JPS64662B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原性物質と結合させて使用する小
さなハプテン化合物誘導体に関し、特に脊椎動物
に注射した場合に形成されるその特定のハプテン
化合物に高度の特異性を有する抗体を提供する。
ある化合物を他の類似構造をもつ化合物と区別す
るには多くの色々な方法があるが、最も鋭敏でか
つ正確な方法のひとつは、ある特定構造に対して
特異性を示す抗体を使用することである。すなわ
ち、抗体の特定化合物との結合定数は他の類似化
合物との結合定数よりも実質上高い。抗体のこの
能力を使用することによつて広い範囲に及ぶ種々
の免疫検定法が開発された。市場に受けいれられ
ている免疫検定法の中には均質酵素
（hemogeneous enzyme）免疫検定法、スピン標
識免疫検定法、放射免疫検定法および血球凝集反
応がある。最後の方法を除き各々の免疫検定は測
定されるべき化合物とデイテクター（detector）
に結合する化合物との間の競合による。

問題の化合物は抗原を製造するために単に修飾
されるだけであろうから、そのような修飾は抗体
の構造特異性に対する効果を考慮せねばならな
い。すなわち、その化合物と抗原との間の結合部
位を選択する際、得られた生成物が元の化合物を
認知する抗体を提供するように選択されねばなら
ない。抗体が元の化合物を認知せねばならないの
みならず、抗体がその化合物に非常に類似した化
合物を認知するほどその化合物の重要な特性を変
化させてもならない。さらに、その化合物の抗原
への結合は、この化合物の高いタイターならびに
その化合物の高い結合定数を提供すべきである。

ジベンゾアゼピン化合物に関する論説が
Chemical Review、74、101（1974）中に見出さ
れる。米国特許第2948718号には薬理学的特性を
有することが報告されているジベンゾアゼピン誘
導体が開示されている。

ジベンゾ〔ｂ、ｆ〕アゼピン化合物はオキソ脂
肪族基を介して抗原性物質、特にポリペプチドお
よび蛋白質に結合する。ここでオキソ基は抗原に
結合し、またアルキル基はカルバモイル基の窒素
に結合し、これは順にアゼピン環の窒素に結合す
る。脊椎動物へ注射すると、これらの化合物が薬
剤テグレトール^R（Tegretol^R）（カルバムアゼピ
ン）に高度な特異性を示す抗体を産生することが
認められる。この化合物はジベンゾアゼピンをホ
スゲンと反応させ、次いでアミノアルコールと反
応させることによつて製造される。アルコールを
酸化してオキソ基にし、次にこれをアミド又はア
ルキルアミン結合を介して適当な抗原、特にポリ
ペプチド又は蛋白質に結合させうる。

本発明で用いられる化合物はカルバムアゼピン
のＮ−誘導体であり、これは、少なくとも１個な
いし約８個より多くない炭素原子、通例約２ない
し６個の炭素原子の脂肪族鎖および０ないし１個
のヘテロ原子（これはカルコゲンもしくは窒素で
あり、特に原子番号７ないし８のヘテロ原子であ
る）を介して結合したオキソ官能基、たとえばア
ルデヒドもしくはカルボキシを有し、そこで酸素
はその脂肪族鎖中においてオキシとして存在し、
かつ窒素は水素原子なしで存在する。このカルボ
キシ誘導体は主としてペプチド結合によつて抗
原、たとえばポリペプチド又は蛋白質と結合し、
このアルデヒド誘導体は還元的アミノ化によりア
ルキルアミン結合を介して結合する。この結合し
た抗原を抗体を生産させるために脊椎動物、特に
家畜に注射する。あらかじめ決定しておいた計画
に基き注射を何度か繰り返した後、この抗体は血
清から取り出しそのままで、又はこの抗体を濃縮
するように更に精製して用いうる。

概して、本発明による抗体の生産に用いられる
化合物は次式 を有する。式中、ｍは０又は１である。R¹は連
結基であり、望ましくは、０から８個の炭素原子
および０から１個のヘテロ原子（カルコゲンおよ
び窒素、好ましくは酸素および窒素、特に好まし
くは酸素）の脂肪族連結基であり、酸素はオキシ
として存在し、かつ窒素は水素原子なしで存在
し、その鎖中のヘテロ原子間には少くとも２個の
炭素原子が存在し、この鎖は分枝状又は直鎖状で
もよく、好ましくは直鎖状であり、ｍが０の時Ｒ
は少くとも２個の炭素原子を有するという条件付
で、唯一個の脂肪族不飽和として０から１個のエ
チレン不飽和部位を有する。Ｚは水素、ヒドロキ
シル、１から６個の炭素原子、通常１から３個の
炭素原子のアルコキシ、炭酸アルキル（OCO₂A、
ここでＡは１ないし６個の炭素原子、通常１ない
し４個の炭素原子のアルキル基である）、ニトロ
フエノキシ、特にパラ又はＹ、ここでＹはポリア
ミノ酸、たとえばポリペプチド残基（蛋白質のポ
リペプチドサブユニツト（subunit）を含む）で
ある。そしてｎはＺがＹである時を除いて１であ
り、またｎがＺで示されるアミノおよびチロシン
基に結合しているアシル基の数に等しい時、ｎは
少くとも１であり、また結合に利用しうるアミノ
およびチロシン官能基の数より大きくなり、通常
はＹの分子量を500で割つた数よりも多くなく、
より通常はＹの分子量を1500で割つた数より多く
なく、かつ通常は分子量100000につき少くとも１
である。

