KR0132003B1 - 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 방식으로 제조된 메티오닐 단백질로부터 아미노펩티다제를 이용하여 천연형 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명에 따라서 메티오닐 인간 성장 호르몬을 염화나트륨이 0내지 100mM의 최종농도로 첨가된 pH 7.5 내지 8.5의 반응완충용액중에서 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스로부터 분리된 아미노펩티다제로 처리함으로써 효소 활성에 최적인 반응 조건하에서 N-말단의 메티오닌 잔기만을 선택적으로 제거하는, 천연형 재조합 인간성장 호르몬의 제조방법이 제공된다.

Description

스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법

제1도는 본 발명에 사용되는 아미노펩티다제의 각 pH 구간에서의 활성도를 나타낸 것이고,

제2도는 100mM 트리스 완충용액(pH 8.0) 중에서의 염화나트륨 농도 변화에 따른 상기 아미노펩티다제의 상대 활성도의 변화를 나타낸 것이고,

제3a 및 3b도는 각각 아미노펩티다제와의 반응에 의해 N-말단의 메티오닐이 제거되기 전과 후의 N-말단 서열 분석 결과를 나타낸 것이며,

제4도는 본 발명에 따라 최종 제조된 천연형 재조합 인간 성장 호르몬을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 유전자 재조합 방식에 의해 제조된 메티오닐 단백질로부터 아미노펩티다제(aminopeptidase)를 이용한 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 x-Pro, Met-Ala, Met-Gly, Met-Lys 및 Met-Arg의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 제외한 N-말단에 메티오닌 잔기를 갖는 단백질, 예를 들면 메티오닐 인간 성장 호르몬(methionyl human growth hormone)을 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스(Streptomyces thermonit rificans, ATCC 23385)의 배양액으로부터 얻은 아미노 펩티다제로 처리하여 상기 단백질의 N-말단의 메티오닌을 제거함으로서 천연형 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

인체로부터 유래되는 단백질은 그 양이 매우 제한될 뿐 아니라 안정성에 있어서도 많은 문제가 제기되고 있다. 예를 들어, 뇌하수체 유래 인간성장호르몬을 접종받은 어린이 중 4명이 바이러스 감염에 의해 사망한 것으로 밝혀짐으로써 미국 식품 의약국으로부터 이의 사용이 금지되기도 하였다[Science. 234, 22(1986)].

따라서, 최근에는 유전공학 기술을 이용하여 대장균 및 효모에서 인체 유래 단백질을 발현 및 분리 정제하여 임상에 이용하고 있다. (대장균:대한민국 특허공고 제89-1244 및 87-701 호 및 특허공개 제 87-2258 및 84-8695호 :효모:대한민국 특허공고 제 92-99호 및 특허공개 제 90-9973 및 90-9976호 참조)

그러나 상기 방법으로 재조합 인체 유래 단백질을 생산할 경우, 천연형 단백질을 구성하는 아미노산 잔기 이외에 N-말단에 핵산전사 개시 코돈(codon)인 ATG에서 전이된 메티오닌 전기가 하나 더 부가된 아미노산 잔기로 이루어진 메티오닐 단백질이 생성된다. 이러한 현상은 재조합 인간 성장 호르몬을 제조할 때 보편적으로 이용되는 숙주인 대장균 또는 효모에서 공히 나타나는 결과이다.

예를들어, 천연형 인간성장 호르몬은 191개의 아미노산 잔기로 이루어지는 반면 재조합 메티오닐 인간 성장 호르몬은 192개의 아미노산 잔기로 이루어지나 생물학적 역가면에서는 천연형 인간 성장 호르몬과 동일한 성질을 나타내고[Moore. J. A. Endocrinology, 122:2920-2926 (1988)], 또한 메티오닌 잔기가 첨가됨으로 인해 발생하는 부작용 등은 보고된 바 없으나, 첨가된 N-말단 메티오닌으로 인하여 간혹 항체가 생성될 수가 있어서 항체 생성율이 천연형보다 약간 높다는 보고가 있었다[Lacer. March 29, 697, (1996)].

