技術分野
本発明は優れた細胞増殖促進作用を有する絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドの製造法及びその医薬分野、化粧料分野への応用に関する。
背景技術
従来より、絹フィブロインには創傷、火傷等により欠損した皮膚組織の治癒促進作用があることから、粉末状やフィルム状にして創傷被覆材として研究されている（特開平１−２５４１６４号、同平８−１９８９７０号、同平９−１９２２１０号、同平１１−１０４２２８号）。また絹フィブロインは、このような作用を有することから化粧料としても応用されている。
しかしながら、これら従来の絹フィブロインを利用した創傷被覆材の治癒促進作用は充分満足すべきものではなく、さらに効果の優れた創傷治癒促進剤の提供が望まれている。
本発明は、欠損した皮膚組織の再生能力、すなわち細胞増殖促進効果に優れた天然由来成分の取得及びその利用を提供することを目的とする。
発明の開示
かかる観点から本発明者らは、未分解絹フィブロイン、すなわち、分子量約３５万のＨ鎖が優れた線維芽細胞増殖作用を有することを見出し、先に特許出願した（特願平１１−１９８２３３号）。
しかし、絹フィブロインＨ鎖は分子量が大きいため、水溶液におけるゲル化は１日以内で起き、取り扱いが容易でない。
そこでゲル化の起きにくい細胞増殖促進作用を有する成分を取得すべくさらに検討した結果、絹フィブロインＨ鎖及びその分解物とは別の低分子量の絹フィブロインＬ鎖の単離に成功した。そしてさらに、当該絹フィブロインＬ鎖は優れた皮膚の線維芽細胞増殖促進作用を有し、創傷治癒促進剤、細胞培養床及び化粧料として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、生繭、乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸又は生糸、絹織物もしくはそれらの残糸を精練し、得られたフィブロイン繊維を中性塩水溶液に溶解し、次いで分別沈澱することを特徴とする絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドの製造法を提供するものである。
また本発明は、絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドを有効成分とする細胞増殖促進剤を提供するものである。
また本発明は、絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドを有効成分とする創傷治癒促進剤を提供するものである。
また本発明は、絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドを含有する細胞培養床を提供するものである。
また本発明は、絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドを含有する化粧料を提供するものである。
また本発明は、細胞増殖促進剤又は創傷治癒促進剤を製造するための絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドの使用を提供するものである。
更に本発明は、絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドを投与することを特徴とする創傷治癒の促進方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
蚕は体内の絹糸腺腔に液状の絹を分泌し、液状絹と言われている。液状絹は絹フィブロインと絹セリシンから成り、液状絹フィブロインは分子量約３７万である（Ｔａｓｉｒｏ Ｙｕｔａｋａ ａｎｄ Ｏｔｓｕｋｉ Ｅｉｉｃｈｉ，Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６，Ｐ１（１９７０））。分子量約３７万の絹フィブロインは還元により分子量約３５万と２．５万に分かれるが、ここでは分子量約２．５万の絹フィブロインを絹フィブロインＬ鎖と言い、分子量約３５万の絹フィブロインを絹フィブロインＨ鎖という。
蚕は営繭時に液状絹を吐糸して繭（繭糸と蛹で構成）を作る。繭糸には中心部に絹フィブロイン、周囲に絹セリシンが存在し、存在比は７０〜８０（フィブロイン）：２０〜３０（セリシン）であることが知られている。生糸は繭糸を数本から数１０本集合（繰糸）して作られる。繭糸、生糸又は生織から絹セリシンを除去する工程を精練といい、精練後の繊維を絹糸又は絹糸フィブロインと言う。精練によって絹セリシンを完全に除去すると限らない。５分練りや７分練りといって、セリシンの半分又は７０％程度を除去することもあるが、この場合も精練工程を経ているので絹糸という。生織とは未精練の絹織物を言う。一般に、絹はフィブロイン単独、セリシン単独、又はフィブロインとセリシンが同時に存在するものを言い、フィブロイン、セリシンのいずれに対しても、またフィルム、粉末、繊維等のいずれの形態に対しても絹と言う。従って、絹フィブロインとフィブロイン及び絹セリシンとセリシンは同じ意味である。絹フィブロインは絹フィブロインフィルム、絹フィブロイン粉末、絹糸フィブロイン等を言うが、このうちの絹糸フィブロインは繭糸、生糸、生織又はそれらの残糸を精練して得られた繊維を言う。