好ましいＲ基としてはアルキレン、アルケニレ
ン、アルキレンオキシアルキレン（ここでアルキ
レン基は少くとも２個の炭素原子によつて分けら
れる）、Ｎ−低級アルキル（１−３個の炭素原
子）、アルキレンアミノアルキレン（ここでアル
キレン基は少くとも２個の炭素原子によつて分け
られる）があげられる。

第一の重要な化合物はＺがＹであり、抗原とし
ての使用が認められ、かつＹが抗原性ポリアミノ
酸である化合物である。これらの化合物は大体次
の式 を有する。

式中、ｍは０又は１である。R¹は結合を表わ
すか又は１から８個の炭素原子、より通常は２か
ら６個の炭素原子、標準的にはｍが０である時少
くとも２個の炭素原子をもつ脂肪族基であり、こ
れは唯一個の不飽和として０から１個のエチレン
不飽和部位と、通常炭素に単独結合している酸素
および窒素、特に鎖中ではオキシとして存在する
酸素である０から１個のヘテロ原子とをもち、ま
た分枝状鎖又は直鎖状鎖、好ましくは直鎖状鎖、
すなわちポリメチレンであり得る。Y¹は少くと
も分子量1000、より通常は少くとも分子量10000、
の抗原性ポリアミノ酸であり、分子量10000000又
はそれ以上でもよく、通常は分子量およそ500000
を越えない。そしてn¹は少くとも１、通常は１よ
り大きく一般にはY¹の分子量を500で、より通常
は1000で、および好ましくはおよそ2000で割つた
数を越えず、かつ少くともY¹の分子量を100000
で割つた数、より通常はY¹の分子量を50000で割
つた数である。中間の分子量をもつ抗原、すなわ
ち20000ないし1000000の範囲にある分子量をもつ
抗原の場合、その数は一般的にはおよそ250まで、
より通常は４ないし100である。低分子量をもつ
抗原（分子量1000ないし5000）の場合、その数は
およそ１ないし10、通常２ないし５である。

前述のごとく、特に重要な化合物はオキソ−カ
ルボニル基（ケト以外）と非オキソ−カルボニル
基とが、ポリペプチド又は蛋白質構造の一部であ
るアミノ酸に結合している化合物である。ポリペ
プチドおよび蛋白質の一群は抗原性があり、その
結果ジベンズアゼピンのカルボニル誘導体をその
ポリペプチド又は蛋白質へ結合させることによ
り、ジベンズアゼピンに対して抗体が形成されう
る。抗原として使用されることもできるが通例は
そういつた使用はされないよりせまいクラスの蛋
白質は、免疫検定でデイテクター（detector）と
して用いられる酵素である。抗原としては不活性
酵素が使用されうる。

ポリペプチド〔本発明中では一般にポリアミノ
酸として言及されている〕は通常およそ２から
100アミノ酸単位（通常はおよそ分子量12000以
下）からなる。より大きなポリペプチドは適宜に
蛋白質と呼ばれる。蛋白質は通常１個から20個の
サブユニツト（subunit）と呼ばれるポリペプチ
ド鎖からなり、これは共有又は非共有結合による
会合体である。サブユニツトは標準としてはおよ
そ100から300のアミノ酸基（又は10000ないし
35000の分子量）からなる。本発明ではポリペプ
チド単位だけからなるか、又は他の官能基と一緒
のポリペプチド単位からなるかにかかわらず、た
とえばヘモグロビン又はチトクロームオキシダー
ゼ中のポリフイリンのように、ポリアミノ酸はポ
リペプチド単位および蛋白質のサブユニツトであ
るポリペプチドを包含する。

ジベンズアゼピン基の数はポリアミノ酸が酸素
であるか又は抗原であるかによつて異る。基の最
大数は溶解度、活性等に対する置換の影響によつ
て限定される。抗体の生成には、ジベンズアゼピ
ンに対する抗体が満足に取り出せるように充分な
数のジベンズアゼピン基が存在せねばならない。
もしそうでなければ他の化合物に対する抗体に比
較してジベンズアゼピンに対する抗体の割合は好
ましくなく低いものとなる。