따라서, 재조합 인간 성장 호르몬 등의 재조합 인체 유래단백질의 제조시 N-말단에 메티오닌이 없는 천연형 재조합 인간 성장 호르몬을 제조하고자 하는 많은 시도가 있었다. 예를 들면, 인간 성장 호르몬의 N-말단과 다른 단백질의 C-말단을 융합 발현시킨 후 특수한 프로테아제(protease)를 이용하여 절단하는 방법(PCT 국제 출원공개 제 WO 89/12678호, EP 제 20290호, EP 제 321940호), 단백질을 세포내에서 발현시켜 숙주세포 밖으로 분비될 때 메티오닌이 절단 제거되도록 함으로써 배지로부터 천연형 단백질을 수득하는 방법 등이 있다 (유럽 특허 공개 제 0088632 A2호, 미국 특허 제 4755465호, 일본 특허 제 01273591호, Ep 제 306673호, 대한민국 특허출원 제 92-10932).

상기의 방법들은 새로 벡터를 만들어 숙주세포로 형질전환하는 등의 번거로운 조작과 발효 조건을 최적화시키는 노력이 부가적으로 필요하다는 단점이 있다. 이러한 부가적인 노력없어 기존에 개발된 벡터 및 숙주 세포를 이용하여 제조, 정제된 메티오닐 인체 유래 반백질을 N-말단에 존재하는 메티오닌만을 선택적으로 제거할 수 있는 특수한 아미노펩티다제로 처리하여 천연형 재조합 단백질을 제조할 수 있다(PCT 국제 출원 공개 제 WO 86/04609 및 WO 86/204527 Al 호).

예를 들어, 메티오닐 인간 성장 호르몬은 그의 N-말단아미노산 서열이 Met-Phe-Pro-Thr-Ile으로 시작되므로 N-말단메티오닌만을 선택적으로 제거하기 위해 사용될 수 있는 아미노펩티다제는, N-말단의 X-Pro(X는 임의의 아미노산 잔기)를 인지하여 절단 반응이 X 잔기앞에서 정지되는 특성을 지니고 있는 효소이어야 하며, 그 가운데서도 효소 활성도가 높은 것일수록 산업적으로 이용하는데 유리하다.

현재까지 알려진 N-말단 메티오닌 잔기 제거에 의한 천연형 재조합 단백질의 제조에 이용되는 아미노 펩티다제로는 비브리오 프로테오라이티커스(Vibrio proteolyticus)로부터 추출, 정제한 아미노펩티다제(WO 86/01229, B.T.G), 돼지 신장으로부터 추출, 정제한 아미노펩티다제(WO 86/204527 Al, 다케다(Takeda))등이 있다.

본 출원인도 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스로부터 상기 천연형 재조합 단백질의 제조에 유용한 아미노펩티다제를 분리한 바있다.(대한민국 특허출원 제 93-11107호, 명칭:신규한 아미노펩티다제 및 그의 분리방법).

일반적으로 효소의 활성은 완충요액의 조건에 따라 가변적일 수 있기 때문에 새로운 효소의 사용시 높은 활성을 나타내도록 하기 위해서는 완충용액 조성 등 반응조건의 최적화가 필요하다.

본 발명자들은 상기에 언급한 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스에서 분리 정제한 암노펩티다제를 천연형 재조합 단백질의 제조에 이용하기 위하여 완충용액의 최적 조건을 찾던 중, 특정 pH 및 염화나트륨 농도 범위에서 효소 활성이 상대적으로 증가됨을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 방식으로 제조된 메티오닐 단백질로부터 아미노펩티다제를 이용하여 천연형 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 본 발명의 목적은 N-말단에티오닌 잔기를 부가적으로 갖는 단백질을 N-말단의 메티오닌 잔기만을 선택적으로 제거하기 위한 최적 반응 조건하에서 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스로부터 분리, 정제하여 얻은 아미노펩티다제로 처리하여 천연형 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다

본 발명에 따라서, N-말단에 메티오닌 잔기를 갖는 단백질, 예를 들면 메티오닐 인간 성장 호르몬을 반응 완충용액에서 최적 반응조건하에서 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스로부터 분리된 아미노펩티다제로 처리하여 천연형 재조합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.