従来の絹糸の製造法は、まず、養蚕農家で生産された生繭（生繭：貯蔵のため処理をしていない繭）を乾繭、煮繭、繰糸して生糸とし、生織を作る。次いでこの生糸又は生織の精練を行い、絹糸また絹織物とする。また、これらの工程で生じる屑を残糸という。乾繭は生繭を１１５〜１２０℃の温度から５〜６時間かけて８０℃程度の温度に徐々に下げて行う。煮繭では１００〜１０５℃の水蒸気及び熱水で１０分間程度処理される。
一方、絹フィブロインは液状絹からも得ることができる。例えば、蚕の絹糸腺の中部及び後部糸腺からゲル状の内容物（液状絹）を取り出し、水溶液等で洗浄することにより付着している少量の絹セリシンを除く方法で、未分解の絹フィブロインを得ることができる。しかし、この方法は蚕を解剖して蚕体内から絹糸腺を取り出し、さらに絹糸腺腔から絹フィブロインを取り出さなければならない。蚕１頭から得られる絹フィブロインは最大で０．４ｇ程度であり、蚕体液や絹糸腺細胞等の不純物を含みやすいこと、及び絹フィブロインを得るのに手間がかかること等により、工業的な生産方法にはならない。
本発明においては工業的に有利な生繭、乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、あるいは生糸、絹織物又はそれらの残糸を材料として用いる。絹フィブロインは保存中に分解しやすいので、新鮮な生繭を原料とするのが最も望ましい。生繭、乾繭、生糸、絹糸及びそれらの残糸の保存は室温以下の温度で光を遮断することが好ましい。
本発明方法ではまず、これらの原料を精練してセリシンを除去する。精練手段としては、尿素水溶液処理、アルカリ水溶液処理、酵素水溶液処理、高圧熱水処理が挙げられるが、尿素水溶液処理が温和であることから特に好ましい。いずれの処理においても、原料が分繊しているほど精練は容易に、速くできる。
尿素水溶液による処理は、例えば絹フィブロインの分解防止、反応効率及び工業的操作性の点から、３０％（（重量（ｇ）／容量（ｍＬ）以下、単に％で示す。）以上の尿素水溶液で７０〜９０℃、６０〜１８０分処理する。より好ましくは４５％以上の尿素水溶液で７５〜８５℃、９０〜１５０分処理される。尿素水溶液には、メルカプトエタノール等を加えてもよい。
ここにおける処理とは、前記原料が尿素水溶液に浸漬されていればよく、この間撹拌してもよい。
アルカリ水溶液による処理は、例えばｐＨ１０〜１２のアルカリ水溶液で、大気圧下の沸騰温度、２〜６０分の範囲で条件を適宜変えて処理する。ｐＨが１０未満では精練が充分でなく、ｐＨが１２を超えると絹フィブロインの分解が速く、コントロールが困難となる。また好ましいｐＨは１０．５〜１１．５である。用いるアルカリ水溶液としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ性ナトリウム塩の水溶液が挙げられ、アルカリ精練の場合、炭酸ナトリウム水溶液は適度なバッファー効果があるため、特に好ましい。
絹を分解することなく精練するには精練時のｐＨ、温度、時間等の処理条件を適宜変化させてコントロールすればよく、例えば沸騰温度以上の温度（例えば１１０℃や１２０℃）で処理するときは、ｐＨを中性寄りに、又は時間を短くする。沸騰温度以下の温度で処理するときはｐＨを高く、時間を長くする等適宜条件を変える。さらに、炭酸ナトリウムの他のナトリウム塩を使う時も炭酸ナトリウムに合わせ、適宜条件を変えることは言うまでもない。ここにおける処理とは、前記原料がアルカリ水溶液中に浸漬されていればよく、この間撹拌してもよい。
酵素水溶液精練はタンパク質分解酵素を生糸や生繭の精練に応用した方法である。従来はパパインがよく利用されていたが、近年はアルカラーゼ（幸新堂化学工業所）が使われている。アルカラーゼによる酵素水溶液精練では前処理が必要で、前処理はｐＨ９〜１０、好ましくはｐＨ９．０〜９．６において、処理時間は８０℃では１０分以内、好ましくは５分以内、６０℃では６０分以内、好ましくは１０分以内で行う。その後、本処理としてアルカラーゼを添加して５０〜６０℃で精練する。精練時間は６０分以内、特に２０分以内が好ましい。この場合、繭層をできるだけ分繊することが好ましい。また、この間撹拌してもよい。
絹精練は通常は大気圧下での水の沸騰点付近の温度で行われる。しかし、１００℃以上の高温で精練（高圧熱水処理又は高圧精練ともいう）することもできる。絹セリシンの溶解度は水の温度の影響が大きく、例えば１１０℃で３０〜１００分、１２０℃で２０〜６０分、１３０℃で１０〜３０分間、熱水に浸漬すればセッケンやアルカリ等の溶解剤を使用しなくても精練ができ、分解しないＬ鎖が得られる。