考えられる蛋白質物質又はポリペプチドの第一
の群は抗原性ポリペプチドである。これらはアミ
ノ基によつてジベンズアゼピン類縁化合物のカル
ボニル基に結合しうる。この生成物はジベンズア
ゼピンに対する抗体の形成に用いられうる。使用
されうる蛋白質物質は広い範囲に及び、また標準
的には1000から10000000の分子量、通例、20000
から500000の分子量である。

酵素は通常はおよそ10000ないし600000の範囲
内の、通常はおよそ12000ないし150000の範囲内
の、そしてより通常は12000ないし80000の範囲内
にある分子量をもつ。いくつかの酵素は複数の酵
素サブユニツトを有する。酵素の分子量について
述べる時には全体の酵素を指すことにする。標識
を特異的アミノ基に限定しない場合には平均して
酵素当り少くともおよそ１ジベンズアゼピン、通
常は酵素当り少くともおよそ２ベンズアゼピンで
あり、ほとんど酵素当り40ジベンズアゼピン以上
のことはなく、通常は酵素当り30ジベンズアゼピ
ン以下である。たとえばリゾチームではジベンズ
アゼピン基の平均数はおよそ２ないし５の範囲内
にある。グルコース−６−リン酸脱水酵素では平
均数は２ないし20の範囲内にある。

ジベンズアゼピン類縁化合物は非オキソ−カル
ボニル基によつて蛋白質中に存在するヒドロキシ
ル又はメルカプト基に結合されうるが、大部分の
結合はアミノに対してである。それゆえ化合物は
エステルおよびチオエステルも存在しうるがアミ
ドとして記載される。アルデヒド誘導体は単独で
アミノへ結合して還元的アミノ化によるアルキル
アミン基を形成する。

カルボキシ修飾ジベンズアゼピンへ結合する遊
離アミノ基をもつ蛋白質中に存在するアミノ酸に
はリジン、Ｎ−末端アミノ酸等がある。ヒドロキ
シルおよびメルカプト含有アミノ酸にはセリン、
システイン、チロシンおよびスレオニンがある。

種々の蛋白質およびポリペプチド型は抗原性物
質として用いられうる。これらの型にはアルブミ
ン、酵素、血清蛋白、たとえばグロブリン、接眼
レンズ蛋白質（ocular lens protein）、リポプロ
テイン等がある。実例としての蛋白質をあげると
牛の血清アルブミン、キーホールアオガイヘモシ
アニン（keyhole limpet hemocyanin）、卵アル
ブミン、牛のガンマ−グロブリン等がある。グラ
ミシジンのような免疫形成性（immunogenic）
である小さな中性ポリペプチドもまた使用されう
る。種々の合成ポリペプチド、たとえばリジンの
ポリマー、グルタミン酸、フエニルアラニン、チ
ロシン等がそれ自身で、又は一緒であるかのいず
れかの状態で用いられうる。特に興味深いのはポ
リリジン又はリジンとグルタミン酸の組み合わせ
である。どの合成ポリペプチドも、たとえばリジ
ンによつて提供されるような充分な数の遊離アミ
ノ基を包含していなければならない。

蛋白質分子の第二の群はデイテクターである。
これらはカルボニル修飾ジベンズアゼピンが結合
する酵素である。上記のごとく、ジベンズアゼピ
ン修飾酵素は免疫検定に有用である。免疫検定法
については後に記載する。

種々の酵素、たとえばペプチダーゼ、エステラ
ーゼ、アミダーゼ、ホスホリラーゼ、カルボヒド
ラーゼ、酸化酵素、たとえば、脱水素酵素、還元
酵素等が用いられうる。特に重要なものはリゾチ
ーム、過酸化酵素、α−アミラーゼ、脱水素酵
素、特にマレイン酸脱水素酵素とグルコース−６
−リン酸脱水素酵素、アルカリホスフアターゼ、
β−グルクロニダーゼ、セルラーゼおよびホスホ
リパーゼのような酵素である。I.U.B.分類による
興味ある酵素は1.オキシドレグターゼ、詳細には
グループ1.1、より詳細には1.1.1、および1.11、
より詳細には1.1 1.1それに3.ヒドロラーゼ、詳細
には3.2、より詳細には3.2.1である。

置換酵素は大体次の式を有する。

式中、ｍおよびR¹は前に記載したとおりであ
る。Y²は活性部位以外で置換された酵素であり、
結合以前の元の活性の少くとも30、好ましくは少
くとも50パーセントを有している。n²は通常は１
から50であり、より通常は２から35であり、好ま
しくは２ないし14、より好ましくは２ないし12で
あり、小さな酵素たとえばリゾチームはすべての
利用しうる結合されたリジン基を有しているが、
一般的には平均して酵素中の利用しうる全リジン
基のおよそ60パーセント以下である。

