漿であるコレステロ
ール測定用組成物が記載されている。 対照基準物の物理的及び生理学的構造（make
−up）が試験すべき物質のそれと非常に近似し
ていれば、対照基準物はより信頼できると考えら
れているため、これまでのコレステロール標準物
質は、上記の特許中に記載されている如く有機
塩、可溶化剤又は馬、牛もしくはヒトの血清で
“調節された”ヒトの血清又は血漿の使用に基い
ている。 ヒトの血清又は血漿を使用を含むそのような方
法はいくつかの欠点を有している。第一に、ヒト
の血清又は血漿の存在は使用者が血清中に存在し
ている肝炎ウイルスが血清中に存在している可能
性による危険にさらされることである。第二に、
ヒトの血清又は血漿の存在はそのようなコレステ
ロール対照基準物のコストを増大させる。 従つて、ヒトの血清又は血漿と一緒に使用され
ないようなコレステロール標準物質に対する要望
がある。本発明のリポ蛋白コレステロールは、ヒ
トの血清又は血漿の存在なしに、ヒトの血清又は
血漿のコレステロール含有量を測定する際のコレ
ステロール標準物質としての使用に適している。 リポ蛋白を精製するために種々の方法が当該分
野で使用されている。最も広く用いられている方
法は、リポ蛋白群を血漿蛋白質塊から及び相互か
ら密度の差により分離する超遠心法である。 他の精製方法は沈殿及び抽出を包含する。例え
ば、米国特許第4104286号には、全卵及び乾燥卵
黄からコレステロールを単離することが記載され
ている。この特許には、エタノールを用いる抽
出、水性アルカリ水酸化物中でのケン化並びにメ
タノール中の炭化水素溶媒を用いる濃縮及び精製
が記載されている。他の沈殿方法は、アルカリ土
類と組み合わされた硫酸化された多糖類の使用を
包含している。これらの試薬はリポ蛋白の沈殿用
としては比較的特殊なものである。 第三の方法は無機基質上へのリポ蛋白の吸着を
包含している。リポ蛋白を精製回収する超遠心及
び沈殿及び抽出方法とは対照的に、吸着方法は一
般に血清又は血漿からリポ蛋白を除くために使用
されており、リポ蛋白は次に不純物として棄てら
れる。米国特許第4081431号には、固体吸着剤と
してシリカを用いる処理によりリポ蛋白含有要素
、、及びを不純物として除くことによ
り、要素に富んだ蛋白質が得られるような血液
分離方法を記載している。 リポ蛋白複合体（complex）を精製するための
吸着技術の使用における主な障害は、リポ蛋白の
回収の難かしさにある。 最も関連のある先行技術は、Zeit.Klin.Chem.6
〔３〕186〜190（1968年５月）の文献である。 著者であるW.Stephen及びL.Rokaはヒトの血
清からのα₁、α₂及びβ−リポ蛋白の除去を記載し
ている。該方法はコロイド状硅酸上へのヒトの血
清の吸着を包含している。吸着された蛋白質を次
に遠心分離し、凍結し、解凍し、そしてPH９にお
いて高い塩濃度の使用により抽出する。著者によ
ると、吸着された蛋白質の回収最大量はPH9.0及
びNaCl濃度12重量／容量％において生じる。著
者は塩濃度が12％の濃度から変化すると、吸着さ
れた蛋白質の回収が大巾に減少することを開示し
ている。（これは約2.0Mの塩濃度に等しい）。 吸着されたリポ蛋白複合体を10〜11.5のPHで溶
出させ、塩濃度を約0.05M未満に調節し、溶出さ
れたリポ蛋白を加熱し、アルカリ炭酸塩及び２価
マンガン塩を加え、そしてPH約6.5〜9.0に調節す
ることにより得られる改良された結果について、
前記の先行技術の特許又は上記の文献には全く記
載も示唆もされていない。前記の先行技術はいず
れも、有機塩、可溶化剤又はヒトの血漿もしくは
血清と一緒に使用されていない血漿又は血清から
上記の如くして製造されたコレステロール標準物
質（reference material）の使用を示唆していな
い。 本発明はリポ蛋白質を精製してコレステロール
含有量の高い物質を製造するための改良された方
法及びコレステロール標準物質としてのリポ蛋白
質の使用に関するものである。該方法は、牛、