精練により得られたフィブロイン繊維は中性塩水溶液に溶解して分別沈澱に付す。
中性塩としては、チオシアン酸リチウム、塩化カルシウム、臭化リチウム、チオシアン酸ナトリウム等が挙げられる。当該中性塩の濃度は中性塩の種類によって異なるが、いずれの中性塩においても飽和水溶液又は５０％飽和以上の濃度が好ましい。特に８０％飽和水溶液以上の濃度が好ましい。チオシアン酸リチウムの場合飽和水溶液は約８０％である。なお、これらの中性塩水溶液のｐＨは５〜８である。
原料が溶解した後の分別沈澱には非結晶絹フィブロインを結晶化させるアセトンやアルコール、特にエタノールを用いるのが好ましい。この操作は、例えばエタノールを順次添加して沈澱物を採取するのが好ましい。アルコールやアセトンの濃度が低いとＨ鎖が選択的に沈澱し、濃度を高くするとＬ鎖が選択的に沈澱するので、これらの溶剤の濃度を調整することにより、Ｌ鎖を選択的に沈澱させることができる。例えば塩化カルシウム水溶液にエタノールを加えて沈澱させる場合には、エタノール濃度８２．４％未満では主にＨ鎖が沈澱し、８２．４％を超えると主にＬ鎖が沈澱する。
かくして得られる絹フィブロインＬ鎖ポリペプチドは、優れた細胞増殖促進作用を示すので、種々の細胞培養添加剤（特に、ヒトを含む動物細胞用添加剤）、細胞培養床、創傷治癒促進剤や化粧料（以下、あわせて外用剤ということもある）として有用である。
創傷治癒促進剤、細胞培養床又は化粧料として用いる場合には、絹フィブロインＬ鎖をハイドロゲル、フィルム、粉末等にして創傷部又は皮膚に適用する外用剤として用いるのが好ましい。フィルム状にするには、絹フィブロインＬ鎖水溶液を平板上に流し、乾燥すればよい。また粉末にするにはこのフィルムを粉砕又は絹フィブロインＬ鎖水溶液を空中噴霧又は絹フィブロインＬ鎖水溶液を撹拌や絹フィブロインＬ鎖水溶液にアルコール添加等により得た沈澱物を、水洗、乾燥、粉砕すればよい。
一方、絹フィブロインＬ鎖は、通常の外用剤、例えば軟膏剤、クリーム剤、パップ剤等の形態で用いることもできる。かかる軟膏剤、クリーム剤、パップ剤等にするには、通常の軟膏基剤、クリーム基剤、パップ基剤等に絹フィブロインＬ鎖を配合すればよい。
これら外用剤への絹フィブロインＬ鎖の配合量は、剤型、基剤によって異なるが、０．００１〜３０（重量／重量）％、特に０．１〜１０（重量／重量）％が好ましい。
実施例
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
実施例１（細胞培養容器へコートした場合の細胞生育促進機能）
Ａ．材料及び方法
（１）フィブロイン
日中交雑種（日１３７×支１４６）の繭層を５、６枚に剥離し、よく分繊した。次いで３０倍量（Ｖ／Ｗ）の５Ｍ尿素水溶液で１００℃、５分間よく撹拌しながら処理して、セリシンを溶解除去した。残りの繊維質（フィブロイン繊維）を水洗、乾燥し、これをフィブロイン（原料）として使用した。
（２）フィブロインＨ鎖、Ｌ鎖の試料溶液の調製
エタノール２６ｇ、水４２ｇ、塩化カルシウム３２ｇの混合液にトリス（ヒドロキシル）アミノメタン１．２１ｇを入れた液の１０．５ｍＬにメルカプトエタノール２１０μｌを加え、７０〜８０℃にあたためておき、脱セリシンした繭層５２３ｍｇを入れて完全に溶解した。これにエタノールを添加し、添加したエタノール濃度が０〜７１．８％（Ｉ）、７１．９〜７２．５％（ＩＩ）、７２．６〜７８％（ＩＩＩ）、７８．１〜８２．３％（ＩＶ）、８２．４〜８４．７％（Ｖ）、８４．８〜８９．２％（ＶＩ）、８９．３〜９１．７％（ＶＩＩ）で得られた各沈澱を集め、それぞれの成分分析を行った。図１にこれらの沈澱物の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）像を示す。この像よりＩ、ＩＩの画分をＨ鎖、ＶＩＩの画分をＬ鎖とした。ＩＩＩ、ＩＶ等の画分ではＨ鎖が分解し、低分子化しているので、除外した。
次に、これらのＨ鎖とＬ鎖の沈澱物を９Ｍ ＬｉＳＣＮに溶解した後、５０倍量の水で３０分、４回透析した。さらに、これらのタンパク量をＵＶ法で測定し、水で希釈してそれぞれ０．０２５％、０．００２５％に調整した。
（３）タンパクの定量・ＵＶ法
タンパク溶液の２７５ｎｍの吸光度を測定し、吸光度１．０のときのタンパク濃度を１ｍｇ／ｍＬとして計算した。
（４）細胞培養シャーレへのフィブロインポリペプチドのコート
ポリスチレンのシャーレ（３５ｍｍφ、ファルコン）にフィブロインＨ鎖、Ｌ鎖の０．０２５％又は０．００２５％水溶液を１ｍＬ入れて風乾し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）２ｍＬで３回洗った後再度風乾し、７０％エタノールに浸漬して滅菌した。フィブロインポリペプチド無添加の対照区用シャーレには、フィブロインポリペプチドの代りに水を１ｍＬ入れて風乾し、以下同様に処理した。
（５）細胞
細胞はクラボウから購入した凍結ヒト皮膚線維芽細胞（成人由来）を使用した。
（６）培地