상기 메티오닐 단백질로는 통상의 정제 방법에 의해 대장균, 효모 등의 숙주세포로부터 얻어진 모든 메티오닐 단백질을 사용할 수 있으며, 사용하는 단백질의 분자량에 따라 아미노펩티다제의 양이 달라지나 메티오닐 인간 성장 호르몬의 경우 1mg당 0.2 내지 20유니트의 아미노펩티다제를 사용하여 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 반응 완충용액의 pH는 7.5 내지 9.5가 바람직하며, 가장 바람직하게는 8 내지 8.5 이고, 염화나트륨을 첨가할 수 있다. 첨가되는 염화나트륨은 최종 농도에는 특별한 제한이 없으나, 최종 농도가 0 내지 100mM이 되게 하는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명은 메티오닐 단백질, 특히 메티오닐 인간 성장 호르몬을 염화나트륨이 0내지 100mM의 최종농도로 첨가된 pH 7.5 내지 9.5의 반응 완충용액중에서 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스로부터 분리된 아미노펩티다제로 처리함으로써 효소 활성에 최적인 반응 조건하에 37℃에서 N-말단의 메티오닌 잔기만을 선택적으로 제거하는 천연형 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 원에서는 재조합 단백질의 예로서 메티오닐 인간 성장 호르몬을 들어 기술하였으나, 본 발명의 방법은 다른 단백질에도 응용가능함은 물론이다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 실시예에서 사용되는 메티오닐 인간 성장 호르몬은 대한민국 특허 출원 제 90-3465호에 의해 명시된 방법으로 정제된 것이고, 아미노펩티다제로는 대한민국 특허출원 제 93-11107호에 명시된 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스에서 분리된 아미노펩티다제를 사용하였다.

아미노펩티다제의 유니트는 100mM의 트리스(pH 8.0)에 용해된 류신-파라니트로 아닐리드(Leucine-PNA)를 기질로 한 완충용액(1㎖)에 아미노펩티다제를 가하여 37℃에서 반응시켰을 때 405nm에서 분당 OD 1만큼을 변화시키는 효소의 양으로 정의된다.

하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시된 것일 뿐이고 본 발명이 이로 한정되는 것은 아니다.

참조예 반응 완충용액의 최적 조건의 결정

반응 완충용액의 최적조건은 본 출원인이 동일자로 출원한 대하민국 특허출원 제_______호의 방법을 이용하여 조사하였다. 기질로서 메티오닐펩티드(Met-Phe-Pro-Thr-Glu-Pro-Ser)를 포함하는 0.1M 트리스 완충용액을 각각 pH 7, pH 7.5, pH 8, pH 8.5 및 pH9의 pH 별로 제조하고, 상기 기질을 포함하는 인산 나트륨 완충용액을 pH 6에서 pH 7.5까지 pH 0.5간격으로 제조하고, 중탄산 나트륨 완충용액을 pH 8.5 내지 pH 10까지 0.5의 pH 간격으로 pH 별로 제조한 후 각 완충용액 1㎖에 동량의 아미노펩티다제를 첨가하여 10분간 처리한 후 그 결과를 제1도에 나타내었다. 이로부터, pH 7.5 내지 9.5의 완충용액에서의 처리가 다른 완충용액에서 보다 상대적으로 우수한 효소 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

또한 적절한 이온 강도를 유지하여 단백질의 안정성 감소를 방지하기 위해 염화나트륨을 각각 0,100,200,300,400 및 500mM의 최종농도로 첨가한 100mM 트리스 완충요액(pH 8.0)중에서 상기 기질을 효소처리하고 그 결과를 제2도에 나타내었다. 도면에서 알 수 있듯이, 염화나트륨의 농도가 증가함에 따라서 효소 활성도가 상대적으로 감소하였다.