馬、羊、豚又はヒトのものであり得るリポ蛋白を
シリカ吸着剤上に吸着させ；吸着されたリポ蛋白
を過剰の溶液から分離し；吸着されたリポ蛋白を
凍結しそして解凍し；吸着されたリポ蛋白を10〜
11.5のPHにおいて溶出させ；リポ蛋白を所望の濃
度に濃縮し；PHを約7.0〜10.0に調節し；塩濃度
を約0.05M未満に調節し；約50゜〜100℃に５分間
〜24時間の間加熱し；アルカリ炭酸塩及び２価マ
ンガン塩を加え；PHを約6.5〜9.0に調節し、そし
て精製されたコレステロールを回収する段階を包
含する。精製されたコレステロールはコレステロ
ール標準物質として使用することができる。 本発明の方法において使用するための出発物質
はコレステロールを含有する血漿又は血清部分で
あることができる。適当な出発物質は哺乳動物源
から得られ、これらにはコレステロールを含有す
る牛、馬、羊、豚又はヒトの血漿血清もしくはそ
れらのフラクシヨン、例えばフイブリノーゲンの
少ない血漿、すなわち例えばコーンフラクシヨン
（Cohn Fraction）上澄液の如きフイブリノー
ゲン製造の副生物、リポ蛋白に富んだ硫酸アンモ
ニウム、すなわち30％（NH₄）₂SO₄上澄液などが
含まれる。 出発物質がリポ蛋白含有血清である場合、塩濃
度は可溶性の塩、例えばクエン酸ナトリウムの添
加により、約0.25〜1.0の最終イオン強度まで増
大させる。他の適当な塩には、塩化ナトリウム、
リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸アンモ
ニウム及び硫酸ナトリウムが含まれる。上記の濃
度への血清の塩濃度の増加は、加えられる１単位
の硅素物質当りに吸着されるリポ蛋白の量を増大
させることが見出された。牛又はヒトの血漿は普
通、抗凝固剤としてのクエン酸塩の添加を包含す
る方法により集められ、そして普通は塩濃度を増
加させる必要がないことが見出されている。 リポ蛋白含有出発物質は0゜〜50℃、好適には
15゜〜2.5℃の温度に保持される。PHは5.5〜9.0、
好適には7.0〜8.0の範囲に調節される。マサチユ
ウセツツ洲02110ボストン・ハイストリート125の
キヤボツト・コーポレーシヨン（Cabot
Corporation）から商品名カボシル（Cabosil）
として商業的に入手しうる微細シリカ粒子の形の
シリカ吸着剤を出発物質に１当り１〜50ｇ、好
適には１当り10〜20ｇの量で加える。 シリカ−リポ蛋白含有出発混合物を次に５分間
〜６時間、好適には３〜４時間の間混合する。シ
リカ粒子は存在するリポ蛋白を優先的に吸着し、
ゲル様の外観を有するシリカ／リポ蛋白複合体を
形成する。過剰の溶液はゲルから一般的な液体／
固体分離技術、例えば遠心分離、により除去され
る。 シリカ／リポ蛋白ゲルを約−20℃に、全てのゲ
ルが凍結するのに充分な時間の間冷却する。容器
の構造及び試料の量によるが、約１〜30目間で充
分である。ゲルを自然に解凍させ、そして複合体
（complex）からにじみ出た液体を棄てる。 ゲルを希塩溶液、例えば0.15M塩化ナトリウ
ム、酢酸ナトリウムもしくはリン酸ナトリウム中
に（大体、塩水容量がペーストの重量の２倍に等
しい）約7.0のPHにおいて懸濁させ、そして沈殿
させる。上澄液を沈殿したゲルから除去し、そし
て希塩溶液を用いる洗浄工程を２回もしくは３回
繰り返す。希塩溶液の使用により、望ましくない
蛋白質、例えばゲルの粒子間間隙中に存在してい
る真正グロブリンの溶解及び除去が確実に行なわ
れる。 洗浄されたゲルをそれの容量の２〜３倍の蒸留
水又は脱イオン水中に10.0〜11.5、好適には10.4
〜10.6、の範囲に調節されているPHにおいて懸濁
させることにより溶出させる。その混合物を約３
〜４時間撹拌し、そしてPHを所望の範囲内に保持
する。次にその混合物を放置して沈殿させる。 上澄液を吸引しそして別にしておく。ゲルの溶
出、撹拌及び吸引をさらに２回繰返し、そして上
澄液フラクシヨンを一緒にする。 一緒にした上澄液フラクシヨンを一般的な方