培地は、クラボウから購入したヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地を使用した。
（７）細胞培養
フィブロインポリペプチドをコートしたシャーレによる細胞培養実験では、シャーレ１枚につき培地２ｍＬを入れ約１０万の細胞を接種した。
（８）生細胞数の測定
シャーレ１枚につき培地２ｍＬ、アラマーブルー（ＩＷＡＫＩ）０．１ｍＬの割合で入れ、３７℃、２時間培養した後、５７０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度から計算した色素の還元量を生細胞数とした。
Ｂ．結果
細胞培養を４日間行った後に、フィブロインポリペプチド無添加の場合を１００％としたヒト皮膚繊維芽細胞の生細胞数を表１に示した。
フィブロインポリペプチドをコートしたシャーレでは、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに対照区より生育率が優れていた。
実施例２（細胞培養用の培地へ添加した場合の細胞生育促進機能）
実験方法は、下記以外は実施例１と同じである。
フィブロインＨ鎖、Ｌ鎖水溶液の培地への添加実験は下記のように行った。マルチウェルプレート（６穴、ファルコン）に培地２ｍＬを入れ、約１０万の細胞を接種し、１日後にフィブロインＨ鎖、Ｌ鎖の水溶液（２５μｇ／ｍＬ）を添加した培地と交換し、さらに培養を４日間続けた。フィブロインポリペプチド無添加の場合の生細胞数を１００％とした対照区に対し、フィブロインポリペプチドを添加した場合の生細胞数を表２に示した。
表２のように培地にフィブロインポリペプチドを添加した場合も、対照区より生育率が良かった。
実施例３（未分解Ｌ鎖が含まれている場合の細胞生育促進機能）
絹タンパクの溶剤として、中性塩水溶液が使われることはよく知られている。この中でＬｉＳＣＮ（チオシアン酸リチウム）の飽和水溶液は絹タンパクの分子量を低下することなく絹タンパクを溶解する。しかし、ＬｉＳＣＮは高価で重量当たりＣａＣｌ２（塩化カルシウム）の約１００倍の価格で市販されている。ＣａＣｌ２は絹タンパクをよく溶解させるが、加熱を要するため、絹タンパクの分子量を低下させやすい。特に、Ｌ鎖よりＨ鎖は熱、酸、アルカリ、光等で分子量が低下しやすい。そこで、実施例１のように、８０℃以下で絹タンパクを溶解すれば、ＣａＣｌ２を用いてもＨ鎖の回収はできる。しかし、ＣａＣｌ２を用いた場合、Ｈ鎖の一部は分解するがＬ鎖はほとんど分解されない。
フィブロインをＣａＣｌ２（８５℃）及びＬｉＳＣＮ（室温）で溶解した溶解液中のフィブロインの電気泳動像を図２に示した。図２において、ＣａＣｌ２で溶解したフィブロインにはＨ鎖が確認できない。ＣａＣｌ２を用いてフィブロインを溶解する場合、溶解温度を８５℃程度で行うと、Ｈ鎖はほとんど分解するが、Ｌ鎖のほとんどは分解されずに残る。このように、Ｌ鎖はＨ鎖に比べて安定であり、取り扱いが容易である。
ＣａＣｌ２を用いてフィブロインを溶解した場合は、溶解温度にもよるが、Ｈ鎖の多くは平均分子量１０万程度にまで分解し、Ｌ鎖はほとんど分解していない。このようなフィブロインを用いて、実施例１と同様の実験を行った。その結果、生細胞数は１３３％を示し、Ｌ鎖が含まれていることで細胞増殖促進作用があり、その作用を利用できることが分かった。
実施例４
実施例１で得られたＨ鎖及びＬ鎖のそれぞれ０．１％、０．５％水溶液を調製し、室温に保って溶液の状態を観察した結果を表３に示した。
表３にみられるようにＨ鎖の水溶液は、０．５％の濃度では１日後ですでにゲル化が始まり、７日後には完全にゲル化した。また０．１％でも、１日後にゲル化の兆候である粘性の増加がみられ、７日後にはゆるいゲルを形成し、１４日後には完全にゲル化した。
これに対してＬ鎖の水溶液は、０．５％の濃度でも７日後までは完全に液状であり、１４日後にわずかに粘性の増加がみられる程度であった。また０．１％の濃度では１４日間以上安定であった。
産業上の利用可能性
本発明の絹フィブロインＬ鎖は、優れた細胞増殖促進作用を有し、かつ安定性が高いので、創傷治癒促進剤等の医薬、皮膚ケア用の化粧料として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、各沈澱物の電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）像を示す図である。
図２は、フィブロインをＣａＣｌ２で溶解した場合とＬｉＳＣＮで溶解した場合のフィブロインの電気泳動像を示す図である。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing a silk fibroin L chain polypeptide having an excellent cell growth promoting action, and its application to the fields of medicine and cosmetics.