실시예 1 : 천연형 재조합 인간 성장 호르몬의 제조

약 600㎍의 메티오닐 인간 성장 호르몬에 아미노펩티다제 8유니트를 첨가하고 반응완충용액(50mM 트리스 (pH 8.0), 100mM NaCl, 및 1mM PMSF)으로 충분히 투석시켜 준 다음, 2㎖ 용량의 세트리콘(centricon, 아미콘(Amicon)사)을 이용하여 부피를 0.6㎖까지 조절한 후 37℃의 물 중탕기에 24시간동안 담가 놓았다. 약 20시간이 경과한 후 동일한 반응 완충용액으로 재투석하였다.

상기 반응이 완료되면, 이 반응액을 20mM 트리스 완충용액 (pH 8.0)으로 충분히 투석시킨 후, 동일 완충용액으로 미리 평형시킨 DEAE-세파로즈 칼럼에 적용하고, 동일 완충용액으로 세척한 다음 20mM트리스, 100mM NaCl 완충용액으로 인간 성장 호르몬을 용출하였다.

실시예 2 : 천연형 재조합 인간 성장 호르몬의 특성조사

실시예 1에서 얻어진 N-말단 메티오닌 잔기가 제거된 천연형 재조합 인간 성장 호르몬을 N-말단 서열 분석기(어플라이드 바이오시스템즈 471A 단백질 서열 분석기(Applied Biosystems 471A Protein Sequencer)를 사용하여 메티오닐기가 제거된 정도를 확인하고 그 결과를 제3도에 나타내었다. 제3a 도는 N-말단의 메티오닌이 제거되기 전, 제3b도는 아미노펩티다제 처리 후의 N-말단 서열 분석 결과를 나타낸다. 도면에서 보면 인간 성장 호르몬의 첫번째 아미노산은 페닐알라닌으로 나타났으며 메티오닌 위치에서는 거의 피크가 보이지 않았다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 처리에 의해서 N-말단의 메티오닌 잔기가 거의 완전히 제거되었으며, 또한 N-말단의 메티오닌만이 선택적으로 절단되고 더 이상의 아미노산은 절단되지 않음이 확인되었다.

N-말단의 메티오닌이 제거된 천연형 재조합 인간 성장 호르몬으 순도 측정은 SDS-PAGE를 이용하여 수행하였으며, 결과는 제4도의 2레인에 나타나 있다.

최종적으로 정제된 천연형 재조합 인간 성장 호르몬의 역가를 방사 수용체 분석법(radio receptor assay)으로 측정한 결과, 세계보건기구(WHO)에서 공급하는 뇌하수체 유래 인간 성장 호르몬의 역가인 2.5IU/mg에 준하는 2.7IU/mg으로 나타났다(대한 내분비 학회지 5권 제3호, 1990).

이상의 설명에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들에 의해 고안된 메티오닐 인간 성장 호르몬과 아미노펩티다제와의 반응조건은 천연형 재조합 인간 성장 호르몬의 물리화학적 성질을 그대로 유지시키면서 N-말단의 메티오닌만을 선택적으로 제거하는 최적의 반응 조건임이 입증되었다.

이상과 같이, 본 발명을 구체적으로 실시태양과 관련하여 설명하였으나, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 당해분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 자명한 변경, 변형 및 수정은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해하여야 한다.

Claims (5)

1. 천연형 재조합 단백질의 제조방법에 있어서, N-말단 메티오닐 단백질을 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스의 배양액으로부터 분리된 하기 특성을 가지는 아미노펩티다제를 사용하여 반응 완충 용액중에서 처리함을 특징으로 하는 제조방법: 단백질의 N-말단 서열이 Lys-Phe-Ser-Lys-Lys-Phe-Asn-Glu로 시작되며, SDS-PAGE 상에서의 분자량이 41 내지 45 kd 이고 천연 상태의 분자량이 36 내지 40kd 임.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 재조합 인간 성장 호르몬임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 반응완충용액의 pH가 7.5 내지 9.5의 범위임을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 반응 완충용액에 염화나트륨을 첨가함을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 염화나트륨을 0 내지 100mM의 최종농도로 첨가함을 특징으로 하는 방법.