法、例えば塩及び中性重合体の添加による沈殿；
吸着／脱着方法；蒸発又は好適には限外濾過によ
り濃縮する。上澄液は50〜3000mg／dl、好適には
約1000〜2000mg／dlの所望のコレステロール濃度
まで濃縮する。 コレステロール濃度は一般的な酵素的又は非酵
素的方法により測定することができる。酵素的方
法の記載に関しては、Ann.Clin.Biochem.10：79
〜84（1973）及びClin.Chem.19：1350〜1356
（1973）を参照のこと。酢酸第二鉄、酢酸ウラン
及び硫酸−硫酸第一鉄試薬の使用を包含する非酵
素的方法の記載に関しては、Annal.Chem.42：
1432（1970）を参照のこと。 リポ蛋白物質は、存在する実質的に全ての塩を
除去するための一般的方法、例えばイオン交換；
ゲル透過；透析もしくは好適には限外過による
透析によつて処理される。塩化物として計算され
る最終的な塩濃度は約0.05M未満、好適には０〜
0.005Mである。PHは7.0〜10.0の範囲、好適には
約8.5に調節される。塩濃度は臨界的であり；加
熱段階をかなりの量の塩の存在下で実施すると、
望ましくない量のリポ蛋白コレステロールの変性
が生じることが見出された。 溶液を50〜100℃の範囲内の温度に５分間〜24
時間の間、好適には80℃に約４〜８時間の間、加
熱する。加熱段階は有害な細菌及び望ましくない
酵素を除去し、そしてリポ蛋白コレステロールの
貯蔵の安定性を増大させる。 加熱段階後に、アルカリ炭酸塩及びアルカリ土
類塩をコレステロール懸濁液に加える。 この添加は、得られるリポ蛋白コレステロール
の透明度を著しく改良する。約0.1〜1.0Mの
Na₂CO₃及び約１ｍＭ〜100ｍＭのMnCl₂が有効
である。約0.5MのNa₂CO₃及び５〜10ｍＭの
MnCl₂が好適である。アルカリ炭酸塩及び２価マ
ンガン塩は、変性した蛋白質の沈殿を生成し、沈
殿はコレステロールから遠心分離により分離され
る。コレステロールは6.5〜10.0の範囲、好適に
は9.0のPHに調節される。好適には、一般的方法、
例えばイオン交換、限外過によるゲル過透析
によりコレステロールから実質的に塩を除去す
る。 次に溶液を6.5〜9.0の範囲内のPHに調節し、そ
して前記の如く加熱する。一方、リポ蛋白を膜フ
イルターを通す過により殺菌過することもで
きる。 実施例 １ プールされた正常の牛の血清を集め、そして約
20〜25℃の温度にした。血清のイオン強度を、固
体クエン酸ナトリウムを50ｍＭの最終的濃度とな
るまで加えることにより、0.5〜1.0の範囲に調節
した。血清のPHは、必要により1N HCl又は1N
NaOHの添加により約7.0のPHに調節した。微細
シリカ形のシリカゲル吸着剤を、１の血清当り
10ｇの量で加え、そして生成したシリカ−リポ蛋
白複合体を約４時間混合した。 該複合体を遠心分離しそして−20℃で凍結し
た。１週間後に、凍結した複合体を室温に放置す
ることにより解凍させ、解凍によりペースト様の
物質が生成した。普通の食塩水（0.15M NaCl）
をペーストに加えた。添加量はペーストの重量の
２倍に等しかつた。混合物を約15分間撹拌し、存
在している固体を重力により沈殿せしめ、そして
生成した透明な上澄液を吸引した。上澄液はペー
スト中に含まれている不準物を含有しており、そ
してそれは棄てられた。塩水の添加並びに上澄液
部分の除去及び廃棄を２〜３回繰返した。 脱イオン化水をペーストに加えた。添加量はペ
ーストの重量の２倍に等しかつた。懸濁液を混合
し、そして1N NaOHの添加によりPHを10.4に調
節した。混合を約２〜３時間続け、1N NaOHの
添加によりPHを10.4に保持した。混合を停止した
後に、存在している固体を沈殿せしめ、そして所
望のリポ蛋白質フラクシヨンを含有する透明な上
澄液を取りだした。脱イオン化水の添加、混合、
PH調節及びリポ蛋白質含有上澄液部分の除去の段
階を２回繰り返した。上澄液蛋白質を一緒にし、
そして５℃に保持した。一緒にした上澄液フラク