酵素の代わりに安定な遊離基を免疫検定におけ
る検出のための官能基（functionality）として用
いてもよい。安定な遊離基は環状員
（annularmember）としてニトロオキシドの窒素
と、環状員として０から１個の他のヘテロ原子、
たとえば酸素および窒素とを有する環状ニトロオ
キシドである。ジベンズアゼピン誘導体の非オキ
ソ−カルボニルに結合する安定な遊離基分子は標
準的には７から16個の炭素原子、より通常は７か
ら12個の炭素原子をもつ。アミノ官能基は環状炭
素原子に直接結合してもよいし、又は１から４個
の炭素原子、より通常は１から２個の炭素原子を
もつ脂肪族鎖によつて環に結合してもよい。その
分子は唯一個の不飽和として０から２のエチレン
不飽和部位、より通常は０から１のエチレン不飽
和部位を有してもよい。

概して、ジベンズアゼピン誘導体の非オキソカ
ルボニルに結合する安定なニトロオキシド官能基
は次の式 を有する。

式中、Ｄは環状原子として通常脂肪族として飽
和の１から６個の炭素原子、より通常は１から３
個の炭素原子、わずか１から３個、通常は２から
３個の炭素原子をもつ２価の脂肪族基であり、Ａ
は低級アルキル（１ないし６個、通常は１ないし
３個の炭素原子）、特にメチルである。

大体、化合物はピロリドン又はピペリジン誘導
体であり、Ｄは炭化水素である。

本発明で使用する種々のアミド生成物を形成さ
せる際には、通例カルボン酸を活性化する。これ
は多くの方法でなしうる。特に興味深い２つの方
法をあげると、ひとつはカルボジイミド、通常は
水溶性のジ脂肪族カルボジイミドもしくはジ環式
脂肪族カルボジイミドと、不活性溶媒、たとえば
ジメチルホルムアミド、アセトニトリルおよびヘ
キサ−メチルホスホロアミド中にて反応させるこ
とである。反応は緩和な条件下で種々の試薬を用
い、かつ反応が起こるのに必要な充分な時間を与
えることによつて行われる。

二番目の方法はアルキルクロロホルメートたと
えばイソブチルクロロホルメートを用いて混成酸
無水物を製造することである。混成酸無水物はカ
ルボキシ置換ジベンズアゼピン、アルキルクロロ
ホルメートおよび第三アミンを合併することによ
り形成される。温度は通常環境温度以下である。

ジベンズアゼピン誘導体に基き少くともクロロ
ホルメートの化学量論量、および通常は化学量論
量の３倍を越えない過剰量が用いられる。第三ア
ミンはクロロホルメートに対して少くとも等モル
量存在する。

次にこの混合物を結合すべきアミノ化合物と合
併し、反応が緩和な条件下で進むようにさせる。

又、アミン官能基をアシル化するために水中で
働くカルボキシ修飾ジベンズアゼピンのエステル
を用いてもよい。ヒドロキシリツク基の実例をあ
げるとｐ−ニトロフエニルエステルを製造するの
に使用されうるｐ−ニトロフエニルがある。アル
デヒド結合には還元的アミノ化が極性、通常は水
性溶媒中にて、還元剤としてナトリウムシアノボ
ロヒドライドを用いて行われる。

本発明の結合抗原に応じて製造される抗体は親
の化合物、結合抗原、抗原への結合に用いられる
化合物又はその誘導体、酸標識化合物、たとえば
酵素結合体およびスピン標識結合体に対する強力
な特異結合性を有する。

次例は本発明を説明するものであり、これによ
り本発明を限定するものではない。表示のない温
度はすべて摂氏度（℃）を表わす。例〜XIIは本
発明による抗体の産生に用いるハプテン化合物お
よび抗原に関するものである。

例 Ｎ−クロルカルボニルジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼ
ピン 60mlの乾燥トルエン中14.10ｇ（0.073モル）の
ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンを含むスラリーへ、
室温にてベンゼン中12.5％のホスゲン（過剰）を
含む120mlの溶液を45分間にわたり滴下添加する。
得られた黄色スラリーを室温にて２時間撹拌し、
さらに２時間加熱還流してから、室温にて１夜撹
拌する。反応混合物をフード中で回転蒸発器によ
り濃縮して薄黄色固体を得、これを200mlベンゼ
ンにとかし、かつ沸騰下ノリツト−A^R（Norit−
A^R）で処理する。この熱溶液をセライトでろ過
し、元の量の半分になるまで濃縮し、室温まで冷
却し、かつ濁るまで石油エーテルを加える。白色
結晶の題記生成物が沈澱する。収量14.4ｇ、融点
145−150゜。ベンゼン−ヘキサンから再結晶させ
ると融点150−156.5゜の針状晶を得る。