BACKGROUND ART [0002] Since silk fibroin has a healing promoting action on skin tissue deficient due to wounds, burns, etc., it has been studied as a dressing material in the form of a powder or a film (JP-A-1-254164, Nos. 8-198970, 9-192210, and 11-104228). Also, silk fibroin has been applied as a cosmetic because it has such an effect.
However, the healing promoting effect of these conventional wound dressings using silk fibroin is not sufficiently satisfactory, and it is desired to provide a more effective wound healing promoter.
An object of the present invention is to provide a naturally derived component excellent in the ability to regenerate defective skin tissue, that is, a cell growth promoting effect, and to provide the use thereof.
DISCLOSURE OF THE INVENTION From such a viewpoint, the present inventors have found that undegraded silk fibroin, that is, an H chain having a molecular weight of about 350,000 has an excellent fibroblast proliferation activity, and has previously filed a patent application (Japanese Patent Application No. 11-111,197). -198233).
However, since silk fibroin H chain has a large molecular weight, gelation in an aqueous solution occurs within one day, and handling is not easy.
Therefore, as a result of further study to obtain a component having a cell growth promoting action that is unlikely to cause gelation, the inventors succeeded in isolating a silk fibroin H chain and a low molecular weight silk fibroin L chain different from its degradation product. Further, they have found that the silk fibroin L chain has an excellent skin fibroblast proliferation promoting action and is useful as a wound healing promoter, a cell culture bed, and a cosmetic, and completed the present invention. .
That is, the present invention provides a method of scouring a cocoon layer or a cocoon thread of a raw cocoon, a dried cocoon or a boiled cocoon, or a cocoon thread, a raw silk, a silk fabric or a remnant thereof, dissolving the obtained fibroin fiber in a neutral salt aqueous solution, and then separating and sedimenting. And a method for producing a silk fibroin L chain polypeptide.
The present invention also provides a cell growth promoter comprising a silk fibroin L chain polypeptide as an active ingredient.
The present invention also provides a wound healing promoter comprising a silk fibroin L chain polypeptide as an active ingredient.
The present invention also provides a cell culture bed containing a silk fibroin L chain polypeptide.
The present invention also provides a cosmetic containing the silk fibroin L chain polypeptide.
The present invention also provides use of the silk fibroin L chain polypeptide for producing a cell growth promoter or a wound healing promoter.
Further, the present invention provides a method for promoting wound healing, which comprises administering a silk fibroin L chain polypeptide.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Silkworms secrete liquid silk into the silk gland cavity of the body and are said to be liquid silk. Liquid silk consists of silk fibroin and silk sericin, and liquid silk fibroin has a molecular weight of about 370,000 (Tasiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Journal of Cell Biology, Vol. 46, P1 (1970)). Silk fibroin with a molecular weight of about 370,000 is divided into about 350,000 and 25,000 by reduction. Here, silk fibroin with a molecular weight of about 25,000 is referred to as silk fibroin L chain, and silk fibroin with a molecular weight of about 350,000 is referred to as silk fibroin. It is called silk fibroin heavy chain.
Silkworms spin liquid silk during cocoon production to make cocoons (consisting of cocoons and pupae). It is known that silk fibroin is present in the center of silk thread and silk sericin is present in the periphery, and the abundance ratio is 70 to 80 (fibroin): 20 to 30 (sericin). Raw silk is made by assembling (twisting) several to several tens of cocoons. The process of removing silk sericin from cocoon, raw silk or raw woven is called scouring, and the fibers after scouring are called silk or silk fibroin. It is not always the case that silk sericin is completely removed by scouring. A 5-minute kneading or a 7-minute kneading may remove half or about 70% of sericin, but in this case also referred to as a silk thread since it has undergone a scouring step. Raw weave refers to unrefined silk fabric. In general, silk refers to a substance in which fibroin alone, sericin alone, or fibroin and sericin are present at the same time, and refers to silk for any of fibroin and sericin, and also for any form of film, powder, fiber and the like. . Thus, silk fibroin and fibroin and silk sericin and sericin have the same meaning. The silk fibroin refers to a silk fibroin film, a silk fibroin powder, a silk fibroin, and the like. Among these, the silk fibroin refers to a cocoon thread, a raw silk, a raw weave, or a fiber obtained by scouring the remaining threads thereof.