シヨンを遠心分離して存在している残留シリカを
除去し、そして限外過により濃縮した。約1000
mg／dlのコレステロール値が得られた。 濃縮されたリポ蛋白質フラクシヨンを次に、
NaClとして測定された塩濃度が約0.002Mに減少
するまで、約３交換量の脱イオン化水を用いる限
界過により透析した。 該リポ蛋白質フラクシヨンのPHを、1N HClの
添加により、約8.0に調節し、そしてそのリポ蛋
白質フラクシヨンを80℃に加熱し、この温度に４
時間保持した。 リポ蛋白質フラクシヨンは室温に冷却した。リ
ポ蛋白質フラクシヨンをさらに透明化するため
に、2M Na₂CO₃を0.24Mの最終的濃度となるま
で加え、そして0.1M MnCl₂を６ｍＭの最終的濃
度となるまで加えた。変性蛋白質を含有する沈殿
を遠心分離により除去し、そして不純物として棄
てた。リポ蛋白質含有溶液を1N HClの添加によ
り9.0のPHに調節した。次に溶液を限外過によ
り濃縮した。約1500mg／dlのコレステロール値が
得られた。濃縮されたリポ蛋白質コレステロール
フラクシヨンを次に６交換容量（replacement
volume）の脱イオン化水を用いる限外過によ
り透析して存在する塩を除去した。NaClとして
測定された最終的な塩濃度は0.05M未満であるこ
とが測定された。リポ蛋白質コレステロール物質
を次に80℃に加熱し、そしてこの温度に８時間保
持した。 1300mg／dlのコレステロール値において精製さ
れたリポ蛋白質コレステロールを分析しそして測
定すると、下記の特徴を有していた：710nｍに
おける光学的密度、0.15未満；容易に殺菌過さ
れる細菌、10個の微生物／ml；透明度は100℃で
少なくとも１時間加熱されても影響をうけなかつ
た；透明度及びコレステロール値は＋５℃で少な
くとも２年間安定であつた；透明度は複数回の凍
結−解凍サイクルにより影響をうけなかつた；酢
酸セルロース又はアクリルアミド上のリポ蛋白質
電気泳動像は牛のリポ蛋白質像の特徴ではなかつ
た。 リポ蛋白質コレステロールの化学分析は下記の
結果を示した： 合計蛋白質、4.0ｇ／dl未満 無機りん、１mg／dl未満、 カルシウム、２mg／dl未満 グルコース、20mg／dl未満 血液尿素窒素、２mg／dl未満 合計ビリルビン、0.2mg／dl未満 ナトリウム、25mg／未満 カリウム、１mg／未満 塩素、10mg／未満 クレアチニン、0.2mg／dl未満 尿酸、0.2mg／dl未満 乳酸塩脱水素酵素、10Mμ／未満 クレアチニンホスホキナーゼ、40Mμ／未満 α−グルタミルトランスフエラーゼ、
100Mμ／未満 血清グルタミン酸オキサロ酢酸アミノ基転移酵
素、20Mμ／未満 グルタミン酸焦性葡萄酸塩アミノ基転移酵素、
30Mμ／未満。 本発明の牛のリポ蛋白質コレステロールはヒト
の血清中でみられるものと本質的に同一であるコ
レステロールエステル：遊離コレステロール比
（約70：30）を有しているため、このコレステロ
ール物質をヒトの血清又はヒトの血漿を加えずに
コレステロール標準物質として使用できる。 精製されたリポ蛋白質コレステロールは下記の
如くしてコレステロール標準物質として使用され
た。リポ蛋白質物質を蒸留水又は脱イオン化水で
75〜100mg／dl；150〜200mg／dl；及び450〜500
mg／dlの範囲に希釈することにより、種々の濃度
のコレステロールを含有する一連の対照標準物を
製造した。これらの濃度はそれぞれヒトのコレス
テロールの“低”、“正常”及び“高”濃度に相当
している。 上記の方法により製造された牛のリポ蛋白質コ
レステロールの試料を、デラウエア洲ウイルミン
トンのイー・アイ・デユポン・デ・ネモアスから
商品名デユポンACAとして販売されている商業
的に入手できるキツトを使用して、酵素コレステ
ロール評価方法〔AllainらのClinical Chemistry
20：470（1978）参照〕により評価しそして下記の