例 ５−（Ｎ−〔6′−ヒドロキシヘキシル〕カルバモ
イル）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕−アゼピン 100mlの乾燥ベンゼン中の3.85ｇ（0.015モル）
の酸塩化物（例）へ、200mlの乾燥ベンゼン中
に懸濁させた7.2ｇ（0.62モル）の６−アミノヘ
キサノールを加える。反応混合物を乾燥管により
大気中の水分から保護しながら24時間還流する。
得られた溶液を冷却し、水性10％HCl、飽和水性
Na₂CO₃、次いで水にて洗浄し、乾燥（MgSO₄）
させる。溶媒を蒸発させて５ｇの粗アルコール生
成物を得る。

例 ５−（Ｎ−〔3′−ヒドロキシプロピル〕カルバモ
イル）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕−アゼピン 200mlの乾燥ベンゼン中の3.83ｇ（0.015モル）
の酸塩化物（例）を含むスラリーへ、4.5ｇ
（0.6モル）の３−アミノプロパノールを加える。
この混合物を一夜放置してから24時間還流する。
得られた黄色溶液を冷却し、50mlの水性2.5％
HCl、50mlの飽和水性Na₂CO₃、次いで水にて洗
浄する。ベンゼン溶液を乾燥（MgSO₄）させ、
元の量の半分になるまで濃縮し、濁るまで石油エ
ーテルを加える。この混合物を冷却して2.75ｇ
（63％）の生成物、融点129−130゜を得る。

例 ５−（Ｎ−〔5′−カルボキシペンチル〕カルバモ
イル）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕−アゼピン Ａ 25mlのアセトン中に1.90ｇ（5.6ミリモル）
のアルコール（例）を含む、氷浴中にて冷却
した溶液へ、7.0mlのジヨーンズ試薬（Jones
reagent）（H₂SO₄中約1.5ｇのCrO₃）をゆつく
りと加え、反応混合物を0゜ないし5゜間に保持す
る。この温度にて1.5時間撹拌後、過剰のジヨ
ーンズ試薬を20mlのイソプロピルアルコールを
添加し、かつ更に30分間撹拌することによつて
分解する。得られた反応混合物をろ過し、かつ
ろ液を濃縮し、調整用TLC（10％MeOH／90％
CHCl₃）で精製して1.40ｇ（65％）の粗酸生成
物を得る。かろうじてメタノール−水から結晶
化させ、かつP₂O₅で0.1mm、39゜にて３日間乾燥
させることにより更に精製して物質、融点135
−136゜、を得る。

Ｂ 70mlの乾燥ベンゼンと３mlの乾燥トリエチル
アミン中に144ｇ（1.1ミリモル）のε−アミノ
カプロン酸を含むスラリーへ、室温にて256mg
（１ミリモル）の生成物を一度に加える。この
反応混合物を一夜還流し、冷却し、かつ濃縮乾
燥させる。得られた残留物を70mlのCHCl₃に溶
かし、10mlの水で２回、飽和ブラインで一度洗
浄してから乾燥（MgSO₄）させる。ろ過した
クロロホルム溶液を濃縮して347mgの橙黄色油
状物を得る。結晶化（酢酸エチル−シクロヘキ
サン）させて61mgの精製生成物を得る。

例 ５−（Ｎ−2′−カルボキシエチルカルバモイル）
−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンの製造 0゜まで冷却させた25mlのアセトン中に2.0ｇ
（6.8ミリモル）のＮ−プロピルアルコール（例
）を含む溶液へ、９mlのジヨーンズ試薬
（CrO₃、2.7ｇ；H₂SO₄、2.5ml；H₂O、７ml）を
滴下添加し、0゜ないし5゜にて90分間撹拌する。過
剰のジヨーンズ試薬を20mlのイソプロピルアルコ
ールを加えて分解する。この緑色混合物をろ過
し、まず200mlのCHCl₃にて、次いで再び250mlの
CHCl₃にて抽出する。合併したCHCl₃抽出物を50
mlの飽和NaHCO₃にて抽出する。重炭酸塩油出
物を25mlのCH₂Cl₂にて洗浄し、次いで0゜にて濃
HClで酸性にして青白色固体の生成物を得る。こ
の固体を数mlの氷冷H₂Oにて一度洗浄し、ろ過
し、かつ乾燥して（デシケーター）64％収量にて
1.33ｇの目的物を得る。酢酸エチル−ヘキサンか
ら再結晶し、無色の結晶として生成物を得る。融
点164−165゜。