In a conventional silk thread manufacturing method, first, raw cocoons (raw cocoons: cocoons that have not been processed for storage) produced by a sericulture farmer are dried cocoons, boiled cocoons, and reeled into raw silk to make a raw weave. Next, the raw silk or raw weave is refined to obtain silk yarn or silk fabric. In addition, waste generated in these steps is referred to as residual yarn. The dry cocoon is performed by gradually lowering the raw cocoon from a temperature of 115 to 120 ° C to a temperature of about 80 ° C over 5 to 6 hours. The cooked cocoon is treated with steam and hot water at 100 to 105 ° C. for about 10 minutes.
On the other hand, silk fibroin can also be obtained from liquid silk. For example, undegraded silk fibroin is obtained by removing gel-like contents (liquid silk) from the middle and posterior glands of the silk gland of the silkworm, and removing a small amount of attached silk sericin by washing with an aqueous solution or the like. Can be obtained. However, this method requires dissection of the silkworm, removal of the silk gland from the silkworm body, and further removal of the silk fibroin from the silk gland cavity. The maximum amount of silk fibroin obtained from one silkworm is about 0.4 g, and it is easy to contain impurities such as silkworm fluid and silk gland cells, and it takes time to obtain silk fibroin. It does not become.
In the present invention, an industrially advantageous raw cocoon, a cocoon layer or a cocoon of a dried or boiled cocoon, or a raw silk, a silk fabric, or a residual yarn thereof is used as a material. Since silk fibroin is easily decomposed during storage, it is most preferable to use fresh raw cocoons as a raw material. Raw cocoons, dry cocoons, raw silk, silk threads, and their remaining threads are preferably stored at a temperature of room temperature or less to block light.
In the method of the present invention, first, these materials are scoured to remove sericin. Examples of the scouring means include urea aqueous solution treatment, alkali aqueous solution treatment, enzyme aqueous solution treatment, and high-pressure hot water treatment, and the urea aqueous solution treatment is particularly preferable because it is mild. In any treatment, scouring is easier and faster as the raw material is separated.
The treatment with the urea aqueous solution is, for example, 30% (weight (g) / volume (mL) or less, simply shown as%) or more urea aqueous solution in view of prevention of decomposition of silk fibroin, reaction efficiency and industrial operability. The treatment is carried out at 70 to 90 ° C. for 60 to 180 minutes, more preferably at 45 to 85 ° C. for 90 to 150 minutes with a 45% or more aqueous urea solution.
The treatment here may be any condition as long as the raw material is immersed in an aqueous urea solution, and may be stirred during this time.
The treatment with the alkaline aqueous solution is performed, for example, with an alkaline aqueous solution having a pH of 10 to 12 at a boiling temperature under the atmospheric pressure and in a range of 2 to 60 minutes with appropriate changes. If the pH is less than 10, scouring is not sufficient, and if the pH exceeds 12, the decomposition of silk fibroin is fast and control becomes difficult. The preferred pH is 10.5-11.5. Examples of the alkaline aqueous solution to be used include an aqueous solution of an alkaline sodium salt such as sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium silicate, sodium metasilicate, sodium phosphate, and sodium hydroxide. It is particularly preferable because it has a buffer effect.
In order to refine the silk without decomposing it, the treatment conditions such as pH, temperature, and time during the scouring may be controlled by appropriately changing the treatment conditions. For example, when the treatment is performed at a temperature higher than the boiling temperature (for example, 110 ° C. or 120 ° C.). Reduces the pH towards neutral or shortens the time. When the treatment is performed at a temperature lower than the boiling temperature, conditions are appropriately changed such as increasing the pH and lengthening the time. Further, when other sodium salts of sodium carbonate are used, it goes without saying that conditions are appropriately changed in accordance with sodium carbonate. The treatment here may be any condition as long as the raw material is immersed in an aqueous alkaline solution, and stirring may be performed during this time.
Enzyme aqueous scouring is a method in which proteolytic enzymes are applied to scouring raw silk and raw cocoons. In the past, papain was often used, but in recent years, Alcalase (Koshindo Chemical Industry) has been used. Pretreatment is necessary in scouring the aqueous enzyme solution with Alcalase. The pretreatment is performed at pH 9 to 10, preferably at pH 9.0 to 9.6, and the treatment time is within 10 minutes at 80 ° C, preferably within 5 minutes, and 60 ° C at 60 ° C. This is done within minutes, preferably within 10 minutes. Thereafter, as the main treatment, alcalase is added and scouring is performed at 50 to 60 ° C. The scouring time is preferably within 60 minutes, particularly preferably within 20 minutes. In this case, it is preferable to separate the cocoon layer as much as possible. In addition, stirring may be performed during this time.
Silk scouring is usually performed at a temperature near the boiling point of water at atmospheric pressure. However, scouring can be performed at a high temperature of 100 ° C. or higher (also referred to as high-pressure hot water treatment or high-pressure scouring). The solubility of silk sericin is greatly affected by the temperature of water. For example, when immersed in hot water at 110 ° C. for 30 to 100 minutes, at 120 ° C. for 20 to 60 minutes, and at 130 ° C. for 10 to 30 minutes, soap or alkali can be dissolved. Scouring can be performed without using an agent, and an L chain that does not decompose can be obtained.