評価値が得られた： 試料１ 100mg／dlのコレステロール 試料２ 250mg／dlのコレステロール 試料３ 460mg／dlのコレステロール 精製された牛のリポ蛋白質のコレステロールが
コレステロール標準物質として効果的に機能する
かどうかを測定するために、上記の評価値を有す
る試料を独立した臨床試験研究所に、それらの日
常のコレステロール測定で使用するために送つ
た。合計７ケ所の独立した研究所が日常のコレス
テロール測定工程で３種の低、正常及び高濃度の
10ml試験溶液を使用し、そして１日以内及び日々
の精度及び正確さを報告してきた。下記の平均値
が得られた。 【表】 実施された研究に関しては、正確さとは指定さ
れた評価値が他の方法により得られた値と一致も
しくは接近している程度を称し；精度とは繰返さ
れる分析値が一致する近接度を称する。 分析の標準的統計的方法を試験研究所からの全
てのデータに適用した。（そのような標準物質の
使用及び統計的分析方法の完全な議論に関して
は、Clinical Chemistry：Principles and
Technics、２版、302〜321頁参照。） この研究に基くと、正確さ及び精度に関して
は、本発明のリポ蛋白質コレステロール溶液は試
験試料のコレステロール含有量の測定におけるコ
レステロール標準物質として有効である。該溶液
は精度の評価用及び系統的分析偏差の検出用の手
段を与える。 オートクレーブ処理におけることのできる液体
の対照試料を製造するためには、リポ蛋白質コレ
ステロール物質を蒸留水又は脱イオン化水の添加
により、“低”、“正常”及び“高”濃度に希釈す
る。次に、試料を水蒸気オートクレーブ処理によ
り約120℃において約15psiの圧力下で殺菌する。 殺菌性過により液体の対照試料を製造するた
めには、リポ蛋白質コレステロール物質を蒸留水
又は脱イオン化水；希塩溶液、例えば普通の食塩
水又は蛋白質溶液、例えば牛のアルブミン又は霊
長類以外の動物の血清、を添加することにより希
釈する。 さらに、液体の対照試料は殺菌剤、例えばナト
リウムアジド又は水銀塩の添加により製造でき
る。 凍結乾燥した精製されたリポ蛋白質コレステロ
ール対照標準物の製造用には、リポ蛋白質コレス
テロール物質を蛋白質含有希釈剤、例えば牛のア
ルブミン又は霊長類以外の血清、で希釈する。任
意に、殺菌剤、例えばナトリウムアジド、水銀塩
又は抗生物質を加えることもできる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ リポ蛋白含有物質の溶液をシリカ吸着剤上に
   吸着させ、吸着されたリポ蛋白を存在しうる過剰
   の溶液から分離し、吸着されたリポ蛋白を凍結
   し、そして解凍し、吸着されたリポ蛋白を溶出さ
   せ、リポ蛋白を所望の濃度まで濃縮し、そしてそ
   れから精製されたリポ蛋白コレステロールを回収
   する段階を包含するリポ蛋白コレステロールの精
   製方法において、 吸着されたリポ蛋白を10〜11.5のPHにおいて溶
   出させ、塩濃度を0.05M未満に調節し、溶出した
   リポ蛋白を50゜〜110℃の温度に精製されたリポ蛋
   白コレステロールの貯蔵安定性を高めるのに充分
   な時間加熱し、0.1〜1.0Mのアルカリ炭酸塩及び
   １〜100ｍＭの２価マンガン塩を加え、PHを6.5〜
   9.0に調節し、そしてそれから該リポ蛋白コレス
   テロールを回収する段階からなることを特徴とす
   る方法。 ２ 該リポ蛋白含有物質の牛のリポ蛋白である特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 溶出段階中PHを10.4〜10.6に保持する特許請
   求の範囲第２項記載の方法。 ４ 温度を80℃に８時間の間保持する特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ５ コレステロールを蛋白質含有希釈剤で希釈し
   そしてコレステロールを凍結乾燥する段階をさら
   に包含する特許請求の範囲第２項記載の方法。