例 ５−（Ｎ−〔5′−（N′−〔2″，2″，5″，5″−テト
ラ
メチル−1″−オキシピロリジニル−3″〕−ホル
ミアミド）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンの製
造 ２mlの乾燥DMF中に112mg（0.32ミリモル）の
カルボキシ−ペンチル酸（例）を含む溶液を乾
燥氷冷アセトン浴により−12゜まで冷却し、そこ
へ100μ（約１ミリモル）のEt₃Nを加える。こ
の反応混合物を30分間撹拌して70μ（0.5ミリモ
ル）のイソブチルクロロホルメートを添加する。
２mlの乾燥DMF中に66mg（0.4ミリモル）のスピ
ン標識アミン（２，２，５，５−テトラメチル−
３−アミノ−１−オキシピロリジン）を含む溶液
を添加し、得られた反応混合物を−10℃にて１時
間、および室温で一夜撹拌する。DMFおよび過
剰の溶媒を温水浴中にて0.5mmで除去する。黄色
残留物を50mlのCH₂Cl₂に溶かし、10mlのH₂Oで
３回、次いで飽和ブラインで洗浄し、乾燥
（MgSO₄）させ、かつ濃縮して黄色半固体（260
mg）の生成物を得る。この粗生成物を酢酸エチル
およびヘキサンで室温にて処理し、薄黄色固体
（91mg、59％）を得る。酢酸エチル−ヘキサンか
ら再結晶して分析上純粋な物質を得る。融点169
−170゜。

例 ５−（Ｎ−〔5′−カルボキシペンチル−1′〕カル
バモイル）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンの牛
血清アルブミン（BSA）への結合 ７mlの乾燥DMF中の140mg（0.4ミリモル）の
カルボキシペンチル酸（例）の溶液〔血清キヤ
ツプ（cap）のついた25mlのR.B.フラスコ内の〕
へ、−10ないし−15゜にて700μのEt₃N（約0.5ミリ
モル）を添加し、続いて62μ（約0.5ミリモル）
のイソブチルクロロホルメートを添加する。得ら
れた白色スラリーを２時間−10ないし−15゜にて
撹拌する。

上記混成酸無水物を、氷冷浴中にて15mlの水お
よび0.05N NaOH中の220mg（約0.003ミリモル）
のBSAの溶液へ30分間にわたりPH8.5−9.0で添加
し（反応混合物のPHは希水性NaOHで8.5に維持
する）、冷室で更に２時間撹拌する。得られた反
応混合物はわずかに混濁している。この溶液を４
の0.1M NaHCO₃−0.1M Na₂CO₃緩衝液で３
回、12時間間隔で透析し、この方法を水で繰り返
して行う。

透析した溶液を0.22μミリポア（millipore）フ
イルターでろ過し、10000RPMにて１時間遠心分
離し、殺菌凍結乾燥フラスコ中で凍結乾燥し、
155mgの結合体を得る。この結合体をUV分析に
かけると、この結合体中に39のハプテンが存在す
ることがわかる。

例 ５−（Ｎ−〔2′−カルボキシエチル−1″〕−カル
バモイル）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンの牛
血清アルブミン（BSA）への結合 乾燥DMF（4Aモレキユラーシーブ）中の305mg
（．001ｍ）のＮ−（２−カルボキシエチルカルバ
モイル）５−Ｈ−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンの
撹拌溶液へ、−５℃にて139μ（．001ｍ）のト
リエチルアミンを加え、続いて126μ（．001
ｍ）のイソブチルクロロホルメートを加える。こ
の混合物を−5゜にて1.5時間撹拌し、その後20ml
のDMF中および0.1M炭酸塩50ml中の1.0ｇｍの
BSAの冷却溶液（0゜）、PH９、へ、この混合物を
５分間にわたり滴下添加する。この反応混合物を
冷室中にて一夜撹拌する。PH９の0.05M炭酸塩４
で２回、次にPH9.5の水性アンモニア４で２
回透析し、続いて凍結乾燥すると1035ｇｍの所望
の生成物が得られ、これはUVによりハプテン数
30と計算される。

例 ５−（Ｎ−〔5′−カルボキシペンチル−1″〕カル
バモイル）−ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンのグ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−
６−PDH）への結合 Ａ 反応フラスコ中へ125μのDMF中の例の
カルボキシペンチル誘導体8.4mg（0.05ミリモ
ル）を入れ、そこへ当モル量のカルビトールク
ロロホルメートおよびトリエチルアミンを加
え、温度をおよそ−20℃に維持する。

次に上記混合物を10mgのグルコース−６−リ
ン酸および20mgのNADHの存在下、温度4゜に
て0.3mlのDMFを含有するPH8.1の0.055Mトリ
ス緩衝液中の1.9mg／mlのグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼの溶液へゆつくりと添加
する。1N水酸化ナトリウム（および200ml必
要）を添加することによりPHを８および９の間
に維持する。次いで生成物を0.055Mトリス、
PH8.1、で40時間（２で４回）透析すると３
mlの透析物が残る。