The fibroin fiber obtained by scouring is dissolved in a neutral salt aqueous solution and subjected to fractional precipitation.
Examples of the neutral salt include lithium thiocyanate, calcium chloride, lithium bromide, sodium thiocyanate and the like. Although the concentration of the neutral salt varies depending on the type of the neutral salt, a saturated aqueous solution or a concentration of 50% saturation or more is preferable for any neutral salt. Particularly, a concentration of 80% saturated aqueous solution or more is preferable. In the case of lithium thiocyanate, the saturated aqueous solution is about 80%. In addition, pH of these neutral salt aqueous solution is 5-8.
It is preferable to use acetone or alcohol, particularly ethanol, for crystallizing amorphous silk fibroin for the fractional precipitation after the raw materials are dissolved. In this operation, for example, it is preferable to sequentially add ethanol to collect a precipitate. When the concentration of alcohol or acetone is low, the H chain is selectively precipitated, and when the concentration is high, the L chain is selectively precipitated. Therefore, the L chain is selectively precipitated by adjusting the concentration of these solvents. be able to. For example, when ethanol is added to an aqueous calcium chloride solution for precipitation, when the ethanol concentration is less than 82.4%, mainly H chains are precipitated, and when it exceeds 82.4%, mainly L chains are precipitated.
Since the silk fibroin L chain polypeptide thus obtained exhibits an excellent cell growth promoting action, various cell culture additives (particularly, additives for animal cells including humans), cell culture beds, wound healing promoters and cosmetics It is useful as a raw material (hereinafter, also referred to as an external preparation).
When used as a wound healing promoter, a cell culture bed, or a cosmetic, it is preferable to use silk fibroin L chain as a hydrogel, film, powder, or the like, and use it as an external preparation applied to a wound or skin. In order to form a film, a silk fibroin L chain aqueous solution may be flowed on a flat plate and dried. Further, to obtain a powder, the film obtained by crushing the film, spraying the aqueous solution of silk fibroin L chain in the air, stirring the aqueous solution of silk fibroin L chain, or adding alcohol to the aqueous solution of silk fibroin L chain, is washed with water, dried and crushed. Just fine.
On the other hand, the silk fibroin L chain can be used in the form of a usual external preparation, for example, an ointment, a cream, a poultice and the like. In order to prepare such ointments, creams, cataplasms, etc., silk fibroin L chains may be blended with ordinary ointment bases, cream bases, cataplasms, etc.
The blending amount of silk fibroin L chain in these external preparations varies depending on the dosage form and the base, but is preferably 0.001 to 30 (weight / weight)%, particularly preferably 0.1 to 10 (weight / weight)%.
EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
Example 1 (Function of promoting cell growth when coated on cell culture vessel)
A. Materials and Methods (1) The cocoon layer of a fibroin daytime hybrid (137 x 146 days) was peeled into 5 or 6 sheets, and well separated. Next, the mixture was treated with a 30-fold amount (V / W) of a 5M aqueous urea solution at 100 ° C. for 5 minutes with good stirring to dissolve and remove sericin. The remaining fibrous material (fibroin fiber) was washed with water and dried, and used as fibroin (raw material).
(2) Preparation of a sample solution of fibroin H chain and L chain 210 μl of mercaptoethanol was added to 10.5 mL of a solution obtained by adding 1.21 g of tris (hydroxyl) aminomethane to a mixed solution of 26 g of ethanol, 42 g of water, and 32 g of calcium chloride. , Warmed to 70-80 ° C, and 523 mg of the cocoon layer that had been de-sericin was added and completely dissolved. Ethanol was added thereto, and the added ethanol concentration was 0 to 71.8% (I), 71.9 to 72.5% (II), 72.6 to 78% (III), 78.1 to 82. Each precipitate obtained at 3% (IV), 82.4-84.7% (V), 84.8-89.2% (VI), 89.3-91.7% (VII) was collected, Each component analysis was performed. FIG. 1 shows an electrophoresis (SDS-PAGE) image of these precipitates. From this image, the I and II fractions were designated as H chains, and the VII fraction was designated as L chains. In the fractions such as III and IV, the H chain was degraded and the molecular weight was reduced.
Next, the precipitates of these H chains and L chains were dissolved in 9 M LiSCN, and dialyzed with 50 times the volume of water for 30 minutes four times. Further, the amounts of these proteins were measured by the UV method, and diluted with water to adjust to 0.025% and 0.0025%, respectively.
(3) Quantification of protein-UV method The absorbance at 275 nm of the protein solution was measured, and the protein concentration at an absorbance of 1.0 was calculated as 1 mg / mL.