Ｂ 失活パーセントおよび阻害パーセントを測定
する検出方法は次の通りであるすなわちPH５−
６の0.1M NAD溶液の２容量部と、PH7.9の
0.055Mトリス−HCl緩衝液中の0.11Mのグルコ
ース−６−リン酸の３容量部とを合併する。透
析した結合体の一部を上記緩衝液で１：100に
希釈する。検定溶液は、50μの（Ｇ−６−
Ｐ）−NAD溶液、750μの緩衝液、失活が測
定されるか、あるいは阻害が測定されるかどう
かにより、50μの緩衝液又は抗体を含有する
緩衝液、および50μの酵素結合体又は酵素対
照から形成される。数部の緩衝液は定量的な転
移を確認するのに用いられる。溶液を分光計に
吸引し、NADHの生成割合を340nｍ、30℃に
て追う。１分当りのODの変化を２分目と３分
目の間で測定する。酵素結合体は88％失活し、
65％阻害されることが認められる。

Ｃ 検定は種々の量のテグレトール（Tegretol）
で行われる。この検定は次のように行われる。
50μのサンプルは0.5％塩化ナトリウムを含有
する250μの緩衝液（PH8.1、25℃、0.55Mト
リス−HCl、0.05％ｗ／ｖナトリウムアジド、
0.005％ｗ／ｖチメロサールおよび0.01％ｖ／
ｖトリトンＸ−100（塩緩衝液）とともに１mlの
カツプ中に分与される。60秒の平衡後50μの
上記サンプル溶液を、１％ｗ／ｖ家兎血清アル
ブミン、0.066Mグルコース−６−リン酸およ
び0.4M NADモノナトリウム塩を含有する緩
衝液中の50μの抗体溶液を加えた二番目のカ
ツプへ分与し、続いて250μの塩緩衝液を分
与する。最後に0.9％ｗ／vNaClおよび１％
ｗ／ｖ家兎血清アルブミンを含有する緩衝液中
の50μの酵素結合体を加え、続いて250μの
緩衝液を添加する。この検定混合物を分光計セ
ル中に吸引し、15秒後最初の吸光度を読みと
り、80秒後に２回目の吸光度を読む。この読み
の差をOD単位として記載する。既知テグレト
ール（Tegretol）濃度の試料を用い、テグレ
トールを含まないものと1μｇ／ml濃度との間
の差を調べてみると11OD単位であり、テグレ
トールを含まないものと10μｇ／mlとの間の差
は51単位である。

例 ５−カルバミル（Ｎ−プロパナリル）−5H−ジ
ベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンの製造 150mlの乾燥CH₂Cl₂（3Aモレキユラーシーブ）
中に9.7ml（．012ミリ）乾燥（4Aモレキユラー
シーブ）ピリジンを含有する溶液を急速に撹拌
し、6.0ｇ（．06モル）乾燥CrO₃を加える。この
溶液を乾燥管により水分から保護し、氷浴中にて
30分間撹拌する。７mlのCH₂Cl₂中のＮ−（３−ヒ
ドロキシプロピルカルバモイル）５−Ｈ−ジベン
ズ〔ｂ、ｆ〕アゼピン（2.91ｇ、．01ｍ）を一度
に加え、反応混合物を室温で45分間撹拌する。溶
液をフラスコから注ぎ出し、タール状残留物を
150mlのCH₂Cl₂で洗う。溶液を合併し、10ml1N
NaOHで３回、100ml1N HClで３回、100mlの飽
和NaHCO₃で３回、飽和ブラインで連続的に洗
浄し、次いでNa₂SO₄で乾燥させる。すべての洗
液をエーテルでもどし洗浄する。エーテルもどし
洗液物およびCH₂Cl₂溶液を合併し、生成物から
溶媒をとばす。油状残留物を放置して結晶化さ
せ、1.71ｇの表題化合物を得る（59％）。ベンゼ
ン−石油エーテルから再結晶させると白色固体、
融点121−122.5゜、が得られる 例 XI ５−カルバミル−（Ｎ−プロパナリル）−5H−
ジベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンのBSAへの結合 40mlのPH７リン酸緩衝液（1.02M）中の600mg
BSA（ペンテツクス再結晶）の冷却溶液（5゜）へ、
５mlメタノール中の例のアルデヒド294mg（．
001ｍ）を加える。わずかに濁つた混合物へ68mg
（．0011ｍ）のナトリウムシアンポロヒドリドを
加え、KH₂PO₄を添加してPHを7.3に調整する。
この反応混合物を冷室にて40時間、次いで室温に
て４時間撹拌すると回り落ちてくる。この沈殿物
を8M尿素中に再懸濁させ、遠心分離にかけた後
この溶液を上澄液と合併し、４の0.05M
Na₂CO₃、PH９、で２回および４のNH₄OH、
PH9.5で２回透析する。凍結乾燥すると588mgの結
合体が得られ、これはUV測定でハプテン数28が
測定される。