(4) Coating Fibroin Polypeptide on Cell Culture Petri dish 1 mL of a 0.025% or 0.0025% aqueous solution of fibroin H chain and L chain is put in a polystyrene petri dish (35 mm, Falcon), air-dried, and PBS (phosphate After washing three times with 2 mL of buffered saline, the mixture was air-dried again and immersed in 70% ethanol for sterilization. 1 mL of water instead of the fibroin polypeptide was added to the control petri dish containing no fibroin polypeptide, and air-dried, followed by the same treatment.
(5) The cell used was a frozen human skin fibroblast (adult-derived) purchased from Kurabo Industries.
(6) Medium A low serum medium for human skin fibroblast proliferation, purchased from Kurabo Industries, was used.
(7) Cell culture In a cell culture experiment using a petri dish coated with a fibroin polypeptide, about 100,000 cells were inoculated with 2 mL of medium per petri dish.
(8) Measurement of viable cell number 2 ml of culture medium and 0.1 ml of Alamar Blue (IWAKI) were added to each petri dish, and cultured at 37 ° C. for 2 hours. After that, the amount of dye reduction calculated from the absorbance at 570 nm and 600 nm was measured. Was defined as the number of living cells.
B. Results Table 1 shows the viable cell count of human dermal fibroblasts after the cell culture was performed for 4 days and the case where no fibroin polypeptide was added was taken as 100%.
In the petri dish coated with the fibroin polypeptide, the growth rate of both the H chain and the L chain was superior to that of the control.
Example 2 (Function of promoting cell growth when added to cell culture medium)
The experimental method is the same as that of Example 1 except for the following.
The experiment for adding the aqueous solutions of the fibroin H chain and L chain to the medium was performed as follows. A multiwell plate (6 wells, Falcon) is charged with 2 mL of medium, about 100,000 cells are inoculated, and one day later, the medium is replaced with a medium containing an aqueous solution of fibroin H chain and L chain (25 μg / mL), and further cultured. For 4 days. Table 2 shows the number of viable cells when the fibroin polypeptide was added to the control group in which the number of viable cells without the addition of the fibroin polypeptide was 100%.
As shown in Table 2, when the fibroin polypeptide was added to the medium, the growth rate was higher than that of the control.
Example 3 (cell growth promoting function when undegraded L chain is contained)
It is well known that a neutral salt aqueous solution is used as a solvent for silk protein. Among them, a saturated aqueous solution of LiSCN (lithium thiocyanate) dissolves the silk protein without reducing the molecular weight of the silk protein. However, LiSCN is expensive and commercially available at about 100 times the price of CaCl 2 (calcium chloride) by weight. CaCl 2 dissolves the silk protein well, but requires heating, so that the molecular weight of the silk protein is easily reduced. In particular, the molecular weight of the H chain is more likely to be reduced by heat, acid, alkali, light, etc. than the L chain. Thus, as in Example 1, if the silk protein is dissolved at 80 ° C. or lower, the H chain can be recovered even with CaCl 2 . However, when CaCl 2 is used, a part of the H chain is decomposed, but the L chain is hardly decomposed.
FIG. 2 shows an electrophoresis image of fibroin in a solution obtained by dissolving fibroin in CaCl 2 (85 ° C.) and LiSCN (room temperature). In FIG. 2, no H chain can be confirmed in fibroin dissolved in CaCl 2 . When fibroin is dissolved using CaCl 2 , if the dissolution temperature is about 85 ° C., the H chain is almost decomposed, but most of the L chain remains without being decomposed. Thus, L chains are more stable than H chains and are easier to handle.
When fibroin is dissolved using CaCl 2 , most H chains are decomposed to an average molecular weight of about 100,000, and L chains are hardly decomposed, depending on the dissolution temperature. An experiment similar to that of Example 1 was performed using such fibroin. As a result, the number of living cells was 133%, and it was found that the presence of the L chain had a cell growth promoting effect, and that the effect could be utilized.
Example 4
Table 3 shows the results of preparing 0.1% and 0.5% aqueous solutions of the H chain and L chain obtained in Example 1, respectively, and observing the state of the solution at room temperature.
As can be seen from Table 3, the H chain aqueous solution started to gel after 1 day at a concentration of 0.5% and completely gelled after 7 days. Even at 0.1%, an increase in viscosity, which is a sign of gelation, was observed after 1 day, a loose gel was formed after 7 days, and completely gelled after 14 days.
On the other hand, the L chain aqueous solution was completely liquid until 7 days even at a concentration of 0.5%, and the viscosity slightly increased after 14 days. At a concentration of 0.1%, it was stable for 14 days or more.
INDUSTRIAL APPLICABILITY The silk fibroin L chain of the present invention has an excellent cell growth promoting action and high stability, and thus is useful as a medicine for promoting wound healing and a cosmetic for skin care. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an electrophoresis (SDS-PAGE) image of each precipitate.
FIG. 2 is a diagram showing electrophoretic images of fibroin when fibroin is dissolved in CaCl 2 and when dissolved in LiSCN.