例 XII ５−カルバミル（Ｎ−プロパナリル）−5H−ジ
ベンズ〔ｂ、ｆ〕アゼピンのBGGへの結合 メタノール（15ml）をPH７の0.2Mリン酸中の
600mgの牛ガンマグロブリン（ペンテツクス分画
）溶液80mlへ添加する。この溶液を5゜に冷却
し、５mlのメタノール中の293mg（．001ｍ）のア
ルデヒド（例）を加え、続いてすぐに68mg（．
0011ｍ）のナトリウムシアンボロヒドリドを添加
する。この混合物を１日冷室にて、次いで２日目
は室温にて撹拌する。混合物は回り落ちてき、上
澄液を再懸濁沈殿物（9M尿素）と合併する。透
析を２6M尿素−0.05M炭酸塩PH９で一回、２
4M尿素−0.05M炭酸塩PH９で一回、2M尿素−
0.05M炭酸塩PH９で一回、４0.05M炭酸塩PH９
で２回、そして最後に４PH10NH₄OHで２回透
析する。透析後溶液は回り落ちてき、凍結乾燥す
ると226mgの結合体が得られ、またこれはUV測
定によりハプテン数18であることが測定された。

例 １ 例の抗原を用いる抗体の産生評価 検定において本発明による化合物の効果を証明
するために、例の抗原を用いて抗体を製造す
る。この検定を行うには0.055Mトリス−HCl、
PH8.1、25℃；0.05％Ｗ／Ｖナトリウムアジド；
0.005％Ｗ／Ｖチメロサール；および2.0重量パー
セントの塩化ナトリウム（Ｗ／Ｖは100ml当りの
グラム）からなる緩衝液を用いる。検定は50μ
の試料、たとえば血清、を250μの緩衝液の入
つたカツプへ移し、続いて１％Ｗ／Ｖ家兎血清ア
ルブミン、0.066Mグルコース−６−リン酸およ
び0.4M NAD（モノナトリウム塩）を含有する緩
衝液中の50μの抗体溶液を添加し、次いて250μ
の緩衝液を添加することにより行われる。最後
に0.9％Ｗ／Ｖ NaClおよび１％Ｗ／Ｖ家兎血清
アルブミンを含有する緩衝液中50μの例の酵
素結合体を添加し、続いて250μの緩衝液を添
加する。この検定混合物を分光計セル中に吸引
し、15秒後最初の吸光度を読み、80秒後に２回目
の吸光度を読む。セルの温度は30℃である。読み
の差をOD単位×10³として記載する。テグレトー
ルを含まない試料およびml当り1μｇのテグレト
ールを含む試料間で20OD単位の差が得られる。

交叉反応性研究ではイミノスチルベンはテグレ
トールの1nｇ／mlと同等の反応にはおよそ167μ
ｇ／ml以上を必要とするが、類似構造をもつ他の
化合物たとえばカルバムアゼピン−10，11エポキ
シド、イミプラミン、アミトリプチリンおよびデ
スメチルイミプラミンは1000μｇ／ml以上でもテ
グレトールの1nｇ／mlに等しい反応は示さない。

上記のデータから本発明ではテグレトールに非
常に感受性の強い、かつテグレトール構造に特異
的な抗体が製造されうることがわかる。更に鋭敏
な効力検定は酵素、たとえばグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、に結合したテグレトール
誘導体、を用いて展開されうる。

上述の発明は理解を明確にするために例示もし
くは具体例によつてある程度詳述したが、ある程
度の変化および修正は特許請求の範囲内で行われ
うることは明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 （式中ｍは０または１であり、R¹は結合を表わ
   すか又は唯一の不飽和として０から１個のエチレ
   ン不飽和部位と炭素に単独結合する０から１個の
   原子番号７〜８のヘテロ原子とをもつ１から８個
   の炭素原子の脂肪族基であり、但しｍが０である
   時R¹は少くとも２個の炭素原子を有し、Y¹は少
   くとも分子量1000の抗原ポリアミノ酸であり、n¹
   は少くとも１であり、かつY¹の分子量を500で割
   つたものより大きくない） で示される化合物 に応答して形成された抗体。 ２ Y¹の分子量がおよそ10000〜500000の範囲内
   にあり、かつn¹が約４〜250の範囲内にある特許
   請求の範囲第１項の抗体。 ３ R¹が２〜６個の炭素原子を有するポリメチ
   レンである特許請求の範囲第１項の抗体。